Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-07T16:46:59Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7523105 bytes, checksum: a1b40bb2fc7f6707988b2c59b1367cc4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-07T16:46:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7523105 bytes, checksum: a1b40bb2fc7f6707988b2c59b1367cc4 (MD5) Previous issue date: 2015-03-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho foi construída uma biblioteca metagenômica a partir de um consórcio microbiano termofílico com aproximadamente 135.000 clones, abrigando cerca de 3,5 Gpb de DNA metagenômico. Essa biblioteca foi construída com o objetivo de identificar genes que codificam enzimas lignocelulolíticas para serem expressos na levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). De 6.720 clones analisados (5 % do total), foram obtidos 182 hits positivos para atividades de celulases, xilanases e β-glicosidases, com seleção e sequenciamento de 30 fosmídeos que deram origem à identificação de 34 ORFs codificando para enzimas glicosil hidrolases, relacionadas com a hidrólise de celulose e hemicelulose. Paralelo à construção da biblioteca, foi obtido uma linhagem de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3) mutante (ura3 ̄ ). Pela primeira vez nesta levedura a deleção deste gene foi realizada utilizando-se a técnica split-marker, com seleção dos mutantes primeiramente em placas contendo geneticina e, posteriormente, associados à seleção em placas contendo ácido 5-fluorótico (5-FOA). Os resultados apresentados mostram que esta técnica de deleção pode ser eficientemente empregada para K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), mesmo levando-se em conta a diploidia desta linhagem. A partir da obtenção do mutante ura3 ̄ , deu-se a construção do vetor pKmLPG para ser usado como sistema de expressão para essa levedura, uma vez que a marca de seleção contida neste vetor é o gene URA3. A característica diferencial e promissora deste sistema de expressão é o uso da sequência do promotor do gene que codifica a enzima endo-polygalacturonase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). A confirmação do vetor pKmLPG será realizada por sequenciamento. Sem essa confirmação, utilizou-se então o vetor de expressão pKMCL para clonagem de três genes de β-glicosidase isolados a partir da biblioteca fosmidial na levedura K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). O vetor pKMCL é derivado do vetor de expressão pKLAC2 de K. lactis e utiliza a marca de seleção que confere resistência ao antibiótico geneticina. Por realização de teste enzimático dos transformantes em meio sólido, observou-se a presença de atividade extracelular de β-glicosidase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3). Com o genoma desta levedura anotado, foi possível identificar o gene, e juntamente com os demais genes de β-glicosidase (P3Gli, P8Gli e P9Gli), foram preditas as estruturas tri-dimensionais dessas proteínas. A confirmação dos transformantes para os genes P3Gli, P8Gli e P9Gli foi realizada por PCR, e atividade de β-glicosidase foi detectada tanto no sobrenadante extracelular quanto na região do periplasma em oito das nove cepas transformantes analisadas. Os resultados de expressão heteróloga de β-glicosidades em K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) mostram que esta linhagem pode ser usada como hospedeira na expressão de diferentes genes lignocelulolíticos, com expectativa de uso das linhagens recombinantes capazes de secretar celulases visando a produção de etanol celulósico. / A metagenomic library harboring around 3,5 Gpb was constructed from a thermophilic microbial consortium. The aim of this library was to identify genes coding lignocellulolytic enzymes that could be expressed in the yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). In total, 6,720 clones (5% of all clones) were analysed and 182 positive hits were found for cellulases, xylanases and β-glucosidases. The sequencing of 30 selected fosmids resulted in the identification of 34 putative open reading frames (ORFs) coding glycoside hydrolases involved with cellulose and hemicellulose degradation. Simultaneously, a defective mutant strain of K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) for gene ura3 was obtained. The gene was deleted by using, for the first time in this yeast, the split- marker technique that consisted in a first selection of mutants in solid medium with the antibiotic geneticin followed by a second selection in the presence of 5- Fluoroorotic Acid. The results presented here demonstrated the efficiency of the split-marker technique in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), even though this is a diploid strain. Once the ura3 - was obtained, the vector pKmLPG was constructed using the URA3 as a marker gene in order to have an expression system for the ura3 - mutant strain. The differential and promising feature of this vector lies in the presence of the promoter sequence of the gene coding an endo-polygalacturonase enzyme from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). The confirmation of the correct vector construction will be performed by sequencing. In order to express genes isolated from the metagenomic library in the yeast K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) three genes coding β-glucosidase were cloned onto the vector pKMCL. This vector is derived from pKLAC2 of Kluyveromyces lactis and it uses the resistance gene for the antibiotic geneticin as a marker. Extracellular activity of endogenous β- glucosidase from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) was detected by enzymatic assay in solid medium during the analyses of transformants, and based in the annotated genome of this yeast, was possible to identify the β-glucosidase gene. The three dimensional structure of the endogenous protein as well from those codified by the β-glucosidase genes (P3Gli, P8Gli and P9Gli) were predicted. The confirmation of transformants for the cloned genes P3Gli, P8Gli and P9Gli was done by PCR, and the β-glucosidase activity was detected in both extracelllular supernatant and periplasm region in eight of nine transformants analysed. Results of heterologous expression of β-glucosidase in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) demonstrated that this strain can be used as a host for expression of various lignocellulolytic genes, with the expectation to use recombinant yeast strains capable to secret celulases targeting the production of cellulosic etanol. / Tese liberada do Sigilo pelo departamento em 04-04-2017, ver arquivo

