Orientador: Christine Hackel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:36:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Trarbach_ErickaBarbosa_D.pdf: 1140988 bytes, checksum: 29019756cf49f8a399fe86c69e38e551 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A síndrome de Kallmann (SK) é uma afecção relativamente rara, caracterizada pela associação de hipogonadismo hipogonadotrófico (HH) e anosmia/hiposmia. Embora a maioria dos casos de SK seja esporádica, diferentes padrões de herança, recessivo ligado ao X, autossômico dominante e autossômico recessivo têm sido descritos, sendo que a forma ligada ao X da síndrome (SKX) encontra-se genotípica e fenotipicamente melhor definida. O gene KAL-1 localizado em Xp22.3 escapa à inativação e codifica uma proteína, a anosmina, cujo papel tem sido relacionado ao processo de migração de neurônios produtores de GnRH que ocorre durante a embriogênese humana. No entanto, muitos casos de hipogonadismo hipogonadotrófico não podem ser relacionados a qualquer alteração olfativa, sendo estes classificados como hipogonadismo hipogonadotrófico normósmicos (HHn). Mutações no gene do receptor do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH-R) têm sido descritas numa parcela desses casos. Além disso, os genes NELF (fator nasal embrionário do hormônio liberador de hormônio luteinizante) e EBF2 (¿early B-cell factor¿) têm sido relacionados ao processo de migração de neurônios produtores de GnRH, sendo considerados possivelmente envolvidos na gênese do HH. O presente trabalho foi elaborado com o objetivo de se investigar a base genética das diferentes formas do HH. Para tal, foram avaliados 31 indivíduos com hipogonadismo hipogonadotrófico (pertencentes a 26 famílias), 22 com anosmia e nove com olfação normal, mediante a análise do cariótipo pela técnica de bandamento GTG seguida da análise molecular dos genes KAL-1 e GnRH-R, por PCR e seqüenciamento. Todos os pacientes estudados apresentaram cariótipo normal, à exceção de um caso esporádico de SK com microdeleção do locus KAL-1 detectada somente por FISH em estudo anteriormente realizado. Entre os pacientes com SK, foram detectadas mutações na região codificante do gene KAL-1 nas três famílias com herança recessiva ligada ao X e em um caso esporádico. Duas famílias apresentaram duas deleções intragênicas similares envolvendo os éxons 5-10; na terceira família detectou-se uma mutação 721C>T no éxon 5 levando a um códon de parada prematuro. Esta mutação ainda não se encontra descrita na literatura. No caso esporádico identificou-se uma mutação ¿frameshift¿ 1956delC no éxon 12. Em relação aos pacientes com HHn, não foram identificadas mutações nos genes GnRH-R e KAL-1. Nesses casos, e nos pacientes com SK cuja etiologia não pôde ser esclarecida, foram ainda analisados os genes NELF e EBF2. Contudo, nenhuma alteração nas seqüências desses genes foi identificada entre os pacientes da nossa casuística. Em conclusão, não foram encontradas evidências cromossômicas da localização de outros genes candidatos responsáveis pelo surgimento do HH. Duas mutações novas e duas deleções intragênicas semelhantes foram identificadas no gene KAL-1 entre os casos esporádicos e familiais da SK, observando-se que essas mutações ocorreram numa freqüência relativamente elevada em nossa casuística. Os pacientes com HHn não apresentaram mutações nos genes KAL-1 e GnRH-R. Não foram observadas anomalias nas seqüências codificantes dos genes NELF e EBF2 em nenhuma das formas de HH / Abstract: Kallmann syndrome (KS) is a relatively rare disorder characterized by the association of hypogonadotropic hypogonadism (HH) with anosmia or hyposmia. Although the majority of KS cases are sporadic, the syndrome may be transmitted as an autosomal dominant, autosomal recessive and X-linked modes of inheritance. The KAL-1 gene responsible for the X linked form of KS (X-KS) was mapped in Xp22.3 and encodes a protein called anosmin, that could function in the migration of GnRH-secreting neurons during embryonic development. However, many cases of hypogonadotropic hypogonadism do not have olfactory alterations, and are referred as normosmic hypogonadotropic hypogonadism (nHH). Mutations in the GnRH-R gene have been described in some of these cases. In addition, the NELF and EBF2 genes have been implicated in the neuronal GnRH migration and are considered promising candidate to HH manifestation. The aim of the present study was to investigate the genetic basis of different forms of HH. Thirty-one patients with HH (belonging to 26 families), 22 affected by KS and nine with normal olfaction, were evaluated by karyotype analysis using GTG banding technique followed by molecular analysis of the KAL-1 and GnRH-R genes, by PCR and sequencing techniques. All patients exhibited normal karyotypes, with exception of a previously studied KS sporadic case, where a microdeletion of the KAL-1 locus was detected only by FISH. Mutations were identified in the coding region of the KAL-1 gene in the three familial cases with X-linked inheritance and in one of the sporadic cases of KS. Two similar intragenic deletions involving exons 5-10 were observed in two families. In the third, a new point mutation on exon 5 (721C>T) leading to a premature stop codon was found, while a frameshift mutation caused by one nucleotide deletion (1956delC) within exon 12 was identified in the sporadic case. Mutations in the KAL-1 and GnRH-R genes were not observed in the patients with nHH. In these cases and in the KS patients without KAL-1 abnormalities, the coding sequences of genes NELF and EBF2 were analyzed. However, no mutation was detected in these genes in our sample. In conclusion, no chromosomal rearrangements or deletions that could be useful for the localization of other candidate genes responsible for HH were detected. Two new point mutations and two similar intragenic deletions of the KAL-1 gene were identified among sporadic and familial KS cases, with a relative high frequency in our sample. In the HHn patients, neither KAL-1 nor GnRH-R mutations were detected. No sequence abnormalities were demonstrated for the coding regions of the NELF and EBF2 genes in both forms of HH / Doutorado / Genetica Humana e Medica / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A região sul do Brasil é caracterizada pela ocorrência de diversas áreas fitoecológicas. Esta heterogeneidade de habitats pode condicionar gradientes ambientais, favorecendo a diferenciação regional e até mesmo eventos de especiação. Para investigar possíveis processos evolutivos ocorridos em plantas dessa região, analisamos os padrões de variação genética molecular em três grupos de espécies relacionadas pertencentes aos gêneros Passiflora (Passifloraceae) e Petunia (Solanaceae). Passiflora actinia e Passiflora elegans são espécies parapátricas que apresentam uma grande similaridade morfológica e genética. P. actinia é uma espécie típica da Mata Atlântica, enquanto P. elegans ocorre em matas de galeria no interior do Rio Grande do Sul (RS). Análises de marcadores nucleares e plastidiais revelaram um gradiente norte-sul nas relações intra e interespecíficas e contribuíram para a identificação de um híbrido interespecífico com morfologia intermediária encontrado na região de parapatria. É possível que a diferenciação genética entre os grupos geográficos de P. actinia e a recente divergência entre P. actinia e P. elegans tenham sido influenciadas pelos processos históricos ocorridos na região, como a migração