Made available in DSpace on 2013-08-07T19:12:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000425616-Texto+Completo-0.pdf: 700521 bytes, checksum: 0b0a886f69479584d784bf6200b7110f (MD5) Previous issue date: 2009 / Natural hybridization among wild species is currently recognized as a sufficiently common process that it can present significant relevance in the evolutionary trajectory of the involved species. This process can be characterized by the occurrence of sporadic events between sympatric species, by the formation of narrow hybrid zones among taxa with parapatric distribution, or even by an extensive process of admixture between parental populations. Leopardus tigrinus and L. geoffroyi are two closely related species of small felids with essentially allopatric distributions in Neotropical Region. In the State of Rio Grande do Sul (RS), in southern Brazil, the two species present a geographic contact zone where we have previously identified the existence of a complex and extensive pattern of hybridization. To better understand the dynamics of this process, it is critical to combine the use of multiple approaches, including the assessment of different types of molecular markers, whose different sensitivity to demographic processes may illuminate the forces shaping this hybrid zone. The objective of this study was to develop new sequence-based nuclear markers that are informative for the investigation of this hybrid zone, aiming to characterize the ongoing admixture and to expand the knowledge on the magnitude and directionality of this process. Our final data set includes DNA sequences of seven different segments (five of them located on the X chromosome, and two on autosomes), which were analyzed along with 11 microsatellite loci in a sample of 68 individuals of both pure and hybrid origin. In addition to the L. tigrinus and L. geoffroyi samples, six L. colocolo samples were included for comparison. Through the use of haplotype networks and Bayesian admixture analyses it was possible to identify 48 hybrids, most of them originating from RS state. Nevertheless, the geographic breadth of the genetic gradient between the two species appears to indicate that the hybrid zone extends beyond RS state. Our results corroborate recent studies that reported the existence of ongoing hybridization between these species, and suggest a pattern of bidirectional and likely asymmetric genomic introgression. / A hibridação natural entre espécies selvagens é atualmente reconhecida como um processo bastante comum, que pode apresentar relevância significativa na trajetória evolutiva das espécies envolvidas. Este processo pode consistir de eventos esporádicos entre espécies simpátricas, ou da formação de zonas híbridas estreitas entre táxons com distribuição parapátrica, ou até mesmo de um intenso processo de miscigenação entre as populações parentais. Leopardus tigrinus e L. geoffroyi são duas espécies de pequenos felinos proximamente relacionados, com distribuições basicamente alopátricas na Região Neotropical. No Estado do Rio Grande do Sul (RS), as duas espécies apresentam uma zona de contato geográfico onde foi verificada a existência de um complexo e extenso padrão de hibridação. Este estudo tem como objetivo caracterizar novos marcadores nucleares a serem utilizados na investigação genética desta zona híbrida a fim de quantificar o processo de hibridação e ampliar os conhecimentos existentes sobre a magnitude e direcionalidade deste fenômeno. Para a realização deste trabalho foram utilizadas sequências de cinco locos localizados no cromossomo X e dois locos autossômicos, além de onze locos de microssatélites, em uma amostra total de 68 indivíduos, incluindo prováveis puros e híbridos. Além das amostras de L. tigrinus e L. geoffroyi, seis amostras de L. colocolo foram incluídas para fins de comparação. Através da construção de redes de haplótipos e de análises Bayesianas de alocação populacional dos indivíduos, foi possível identificar 48 híbridos, a maioria deles com procedência do RS. No entanto, a amplitude geográfica do gradiente genético entre as duas espécies parece indicar uma extensão da zona híbrida para além do estado do RS. Os resultados corroboram estudos recentes documentando a existência de um processo atual de hibridação entre estas espécies, e indicam a ocorrência de um padrão de introgressão genômica bidirecional e provavelmente assimétrico.

Made available in DSpace on 2013-10-11T13:36:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451413-Texto+Completo-0.pdf: 1438370 bytes, checksum: 1320e7640f2832d4355692836e95b936 (MD5) Previous issue date: 2013 / Hybridization in animal species has been observed with increasing frequency in nature, probably due to advances in molecular techniques, which have allowed accessing a wealth of information on the biology of living beings. The Neotropical felids Leopardus geoffroyi e L. tigrinus have essentially allopatric distributions, with a narrow contact zone that includes Rio Grande do Sul state, Brazil. Following initial suspicions raised by field studies, hybridization between these species was confirmed by the analysis of mitochondrial DNA and nuclear microsatellites (Trigo 2008). The main objective of this study was to clarify aspects related to hybridization and introgression between these species, including its symmetry