O retardo mental (RM) representa um problema de saúde pública mundial ainda negligenciado no Brasil e, em especial nas regiões mais pobres como o Nordeste. A síndrome do X frágil (SXF) é uma das formas mais estudadas de RM hereditário em seres humanos. Esta doença monogênica, de herança ligada ao X dominante, é decorrente de uma mutação no exon 1 do gene FMR1, localizado na região Xq27.3. A mutação no FMR1 se caracteriza pelo aumento de repetições de trinucleotídios CGG em tandem na região 5 UTR desse gene, sendo a expansão dessas trincas o principal evento mutacional responsável pela SXF. De maneira geral, os fenótipos cognitivos de indivíduos do sexo masculino com a síndrome incluem deficiência intelectual de moderada à grave. No presente trabalho, realizamos um estudo transversal da SXF em indivíduos portadores de retardo mental de causa desconhecida, engajados em Programas de Educação Especial e em instituições psiquiátricas de São Luís-MA, rastreando amplificações de sequências trinucleotídicas no gene FMR1. A amostra foi composta por 238 indivíduos do sexo masculino, não aparentados, na faixa etária de 4 a 60 anos (média = 21 9 anos). O DNA dos participantes foi obtido a partir de 5 mL de sangue coletados em tubos com anti-coagulante EDTA e a análise molecular da região gênica de interesse foi realizada através da reação em cadeia da polimerase, utilizando-se três primers. Dentre os indivíduos triados quanto à presença de mutações no gene FMR1, apenas um apresentou um resultado inconclusivo e 2 (0,84%) foram positivos para a SXF, sendo que um deles (3503) apresentou mais de 200 repetições CGG no locus FRAXA e o outro indivíduo (3660) apresentou uma deleção de ~197 pb envolvendo parte das repetições CGG e uma região proximal às repetições CGG. Ambos possuíam história familiar de RM ligado ao X. No indivíduo 3503 observamos as seguintes características clínicas: temperamento dócil, orelhas grandes, mandíbula proeminente e flacidez ligamentar. O indivíduo 3660 apresentava hiperatividade, contato pobre com os olhos, orelhas grandes, mandíbula proeminente, pectus excavatum, macroorquidismo e pouca comunicação. O esclarecimento sobre a doença oferecido às famílias de ambos contribuiu sobremaneira para o entendimento da condição, do prognóstico e dos riscos de recorrência. A prevalência da SXF em nossa amostra, 0,84%, embora relativamente baixa, encontra-se na faixa de incidência de casos diagnosticados em outras populações que, em sua maioria, relatam incidências variando de 0 a 3%. Em parte, atribuímos o percentual encontrado aos critérios de inclusão utilizados em nosso estudo. Concluímos que o protocolo de triagem molecular utilizado em nosso estudo se mostrou eficiente e adequado para a realidade do Maranhão, podendo constituir uma ferramenta auxiliar a ser aplicada na avaliação de rotina dos portadores de RM, com grandes benefícios para o Estado. / Mental retardation (MR) is considered a global public health problem in Brazil and it is still ignored mainly in poor regions like Northeast Brazil. The fragile X syndrome (FXS) is one of the most common heritable disease in humans. it is a monogenic disease with X-linked dominant inheritance due to a mutation in exon 1 of the FMR1 gene, located at Xq27.3 region. The mutation in FMR1 is characterized by the increase in number of CGG repeats in the 5 'UTR of the gene. This expansion of CGG triplets in the first exon of the FMR1 gene is the main mutational event responsible for FXS. In general, the cognitive phenotypes of males with this syndrome include intellectual disabilities from moderate to severe. In this work, we conducted a cross-sectional study of FXS in individuals with MR of unknown cause, in Especial Education Programs and Psyquiatric Instituitions in São Luís-MA, by screening for amplifications of trinucleotide sequences within the FMR1 gene. The sample consisted of 238 unrelated males, which ages were from 4 to 60 years (mean = 21 9 years). The DNA of all individuals was obtained from 5 mL of peripheral blood which was colected in EDTA-anticoagulated tubes. The molecular analysis of the genetic region of interest was performed by polimerase chain reaction using three primers. Of the individuals screened for the presence of the mutation in the FMR1 gene, only one was inconclusive and two (0.84%) were positive for FXS. One (3503) presented more than 200 CGG repeats in FRAXA locus, and the other (3660) presented with a ~ 197 bp deletion involving part of CGG repeats and a proximal region to the CGG repeats. Both of these individuals have family history of X-linked Mental Retardation. The individual 3503 has the following clinical features: docile temperament, large ears, prominent jaw and ligamentous laxity. The individual 3660 presents hyperactivity, poor contact with eyes, large ears, prominent jaw, pectus excavatum, macroorchidism and little communication. Information about the disease helped the families of both individuals with FXS to understand the condition, the prognosis and about the recurrence risk. We found a FXS prevalence of 0.84% in our sample, although relatively low, it is in the range of incidence of diagnosed cases in other populations that report mostly incidences ranging from 0 to 3%. We partially attribute the percentage found due to the inclusion criteria used in our study. We conclude that the protocol for molecular screening used in our study proved to be efficient and appropriate to the reality of Maranhão, constituting an auxiliary tool to be applied in the routine assessment of patients with MR, with great benefits for the state.