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-09-01T12:19:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5085059 bytes, checksum: 103de3ea07839366dccf5fcbeba75d90 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T12:19:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5085059 bytes, checksum: 103de3ea07839366dccf5fcbeba75d90 (MD5) Previous issue date: 2017-02-06 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Begomovírus bipartidos (Familía Geminiviridae) - grupo de vírus de DNA que se replica no núcleo de células infectadas – codifcam a proteína de movimento NSP (nuclear shuttle protein) que facilita a translocação do DNA viral do núcleo para o citoplasma, através dos poros nucleares. O tráfego intracelular do complexo NSP- DNA é assessorado pela proteína NIG (NSP-interacting GTPase), localizada no compartimento citoplasmático celular. Nesta investigação, é descrita a caracterização de AtWWP1, uma proteína dotada de dois domínios WW, identificada por sua interação com NIG. No capítulo II foi demonstrado que AtWWP1 forma corpos nucleares (NBs) por meio de seu domínio WW e é capaz de relocar NIG do citoplasma para o núcleo, confinando-a em corpos nucleares. Portanto, a interação AtWWP1-NIG, mediada pelo domínio WW de AtWWP1, pode interferir com o papel pro-viral de NIG durante a infecção o qual é associado à sua localização citoplasmática. Consistente com essa hipótese, a perda de função de AtWWP1 em Arabidopsis resulta em aumento de suscetibilidade em resposta à infecção por begomovírus, ao passo que a superexpressão de AtWWP1 confere tolerância à infecção viral. Entretanto, a função antiviral de AtWWP1-NB pode ser antagonizada durante a infecção viral, uma vez que foi observado um decréscimo ou desorganização dos corpos nucleares de AtWWP1 em células infectadas. Os dados apresentados no capítulo II demonstraram que AtWWP1 se organiza em estruturas subnucleares as quais conferem imunidade intrínseca contra infecção por begomovírus. Contudo, a função molecular dos corpos nucleares de AtWWP1 não foi elucidada. No capítulo III, foi demonstrado que AtWWP1 co-localiza em corpos nucleares com a proteína CDKC2, cuja função celular é associada à transcrição e processamento de RNA. CDKC2 modula o estado de fosforilação do domínio C- terminal da RNA polimerase II (CTD-RNAPII). Foi demonstrado que AtWWP1 também interage com CTD-RNAPII em NBs. Os corpos nucleares de AtWWP1 foram desfeitos ou reorganizados em corpos nucleares maiores após tratamentos com inibidores de transcrição e fosforilação; tal comportamento se assemelha ao observado em CDKC2-NBs, cuja organização dinâmica dos corpos nucleares depende do status transcricional da célula. Como evidência adicional de seu papel na transcrição celular, foi demonstrado que AtWWP1 possui capacidade de ligação a DNA e que seus NBs estão associados à região de eucromatina. Consistente com os resultados previamente obtidos, a alteração nos níveis transcricionais de AtWWP1 em linhagens transgênicas resultou no enriquecimento de fatores de transcrição diferencialmente expressos. Coletivamente, os dados obtidos neste trabalho demonstram que AtWWP1 forma corpos nucleares correspondentes a sítios ativos de expressão gênica ou de processamento de RNA acoplado à transcrição. / As DNA viruses, which replicate in the nucleus of infected cells, the bipartite begomoviruses (Geminiviridae family) encode the nuclear shuttle protein to facilitate the translocation of viral DNA from the nucleus to the cytoplasm via nuclear pores. This intracellular trafficking of NSP-DNA complexes is accessorized by the NSP- interacting GTPase (NIG) at the cytosolic side. Here, we report the characterization of AtWWP1, a WW domain-containing protein, identified as a NIG partner. In the chapter II, we demonstrated that AtWWP1 forms nuclear bodies (NBs) via its WW domains and relocates NIG from the cytoplasm to the nucleus where it is confined to AtWWP1-NBs.Therefore, the NIG-AtWWP1 interaction, which also occurs via the WW domains, may interfere with the NIG pro-viral function that is associated with its cytosolic localization. Consistent with this hypothesis, loss of AtWWP1 function debilitates further the plant upon begomovirus infection and overexpression of AtWWP1 confers tolerance to begomovirus. The antiviral function of AtWWP1-NBs, however, may be antagonized by viral infection, which was demonstrated to induce either a decrease in the number or disruption of AtWWP1-NBs. Our data established that AtWWP1 organizes nuclear structures as nuclear foci, which provide intrinsic immunity against begomovirus infection. Nevertheless, the underlying biochemical function of these AtWWP1-NBs has yet to be elucidated. In Chapter III, we demonstrated that AtWWP1-NB co-localizes with CDKC;2-NB, which has been shown to be involved in transcription and RNA processing. Like CDKC2, which modulates the phosphorylation status of RNA polymerase II C-terminal domain (CTD-RNA pol II), we showed that AtWWP1 interacts with CTD-RNA pol II within NBs. AtWWP1-NBs were disintegrated into diffuse pattern or converted to larger structures upon treatment with transcriptional inhibitors, a feature that resembles the CDKC2-NB dynamic organization, which depends on the transcriptional status of the cells. As further evidence for a role in transcription, we also demonstrated that AtWWP1 displays DNA binding activity and AtWWP1-NBs associate with active chromatin regions. Accordingly, the manipulation of the AtWWP1 levels promoted an enrichment of differentially expressed transcriptional factors in transgenic lines. Collectively, our data establish that the nuclear bodies formed by AtWWP1 are associated with active gene expression or co-transcriptional RNA processing. / Os anexos impressos estão na ordem invertida em relação à versão digital, mas não compromete o conteúdo.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-09-01T16:06:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 16381046 bytes, checksum: 744e0d70d25cc43dd4482fbf751a1c8c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T16:06:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 16381046 bytes, checksum: 744e0d70d25cc43dd4482fbf751a1c8c (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A emergência dos begomovírus (virus transmitidos por mosca-branca classificados no gênero Begomovirus, família Geminiviridae) no Brasil provavelmente ocorreu pela transferéncia horizontal de vírus presentes em plantas não-cultivadas após a introdução da Bemisia tabaci MEAMl. Recentemente, Euphorbia yellow mosaic alphasatellite (EuYMA) foi encontrado em associação com Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV) infectando Euphorbia heterophylla, uma importante invasora na cultura da soja no Brasil. A variabilidade genética e a estrutura da população de begomovírus infectando E. heterophylla, e novas ocorrências