and directionality, and also to test the application of multiple loci linked to the X chromosome to differentiate ancestral haplotype sharing from that resulting from the hybridization process. We selected 43 L. geoffroyi individuals and 38 L. tigrinus from regions that are near as well as outside the contact zone, in addition to six L. colocolo used as outgroups for comparison. Through the use of haplotype networks, it was possible to identify 38 hybrids, and based on shared haplotype blocks, we inferred that this number could reach more than 53 individuals. We observed bidirectional and quite asymmetric introgression between these species, corroborating the hypothesis that this is a current and complex hybridization process. In addition, an important result was the demonstration that the X chromosome segment analyzed here harbors sufficient information content to identify ancestral haplotypic blocks from each of the implicated species, opening up new avenues for in-depth genomic analyses targeting this hybridization process. / A hibridação entre espécies animais vem sendo observada cada vez mais frequentemente na natureza, devido provavelmente ao avanço das técnicas moleculares, que têm nos permitido acessar inúmeras informações previamente desconhecidas com relação à biologia dos seres vivos. Os felídeos Neotropicais Leopardus geoffroyi e L. tigrinus possuem sua distribuição essencialmente alopátrica, com uma estreita zona de contato que inclui o Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Após suspeita levantada em estudos de campo, a hibridação entre estas espécies foi confirmada com análises do DNA mitocondrial e microssatélites nucleares (Trigo 2008). O principal objetivo do presente trabalho é aprofundar a investigação dos processos de hibridação e introgressão entre estas duas espécies, incluindo aspectos como sua simetria e direcionalidade, bem como testar a viabilidade de utilização de múltiplos locos localizados no cromossomo X para diferenciar o compartilhamento de haplótipos por ancestralidade daquele resultante do processo de hibridação. Foram selecionados 43 indivíduos da espécie L. geoffroyi e 38 da espécie L. tigrinus, de regiões próximas (incluindo prováveis puros e híbridos) e também de regiões afastadas da zona de contato, além de seis L. colocolo utilizados como grupo externo para fins de comparação. Através da construção e análise de redes de haplótipos, foi possível identificar 38 híbridos, enquanto através da avaliação de blocos haplotípicos compartilhados, inferiu-se que este número pode chegar a mais de 53 indivíduos. Foi observada introgressão bidirecional e bastante assimétrica entre as espécies, corroborando a hipótese de que se trata de um processo atual e complexo em sua dinâmica. Além disso, um resultado importante deste estudo foi a demonstração de que o segmento analisado do cromossomo X apresenta poder informativo suficiente para identificar blocos haplotípicos ancestrais de cada uma das espécies envolvidas, o que abre caminho para análises genômicas mais aprofundadas deste processo de hibridação.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Cièncias da Saúde, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-10-13T15:04:38Z No. of bitstreams: 1 2014_LucasMouraViana.pdf: 1555497 bytes, checksum: 785c20525754655778fc10a098a4e2ee (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-12T10:32:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_LucasMouraViana.pdf: 1555497 bytes, checksum: 785c20525754655778fc10a098a4e2ee (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-12T10:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_LucasMouraViana.pdf: 1555497 bytes, checksum: 785c20525754655778fc10a098a4e2ee (MD5) / Introdução: Migrânea vestibular é caracterizada por vertigem episódica associada à enxaqueca e, em algumas famílias, é transmitida como herança autossômica dominante. Bahmad e colegas descreveram um locus no cromossomo 5 em uma família com vários portadores de Migrânea vestibular segregando de forma autossômica dominante, porém nenhuma mutação foi identificada. Objetivo: o objetivo deste estudo é descrever a análise genéticomolecular de uma família com vários portadores de migrânea vestibular. Materiais e métodos: 29 membros foram analisados clinicamente e 14 geneticamente, sendo 5 portadores da doença. Para identificar o gene responsável por essa condição nos vários membros dessa família, foi realizado o estudo de análise de ligação com o chip “Illumina Human Omni Express” versão 12v1_A. LOD scores foram calculados usando os programas Vitesse e linkmap. O sequenciamento do exoma foi realizado em 3 indivíduos afetados com o kit de captura da Nimblegen SeqCap EZ exome V3. O sequenciamento foi feito em um sequenciador Illumina GAIIX ou HiSeq 2000. Arquivos do tipo Fastq foram alinhados com novaoalign. Resultados: cálculos de análise de ligação multipontos, usando uma penetrância de 0.85, baseado na história familiar, e frequência de alelos determinados de membros não afetados da família, identificou um pico de LOD score de +2.9 entre rs6517577 e rs3169 no cromossomo 21. Sequenciamento do exoma identificou uma mutação missense no gene BACE 2 (rs149345353) encontrado neste locus. Os casos esporádicos não apresentaram a mesma mutação. Conclusão: Trata-se da primeira mutação descrita na literatura em portadores de