da Mata Atlântica para o sul e o seu padrão de estabelecimento no RS. A Serra do Sudeste (RS) é um dos centros de diversidade do gênero Petunia, caracterizado pela presença de espécies com diferentes síndromes florais. P. exserta (polinizada por beija-flores, flores vermelhas) tem sua ocorrência restrita a esta região, sendo encontrada no interior de reentrâncias rochosas em torres areníticas. P. axillaris (polinizada por mariposas, flores brancas) habita áreas abertas e possui ampla distribuição geográfica. Nas torres onde estas espécies ocorrem em simpatria, foram encontradas plantas com morfologia floral intermediária, sugerindo hibridação entre elas. As análises de marcadores plastidiais corroboraram a hipótese de hibridação interespecífica e de divergência recente entre estas espécies e revelaram um baixo fluxo gênico entre as populações das torres. Entre as 11 espécies de Petunia, seis são encontradas exclusivamente nos planaltos das regiões sul e sudeste do Brasil: P. altiplana, P. bonjardinensis, P. mantiqueirensis, P. reitzii, P. saxicola e P. scheideana. A distribuição de marcadores plastidiais concorda com a hipótese de divergência recente destas espécies. Este padrão talvez esteja relacionado com as mudanças climáticas ocorridas no Quaternário, já que o habitat destas espécies (campos de altitude) foi fortemente afetado por estas alterações. Durante os estágios glaciais havia expansão das áreas de campo e nos interglaciais avanço da floresta com araucária. É possível que o padrão fragmentado dos campos, isolados nas áreas de maior altitude do planalto e cercados por áreas de floresta com araucária, tenha contribuído para a diversificação do grupo. / Brazilian southern region is characterized by the occurrence of several phytoecological areas. This habitat heterogeneity can condition environmental gradients, favor regional differentiation, and even speciation events. To investigate the possible evolutionary process which occurred in plants of this region, we analyzed the patterns of molecular genetic variation in three groups of related species classified in the Passiflora (Passifloraceae) and Petunia (Solanaceae) genera. Passiflora actinia and Passiflora elegans are parapatric species which show high morphologic and genetic similarity. P. actinia is a species typical of the Atlantic Forest, while P. elegans occurs in gallery forests in the interior of Rio Grande do Sul (RS). Analyses of nuclear and plastid markers revealed a north-south gradient both in the intra e interspecific relationships, and contributed to the identification of an interspecific hybrid with intermediate morphology in the parapatric region. It is possible that the genetic differentiation among P. actinia’s geographic groups and the recent P. actinia/P. elegans divergence have been influenced by historical processes occurred in the region, like the Atlantic Forest southern migration and its pattern of establishment in RS. The Serra do Sudeste region (Southeast Sierra in RS) is one of Petunia’s centers of diversity, characterized by the presence of species with different floral syndromes. P. exserta (pollinated by hummingbirds, red flowers) has its occurrence restricted to this region, and is found in the interior of shelters of sand towers. P. axillaris (pollinated by hawkmoths, white flowers) live in open areas and has a wide geographical distribution. In the towers in which these species are found in sympatry, plants with intermediate flower morphology were found, suggesting hybridization between them. Plastid markers analyses confirmed the interspecific hybridization hypothesis and the recent divergence between these species, revealing a low gene flow between the populations of the towers. Among the 11 species of Petunia, six were found exclusively in the Brazilian south and southeast highlands: P. altiplana, P. bonjardinensis, P. mantiqueirensis, P. reitzii, P. saxicola and P. scheideana. Plastid markers distribution agrees with the hypothesis of recent divergence of these species. This pattern is probably related to the climatic changes occurred in the Quaternary since the habitat of these species (campos de altitude) has been strongly affected by these modifications. During the glacial stages expansion of grasslands areas occurred, while in the interglacial periods Araucaria forest would advance. Possibly the fragmented pattern of the grasslands, isolated in the high altitude areas of the plateau and surrounded by Araucaria forest, has contributed to the group’s diversification.

Rizóbios são bactérias estritamente aeróbias, quimioorganotróficas, com a forma de bastonetes não formadoras de esporos, Gram-negativas, com um tamanho que varia de 0,5- 0,9 µm X 1,2-3,0 µm. Normalmente encontradas no solo, fixam nitrogênio atmosférico (N2) em simbiose com leguminosas e algumas plantas não leguminosas, induzindo a formação de nódulos nas raízes, permanecendo nestas como bacteróides fixadores de nitrogênio. No Brasil rizóbios são inoculados em lavouras de soja, pois a inoculação com bactérias fixadoras de nitrogênio supre totalmente a necessidade de utilização de adubos nitrogenados. No presente estudo foi realizada uma análise comparativa entre as espécies Bradyrhizobium japonicum (estirpe USDA 110) e Bradyrhizobium elkanii (estirpe SEMIA 587) através da aplicação da técnica de RDA (Representational Difference Analysis). RDA é uma técnica bastante útil para revelar seqüências únicas entre dois genomas ou transcritomas semelhantes. Após três ciclos de hibridizações subtrativas e amplificações dos fragmentos tester, fragmentos de aproximadamente 300 pb foram gerados. Estes fragmentos foram clonados em pUC18 e seqüênciados. Das 200 seqüências obtidas, 46 pertenceram exclusivamente à B. elkanii e 154 tiveram homologia com B. japonicum. Entre as 46 seqüências sem homologia com B. japonicum, 39 não demonstraram homologia com nenhuma seqüência depositada nos bancos de dados públicos e sete seqüências mostraram homologia com proteínas conhecidas. Estas sete seqüências foram divididas em três grupos: seqüências homólogas a outras estirpes ou espécies de Bradyrhizobium, seqüências homólogas a outras bactérias fixadoras de nitrogênio e seqüências homólogas a bactérias não fixadoras de nitrogênio. O grupo com homologia a estirpes de Bradyrhizobium foi composto por dois clones: clone i5 foi homólogo a um transportador ABC (ATP Binding Cassette, hlyB like protein) de Bradyrhizobium sp. ORS278, e o clone i29 foi homólogo à subunidade menor da carboxylase (tipo RuBisCO) da estirpe foto-organotrófica Bradyrhizobium sp. BTA1. O grupo com homologia a outras bactérias fixadoras de nitrogênio foi composto por três clones: clone i150 foi homólogo à subunidade alfa da 4-hydroxybenzoyl-CoA redutase de Mesorhizobium loti, clone i170 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Rhodopseudomonas palustris, e o clone ii23 foi homólogo ao fator de virulência mviN de Xanthobacter autotrophicus Py2. O grupo com homologia a bactérias não fixadoras de nitrogênio foi também composto por dois clones: clone i65 foi homólogo à peptidase M19 de Sphingopyxis alaskensis RB2256, e o clone i157 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Nitrobacter winogradsky. Esse conhecimento genômico de B. elkanii poderá ajudar na compreensão das diferenças fisiológicas encontradas entre essas duas espécies e servir como base na caracterização de estirpes isoladas de nódulos de soja. / Rhizobia are strictly aerobic chemoorganotrophic rod-shaped sporeless