de EuYMA, foram investigados em amostras coletadas em nove estados Brasileiros entre 2009 e 2014. Apenas EuYMV foi detectado (com uma exceção), e um total de 158 e 57 haplótipos foram comparados em conjuntos de dados correspondentes ao DNA-A e DNA-B, respectivamente. EuYMA foi detectado em apenas seis amostras coletadas nos estados do Rio Grande do Sul e Paraná. Comparado com populações de outros begomovírus, o EuYMV possui um menor grau de variabilidade genética, e poucos eventos de recombinação intraespecíficos. Analise de componentes principais permitiu a diferenciação de seis subpopulações virais de acordo com os locais de amostragem, corroborando as análises filogenéticas. Os polimorfismos de 23 sitios que mais contribuiram para a estrutura geografica foram descritos como suficientemente informativos para discriminar entre as subpopulações virais. A caracterização biológica e molecular da associação do alfassatélite EuYMA com o EuYMV foi realizada após a construção de clones infeciosos de ambos os agentes. Diferenças fenotípicas na infecção por EuYMV na presença do EuYMA foram observadas em Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana e E. heterophylla. Ensaios de transmissão indicaram que o EuYMA afeta negativamente a transmissão de EuYMV por Bemisia tabaci MEAMl. Em conjunto, os resultados indicam que o EuYMV apresenta menor grau de variabilidade genética comparado a outros begomovírus que infectam plantas cultivadas e não-cultivadas no Brasil, porém, similar ao descrito para outros begomovírus, segrega de acordo com o local de amostragem. Além disso, o EuYMA é capaz de modular os sintomas, o acúmulo Viral e a transmissão pela mosca-branca no contexto da infecção pelo EuYMV, potencialmente interferindo na disseminação do vírus no campo. / The emergence of begomoviruses (whitefly-transmitted viruses classified in the genus Begomovirus, family Geminiviridae) in Brazil probably occurred by horizontal transfer of viruses infecting non-cultivated plants after the introduction of Bemisia tabaci MEAMl. Recently, Euphorbia yellow mosaic alphasatellite (EuYMA) was found in association with Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV) infecting Euphorbia heterophylla, an important invasive species in soybean and other crops in Brazil. We assessed the genetic variability and population structure of begomoviruses infecting E. heterophylla, and the geographical range of alphasatellites in samples collected throughout nine Brazilian states from 2009 to 2014. Only EuYMV was detected (with one exception), and a total of 158 and 57 haplotypes were compared in DNA-A and DNA-B datasets, respectively. EuYMA was detected in only six samples collected in the states of Rio Grande do Sul and Paraná. Compared with other begomoviruses, EuYMV has a low degree of genetic variation, and few intraspecific recombination events. The application of principal component analysis allowed the differentiation of six viral subpopulations according to sampling locations, in agreement with phylogenetic analysis. The polymorphisms of 23 sites that mostly contributed to the geographical structure were shown to hold supporting information to discriminate between the viral subpopulations. Biological and molecular aspects of the association between the alphasatellite EuYMA and EuYMV were studied following the construction of infectious clones of both agents. Phenotypic differences of EuYMV infection in the presence of EuYMA were observed in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and E. heterophylla. Transmission assays indicated that EuYMA negatively affects the transmission of EuYMV by Bemisia tabaci MEAMl. Together, the results indicate that EuYMV displays a lower degree of genetic variation compared to other begomoviruses infecting cultivated and non-cultivated plants in Brazil but, similar to other begomoviruses, segregates according to sampling location, and that EuYMA is capable of modulating symptoms, Viral accumulation and whitefly transmission of EuYMV, potentially interfering with Virus dissemination in the field.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-09-01T16:34:42Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 480210 bytes, checksum: 50d18bd67c0f2b08ed0c2edff62365e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T16:34:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 480210 bytes, checksum: 50d18bd67c0f2b08ed0c2edff62365e4 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O fungo fitopatogênico Corynespora cassiicola (Berk. & M. A. Curtis) C. T. Wei é uma espécie cosmopolita com relatos de ocorrência em folhas, hastes e raízes em diversas espécies de plantas, sendo frequentemente associada como agente causal da mancha alvo em diferentes espécies de importância agronômica. Este estudo analisou uma coleção de 32 isolados de C. cassiicola, obtidos de diferentes hospedeiros e locais no Brasil. Sete genes nucleares e um gene mitocondrial foram parcialmente sequenciados e analisados de modo a explorar as relações filogenéticas e filogeográficas entre os isolados e verificar se existe associação entre o gene precursor da toxina produzida pelo fungo, a cassiicolina, e as linhagens encontradas. Adicionalmente, a presença de mutações pontuais independentes – E198A, F200Y e G143A – que conferem resistência a fungicidas foram investigadas. Os isolados se agruparam em três linhagens. A distribuição dos isolados entre as linhagens não esteve associada a hospedeiro ou origem geográfica dos isolados. Isolados da coleção contêm uma de quatro possíveis isoformas da cassiicolina. Em geral, associação entre as isoformas e clados filogenéticos foi ausente. As três mutações pontuais que conferem resistência a fungicidas estão presentes (sozinhas ou combinadas) em oito isolados. Duas dessas mutações (E198A e F200Y) nunca haviam sido identificadas em isolados de C. cassiicola. As evidências de variabilidade genética entre os isolados e a ocorrência de três mutações pontuais independentes, em conjunto com o hábito polífago de C. cassiicola, comprometem as atuais práticas de manejo da doença na agricultura brasileira. As informações obtidas neste estudo poderão ser úteis em análises ecológicas e epidemiológicas de C. cassiicola, bem como no desenvolvimento de medidas de manejo da mancha alvo. / The plant pathogenic fungus Corynespora cassiicola (Berk. & M. A. Curtis) C. T. Wei is a cosmopolitan species with reports of occurrence in leaves, stems and roots in several plant species, being frequently associated as the causal agent of the target spot in different plant species of agronomic importance. This study analyzed a collection of 32 isolates of C. cassiicola obtained from different hosts and locations in Brazil. Seven nuclear genes