Migrânea vestibular. A ausência da mutação nos indivíduos afetados esporadicamente sugere que nem todos os casos são transmitidos geneticamente ou uma heterogeneidade genética da doença. / Introduction: Familial Vestibular Migraine is characterized as episodic vertigo and migraine, and it is inherited as an autosomal dominant trait in some families. Bahmad et al have described a locus on chromosome 5 in a multigenerational family with many affected members, though no mutation has been described. Objective: the objective of this study is to describe the genetics analysis of a family with many affected members by Vestibular Migraine. Material and Methods: 29 members were clinically characterized and 14 had the genetics assessment (5 affected). To identify the gene related to that disease a linkage analysis was performed using the ‘Illumina Human Omni Express’ chip verion 12v1_A. LOD scores were calculated using the vitesse and linkmap software. Exome sequencing was done in 3 affected individuals with the Nimblegen SeqCap EZ exome V3 kit. Illumina GAIIX or HiSeq 2000 sequencer performed the sequencing. Fastq files were aligned with novoalign. Results: Multipoint linkage analysis, using a penetrance of 0.85 based on familiar history, identified a LOD score peak (+2.9) between rs6517577 and rs3169 on chromosome 21. Exome sequencing identified a missense mutation in BACE2 gene (rs149345353), which lies in that locus. The sporadic cases didn’t show the same mutation. Conclusion: This is the first mutation described in a family with vestibular migraine. The absence of the mutation in sporadic cases suggests that either might have a genetic heterogeneity or non-genetic causes for Vestibular Migraine.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013 / Submitted by Cristiane Mendes (mcristianem@gmail.com) on 2014-11-20T15:57:11Z No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-25T11:23:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T11:23:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_AdrianaRibeiroSilvaBatista.pdf: 1047867 bytes, checksum: 12e3ae6bf0f048123f1ab86e90f87883 (MD5) / Pepper ringspot virus (PepRSV) é um tobravírus, até o momento, detectado somente no Brasil, que destaca-se dentro do gênero por apresentar curiosa associação entre as partículas virais e mitocôndrias do hospedeiro. Os poucos avanços descritos desde a década de 60 aos dias atuais não foram suficientes para demonstrar o mecanismo físico-químico que explica essa relação. Na tentativa de ampliar o campo de estudo em PepRSV, buscou-se contruir um cDNA infeccioso visando o desenvolvimento de uma ferramenta capaz de expressar proteínas heterólogas ou induzir o silenciamento gênico: “virus induced gene silencing” (VIGS). Essa tecnologia visa a mesma aplicabilidade do cDNA infeccioso de Tobacco rattle virus (TRV), que já apresentou resultados significativos na indução de VIGS, contudo não pode ser utilizado livremente no Brasil, pois esse vírus é conhecido como praga quarentenária no País. Por essa razão, o uso de TRV em território brasileiro é restrito, principalmente pela dificuldade na obtenção de uma autorização de uso. O PepRSV apresenta genoma bipartido de RNA fita simples. Durante a obtenção do clone desse vírus a ser utilizado como ferramenta molecular, os dois segmentos completos do RNA genômico foram clonados em vetores plasmidiais comerciais (pGEM-T Easy; pCR4) e modificados, em seguida, com a adição do promotor 35S de Cauliflower mosaic virus (CaMV) na extremidade 5' e uma sequência de ribozima na região 3' do genoma de cada segmento. Além da construção dessa ferramenta, propõe-se avaliar a variabilidade do RNA2 de PepRSV, estudos que, atualmente, está restrito a um único isolado. Dois isolados de PepRSV (Pivo4 e Lavrinha) obtidos em campos de tomateiro no município de Luziânia do Estado de Goiás foram utilizados nesse estudo. O RNA2, segmento genômico destes isolados foi sequenciado. A análise filogenética baseada na comparação de sequências de aminoácidos (aa) da capa proteica dos três isolados (Pivo4, Lavrinha e CAM) de PepRSV não separou Pivo4 e Lavrinha do isolado CAM, pois a inferência do algoritmo correspondente bootstrap foi irrelevante. Os isolados obtidos foram semelhantes ao isolado CAM e apresentaram ORF para capa proteica (CP), mas não apresentaram homólogos das ORFs 2a e 2b presentes em isolados da espécie tipo TRV que pertence ao mesmo gênero. A comparação entre os três isolados sugere a presença de uma inserção a downstream a ORF do CP nos isolados Pivo4 e Lavrinha em relação ao isolado CAM e também uma recombinação na região 3' UTR entre as moléculas de RNA2 e RNA1 dessesisolados. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pepper ringspot virus is a Tobravirus until now detected only in Brazil. It is a peculiar virus due to the occurrence of a curious association between viral particles and their host mitochondria. From the 60's to the present day, no studies have been able to demonstrate the physicochemical mechanism underlying this relationship. In an attempt to broaden the studies on PepRSV, it was planned to construct na infectious cDNA clone to be used as a viral vector for expression of heterologous proteins or a virus induced gene silencing (VIGS) vector. It is proposed the construction of an infectious cDNA of PepRSV with a similar applicability of the Tobacco rattle virus (TRV) vector. It is already shown that this vector is useful in the induction of VIGS. The TRV vector cannot be used in Brazil, because it is a quarantine pest. Hence the use of TRV in Brazil is extremely limited, mainly due to the difficulty of obtaining a permission to use in the Brazilian territory. The virus has a bipartite genome of single strand RNA components. During the construction development, the two complete segments of the genome of PepRSV were cloned in plasmid vectors (pGEM-T Easy; pCR4) and modified to contain a promoter 35 of Cauliflower mosaic virus in the 5' end and a ribozyme sequence in the 3' region of the genome of each segment. Additionally to this construction for infectious clones, we propose to assess the variability of the PepRSV RNA2, which was restricted to a single isolate. Two PepRSV isolates (Pivo4 and Lavrinha) obtained in tomato fields in the county of Luziânia, Goiás State. The genome segment (RNA 2) of these isolates was sequenced. Phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of coat protein (CP) among three isolates did not separate those isolates in different ramifications due to lower bootstrap value. The isolates obtained were in agreement as CAM isolate for coat protein (CP) ORF feature, but do not showed homologous ORFs2a and 2b present in TRV isolates of the Tobravirus type species. By sequence comparison, Pivo4 and Lavrinha isolates had presentedlarge nucleotides insertion downstream of CP ORF as opposed to CAM isolate suggesting a recombination in 3'UTR between RNA1 and RNA2 of each isolate.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-27T12:41:51Z No. of bitstreams: 1 2012_MariaBeatrizWalterCosta.pdf: 4472250 bytes, checksum: aa1c67471c8a9327387daa575bc0ec6b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-03T13:34:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_MariaBeatrizWalterCosta.pdf: 4472250 bytes, checksum: aa1c67471c8a9327387daa575bc0ec6b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-03T13:34:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_MariaBeatrizWalterCosta.pdf: 4472250 bytes, checksum: aa1c67471c8a9327387daa575bc0ec6b (MD5) / O conhecimento sobre as intera cções moleculares entre anticorpos com a nidade a acidos nucl eicos e seus alvos ainda e muito limitado. Trabalhos anteriores do grupo de Imunologia Molecular da Universidade de Bras lia de busca em bancos de dados apon- tavam para uma prov avel tendência de reconhecimento de acidos nucl eicos dos anticorpos pertencentes a fam lia murina de imunoglobulina de cadeia vari avel pesada dez, ou VH10. Portanto, para melhor entender esse comportamento, decidiu-se analisar bibliotecas de regiões determinantes de complementaridade tr^es de cadeia pesada, CDR H3, em contextos das fam lias murinas VH10 e VH4, antes e ap os essas bibliotecas terem sido selecionadas contra DNA ta simples. Desta forma, procurou-se compreender o comportamento dessas duas fam lias e de certos determinantes da CDR H3 no reconhecimento de anticorpos a DNA. As bibliotecas de estudo foram submetidas a seq uenciamento de alto-desempenho, utilizando-se a metodologia Illumina, e foram ent~ao analisadas por meio de um pipeline de Bioinform atica. Esse pipeline consistiu na prepara c~ao das seq uências FASTQ recebidas e na an alise posterior, sendo esta ultima composta por estudos de variabilidade das bibliotecas, enriquecimento de seq uências ap os a sele ção contra DNA, divergência de Kullback-Leibler, compara ção de padrões e composi ção da CDR H3. A an alise revelou que a os padrões de seq uências selecionadas positivamente e negativamente são muito semelhantes em VH10, e que este arcabou co e menos estringente que VH4 em relação a exigir seq uências de CDR H3 mais espec cas a DNA. Portanto, concluiu-se que a fam lia VH10 apresenta tendência intr nseca a forma c~ao de anticorpos anti-DNA, o que não ocorre com a fam lia VH4. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / We still possess very little knowledge of the molecular interaction between anti-nucleic acids and their targets. Previous research in databases made by the Molecular Immunology group of the University of Brasilia has indicated a probable tendency of nucleic acids' recognition of the antibodies of the murine heavy chain immunoglobulin family ten, VH10. Therefore, to better understand this behaviour, we analysed libraries of heavy chain complementarity determinig region three, CDR H3, in the context of the murine families VH10 and VH4, before and after these libraries have been selected against DNA single strand. In this manner, we sought to understand the behaviour of these families and of certain CDR H3 features in the antibody's recognition of DNA. The libraries were submitted to deep-sequencing Illumina platform and then analysed by a Bioinformatics pipeline. The pipeline was comprised in the preparation of the FASTQ Illumina sequences and in an afterwards analysis, which consisted in studies of library variability, sequence enrichment, Kullback-Leibler divergence, pattern comparison and CDR H3 composition. Analysis revealed that the patterns of the positive and negative selected groups are similar in VH10 and that this framework is more stringent than VH4 in demanding CDR H3 sequences that are more DNA-speci c. Therefore, it was concluded that the VH10 family presents an intrinsic tendency to form anti-DNA antibodies, which does not occur with the VH4 family.