bacteria. They are a Gram-negative bacteria with a size that varies between 0.5-0.9 µm to 1.2-3.0 µm. Normally found in the ground, they fix atmospheric nitrogen (N2) in symbiosis with leguminous plants and some non leguminous plants, inducing the formation of nodules in the roots where the bacterium differentiates itself into nitrogen-fixing bacteroids. In Brazil, rhizobia are inoculated in soybean crops. This inoculation totally fulfills the crop need of nitrogen. In the present study a comparative analysis was carried out between Bradyrhizobium japonicum (USDA 110) and Bradyrhizobium elkanii (SEMIA 587) through the application of the RDA technique (Representational Difference Analysis). RDA is a quite useful technique to reveal the unique sequences between two genomes or transcriptomes. After three cycles of subtractive hybridizations and amplifications of the tester DNA, 300 pb fragments were obtained. These fragments were cloned into pUC18 vector and were sequenced. Two hundred RDA sequences were obtained. Forty six sequences among the 200 belonged exclusively to the tester strain B. elkanii SEMIA 587, and 154 had homology to the driver strain B. japonicum USDA110. From the 46 sequences with no homology to B. japonicum USDA 110 genome, 39 showed no homology with sequences in public databases and seven sequences showed homology with known proteins. These seven sequences were divided in three groups: homolog to other Bradyrhizobium strains, homolog to other nitrogen-fixing bacteria, and homolog to non nitrogen-fixing bacteria. The group of homolog to other Bradyrhizobium strains was composed by two clones: clone i5 was homolog to a putative toxin secretion ABC transporter from Bradyrhizobium sp. ORS278, and clone i29 was homolog to a putative carboxylase like RuBisCO small subunit from the photoorganotroph Bradyrhizobium sp. BTA1. The group of homolog to other nitrogen-fixing bacteria was composed by three clones: clone i150 was homolog to a 4-hydroxybenzoyl-CoA reductase alpha-subunit of Mesorhizobium loti, clone i170 was homolog to a conserved hypothetical protein of Rhodopseudomonas palustris, and clone ii23 was homolog to a virulence factor mviN of Xanthobacter autotrophicus Py2. The group of homolog to other non nitrogen-fixing bacteria was also composed by two clones: clone i65 was homolog to a peptidase M19 of Sphingopyxis alaskensis RB2256, and clone i157 was homolog to a conserved hypothetical protein of Nitrobacter winogradsky. This better understanding of B. elkanii genome could help us in the comprehension of physiological differences between these two species and it could be a useful tool to characterize Bradyrhizobia strains isolated from soybean nodules.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-08T18:51:24Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3016157 bytes, checksum: 362c5f16a4717763663adf239c105fa9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-08T18:51:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3016157 bytes, checksum: 362c5f16a4717763663adf239c105fa9 (MD5) Previous issue date: 2000-09-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A família Geminiviridae compreende um grupo de vírus de plantas que são empacotados em vírions como DNA fita simples e ocorrem como DNA fita simples e fita dupla nas células infectadas. Seu genoma pode ser monopartido ou bipartido. O genoma dos geminivírus bipartidos é dividido em dois componentes genômicos, denominados DNA A e DNA B. Utilizando-se ensaios de PCR, foram detectados geminivírus em plantas sintomáticas de tomateiros (Lycopersicon esculentum), coletadas nos Estados de Minas Gerais e Rio de Janeiro, Brasil. Com oligonucleotídeos degenerados específicos para cada componente, fragmentos de tamanhos esperados, correspondentes aos componentes A e B de geminivírus, foram amplificados a partir do DNA total de tomateiros infectados. Esses resultados confirmaram a natureza bipartida destes geminivírus. Os fragmentos amplificados, contendo as regiões intergênicas mais as seqüências flanqueadoras 3' e 5', foram clonados e seqüenciados. A análise comparativa das seqüências revelou que os fragmentos destes geminivírus apresentam moderada conservação de seqüência com outros membros do gênero Begomovirus e preenchem os requerimentos para serem caracterizados como novos vírus distintos. Suas regiões intergênicas diferem significativamente na seqüência de nucleotídeos, e a seqüência deduzida de aminoácidos da região N- terminal de suas proteínas capsidiais não supera 85% de identidade com outras espécies do gênero Begomovirus. Coletivamente, esses resultados indicam que os dois geminivírus que infectam tomateiro, detectados em plantas coletadas nos Estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais, são novas espécies da família Geminiviridae. O geminivírus do Estado do Rio de Janeiro, aqui designado TYhMV ("Tomato yellowish mosaic virus"), foi parcialmente caracterizado com a clonagem e o seqüenciamento completo do componente B. A taxonomia do novo vírus foi confirmada pela análise filogenética baseada na seqüência do componente B e na seqüência deduzida de aminoácidos das proteínas BV1 e BC1. Esses resultados confirmaram que o novo vírus pode ser classificado como uma espécie distinta de Begomovirus, sendo mais relacionado com os Begomovirus TGMV e BGMV, previamente identificados no Brasil. A tentativa de clonagem do componente A completo amplificado com oligonucleotídeos específicos resultou em quatro clones distintos, os quais compartilham a seqüência da região intergênica. Embora estes clones não tenham sido totalmente caracterizados, a comparação de suas regiões intergênicas com a correspondente região do componente B clonado revelou que eles compartilham 98,5% de identidade de seqüência. O alto grau de conservação da seqüência de suas regiões intergênicas indica que o componente B clonado e os clones do componente A pertencem ao genoma de TYhMV. / The Geminiviridae family comprises a group of plant viruses that are packaged as single-stranded DNA in virions and exist as single-stranded and double-stranded DNA in infected cells. Their genome can be either monopartite or bipartite. The genome of the bipartite geminiviruses is spliced between two genomic components, designated DNA A and DNA B. We have used a PCR- based diagnostic assay to detect geminiviruses in symptomatic tomato (Lycopersicon esculentum) plants, collected in the states of Minas Gerais and Rio de Janeiro, Brazil. With degenerate primers specific for each component, the correctly sized fragments corresponding to A and B components of geminiviruses were amplified from DNA extracts of tomato plants. These results confirmed the bipartite nature of these geminiviruses. The amplified fragments corresponding to the intergenic region plus 5' and 3' flanking sequences were cloned and sequenced. Sequence comparison analysis revealed that they share a moderate conservation of sequences with other members of the Begomovirus genus and fit well into the requirements for distinct, new viruses. Their intergenic regions differ significantly in nucleotide sequence and the deduced N-terminal regions of their coat protein share no more than 85% identity with other species of the Begomovirus genus. Taken together, these results indicate that the two tomato-infecting geminiviruses detected in plants collected in the states of Minas Gerais and Rio de Janeiro, Brazil, are distinct, new species of the family Geminiviridae. The tomato-infecting geminivirus