and a mitochondrial gene were partially sequenced and analyzed in order to explore the phylogenetic and phylogeographic relationships among the isolates and to verify if there is an association between the precursor gene of the toxin produced by the fungus, the cassiicolin, and the lineages we found. Additionally, the presence of independent point mutations - E198A, F200Y and G143A - that confer resistance to fungicides were investigated. The isolates were grouped into three lineages. The distribution of the isolates between the lineages was neither associated with host nor geographical origin of the isolates. The isolates of the collection contain one of four possible cassiicolin isoforms. In general, association between isoforms and phylogenetic clades was absent. The three point mutations that confer resistance to fungicides were present (alone or in combination) in eight isolates. Two of these mutations (E198A and F200Y) had never been identified in isolates of C. cassiicola. The evidence of genetic variability among the isolates and the occurrence of three independent point mutations, along with the polyphagous habit of C. cassiicola, compromise the current disease management practices in the Brazilian agriculture. Therefore, the information generated may be useful in ecological and epidemiological analysis of C. cassiicola, as well as in the development of management measures against the target spot.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-01-16T15:52:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1839879 bytes, checksum: d2c436aff7b853ecf204a948d2c41ebc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-16T15:52:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1839879 bytes, checksum: d2c436aff7b853ecf204a948d2c41ebc (MD5) Previous issue date: 2017-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O setor da agroindústria representa a maior fração das divisas na economia brasileira. No entanto, as culturas agronômicas estão sujeitas aos estresses do meio ambiente, incluindo os estresses bióticos (causados por microrganismos, herbívoros ou vírus) e abióticos (disponibilidade de água, nutrientes, presença de agentes estressantes no solo, etc) e eventos de desenvolvimento, como a senescência. No caso de defesa a estresses múltiplos, as plantas ativam uma via de sinalização de morte celular programada (PCD, programmed cell death) mediada pelos fatores de transcrição GmNAC081 e GmNAC030 que pertencem a uma grande família de transfatores específicos de plantas. Foi observado que GmNAC081 está envolvido com o processo de senescência natural e seu silenciamento retarda a senescência foliar e atenua os demais sintomas decorrentes da morte celular programada; porém, o mecanismo bioquímico envolvido não foi totalmente elucidado. Nesta investigação, foi explorada uma abordagem de genômica funcional para avaliar o mecanismo pelo qual GmNAC081 está envolvido em senescência, bem como o efeito da expressão ectópica de GmNAC081 durante o déficit hídrico. As linhagens transgênicas superexpressando o gene GmNAC081 senesceram mais rápido do que as plantas não transformadas. Nas linhagens transgênicas, GmNAC081-1, e GmNAC081-3, a expressão ectópica de GmNAC081 acelerou o amarelecimento foliar que foi associado com maior acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS), comparado com as plantas controles. Enquanto que no estádio V3 (20 dias após germinação), nas linhagens transgênicas, o nível de transcritos de GmNAC081 foi muito superior àqueles de plantas não transformadas BR16, no estádio R7 (80 DAG), a expressão de GmNAC081 endógeno, em BR16, foi induzida pelo processo de senescência, alcançando níveis similares àqueles das linhagens transgênicas. A indução natural de GmNAC081 durante senescência mimetizou o fenótipo da superexpressão do transgene, uma vez que, em clusterização, as sequências expressas durante senescência natural em BR16 agruparam junto com as sequências expressas da linhagem GmNAC081-3 nas plantas em R7. Em contraste, nas plantas em V3, na linhagem transgênica, 1849 e 2813 genes foram induzidos e reprimidos, respectivamente, dos quais 455 genes regulados positivamente e 1200 genes regulados negativamente foram comum ao processo de senescência natural de folhas. Estes resultados indicam que GmNAC081 tem um papel predominante como regulador positivo de senescência foliar natural. Entre os genes regulados positivamente destacam-se alvos diretos de GmNAC081, validando os resultados de RNA-seq. Além disso, foram selecionados adicionais genes candidatos com o potencial de serem modulados por GmNAC081, como JMT, MLO3, NRT1.5, KIN10, KIT1 e SPI, os quais contem sítios de ligação para o gene GmNAC081 nos seus promotores. Estes resultados ampliaram a atividade transcricional de GmNAC081 em escala genômica, identificando um conjunto de possíveis alvos diretos que atuam para estabelecimento do processo de senescência. Também foi avaliado o efeito da superexpressão do gene GmNAC081 em resposta ao déficit hídrico. As plantas superexpressando GmNAC081 foram mais sensitivas ao déficit hídrico, apresentando menor teor de água e menor potencial hídrico, sob o mesmo regime de déficit hídrico, que as plantas não transformadas, o que foi associado com um fenótipo de senescência acelerada induzida por seca. Além disso, os parâmetros fisiológicos de trocas gasosas e de fluorescência monitorados durante o déficit demostraram a maior sensitividade das plantas transgênicas à seca. Coletivamene, os resultados dessa investigação descreveram a atividade transcricional de GmNAC081 em escala genômica e demonstraram que GmNAC081 exerce uma função positiva predominante no estabelecimento de senescência natural e regula negativamente a tolerância de plantas à seca. / In Brazil, the agribusiness contributes considerably to economy. However, the crops are exposed to environmental stresses, including biotic stresses, which are caused by microorganisms, herbivores or viruses, as well as abiotic stresses caused by water deficit, nutrient depravation, presence of stressing agents in the soil, etc. In the case of defense to multiple stresses, the plants activate a programmed cell death (PCD) signaling mediated by GmNAC081 and GmNAC030 proteins, which belong to a large family of plant-specific transcriptional factors. Recently, GmNAC081 has been demonstrated to play a positive role in natural leaf senescence, as GmNAC081 silencing delays leaf senescence and attenuates the hallmarks of PCD, although the underlying mechanism has not been totally elucidated. In this investigation, a functional genomic approach was exploited to evaluate the mechanism by which GmNAC081 mediates senescence, as well as the effect of ectopic expression of GmNAC081 during