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-10-30T11:49:25Z No. of bitstreams: 1 2012_HalianGoncalvesVilela.pdf: 6486879 bytes, checksum: 11419885aab290eed0434bfcace65b7b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-31T10:54:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_HalianGoncalvesVilela.pdf: 6486879 bytes, checksum: 11419885aab290eed0434bfcace65b7b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-31T10:54:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_HalianGoncalvesVilela.pdf: 6486879 bytes, checksum: 11419885aab290eed0434bfcace65b7b (MD5) / O Z-DNA é uma conformação alternativa da molécula de DNA envolvida na regulação da expressão gênica. Porém, a função específica desta estrutura no metabolismo celular ainda não foi totalmente elucidada. Este trabalho apresenta um fluxograma de análise que utiliza o ambiente R para investigar regiões potencialmente formadoras de Z-DNA (ZDRs) ao longo de genomas. Tal método combina a análise termodinâmica empregada pelo conhecido software Z-Catcher com a capacidade de manipulação de dados biológicos dos pacotes do Bioconductor. A metodologia desenvolvida foi aplicada no cromossomo 14 do genoma humano como estudo de caso e com isso foi possível estabelecer uma correlação entre as ZDRs e os sítios de início da trancrição (TSSs), que se mostrou de acordo com resultados de estudos anteriores. Além disso, foi possível demonstrar que ZDRs posicionadas no interior de genes tendem a ocorrer preferencialmente em introns ao invés de exons e que ZDRs à montante dos TSSs podem ter correlação positiva com estimulação da atividade da RNA polimerase. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Z-DNA is an alternative conformation of the DNA molecule implied in regulation of gene expression. However, the exact role of this structure in cell metabolism is not yet fully understood. Presented in this work is a novel Z-DNA analysis work ow which employs the R software environment to investigate Z-DNA forming regions (ZDRs) throughout genomes. It combines thermodynamic analysis of the well-known software Z-Catcher with biological data manipulation capabilities of several Bioconductor packages. The methodology was applied in the human chromosome 14 as a case study. With that, a correlation was established between ZDRs and transcription start sites (TSSs) which is in agreement with previous reports. In addition, the work ow was able to show that ZDRs which are positioned inside genes tend to occur in intronic sequences rather than exonic and that ZDRs upstream to TSSs may have a positive correlation with the up-regulation of RNA polymerase activity.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-11-28T12:00:31Z No. of bitstreams: 1 2012_ViniciusDanielFerreiraBatista.pdf: 1512646 bytes, checksum: e4fb096aa8b82d64fbc0c08c52e23512 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-12-03T14:18:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ViniciusDanielFerreiraBatista.pdf: 1512646 bytes, checksum: e4fb096aa8b82d64fbc0c08c52e23512 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-03T14:18:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ViniciusDanielFerreiraBatista.pdf: 1512646 bytes, checksum: e4fb096aa8b82d64fbc0c08c52e23512 (MD5) / O sistema de expressão Pichia pastoris tem sido utilizado com sucesso na produção de uma grande variedade de proteínas heterólogas. Esta levedura reúne características como fácil manipulação molecular, crescimento celular rápido, capacidade de realizar modificações pós-traducionais e secreção eficiente de proteínas, além de atingir altas densidades celulares com grande produção da proteína heteróloga. O objetivo deste estudo foi construir um vetor de expressão em P. pastoris para produção de proteína heteróloga, reunindo elementos genéticos que possibilitem a seleção de transformantes com multicópias integradas, buscando aumentar o nível de expressão. Nesse sentido, foi utilizado o vetor comercial pPICZαA (Invitrogen) que teve seu gene de resistência Sh ble substituído pelo gene kanR, derivado do transposon Tn 903, alterando a resistência ao antibiótico zeocina para o antibiótico G418. Elevadas concentrações deste antibiótico podem ser utilizadas para a seleção de clones com alto número de cópias integradas. Após troca da marca de seleção, foram clonados no vetor um promotor do gene constitutivo glicolítico PGK1 (PPGK1) de P. pastoris, um sinal de secreção fator α de acasalamento de Saccharomyces cerevisiae - com códons otimizados para P. pastoris - e um novo sítio múltiplo de clonagem. Para analisar a capacidade de produzir uma proteína heteróloga, o gene da pró-quimosina B de Bos taurus foi clonado no vetor e mostrou-se capaz de coagular leite no teste de atividade. Novos elementos genéticos podem ser clonados no vetor a fim de aumentar a frequência de integração genômica, como uma porção repetitiva do DNA de P. pastoris - que servirá como alvo da integração - e o gene defectivo leu2-d de S. cerevisiae para uso de marca auxotrófica. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Pichia pastoris expression system has been successfully used in the production of a wide variety of heterologous proteins. This yeast combines characteristics such as easy molecular handling, rapid cell growth, capacity to carry out post-translational modifications and efficient secretion. In addition, it can achieve high cell densities with high production of the heterologous protein. The aim of this study was to create a new P. pastoris vector using genetic elements that allow the selection of multicopy transformants aiming to increase heterologous expression. We used the commercial vector pPICZαA (Invitrogen) as a platform to replace the native Sh ble gene by kanR , derived from transposon Tn5, and, thus, changing antibiotic resistance from zeocin to G418. High concentrations of the former antibiotic can be used to select clones with high number of integrated copies. Next, we cloned the promoter of the constitutive glycolytic gene PGK1 (PPGK1) from P. pastoris, the α mating factor signal sequence of Saccharomyces cerevisiae - with codons optimized for P. pastoris - and a new multiple cloning site. To analyze the ability to produce a heterologous protein, the bovine chymosin B was cloned and successfully secreted as judged by milk coagulating test. Furthermore, we began the construction of a new vector based on the auxotrophic leu-2d marker from S. cerevisiae which should enable the selection of multiple events of integration in the genome of a LEU2-null strain of P. pastoris.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-11-13T22:24:33Z No. of bitstreams: 1 2006_Rosângela Vieira de Andrade.pdf: 1964649 bytes, checksum: 02d5cbead8298816e470ce3372c02313 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-02-25T23:59:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Rosângela Vieira de Andrade.pdf: 1964649 bytes, checksum: 02d5cbead8298816e470ce3372c02313 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-25T23:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Rosângela Vieira de Andrade.pdf: 1964649 bytes, checksum: 02d5cbead8298816e470ce3372c02313 (MD5) Previous issue date: 2006-06 / Paracoccidioides brasiliensis, um fungo dimórfico, termo-regulado, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica de alta prevalência na América Latina. Presume-se que a sua patogenicidade seja uma conseqüência do processo de diferenciação celular, da forma de micélio para a de levedura, que ocorre neste fungo durante a infecção humana. O presente trabalho iniciou-se com o Projeto Genoma Funcional e Diferencial do P. brasiliensis, no qual foram seqüenciadas 25.597 Expressed Sequence Tags (ESTs). Destas, 19.718 ESTs possuíam PHRED 20 e foram agrupadas em 6.022 grupos (genes), dos quais 2,655 eram contigs (grupos com mais de uma EST) e 3,367 eram singlets (grupos com apenas uma EST). Os 6,022 grupos representam aproximadamente 80% do genoma estimado deste fungo. Estes genes foram anotados e categorizados funcionalmente (MIPS) de acordo com o processo celular no qual estavam envolvidos: virulência (28 genes), genes potencialmente envolvidos em alvos para drogas (17 genes), vias de transdução sinal (37 genes), transportadores tipo MDR (multidrugs resistence) (20 genes), genes de choque térmico (48 genes) e estresse oxidativo (23 genes), entre outros. Genes diferencialmente expressos em células de micélio e levedura foram identificados usando duas metodologias de análises da expressão gênica em larga escala: subtração in silico e microarranjos de cDNA. A subtração in silico foi baseada no cálculo do número de ESTs de micélio e de levedura em cada contig. Contigs formados por 100% da mesma forma ou por um número maior de ESTs em uma das fases foram considerados diferencialmente expressos. Esta análise indicou 417 genes diferencialmente expressos, sendo 178 de micélio e 239 de levedura. Para os microarranjos de cDNA, 1.152 genes foram selecionados, sendo 565 contigs formados por 6 ou mais ESTs de micélio e levedura, 39 contigs formados por 2, 3, 4 ou 5 ESTs exclusivos de micélio ou levedura e 548 singlets que apresentavam anotação funcional. Nos microarranjos, os fragmentos de cDNA foram amplificados por PCR e hibridados com RNA total das duas formas. Destes genes, 328 mostraram-se diferencialmente expressos, sendo 58 de micélio e 270 de levedura. Estas duas estratégias identificaram 110 genes diferencialmente expressos em micélio e levedura. Dentre estes, foram selecionados para análise os genes classificados em três categorias MIPS. Na categoria metabolismo, foram selecionados 12 genes, sendo 5 (icdh, scs, tal, adk, udk) mais expressos em micélio e 7 (icl, acylcs, pdh, adh, papsr, aca, amt) mais expressos em levedura. Na categoria metabolismo e transporte de íons, foram selecionados 5 genes, sendo 2 (chs, ats) da via de síntese de novo de cisteína do metabolismo de enxofre e 3 (isc, ktp, pct) envolvidos no transporte de íons. Na categoria controle e organização celular - parede celular, membrana e citoesqueleto, foram selecionados 5 genes: ags, pcd, vrp bgl e hex. O caráter diferencial de todos estes genes foi confirmado por experimentos de northern blot. Estas análises mostraram que: células de micélio apresentam uma tendência para o metabolismo aeróbico enquanto um metabolismo anaeróbico é sugerido para as células de levedura; a super expressão em levedura dos genes que codificam as enzimas ATP sulfurilase, APS quinase, PAPS redutase e coline sulfatase, pertencentes ao metabolismo de enxofre, mostram a importância do enxofre orgânico para os processos de