from Rio de Janeiro, here designated TYhMV (tomato yellowish mosaic virus), was further characterized by full-length cloning and sequencing of its B component. The taxonomy of the new virus was further confirmed by phylogenetic analysis based on the sequence of the B component and the deduced aminoacid sequence of the BV1 and BC1 proteins. These results confirmed that the new virus may be classified as a distinct species of Begomovirus, more related to other previously characterized Begomovirus from Brazil, such as TGMV and BGMV. Attempts to clone the fully amplified A component with specific primers resulted in four distinct clones, which share the same sequence of the intergenic region. Although these clones have not been fully characterized, comparison of their intergenic region with the corresponding region of the cloned B component revealed that they share 98.5 % sequence identity. The high degree of sequence conservation of their intergenic regions indicates that the cloned B component and the clones of the A component belong to the genome of TYhMV. / Dissertação importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissCCS.pdf: 1405492 bytes, checksum: 1ccf925c4d6d2952c26ebbf9e80a1949 (MD5) Previous issue date: 2004-08-31 / Molecular markers were used to examine the genetic variability of eight landraces of peach palm (Bactris gasipaes var. gasipaes) and two wild populations (B. gasipaes var. chichagui), their relationships and genetic structures. Two hundred plants of these 8 races were used and 18 plants of the two wild populations, one from the Magdalena River, Colômbia, and the other from the Xingu River, Pará, Brasil. Eight primers were used to generate RAPD markers, of which 124 markers were obtained with 101 polymorphic. The observed heterozygosity of the set of landraces and wild populations was 0.38, with 93 % polymorphism, both slightly greater than in earlier studies. The Amazonian landraces had greater heterozygosity and % polymorphism than the Central American race. The structure of the dendrogram based on Nei s (1972) distances with the four previously studied landraces was similar to that study, essentially validating it and confirming two landrace groups one Occidental and one Oriental. When the Juruá landrace was added to the analysis, it joined with the other Occidental races, as expected by its geographic position. When the other landraces (with small sample sizes) were added to the analysis, a consistency and some problems were observed. The consistency was that all the landraces joined the Occidental group, expected by their geographic positions. The problems were the grouping of the Vaupés landrace with the Juruá landrace, which are geographically distant and have different fruit sizes and shapes. The relationship between the Cauca landrace and the Inirida landrace was also problematic, since they are geographically separated. These problems can only be resolved with new germplasm collections in the appropriate geographic areas and with an appropriate number of individuals. The two wild populations joined the landraces at a great distance, suggesting that they did not participate in the domestication of the cultivated landraces and indirectly reenforcing the hypothesis of a single origin in southwestern Amazonia. / Marcadores moleculares foram utilizados para verificar a variabilidade genética de oito raças primitivas de pupunha (Bactris gasipaes var. gasipaes) e duas populações silvestres (B. gasipaes var. chichagui), suas relações e estruturas genéticas. Foram utilizadas 200 plantas das 8 raças primitivas de pupunha e 18 plantas de duas populações silvestres, sendo uma do rio Magdalena, Colômbia, e outra do rio Xingu, Pará, Brasil. Oito iniciadores foram usados para gerar marcadores RAPD, obtendo 124 marcadores, dos quais 101 polimórficos. A heterozigosidade observada do conjunto de raças e populações foi de 0,38, com porcentagem de polimorfismo de 93%, ambas um pouco maior que nos estudos anteriores. As raças da Amazônia apresentaram maiores heterozigosidades e % polimorfismo que a raça de América Central. A estrutura do dendrograma baseado nas distâncias de Nei (1972) para as quatro raças estudadas anteriormente foi muito similar a este primeiro estudo, essencialmente validando esta, e confirmando dois grupos de raças um Ocidental e um Oriental. Quando a raça Juruá foi adicionada à análise, se agrupou com as raças Ocidentais, como esperado pelo posicionamento geográfico. Quando as outras raças (com tamanhos amostrais insuficientes) foram adicionadas à análise, observou-se algumas consistências e problemas. A consistência principal foi o agrupamento de todas as raças ocidentais no lado ocidental do dendrograma. Os problemas foram os agrupamentos da raça Vaupés com a raça Juruá, que são distantes geograficamente e possuem formatos e tamanhos de fruto muito diferentes. A relação entre Cauca e Inirida também foi problemática, pois são geograficamente separadas. Estes problemas somente podem ser resolvidos com novas coletas de germoplasma nas áreas geográficas apropriadas com um número apropriado de indivíduos. As duas populações silvestres se agruparam muito longe das raças, sugerindo que não participaram da domesticação das populações cultivadas e indiretamente reforçando a hipótese de uma origem no sudoeste da Amazônia.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biociências, Departamento de Fitopatologia, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-05-29T14:28:50Z No. of bitstreams: 1 2012_MarianaMartinsSeveroAlmeida_Parcial.pdf: 945374 bytes, checksum: f043ad10704b6537a7c84b10ae738f0a (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-30T13:41:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MarianaMartinsSeveroAlmeida_Parcial.pdf: 945374 bytes, checksum: f043ad10704b6537a7c84b10ae738f0a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-30T13:41:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MarianaMartinsSeveroAlmeida_Parcial.pdf: 945374 bytes, checksum: f043ad10704b6537a7c84b10ae738f0a (MD5) / No Brasil, plantas pertencentes à família Malvaceae estão amplamente distribuídas em todo país, como plantas cultivadas, ornamentais, daninhas ou espécies selvagens. É comum observar claros sintomas de mosaico em plantas daninhas da família Malvaceae e, invariavelmente, elas são infectadas por begomovírus, no entanto, é raro observar sintomas semelhantes de vírus em plantas malváceas ornamentais e cultivadas. Neste trabalho foi realizado um estudo sobre a presença de infecção por begomovírus bipartidos em três espécies da família Malvaceae: malva-preta (Sidastrum micranthum), algodão (Gossypium hirsutum) e chapéu-de-turco ou hibisco-colibri (Malvaviscus arboreus). Nove plantas de algodoeiro apresentando sintoma de mosaico amarelo foram coletadas em casa de vegetação da Embrapa Algodão em Campina Grande, Paraíba, seis plantas de hibisco-colibri foram coletadas em um jardim no centro da cidade do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, com forte sintoma de clorose nas folhas e apenas uma amostra de malva-preta foi coletada no Jardim Zoológico Sgt. Sílvio Delmar Hollemback, Brasília, Distrito Federal, com sintoma de mosaico dourado típico de begomovirose. As sequências dos genomas destes begomovírus foi determinada (DNA-A e DNA-B, 2629 2711 nucleotídeos de comprimento) após clonagem dos produtos amplificados via círculo rolante de cada amostra de DNA. As sequências nucleotídicas dos clones de DNA-A dos isolados tiveram