water deficit. The GmNAC081-overexpressing lines displayed accelerated senescence as compared to wild type, untransformed plants. In the transgenic lines, GmNAC081-1 and GmNAC081-3, the ectopic expression of GmNAC081 accelerated leaf yellowing, which was associated with a greater accumulation of ROS, as compared to control lines. While in V3 plants (20 days after germination (20 DAG)), in the transgenic lines, the transcript levels of GmNAC081 were much greater that those of untransformed plants, BR16, in R7 plants (80 DAG), the expression of endogenous GmNAC081 in BR16 was induced by senescence, reaching similar levels as the transgenic lines. The natural induction of GmNAC081 during senescence mimicked the phenotype of transgene overexpression because the expressed sequences during natural senescence in BR16 clustered together with the expressed sequences of the GmNAC081-3 line in plants at R7. In contrast, in V3 plants, in the transgenic line, 1849 and 2813 genes were induced and repressed, respectively; among those, 455 up-regulated genes and 1200 downregulated genes were common to the process of leaf senescence. These results indicate that GmNAC081 plays a major role as a positive regulator of natural leaf senescence. Among the up-regulated genes, direct targets of GmNAC081 were highlighted, validating the results of RNA-seq. Furthermore, additional candidate genes were selected with the potential to be modulated directly by GmNAC081, including JMT, MLO3, NRT1.5, KIN10, KIT1 e SPI, which contain GmNAC081 binding sites on their promoter. These results amplified the transcriptional activity of GmNAC081, as they identified a set of possible direct target genes, which function in the onset of senescence. The effect of GmNAC081 overexpression in response to water deficit was also examined. GmNAC081-overexpressing plants were more sensitive to water stress, as they displayed a lower water potential and relative water content than untransformed plants under the same regime of water deficit, which was associated with a drought-induced accelerated senescence phenotype. Furthermore, gas exchange and fluorescence physiological parameters during water deficit confirmed the greater sensitivity of transgenic lines to drought. Collectively, our results described the widegenomics transcriptional activity of GmNAC081, demonstrating that GmNAC081 plays a major positive role in leaf senescence and a negative role in water deficit tolerance.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-01-13T08:21:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1062061 bytes, checksum: 36720a2028bf76afcba32f3865472cd7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-13T08:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1062061 bytes, checksum: 36720a2028bf76afcba32f3865472cd7 (MD5) Previous issue date: 2015-10-26 / A principal contribuição da genética molecular no melhoramento é a utilização direta das informações de DNA no processo de identificação de indivíduos geneticamente superiores. Sob esse enfoque, idealizou-se a seleção genômica ampla (Genome Wide Selection – GWS), a qual consiste na análise de um grande número de marcadores SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) amplamente distribuídos no genoma. Este trabalho de simulação apresenta uma abordagem completa para a seleção genômica por meio de adequados modelos genéticos incluindo efeitos aditivos e devido à dominância, que são essenciais para a seleção de clones e de cruzamentos, bem como para melhorar a estimativa de efeitos aditivos para a seleção. Até o momento, as abordagens via Ridge Bayesiana e Lasso para modelos aditivo-dominante não foram avaliados e comparados na literatura. Neste trabalho, foram avaliados o desempenho de 10 modelos de predição aditivo-dominante (incluindo os modelos existentes e propostas de modificação). Um novo método Bayesiano/Lasso modificado (chamado BayesA* B* ou t-BLASSO) obteve melhor desempenho na estimação de valores genéticos genômicos dos indivíduos, em todos os quatro cenários (dois níveis de herdabilidades × duas arquiteturas genéticas). Os métodos do tipo BayesA*B* apresentaram melhor capacidade para recuperar a razão entre a variância de dominância e a variância aditiva. Além disso, o papel das três fontes de informação da genética quantitativa (chamadas de desequilíbrio de ligação, co-segregação e relações de parentesco) na seleção genômica foram elucidadas pela decomposição da herdabilidade e da acurácia nos três componentes, mostrando suas relações com a estrutura de populações e o melhoramento genético, a curto e longo prazo. Além disso, neste trabalho de simulação também foi desenvolvido dois novos estimadores para a acurácia preditiva da seleção genômica. O trabalho propõe e avalia o desempenho e a eficiência destes novos estimadores chamados estimador regularizado (RE) e estimador híbrido (HE). O estimador regularizado leva em consideração tanto a herdabilidade genômica quanto a herdabilidade da característica, além da capacidade preditiva. Enquanto, o estimador híbrido (HE), combina as acurácias experimental e esperada. As comparações entre RE e HE com o estimador tradicional (TE) foram feitas sob quatro procedimentos de validação. Em geral, RE apresentou acurácias mais próximas aos valores paramétricos, principalmente quando há seleção de marcadores. RE também foi menos tendencioso e mais preciso, com desvios padrão menores do que o estimador tradicional. Diante dos resultados, o TE pode ser usado apenas com a validação independente, em que tende a ter um melhor desempenho do que RE, embora superestimando a acurácia. O estimador híbrido (HE) provou ser muito eficaz na ausência de validação. Enquanto, que a validação independente mostrou-se superior em relação aos procedimentos de Jacknife, perseguindo melhor a acurácia paramétrica com ou sem seleção de marcador. As seguintes inferências podem ser feitas de acordo com o estimador de acurácia e tipo de validação: (i) a acurácia mais provável: HE sem validação; (ii) a maior acurácia possível (acurácia superestimada): TE com validação independente; (iii) a menor acurácia possível (acurácia subestimada): RE com validação independente. / The main contribution of molecular genetics is the direct use of DNA information to identify genetically superior individuals. Under this approach, genome-wide selection (GWS) can be used with this purpose. GWS consists in analyzing of a large number of SNP markers widely distributed in the genome. This simulation work presents a complete approach for genomic selection by using adequate genetic models including dominance effects, which are essential for selecting crosses and clones as well as for improving the estimation of additive effects for parent selection. To