crescimento e diferenciação deste patógeno; a expressão diferencial de genes envolvidos na organização celular é essenciais para o processo de diferenciação celular, virulência e conseqüentemente patogenicidade de P. brasiliensis. Neste contexto, o conjunto das informações geradas neste trabalho fornece novos caminhos para o entendimento da transição dimórfica do P. brasiliensis, bem como identifica novos genes importantes para a virulência/patogenicidade deste fungo, que constituem potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-11-19T11:12:03Z No. of bitstreams: 1 2006_Saulo José Linhares de Siqueira.pdf: 1655265 bytes, checksum: 8e88bcc077de7db3a8c96fb0dd47d4ce (MD5) / Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2010-03-17T15:59:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Saulo José Linhares de Siqueira.pdf: 1655265 bytes, checksum: 8e88bcc077de7db3a8c96fb0dd47d4ce (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-17T15:59:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Saulo José Linhares de Siqueira.pdf: 1655265 bytes, checksum: 8e88bcc077de7db3a8c96fb0dd47d4ce (MD5) Previous issue date: 2006-03 / Humicola grisea var. thermoidea é um fungo termofílico que apresenta um sistema celulolítico com potencial para aplicação em processos de degradação de material lignocelulósico para produção de etanol. O crescente interesse nesse combustível e a abundância de materiais lignocelulósicos que podem ser usados como matéria-prima (como rejeitos agrícolas) fez aumentar o interesse no estudo de celulases. A expressão de celulases em S. cerevisiae é interessante pois esse microrganismo pode ser utilizado diretamente em processos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) para produção de etanol. Anteriormente os cDNA da cbh1.2 e bgl4 de H. grisea var. thermoidea foram expressos em levedura. Neste trabalho o cDNA do gene de egl2 desse fungo foi amplificado por RT-PCR e clonado no vetor de expressão pAAH5 de Saccharomyces cerevisiae. Este vetor foi utilizado para transformar a linhagem MFL de S. cerevisae com genótipo leu2-. A atividade enzimática dos transformantes foi detectada por ensaio com Congo Red em placas contendo carboximetilcelulose (CMC) como substrato. A endoglicanase 2 de H. grisea var. thermoidea foi expressa em S. cerevisiae sob controle do promotor ADH1 e a levedura produziu a enzima em sua forma ativa. A enzima EGL2 recombinante possui massa molecular de 55 kDa e sua atividade enzimática foi caracterizada. Essa enzima apresentou atividade ótima em pH 5,0 e em temperaturas entre 50 e 60° C. EGL2 manteve aproximadamente 80% de sua atividade após pré-incubação a 50 °C por 6 horas, mostrando-se estável nessa temperatura. A enzima apresentou atividade sobre papel de filtro e atividade significativa sobre celulose microcristalina. Esta enzima foi capaz de hidrolisar o substrato sintético MUC, indicando que a enzima tem atividade sobre pequenos celo-oligossacarídeos. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Humicola grisea var. thermoidea is a thermophilic fungus that produces high levels of cellulases which has high potential for use in lignocellulose degradation for ethanol production. With the increasing interest on this fuel and the amount of lignocellulosic wastes that can be used as raw material, new cellulases are characterized each day. Strains of S. cerevisiae expressing cellulases can be used in simultaneous saccharification and fermentation process (SSF) for ethanol production. Previously, cbh1.2 and bgl4 cDNAs from H. grisea var. thermoidea was expressed in yeast. In this work, egl2 cDNA from this fungus was obtained by RT-PCR and inserted into a Saccharomyces cerevisiae expression vector. The resulting molecular construction was introduced into a leu2 S. cerevisiae strain. Enzymatic activity in the transformants were detected by the Congo red assay using carboxymethil cellulose (CMC) as substrate. Endoglucanase 2 from H. grisea var. thermoidea was expressed in S. cerevisiae under the control of ADH1 promoter and the enzyme was in its active form. Recombinant EGL2 presented a molecular mass of 55 kDa. This enzyme has an optimal pH of 5.0 and optimal temperatures between 50 and 60 °C. Recombinant EGL2 retained 80% of the initial activity after incubation at 50 °C up to 6 hours. The enzyme showed high activity toward filter paper and significantly activity toward microcrystalline cellulose. The activity toward the synthetic substrate MUC was observed, indicating that this enzyme can hydrolize small cellooligosaccharides.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by samara castro (sammy_roberta7@hotmail.com) on 2010-10-24T17:57:02Z No. of bitstreams: 1 2006-Gina Camilo de Oliveira.pdf: 655367 bytes, checksum: 40e91312e15ca06d389e0b1649a314b9 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-10-27T23:55:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006-Gina Camilo de Oliveira.pdf: 655367 bytes, checksum: 40e91312e15ca06d389e0b1649a314b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T23:55:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006-Gina Camilo de Oliveira.pdf: 655367 bytes, checksum: 40e91312e15ca06d389e0b1649a314b9 (MD5) / O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica e endêmica na América Latina. Estima-se que 10 milhões de indivíduos estejam infectados, mas