identidade de 62% entre si e para os clones de DNA-B dos isolados as sequências nucleotídicas foram 62% a 70% idênticas entre si, sugerindo que distintos begomovírus estavam presentes nessas amostras. Não foi encontrado o componente de DNA-A na amostra de malva-preta e a sequência do componente de DNA-B compartilhou 69% de identidade nucleotídica com Sida micrantha mosaic virus (SiMMV) sugerindo a presença de uma nova espécie de begomovírus. Das amostras de algodão, a sequência de DNA-A apresentou identidade máxima de 78% com Tomato common mosaic virus (ToCMV) e o DNA-B compartilhou 64% de identidade genômica com Cabbage leaf curl virus (CabLCV) e Rhyncosia rugose golden mosaic virus (RhRGMV). Finalmente, da planta ornamental hibisco-colibri foi isolado uma sequência de DNA-A com 78% de identidade com Abutilon mosaic Bolivia virus (AbMBoV) e uma sequência de DNA-B com 74% de identidade também com Abutilon mosaic Bolivia virus (AbMBoV). Ficou claro que novas espécies de begomovírus estão ocorrendo em plantas daninhas, cultivadas e ornamentais da família Malvaceae no Brasil, podendo causar epidemias futuras no país e em países vizinhos. Uma análise detalhada foi realizada com estas sequências, algumas das quais não possuem características tipicamente encontradas nos geminivírus, tais como o motivo nonanucleotídeo conservado TAATATTAC. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In Brazil, malvaceous plants are widely spread throughout the country, as cultivated plants, ornamental plants and weeds or wild species. It is common to see clear mosaic symptoms on weeds in the Malvaceae family and invariably they are infected by begomoviruses, however, it is rare to observe virus-like symptoms on cultivated and ornamental malvaceous plants. In this work was made a study on the presence of bipartide begomovirus infection in three malvaceous species: dainty sand mellow (Sidastrum micranthum), cotton (Gossypium hirsutum) and turkcap (Malvaviscus arboreus). Nine cotton plants showing yellow mosaic symptoms were collected in a greenhouse at Embrapa Cotton in Campina Grande, Paraíba, six turkcap plants were collected in a garden in the center of Rio de Janeiro city, Rio de Janeiro, with strong symptoms of chlorosis in the leaves and only one sample of dainty sand mellow was collected at the Zoo Sgt. Sílvio Delmar Hollemback, Brasília, Distrito Federal, with golden mosaic symptoms typical of begomoviruses. The genome sequence of these begomovirus was determined (DNA-A and DNA-B, 2629 to 2711 nucleotide-long) after cloning of rolling circle amplified products of each DNA sample. The nucleotide sequence of clones of the DNA-A isolates had 62% identity to each other and to the clones of DNA-B isolates the nucleotide sequence were 62% to 70% identical to each other, suggesting that distinct begomovirus were present on these samples. From dainty sand mellow plant, a DNA-A component was not found and a DNA-B component sequence with 69% nucleotide identity to Sida micrantha mosaic virus (SiMMV) was found, suggesting the presence of a new begomovirus species. From cotton plants, a DNA-A sequence sharing the maximum nucleotide identity of 78% with Tomato common mosaic virus (ToCMV) and a DNA-B sequence sharing 64% identity with Cabbage leaf curl virus (CabLCV) and Rhyncosia rugose golden mosaic virus (RhRGMV) were found. Finally, from ornamental plant turkcap, the DNA-A sequence was 78% identical to Abutilon mosaic Bolivia virus (AbMBoV) and the DNA-B 74% to Abutilon mosaic Bolivia virus (AbMBoV). It was clear that new begomovirus species are occurring on weed, cultivated and ornamental malvaceous plants in Brazil, and may cause future epidemics in the country and surrounding countries. A detailed analysis was carried on with these sequences, some of them lacking some particular characteristics commonly found on geminiviruses, such as the conserved nonanucleotide motif TAATATTAC.

Rizóbios são bactérias estritamente aeróbias, quimioorganotróficas, com a forma de bastonetes não formadoras de esporos, Gram-negativas, com um tamanho que varia de 0,5- 0,9 µm X 1,2-3,0 µm. Normalmente encontradas no solo, fixam nitrogênio atmosférico (N2) em simbiose com leguminosas e algumas plantas não leguminosas, induzindo a formação de nódulos nas raízes, permanecendo nestas como bacteróides fixadores de nitrogênio. No Brasil rizóbios são inoculados em lavouras de soja, pois a inoculação com bactérias fixadoras de nitrogênio supre totalmente a necessidade de utilização de adubos nitrogenados. No presente estudo foi realizada uma análise comparativa entre as espécies Bradyrhizobium japonicum (estirpe USDA 110) e Bradyrhizobium elkanii (estirpe SEMIA 587) através da aplicação da técnica de RDA (Representational Difference Analysis). RDA é uma técnica bastante útil para revelar seqüências únicas entre dois genomas ou transcritomas semelhantes. Após três ciclos de hibridizações subtrativas e amplificações dos fragmentos tester, fragmentos de aproximadamente 300 pb foram gerados. Estes fragmentos foram clonados em pUC18 e seqüênciados. Das 200 seqüências obtidas, 46 pertenceram exclusivamente à B. elkanii e 154 tiveram homologia com B. japonicum. Entre as 46 seqüências sem homologia com B. japonicum, 39 não demonstraram homologia com nenhuma seqüência depositada nos bancos de dados públicos e sete seqüências mostraram homologia com proteínas conhecidas. Estas sete seqüências foram divididas em três grupos: seqüências homólogas a outras estirpes ou espécies de Bradyrhizobium, seqüências homólogas a outras bactérias fixadoras de nitrogênio e seqüências homólogas a bactérias não fixadoras de nitrogênio. O grupo com homologia a estirpes de Bradyrhizobium foi composto por dois clones: clone i5 foi homólogo a um transportador ABC (ATP Binding Cassette, hlyB like protein) de Bradyrhizobium sp. ORS278, e o clone i29 foi homólogo à subunidade menor da carboxylase (tipo RuBisCO) da estirpe foto-organotrófica Bradyrhizobium sp. BTA1. O grupo com homologia a outras bactérias fixadoras de nitrogênio foi composto por três clones: clone i150 foi homólogo à subunidade alfa da 4-hydroxybenzoyl-CoA redutase de Mesorhizobium loti, clone i170 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Rhodopseudomonas palustris, e o clone ii23 foi homólogo ao fator de virulência mviN de Xanthobacter autotrophicus Py2. O grupo com homologia a bactérias não fixadoras de nitrogênio foi também composto por dois clones: clone i65 foi homólogo à peptidase M19 de Sphingopyxis alaskensis RB2256, e o clone i157 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Nitrobacter winogradsky. Esse conhecimento genômico de B. elkanii poderá ajudar na compreensão das diferenças fisiológicas encontradas entre essas duas espécies e servir como base na caracterização de estirpes isoladas de nódulos de soja. / Rhizobia are strictly aerobic chemoorganotrophic rod-shaped sporeless bacteria. They are a Gram-negative bacteria with a size that varies between 0.5-0.9 µm to 1.2-3.0 µm. Normally found in the ground, they fix atmospheric nitrogen (N2) in symbiosis with leguminous plants and some non leguminous plants, inducing the formation of nodules in the roots where the bacterium differentiates itself into nitrogen-fixing bacteroids. In Brazil, rhizobia are inoculated in soybean crops. This inoculation totally fulfills the crop need of nitrogen. In the present study a comparative analysis was carried out between Bradyrhizobium japonicum (USDA 110) and Bradyrhizobium elkanii (SEMIA 587) through