date, the approaches via Ridge, Lasso and Bayesian additive-dominance models have not been evaluated and compared in the literature.The performance of 10 additive-dominance prediction models (including current ones and proposed modifications) were evaluated. A new modified Bayesian/Lasso method (called BayesA*B* or t-BLASSO) performed best in the prediction of genomic breeding value of individuals, in all the four scenarios (two heritabilities × two genetic architectures). The BayesA*B*-type methods showed better ability for recovering the dominance variance/additive variance ratio. Also, the role of the three quantitative genetics information sources (called linkage disequilibrium, co- segregation and pedigree relationships) in genomic selection were elucidated by decomposing the heritability and accuracy in the three components and showing their relations with the structure of populations and the genetic improvement in the short and long run. Moreover, this simulation work also, we developed the new estimators for the prediction accuracy of genomic selection. The work proposes and evaluates the performance and efficiency of these new estimators called regularized estimator (RE) and hybrid estimator (HE). The regularized estimator takes in consideration both the genomic and trait heritabilities, in addition to the predictive ability. The hybrid estimator (HE), combines both experimental and expected accuracies. The comparisons of the RE and HE with the traditional (TE) were done under four validation procedures. In general, the new estimator presented accuracies closer to the parametric ones, mainly when selecting markers. It was also less biased and more precise, with smaller standard deviations than the traditional estimator. The TE can be used only with independent validation, where it tends to perform better than RE, although overestimating the accuracy. The hybrid estimator (HE) proved to be very effective in the absence of validation. The independent validation showed to be superior over the Jacknife procedures, chasing better the parametric accuracy with or without marker selection. The following inferences can be made according to the accuracy estimator and kind of validation: (i) most probable accuracy: HE without validation; (ii) highest possible accuracy: TE with independent validation; (iii) lowest possible accuracy: RE with independent validation. / Sem Agência de Fomento

O carcinoma medular de tireóide (CMT) é responsável por 5 a 8% dos tumores malignos da tireóide, ocorrendo na forma esporádica (80%) ou hereditária (20%). O CMT hereditário é uma doença autossômica dominante, maligna, de difícil diagnóstico clinico-laboratorial precoce e de alta mortalidade, podendo apresentar-se como componente das síndromes de Neoplasia Endócrina Múltipla (NEM 2A e 2B) ou Carcinoma Medular de Tireóide Familiar (CMTF) ou outras formas (famílias não incluídas nas formas anteriores). A síndrome genética NEM 2A se caracteriza por CMT (95%), feocromocitoma (30-50%) e hiperparatireoidismo (10-20%). De acordo a alguns autores e baseando-se na apresentação clínica, a síndrome NEM 2A foi subdividida em 3 subtipos fenotípicos; 1) NEM 2A(1), que consiste no acometimento pelos 3 componentes da síndrome (CMT, feocromocitoma e hiperparatireoidismo), 2) NEM 2A(2), que consiste no acometimento por 2 componentes da síndrome (CMT e feocromocitoma) e 3) NEM 2A(3), que consiste no acometimento por 2 componentes da síndrome (CMT e hiperparatireoidismo). A síndrome NEM 2B se caracteriza pela presença de CMT (90%), feocromocitoma (45%), ganglioneuromatose intestinal (100%) e hábitos marfanóides (65%). O CMTF, consiste na presença de CMT isolado em pelo menos 4 membros da mesma família e as outras formas hereditárias consistem no acometimento de 2 ou 3 membros da família com CMT, sem a presença de feocromocitoma ou hiperparatireoidismo até o momento do rastreamento. Diferentes mutações no proto-oncogene rei foram identificadas como responsáveis pelo CMT e estudos recentes sugerem uma correlação entre o genótipo-fenótipo, podendo existir uma variabilidade grande de síndromes clínicas associadas as diferentes mutações, ou seja, indivíduos com um determinado tipo de mutação tem uma probabilidade maior ou menor de apresentar um determinado componente da síndrome. Visto que o CMT é uma doença autossômica dominante, maligna e de alta mortalidade, a aplicação do rastreamento genético para o manejo adequado da hereditariedade do CMT é de extrema importância, já que o diagnóstico precoce determina a conduta e o prognóstico no indivíduo afetado e em seus familiares. O presente estudo teve como objetivo a análise molecular do protooncogene ret no CMT e avaliar uma possível correlação entre as mutações identificadas e os diferentes fenótipos nos indivíduos afetados e seus familiares. Foram selecionadas para estudo molecular 21 famílias com diagnóstico íiistopatológico de CMT, provenientes de diferentes localidades e encaminhados aos ambulatórios de endocrinologia do HCPA e HC-Curitiba. O DNA genômico foi extraído de leucócitos periféricos dos indivíduos afetados e/ou familiares. Os exons 10, 11, 13 e/ou 16 do proto-oncogene ret foram amplificados pela técnica de reação polimerase em cadeia (PCR) com primers específicos. A presença de mutações foi determinada pela análise de restrição enzimática e/ou sequenciamento, seguindo a estratégia diagnostica. Das 21 família analisadas, 14 famílias apresentavam a forma hereditária do CMT e 7 a forma esporádica. Das famílias com CMT hereditário (6 NEM 2A, 2 NEM 2A associada à Líquen Amilóide Cutânea (CI_A), 1 NEM 2B, 2 CMTF e 3 outras formas hereditárias), no total de 96 indivíduos. Em todas as famílias com NEM 2A, inclusive na variante Cl_A, a mutação localizava-se no exon 11 (códon 634; TGC -» CGC ou TGC TAC) e nas famílias com CMTF, no exon 10 (códon 618, TGC AGC). No paciente portador da NEM 2B foi detectada uma mutação de novo no exon 16 (códon 918, ATG ->ACG). Nas outras formas de carcinoma hereditário, as mutações localizavam-se no exon 11 (códon 634, TGC CGC ou TGC TAC) numa família, em outra no exon 10 (códon 618, TGC -> AGC) e na última no exon 10 (códon 618 ou 620, TGC CGC). Foram identificadas mutações em todos os indivíduos com história clínica e laboratorial sugestiva de doença hereditária e/ou diagnóstico histopatológico de CMT muiticêntrico e em 8 familiares assintomáticos, destacando a importância do rastreamento genético como método diagnóstico. / Medullary Carcinoma of the Thyroid (MTC), a rare thyroid malignancy originating from parafollicular C cells, represents less than 8% of ali thyroid cancers and may occur either as sporadic (80%) or hereditary (20%) disease. Hereditary MTC oan occur either alone - familial MTC (FMTC) - or