apenas 2% desenvolvem a doença. A forma miceliana encontrada na natureza constitui a fase infectiva que diferencia para a forma de levedura no pulmão humano estabelecendo a infecção. O fungo promove uma resposta imunitária mediada por células e uma resposta inflamatória no pulmão. Os macrófagos são células efetoras do sistema imunitário que reconhecem e eliminam patógenos invasores. Inicialmente identificada como uma citocina de linfócitos T, o fator inibitório de macrófago (MIF) é também uma citocina do macrófago e atua como um importante mediador da inflamação, devido às suas características imunomodulatórias. MIF apresenta atividade enzimática de tautomerase, conferida pelo aminoácido Prolina conservado na posição 2 e também tem uma participação importante no ciclo celular por meio da inibição da apoptose ao inativar p53. O Projeto Genoma Funcional e Diferencial de P. brasiliensis realizado no Laboratório de Biologia Molecular da Universidade de Brasília junto à Rede Genoma Centro-Oeste permitiu a geração de ESTs (do inglês “Expressed Sequence Tags”) a partir de bibliotecas de cDNA das formas de micélio e levedura de P. brasiliensis. Não há relatos na literatura de homólogos de MIF em fungos, porém, no genoma do P. brasiliensis foi descrito uma seqüência que possui similaridade gênica significativa com o MIF de mamíferos, indicando um envolvimento potencial na patogênese do P .brasiliensis. O fragmento encontrado (contig 1528: pbmif) é de aproximadamente 400 pares de bases, diferencialmente expresso na fase de levedura de P.brasiliensis. MIF é uma proteína que possui homólogos em plantas, nematóides e vertebrados. O objetivo desse trabalho é identificar e caracterizar possíveis clones de cDNA (PbMIF) homólogos a MIF isolado da biblioteca de P. brasiliensis. Um clone de cDNA de MIF foi seqüenciado e identificado como similar a MIF humano. A expressão do mRNA é diferencial em levedura, como detectado por Northern Blot. A sequência de aminoácidos de MIF do P. brasiliensis tem similaridade de 56% (32% de identidade) com o MIF de Mus musculus. Para a produção da proteína recombinante em Escherichia coli, o cDNA de MIF foi clonado no vetor de expressão (pET21). A detecção e caracterização de um homólogo de fator inibitório de macrófago (MIF) no P. brasiliensis é um relato inédito descrito em fungos e o papel de MIF mimetizando uma citocina pode revelar novos fatores de virulência para a infecção pelo P. brasiliensis. Portanto, pela coevolução com o sistema imunitário, patógenos poderiam desenvolver relevantes estratégias para evasão das defesas do hospedeiro desenvolvendo moléculas homólogas a citocinas, como seria o caso do MIF de P. brasiliensis. O papel do MIF de P.brasiliensis é desconhecido, assim sua caracterização favorecerá o desenvolvimento de informações sobre o mecanismo de patogenicidade do fungo . _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a fungal disease that is endemic in Latin America. This infection affects 10 million individuals but only 2% develop the disease. The mycelia found in nature constitute the infective phase that differentiates to yeast form in the human lungs to establish the infection. The fungus promotes a cell mediated immune and inflammatory pulmonary response. Macrophages are pivotal effector cells of the innate immune system, recognizing and eliminating invasive microbial pathogens. Initially identified as a T-cell cytokine, the Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) is also a macrophage cytokine and an important mediator of inflammation, it has immunomodulatory characteristics. MIF has enzymatic activity relationed to the Nterminal proline residue in the position 2 and MIF can inhibit apoptosis through the inactivity of p53. From the project “Functional and Differential Genome of P. brasiliensis” ESTs (Expressed Sequence tags) database we discover a putative fungi homologue to the mammalian MIF. There are no previous reports in the literature of MIF homologues in fungi, however the sequence described in the genome of P. brasiliensis has sequence similarity to MIF genes found in animal, nematode and plant. The aim of this work is to investigate the gene encoded by the Pb MIF homolog in order to characterize its coding sequence and predicted polypeptide and characterize the differential expression. A MIF related cDNA clone was fully sequenced and the predicted MIF homolog was identified. The mRNA expression is restricted to the yeast form, as detected by Northern Blot. Sequence analysis indicated that the predicted amino acid sequence has a similarity of 56% (32% identical) with the MIF of Mus musculus. The Pb MIF CDS (coding sequence) was subcloned into bacterial expression vector (pET21) fused to a histidine tag. This CDS was expressed in Escherichia coli to produce recombinant protein. We have detected and characterized a Pb MIF putative homolog. This is the first report of a MIF homolog among fungi and its role as a cytokine mimetic may reveal new virulent factors for P. brasiliensis infection. During the co-evolution with immune system, pathogens must had developed relevant strategies of evasion of host response. Though incorporating cytokines homologs may be a successful strategy for P. brasiliensis infection. The Pb MIF homolog may be part of an unknown strategy for P. brasiliensis survival inside the mammalian host.