the application of the RDA technique (Representational Difference Analysis). RDA is a quite useful technique to reveal the unique sequences between two genomes or transcriptomes. After three cycles of subtractive hybridizations and amplifications of the tester DNA, 300 pb fragments were obtained. These fragments were cloned into pUC18 vector and were sequenced. Two hundred RDA sequences were obtained. Forty six sequences among the 200 belonged exclusively to the tester strain B. elkanii SEMIA 587, and 154 had homology to the driver strain B. japonicum USDA110. From the 46 sequences with no homology to B. japonicum USDA 110 genome, 39 showed no homology with sequences in public databases and seven sequences showed homology with known proteins. These seven sequences were divided in three groups: homolog to other Bradyrhizobium strains, homolog to other nitrogen-fixing bacteria, and homolog to non nitrogen-fixing bacteria. The group of homolog to other Bradyrhizobium strains was composed by two clones: clone i5 was homolog to a putative toxin secretion ABC transporter from Bradyrhizobium sp. ORS278, and clone i29 was homolog to a putative carboxylase like RuBisCO small subunit from the photoorganotroph Bradyrhizobium sp. BTA1. The group of homolog to other nitrogen-fixing bacteria was composed by three clones: clone i150 was homolog to a 4-hydroxybenzoyl-CoA reductase alpha-subunit of Mesorhizobium loti, clone i170 was homolog to a conserved hypothetical protein of Rhodopseudomonas palustris, and clone ii23 was homolog to a virulence factor mviN of Xanthobacter autotrophicus Py2. The group of homolog to other non nitrogen-fixing bacteria was also composed by two clones: clone i65 was homolog to a peptidase M19 of Sphingopyxis alaskensis RB2256, and clone i157 was homolog to a conserved hypothetical protein of Nitrobacter winogradsky. This better understanding of B. elkanii genome could help us in the comprehension of physiological differences between these two species and it could be a useful tool to characterize Bradyrhizobia strains isolated from soybean nodules.

A região sul do Brasil é caracterizada pela ocorrência de diversas áreas fitoecológicas. Esta heterogeneidade de habitats pode condicionar gradientes ambientais, favorecendo a diferenciação regional e até mesmo eventos de especiação. Para investigar possíveis processos evolutivos ocorridos em plantas dessa região, analisamos os padrões de variação genética molecular em três grupos de espécies relacionadas pertencentes aos gêneros Passiflora (Passifloraceae) e Petunia (Solanaceae). Passiflora actinia e Passiflora elegans são espécies parapátricas que apresentam uma grande similaridade morfológica e genética. P. actinia é uma espécie típica da Mata Atlântica, enquanto P. elegans ocorre em matas de galeria no interior do Rio Grande do Sul (RS). Análises de marcadores nucleares e plastidiais revelaram um gradiente norte-sul nas relações intra e interespecíficas e contribuíram para a identificação de um híbrido interespecífico com morfologia intermediária encontrado na região de parapatria. É possível que a diferenciação genética entre os grupos geográficos de P. actinia e a recente divergência entre P. actinia e P. elegans tenham sido influenciadas pelos processos históricos ocorridos na região, como a migração da Mata Atlântica para o sul e o seu padrão de estabelecimento no RS. A Serra do Sudeste (RS) é um dos centros de diversidade do gênero Petunia, caracterizado pela presença de espécies com diferentes síndromes florais. P. exserta (polinizada por beija-flores, flores vermelhas) tem sua ocorrência restrita a esta região, sendo encontrada no interior de reentrâncias rochosas em torres areníticas. P. axillaris (polinizada por mariposas, flores brancas) habita áreas abertas e possui ampla distribuição geográfica. Nas torres onde estas espécies ocorrem em simpatria, foram encontradas plantas com morfologia floral intermediária, sugerindo hibridação entre elas. As análises de marcadores plastidiais corroboraram a hipótese de hibridação interespecífica e de divergência recente entre estas espécies e revelaram um baixo fluxo gênico entre as populações das torres. Entre as 11 espécies de Petunia, seis são encontradas exclusivamente nos planaltos das regiões sul e sudeste do Brasil: P. altiplana, P. bonjardinensis, P. mantiqueirensis, P. reitzii, P. saxicola e P. scheideana. A distribuição de marcadores plastidiais concorda com a hipótese de divergência recente destas espécies. Este padrão talvez esteja relacionado com as mudanças climáticas ocorridas no Quaternário, já que o habitat destas espécies (campos de altitude) foi fortemente afetado por estas alterações. Durante os estágios glaciais havia expansão das áreas de campo e nos interglaciais avanço da floresta com araucária. É possível que o padrão fragmentado dos campos, isolados nas áreas de maior altitude do planalto e cercados por áreas de floresta com araucária, tenha contribuído para a diversificação do grupo. / Brazilian southern region is characterized by the occurrence of several phytoecological areas. This habitat heterogeneity can condition environmental gradients, favor regional differentiation, and even speciation events. To investigate the possible evolutionary process which occurred in plants of this region, we analyzed the patterns of molecular genetic variation in three groups of related species classified in the Passiflora (Passifloraceae) and Petunia (Solanaceae) genera. Passiflora actinia and Passiflora elegans are parapatric species which show high morphologic and genetic similarity. P. actinia is a species typical of the Atlantic Forest, while P. elegans occurs in gallery forests in the interior of Rio Grande do Sul (RS). Analyses of nuclear and plastid markers revealed a north-south gradient both in the intra e interspecific relationships, and contributed to the identification of an interspecific hybrid with intermediate morphology in the parapatric region. It is possible that the genetic differentiation among P. actinia’s geographic groups and the recent P. actinia/P. elegans divergence have been influenced by historical processes occurred in the region, like the Atlantic Forest southern migration and its pattern of establishment in RS. The Serra do Sudeste region (Southeast Sierra in RS) is one of Petunia’s centers of diversity, characterized by the presence of species with different floral syndromes. P. exserta (pollinated by hummingbirds, red flowers) has its occurrence restricted to this region, and is found in the interior of shelters of sand towers. P. axillaris (pollinated by hawkmoths, white flowers) live in open areas and has a wide geographical distribution. In the towers in which these species are found in sympatry, plants with intermediate flower morphology were found, suggesting hybridization between them. Plastid markers analyses confirmed the interspecific hybridization hypothesis and the recent divergence between these species, revealing a low gene flow between the populations of the towers. Among the 11 species of Petunia, six were found exclusively in the Brazilian south and southeast highlands: P. altiplana, P. bonjardinensis, P. mantiqueirensis, P. reitzii, P. saxicola and P. scheideana. Plastid markers distribution agrees with the hypothesis of recent divergence of these species. This pattern is probably related to the climatic changes occurred in the Quaternary since the habitat of these species (campos de altitude) has been strongly affected by these modifications. During the glacial stages expansion of grasslands areas occurred, while in the interglacial periods Araucaria forest would advance. Possibly the fragmented pattern of the grasslands, isolated in the high altitude areas of the plateau and surrounded by Araucaria forest, has contributed to the group’s diversification.