as the thyroid manifestation of multipie endocrine neoplasia type 2 (MEN 2) syndromes (MEN 2A and MEN 2B) or others. MEN 2A is characterized by MTC (95%), phaeochromocytoma (30-50%) and hyperparathyroidism (10-20%). Three phenotypic subtypes have been reported. MEN 2A(1) corresponda to kindred with ai! three components. MEN 2A(2) includes kindred with MTC and phaeochromocytoma, without hyperparathyroidism. MEN 2A(3) relates to kindred with MTC and hyperparathyroidism, without phaeochromocytoma. A variant of MEN 2A, associated with pruritic skin lesions known as cutaneous lichen amyloidosis (CLA), has aiso been described in a few kindred. MEN 2B syndrome is weil characterized by having a specific phenotype, by MTC (90%), neuromas and ganglioneuromatosis (100%) and marfanoid habitus (65%). FMTC includes kindred with at least 4 members with MTC, without other components of MEN 2A or MEN 2B. Other hereditary MTCs correspond to kindred with MTC in 2 or 3 members, without phaechromocytoma or hyperparathyroidism. Germiine mutations in the ret proto-oncogene, which codes for a receptor tyrosine kinase, cause MEN 2 and recent studies suggest a relationship between specific mutations and different phenotypes in MEN 2 syndromes. Early diagnosis and treatment considerably improve the prognosis in patienís with MTC and genetic screening is a fundamental tool for the management of MTC hereditary. The purpose of this study was to identify ret proto-oncogene mutations and analyze a possible relationship between genothype-phenothype in Brazilian kindred with MTC. A total of 21 families with histopathoiogical diagnosis of MTC were included in the study, 14 with the hereditary pattern and 7 with sporadic tumors. DNA was extracted from leukocytes of the affected individuais and relatives. Exons 10, 11, 13 and 16 were amplificated by PCR, using specific primers. The presence of mutation was determined by enzymatic restriction analysis and/or automatic sequencing. The phenotypes of hereditary MTC •Já were as foilows: 6 MEN 2A, 2 MEN 2A associated with CLA, 1 MEN 2B, 2 FMTC and 3 other forms. We identified mutations at codon 634, exon 11 (TGC -> CGC or TGC TAC) in ali families with MEN 2A and MEN 2A+ CLA. In both cases of FMTC, the mutation was found in the codon 618, exon 10 (TGC --> AGC). A mutation at codon 918, exon 16 (ATG -> AGC) was identified in the only individual with MEN 2B, while in the other hereditary forms of the MTC, mutations were identified at 3 different codons, 634 (exon 11, TGC -> CGC or TGC -> TAC). 618 (exon 10, TGC AGC) and 618 or 620 (exon 10, TGC CGC). The genetic screening was abie to identified 8 assymtomatic carriers and determine the hereditary MCT pattern in 2 individuais with apparentiy sporadic tumors. In conclusion, genetic testing can identify affected and assymtomatic individuais with hereditary disease, allowing eariy diagnosis and treatment. In addition, the resuits suggest a correlation between specific mutations and phenotypes, meaning that molecular analysis could also improve the follow up of gene carriers.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3067.pdf: 3124482 bytes, checksum: 1b3dfc28c4bcee4b3d0072ea2a186976 (MD5) Previous issue date: 2010-06-02 / Universidade Federal de Sao Carlos / Mdh-1 enzyme locus coding for cytoplasmic malate dehydrogenase has three common alleles Mdh-1100 (F), Mdh-180 (M) e Mdh-165 (S) and it has been extensively used as racial marker in populational studies of Apis mellifera. Additional isoforms are detected by electrophoretic analysis during ontogenetic development of A. mellifera, indicating differential expression of this locus, and a large set of evidences suggests that Mdh-1 alleles are under temperature-mediated selection. In this work, we proposed to study molecular aspects of this locus aiming to understand the nature of observed polymorphism and possible mechanisms leading to the formation of additional isoforms. Our results suggest Mdh-1100 as the ancestral allele that gave origin to alleles Mdh-180 and Mdh-165, and electrophoretic mobility differences of allelic products may be attributed to the substitution of a single aminoacid in each variant. Regarding genic expression during development, we re able to determine that both loci Mdh-1 and Mdh-2, coding for mitochondrial malate dehydrogenase, have high expression in larval and late pupal stages, and present a significant decrease in expression during transitional stages between larva and pupa. We also determined that additional isoforms are characteristic of pupae fat body and hemolymph, not being detected in other tissues, appearing at late larval stage and starting to disappear with beginning of pupal pigmentation. We were not able to identify the causes promoting the formation of the new isoforms, but our results suggest that this phenomenon is not due to alternative splicing or expression of a stage- and tissue-specific gene. / O loco enzimático Mdh-1, codificante da malato desidrogenase citoplasmática, possui três alelos comuns Mdh-1100 (F), Mdh-180 (M) e Mdh-165 (S) e tem sido extensivamente utilizado como um marcador racial nos estudos de população de Apis mellifera. Análises eletroforéticas demonstram o surgimento de isoformas adicionais durante o desenvolvimento ontogenético de A. mellifera, indicando que o loco apresenta expressão diferencial, e um amplo conjunto de evidências sugere que os alelos deste loco estão sob ação da seleção natural mediada pela temperatura. Neste trabalho, nos propusemos a estudar aspectos moleculares deste loco com o objetivo principal de entender a natureza do polimorfismo observado e os possíveis mecanismos que levam à formação das isoformas adicionais. Nossos resultados sugerem que o alelo Mdh-1100 é ancestral e originou os outros alelos Mdh-180 e Mdh-165, e que a diferença na mobilidade eletroforética dos produtos destes alelos pode ser atribuída à alteração de um único aminoácido em cada uma das variantes. Em relação à expressão gênica durante o desenvolvimento, pudemos determinar que tanto o loco Mdh-1 quanto o loco Mdh-2, codificante da malato desidrogenase mitocondrial, apresentam elevada expressão durante a fase de larva e no final da fase de pupa, e uma significativa redução durante a transição de larva a pupa. Também determinamos que as isoformas adicionais são características do corpo gorduroso e da hemolinfa, não sendo encontradas em outros tecidos, e surgem no final da fase larval e começam a desaparecer com o início da pigmentação das pupas. Não pudemos identificar as causas que promovem o aparecimento dessas novas isoformas, porém, nossos resultados sugerem que o fenômeno não deve ser devido a splicing alternativo ou expressão de um novo gene estágio- e tecido-específicos.