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Marianna Gomes (mariannasouza@bce.unb.br) on 2016-12-08T16:35:33Z No. of bitstreams: 1 2016_AndréGustavoMachadoBertran.pdf: 53030977 bytes, checksum: 8b87d46e5db736462cd27c947d0fa8ec (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-31T17:09:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AndréGustavoMachadoBertran.pdf: 53030977 bytes, checksum: 8b87d46e5db736462cd27c947d0fa8ec (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-31T17:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AndréGustavoMachadoBertran.pdf: 53030977 bytes, checksum: 8b87d46e5db736462cd27c947d0fa8ec (MD5) / As espécies do gênero Tospovirus são importantes patógenos vegetais efontes de prejuízo à produção agrícola mundial. Os tospovírus são membros da famíliaBunyaviridae de vírus de (-)ssRNA com genoma tri-segmentado denominado L, M e S RNAs. Arelação entre o vetor e o vírus é do tipo circulativa-propagativa e sabe-se que a presença deRNAs Defectivos-Interferentes (DI-RNAs) pode interferir negativamente na habilidade de umisolado viral ser transmitido pelo inseto vetor. Nesta tese de doutorado, os capítulos 1 e 2apresentam a descoberta, a caracterização molecular e estrutural, o estudo da dinâmica deacumulação e efeitos biológicos de um novo tipo de RNA defectivo viral: RNAs Diméricos-Imperfeitos (ID-RNAs). OS ID-RNAs são moléculas de RNA viral resultantes de duplicações dosegmento S RNA apresentando deleções, ou na região 3’UTR do primeiro monômero, ou naregião 5’UTR do segundo monômero, mas nunca nas duas regiões UTR simultaneamente. OsID-RNAs foram encontrados até o momento em Polygonum ringspot virus (PolRSV) e TSWVinfectando a planta modelo Nicotiana benthamiana. O acúmulo de ID-RNAs é modificado pelatemperatura de incubação das plantas: a baixas temperaturas (18˚C) há inibição, enquanto aaltas temperaturas (30˚C) há incremento. Interessantemente, os ID-RNAs caracterizados para oisolado p105 de TSWV parecem ter influenciado negativamente o acúmulo das proteínas viraisNSm e N. O capítulo 3 apresenta o resultado de diversas estratégias para o desenvolvimento deum sistema de genética reversa para tospovírus em modelos vegetais in vivo e in vitro e modelosanimais in vitro (células de hamster e mosquito). Dentre as abordagens testadas, a expressãoheteróloga das proteínas N e L de TSWV em células de hamster foi capaz de reconhecer,replicar e transcrever em mRNA o gene-repórter mGFP4 presente em uma construção sintéticade mini-genoma tipo-DI-RNA. Curiosamente, a transfecção do mini-genoma apenas na presençada expressão heteróloga da proteína L também levou a atividade do gene-repórter. Demonstrouseainda que a adição a esse sistema de um plasmídeo dirigindo a transcrição do S RNA deTSWV foi capaz de retardar a expressão do gene-repórter. Adicionalmente, descobriu-se que atransfecção do segmento M de TSWV em orientação viral complementar foi capaz de aumentara atividade detectada para o gene-repórter hRLuc em um sistema de genética reversa paraBunyamwera virus. Foram também realizados ensaios de resgate de infecção de TSWV emcélulas de hamster e mosquito nos quais verificou-se a expressão da proteína NSs para umtratamento composto por um conjunto mínimo de plasmídeos dirigindo a transcrição dos trêssegmentos genômicos virais, sem a expressão heteróloga das proteínas N e L (hamster) e aocorrência de efeitos citopáticos caracterizados por mudanças morfológicas e formação desincícios celulares (mosquito). Os resultados qualitativos apresentados no capítulo 3 constituema primeira demonstração científica em toda a literatura científica de um sistema de genéticareversa funcional para TSWV baseado em atividade de mini-replicon. / The tospoviruses are important plant pathogens that causeconsiderable damage to many crops worldwide. The Tospovirus genus is part of the Bunyaviridaefamily of negative ssRNA viruses with tripartite genomes (L, M and S RNAs). Tospoviruses havea circulative-propagative interaction with their insect vectors. It is known that the presence ofDefective-Interfering RNAs (DI-RNAs) in an inoculum can alter the transmissibility of an isolateand interfere with symptom development attenuating it. This doctorate thesis adds to the list ofknown defective viral RNAs for tospoviruses the Imperfect-Dimer RNAs (ID-RNAs), which aredescribed in length in chapter one and chapter two regarding their molecular characterization,structural properties, the dynamics of their accumulation and their biological effects. ID-RNAs aredimer forms of the S RNA that carry in their junction sites a deletion at either the 3'UTR of the firstmonomer or the 5'UTR of the second monomer and are generated specifically in the infection ofthe plant host Nicotiana benthamiana. ID-RNAs were detected so far for Polygonum ringspotvirus (PolRSV) and TSWV. ID-RNA accumulation is modulated by temperature: low incubationtemperatures (18˚C) inhibit ID-RNA accumulation, whereas high incubation temperatures (30˚C)enhance it. The accumulation of ID-RNAs for TSWV isolate p105 had a negative effect over theprotein expression of the NSm and N viral proteins. Lastly, chapter 3 presents the results ofdiverse approaches that were tested for the development of a reverse genetics system fortospoviruses using in vivo and in vitro plant models and in vitro animal models (hamster andmosquito cell lines). In one of the approaches, the heterologous expression of the N and Lproteins of TSWV was carried out in hamster cells and was able to recognize, replicate andtranscribe the mRNA of the mGFP4 reporter-gene contained in a synthetic DI-RNA-like minigenome.Interestingly, the expression of only the L protein in association to the transfection of themini-genome also led to the reporter-gene activity. It was also shown that the transfection of aplasmid that drives the cytosolic transcription of the genomic S RNA in concert with theheterologous expression of the N and L proteins and the transfection of the reporter-carryingmini-genome had a delaying effect on the reporter-gene expression. Moreover, it is shown thatthe transfection of a plasmid driving the transcription of the M RNA from TSWV in viralcomplementary sense in the context of a Bunyamwera virus mini-replicon system promoted anenhancement of the activity of the reporter-gene hRLuc. Infectivity rescue assays were alsoperformed in both hamster and mosquito cells. Protein NSs expression was faintly detected forthe former in a treatment composed only of transcription plasmids for the L, M and S RNAs invirus complementary sense, without heterologous expression of the L and N proteins. For thelatter, cytopathological effects characterized by alteration of cell morphology and syncytiaformation were observed. Taken together, the qualitative results presented in chapter 3 constitutethe first efficient scientific demonstration of a reverse genetics system for tospovirus andrepresent an important hallmark of research for the genus Tospovirus.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016 / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2017-01-11T13:19:41Z No. of bitstreams: 1 2016_AndressaAbyFarajLinharesMaciel.pdf: 5427872 bytes, checksum: 6b21384554a80617808b4a89dbfb217a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-16T21:04:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AndressaAbyFarajLinharesMaciel.pdf: 5427872 bytes, checksum: 6b21384554a80617808b4a89dbfb217a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-16T21:04:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AndressaAbyFarajLinharesMaciel.pdf: 5427872 bytes, checksum: 6b21384554a80617808b4a89dbfb217a (MD5) / Introdução: A globulina carreadora de tiroxina (TBG) é a principal proteína transportadora dos hormônios tireoidianos em humanos. Anormalidades hereditárias que comprometem a estrutura e função da proteína resultam em deficiência completa (TBG-CD) e parcial de TBG (TBG-PD). O gene que codifica a TBG é o SERPINA7 e está localizado no braço longo do cromossomo X (Xq22.2). Objetivos: Os objetivos desse estudo foram realizar análise molecular do gene SERPINA7 em uma família brasileira com TBG-PD, investigar o padrão de inativação da região do cromossomo X que compreende o gene, bem como realizar modelagem estrutural da proteína mutante e análise estrutural comparativa à família de proteínas serpinas, a fim de inferir efeitos funcionais da mutação identificada. Métodos: O DNA genômico foi extraído do caso índice, do seu pai, da sua irmã gêmea dizigótica e seus dois irmãos. Reação de polimerização em cadeia (PCR) foi utilizada para amplificação do gene SERPINA7 e os produtos foram submetidos a sequenciamento pelo método Sanger. O padrão de inativação do cromossomo X foi avaliado no caso índice por meio da análise do padrão de metilação do gene que codifica o receptor androgênico (AR gene), que está localizado próximo do gene SERPINA7 (Xq11.2). Análises estruturais na família das serpinas foram feitas usando PFSTATS, que também foi usado para mapear posições equivalentes em todos homólogos humanos. A modelagem molecular foi realizada usando protocolo descrito por Feyfant e colaboradores. Resultados: Uma nova mutação missense no gene SERPINA7 (p.R35W) foi encontrada em heterozigose no caso índice e em hemizigose nos seus irmãos do sexo masculino. Eles apresentaram baixos níveis séricos de TBG compatíveis com TBG-PD. Esta mutação consistiu na substituição de um nucleotídeo (C>T) na posição 163 do éxon 1, que resultou na troca de uma arginina por um triptofano no códon 35 (p.R35W). O caso índice expressou uma razão de inativação do cromossomo X de 20:80. Na mutação, o carbono alfa do resíduo 35 encontrata-se a cerca de 17Å de distância do átomo mais próximo do T4, e este resíduo reside numa hélice, com a sua cadeia lateral de frente para o solvente. A Arg35 está também envolvida com interações eletrostáticas com os principais oxigênios das cadeias da Met264 e Asp261, e também do oxigênio do grupo carboxamida na Asn32 e ainda com duas moléculas de água. Os padrões de conservação e de correlação envolvendo este resíduo, pode ser visto que os resíduos mais frequentes nestas posições são as lisinas (26,7%), argininas (18,4%) e glutaminas (10,8%). Triptofanos, como na proteína mutante, são extremamente raros (0,1%) e não há significantes (p<10-10) correlações de emparelhamentos envolvendo resíduos nesta posição. Conclusão: O presente estudo relatou uma nova variante do gene SERPINA7 associada à TBG-PD em três irmãos: uma mulher e dois homens. O padrão de inativação do cromossomo X observado no caso índice aponta para um desvio do padrão de inativação, o que corrobora a variabilidade genótipo-fenótipo em mulheres com mutações heterozigóticas no gene SERPINA7, uma condição rara. A natureza hidrofóbica do triptofano poderia resultar em um fragmento apolar que estaria significativamente exposto ao solvente na proteína mutante podendo resultar em agregação da proteína e/ou enovelamento incorreto, e consequente defeito no transporte sérico de T4. Adicionalmente, esses achados sugerem que a TBG e seus homólogos dentro da família das serpinas poderiam ser igualmente afetados por mutações nesta posição rompendo a rede de interações com seus vizinhos na estrutura nativa, com provável impacto funcional. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Thyroxine-binding globulin (TBG) is the major human thyroid hormone transport protein. Inherited TBG abnormalities that implicated the protein’s structure and function result in complete (TBG-CD) and partial (TBG-PD) and TBG deficiency. The SERPINA7 gene encodes TBG and it is located on the long arm of the X chromosome (Xq22.2). Objectives: The purpose of this study was to perform the molecular analysis of the SERPINA7 gene in a Brazilian family with TBG-PD, investigate the X-chromosome inactivation pattern region comprising the gene as well as perform structural modeling of the mutant protein and comparative structural analysis of the serpin family of proteins, in order to infer functional effects of these mutations. Methods: Genomic DNA was extracted from the female proband, her father, her dizygotic twin sister and her two brothers. The samples were subjected to polymerase chain reaction (PCR) for SERPINA7 gene amplification and the products were sequenced by the Sanger method. The proband’s sample was evaluated by methylation analysis using the human androgen receptor (AR) gene, which is located next to the TBG gene (Xq11.2). Structural analysis of the serpin family was analyzed using PFSTATS and was also used to map equivalent positions in all human homologs. The molecular modeling was using the protocol described by Feyfant et al. Results: A novel missense mutation in the SERPINA7 gene (p.R35W) was found in heterozygosity in the proband and in hemizygosity in her brothers. They presented low serum TBG levels compatible with TBG-PD. This mutation consisted in a single nucleotide substitution (C>T) at position 163 of exon 1 which resulted in the replacement of an arginine by a tryptophan at codon 35. The proband expressed an Xchromosome inactivation ratio of 20:80. In this mutation, the alpha carbon of residue 35 is about 17Å away from the closest atom from T4 and this residue lies in a helix, with its side chain facing the solvent. Arg35 is also involved in electrostatic interactions with the main chain oxygens of Met264 and Asp261, and also the oxygen on the carboxamide group in Asn32, besides interacting with two waters molecules. The conservation and correlation patterns involving this residue, it can be seen that the most frequent residues in these positions are lysines (26.7%), arginines (18.4%) and glutamines (10.8%). Tryptophans are extremely rare (0.1%), and there is no significant (p<10-10) pairwise correlations involving residues in this position. Conclusion: This study reported a new variant of the SERPINA7 gene associated with TBG-PD in three siblings: one woman and two men. The X-chromosome inactivation pattern verified in the proband corroborated that deviations in the inactivation pattern account for genotype-phenotype variability in women with heterozygous mutations in the SERPINA7 gene, a rare condition. The hydrophobic nature of tryptophan would result in an apolar patch that would be significantly exposed to the solvent can result in protein aggregation and/or misfolding, and the consequent defect in the serum T4 transport. Additionally, these findings suggest that the TBG and its homologs in the serpin family could be similarly affected by mutations in this position which would disrupt the interaction network to its neighbors in the native structure, with probable functional impact.