O adenocarcinoma de pâncreas continua sendo uma doença com alta mortalidade apesar dos avanços na ciência e na tecnologia. O diagnóstico é tardio, na maior parte dos casos, impossibilitando uma abordagem com fins curativos. Os estudos em busca de um método para o diagnóstico precoce ou mesmo um tratamento eficaz, até o momento, não revelaram mudanças significativas. Atualmente, pesquisas em biologia molecular apontando alterações em determinados genes nos tumores de pâncreas parecem ser promissoras. Neste sentido, porém seguindo uma outra linha de pesquisa, o estudo atual que objetiva a determinação das características nucleares das células neoplásicas através da cariometria por análise digital, constitui um passo inicial para futuras especulações. Recentemente, estudos em outros tecidos como o prostático, o mamário e o endométrio vêm demonstrando existir eficácia na diferenciação entre seus tecidos normais e neoplásicos e também uma forte relação entre as alterações encontradas na cromatina de seus núcleos celulares e a agressividade de seus respectivos tumores. Utilizando-se tecido pancreático estocado em parafina por até onze anos no laboratório de Patologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), foram determinadas as características nucleares em mil e trezentos núcleos de células ductais de adenocarcinoma de pâncreas e de tecido pancreático normal. Noventa e três características da cromatina foram estudadas por análise digital. Onze características apresentaram valores diferentes entre os dois grupos e estas diferenças foram estatisticamente significativas. A média para o valor da ÁREA nuclear nos tumores foi de 977.78 e de 336.60, no tecido normal; a da RLM278 foi de 353.23 e 97.07; a da RLM266 de 99.32 e 28.06; a do PERIM de 125.58 e 65.05; a do ROUND de 1.37 e 1.04; a da IOD de 123.49 e 107.97; a da FRACDIM de 1.22 e 1.05; a da DENSMIN de 0.01 e 0.14; a da DENSMAX de 0.53 e 0.62; a da DENSSD 0.25 e 0.10 e a da DENS20P de 0.49 e 0.33, respectivamente para os núcleos dos tumores e para os do tecido normal. Sete destas características serviram como marcadores ideais de neoplasia. Estes achados permitiram a criação de uma assinatura digital específica para cada um dos dois tipos de tecido estudado. / Pancreatic adenocarcinoma still results in high mortality rates despite recent advances in science and technology. The diagnosis is late in most cases, hindering the possibilities of cure. So far, studies searching for early diagnostic methods or effective treatment of pancreatic cancer have not resulted in significant changes. Molecular biology has recently expanded our knowledge about the association between gene abnormalities and pancreatic cancer. Following a different research line, this study aims to determine nuclear features of neoplastic cells through digital karyometry assessment, proposing a first step for future speculations. Studies of other tissues like prostate, breast, and endometrium have recently shown efficacy in differentiating between their normal and neoplastic tissues and also a strong relation between changes found in chromatin of cell nuclei and tumor aggressiveness. In the present study, nuclear features were determined in one thousand and three hundred cells removed from cancerous and normal pancreatic tissue stored at the HCPA Pathology Unit through an eleven year period. Ninety-three chromatin features were studied by digital karyometry. Eleven features showed significantly different values between both groups. The average values for nuclear AREA in cancerous and normal tissue was, respectively, 977.78 and 336.60; for RLM278 was 353.23 and 97.07; for RLM266 99.32 and 28.06; PERIMETER of 125.58 and 65.05; ROUNDNESS of 1.37 and 1.04; IOD of 123.49 and 107.97; FRACDIM of 1.22 and 1.05; DENSMIN of 0.01 and 0.14; DENSMAX of 0.53 and 0.62; DENSSD of 0.25 and 0.10; and DENS20P of 0.49 and 0.33, for cancerous nuclei and normal nuclei, respectively. Seven of those features served as ideal neoplasm markers. Such findings yielded the creation of a specific digital signature for each of the two types of studied tissues.

Bacilos são bactérias aeróbias ou anaeróbias facultativas, Gram positivas ou Gram variáveis, produtoras de endósporos, que lhes conferem resistência ao estresse ambiental. Os gêneros Bacillus e Paenibacillus são os que possuem as espécies reconhecidamente fixadoras de nitrogênio. Outra característica dos bacilos é o grande potencial em produzir substâncias capazes de promover o crescimento vegetal, como hormônios, sideróforos, antibióticos e a capacidade de solubilização de fosfatos. Enquanto múltiplas espécies de bacilos podem ser detectadas nos solos e na rizosfera de várias plantas, muito pouco tem sido feito para estimar a sua diversidade e para indicar quais são as espécies mais comumente isoladas. Dois estudos semelhantes foram conduzidos nesse trabalho, com os seguintes objetivos: i) isolar as espécies de bacilos fixadores de nitrogênio predominantes em diferentes regiões orizícolas e tritícolas do Estado do Rio Grande do Sul, ii) estimar a sua diversidade; e iii) avaliar suas atividades como bactérias promotoras de crescimento de plantas, para utilização como futuros inoculantes. Das espécies que foram identificadas, através do seqüenciamento parcial do gene do RNA ribossomal 16S, as mais comuns foram P. borealis e P. graminis. Para a grande maioria das bactérias isoladas não foi possível a identificação em nível de espécie. Há uma alta probabilidade de que tais bactérias constituam espécies ainda não descritas, mas filogeneticamente muito próximas a P. borealis e P. graminis. Dentre os isolados da rizosfera de arroz e trigo, dois foram descritos como novas espécies neste trabalho: Bacillus oryzae e Paenibacillus riograndensis. Uma característica marcante entre os isolados da rizosfera foi a capacidade destes de produzir grandes quantidades de ácido indol-acético. Poucos isolados, tanto do solo quanto da rizosfera, produziram sideróforos e solubilizaram fosfato. As linhagens selecionadas para experimentos in vivo em casa de vegetação provaram ser muito eficientes na promoção do crescimento de suas plantas hospedeiras. Tais linhagens poderão ser usadas na formulação de novos inoculantes, melhorando o sistema de cultivo em que eles venham a ser aplicados. A identificação e o isolamento de bacilos de solos temperados e subtropicais, que combinem a habilidade de fixar nitrogênio com a produção de substâncias capazes de promover o crescimento vegetal, poderá aumentar significativamente a produtividade das lavouras graníferas no Brasil e no Estado do Rio Grande do Sul, em especial. / Bacilli are aerobic or facultatively anaerobic, Gram positive or variable, endospore-forming bacteria that exhibit resistance to environmental stress. Bacillus and Paenibacillus genera include the best knowing nitrogen-fixing species. Another bacilli characteristic is their great potential in producing substances that promote plant growth by the production of hormones, siderophores and phosphate solubilization. While multiple species of bacilli can be detected in the soils and rhizosphere, scarce research has been carried out to estimate their diversity and indicate the most commonly isolated species. In this work, two similar studies have been conducted with the objectives of: i) isolate the predominant nitrogen-fixing bacilli species from different rice and wheat crops of Rio Grande do Sul State, ii) estimate their diversity, and iii) evaluate their plant growth promoting (PGP) activities in order to use them further as inoculant strains. Among the species that have been identified through partial 16S rRNA gene sequence analysis, P. borealis and P. graminis were the most common species in both locations, soil and rhizosphere. It was not possible to identify the vast majority of isolates at the level of species. There is a high probability that these bacteria constitute species not yet described, but phylogenetically very closely related to P. borealis and P. graminis. Two isolates from rice and wheat rhizospheres were described as new species: Bacillus oryzae and Paenibacillus riograndensis. A remarkable characteristic among isolates of the rhizosphere was their ability to produce high amounts of indole-acetic acid. Few isolates, both from bulk soil and rhizosphere, produced siderophores and/or solubilized phosphates. The strains selected for in vivo experiments in a greenhouse proved to be very effective in promoting the growth of their host plants. Such strains can be used in the formulation of new inoculants, improving the cropping system in which they will be applied. The identification and the isolation of PGP bacilli from temperate and subtropical soils, which combine the ability to fix nitrogen with the production of substances capable of promoting plant growth, could also significantly increase the productivity of grain crops in Brazil and Rio Grande do Sul State in special.