O papel dos polimorfismos genéticos da ECA (PGECA) na insuficiência cardíaca (IC) como preditor de desfechos clínicos e ecocardiográficos ainda não está estabelecido. É necessário identificar o perfil genotípico local para se observar se o impacto clínico desses genótipos é igual entre populações estrangeiras e a brasileira. O objetivo deste trabalho foi determinar a frequência das variantes do PGECA e sua relação com a evolução clínica de pacientes com IC de etiologia não isquêmica de uma população do Rio de Janeiro, utilizando desfechos clínicos, ecocardiográficos e do Seattle Heart Failure Model (SHFM).Para isso, realizou-se análise secundária de prontuários de 111 pacientes, acompanhados de forma prospectiva e retrospectiva, além da análise genética com identificação da variante do PGECA e sua classificação. Os pacientes foram acompanhados em média por 64,93,9 meses, tinham 59,51,3 (26-89) anos, predomínio do sexo masculino (60,4%) e da cor da pele branca (51,4 %), mas com alta prevalência de pretos (36 %). A distribuição do PGECA observada foi: 51,4 % DD, 44,1 % DI e apenas 4,5 % II. Hipertensão arterial foi a comorbidade mais frequentemente observada (70,3 %). O tratamento farmacológico estava bastante otimizado: 98,2 % em uso de betabloqueadores e 89,2 % em uso de inibidores da ECA ou losartana. Nenhuma das características clínicas ou do tratamento medicamentoso variou entre os grupos. Cerca de metade da coorte (49,5 %) apresentou fração de ejeção de VE (FEVE) ≤35 %. O diâmetro sistólico do VE (DSVE) final foi a única variável ecocardiográfica isolada significativamente diferente entre os PGECA: 59,21,8 DD x 52,31,9 DI x 59,25,2 (p=0,029). Quando analisadas de maneira evolutiva, todas as variáveis (FEVE, DSVE e DDVE) diferiram de maneira significativa entre os genótipos: p=0,024 para ∆FE, p=0,002 para ∆DSVE e p=0,021 para ∆DDVE. O genótipo DI se associou ao melhor parâmetro ecocardiográfico (aumento de FEVE e diminuição de diâmetros de VE), enquanto que o DD e II apresentaram padrão inverso. Os valores derivados do SHFM (expectativa de vida, mortalidade em um ano e mortalidade em cinco anos) não variaram de forma significativa entre os genótipos, mas notou-se um padrão com o DD associado a piores estimativas, DI a estimativas intermediárias e II a valores mais benignos. Não houve diferença significativa entre desfechos clínicos isolados (óbitos: p=0,552; internação por IC: p=0,602 e PS por IC: p=0,119) ou combinados (óbitos + internação por IC: p=0,559). Na análise multivariada, o peso alelo D foi preditor independente da variação do DSVE (p=0,023). Em relação aos preditores independentes de óbito + internação por IC, foram identificados classe funcional NYHA final (p=0,018), frequência cardíaca final (p=0,026) e uso de furosemida (p=0,041). Em suma, a frequência alélia e das variantes do PGECA foram diferentes da maioria do estudos internacionais. O alelo D foi associado de forma independente à pior evolução ecocardiográfica. Não houve diferenças significativas em relação aos parâmetros derivados do SHFM, embora o genótipo II pareça estar associado com o melhor perfil clínico. Por último, não houve diferenças em relação aos desfechos clínicos entre os PGECA. / The role of angiotensin-converting enzyme polymorphisms (ACEGP) has not yet been established as predictors of clinical outcomes in Heart Failure (HF). The local genotype profile must be identified in order to discover whether the clinical impact of these genotypes is the same in the Brazilian and foreign populations. The objective was to define the frequency of ACEGP variants and its relationship with the clinical progress of HF patients with non-ischemic etiology for a population in Rio de Janeiro, using clinical outcomes, echocardiogram parameters and the Seattle Heart Failure Model (SHFM). The medical records of 111 patients monitored prospectively and retrospectively were studied through a secondary data analysis, in addition to a genetic analysis with identification of the ACEGP variant and its classification. Aged 59.51.3 (26-89) years old, the patients were followed for an average of 64.93.9 months, mainly men (60.4%) and white (51.4%), but with a high prevalence of black (36 %). The observed ACEGP distribution was: 51.4% DD, 44.1% DI and only 4.5% II. High blood Arterial Hypertension was the co- morbidity most frequently observed (70.3%). Pharmacological treatment was highly optimized: 98.2% were taking beta blockers and 89.2% were taking ACE inhibitors or losartan. There was no significant difference in clinical characteristics or medical treatment among the groups. Almost half the cohort (49.5%) presented a left ventricular ejection fraction (LVEF) of ≤35%. The final left ventricular systolic diameter (LVSD) was the only isolated echo-cardiographic variable that differed significantly among the ACEGP: 59.21.8 DD x 52.31.9 DI x 59.25.2 (p=0.029). When final and initial echocardiograms were compared, the variation of these variables (LVEF, LVSD and LVDD) differed significantly among the genotypes: p=0.024 for ∆EF, p=0.002 for ∆LVSD and p=0.021 for ∆LVDD. The DI genotype was associated with the best echocardiographic pattern (increased LVEF and smaller LV diameters), while DD and II presented an inverse pattern. The values derived from the SHFM (life expectancy, one-year mortality and five-years mortality) did not vary significantly among the genotypes, although a pattern was noted for DD associated with poorer estimates, intermediate DI estimates and II with the most benign values. There were no significant differences among clinical outcomes separately (deaths: p=0.552; hospitalization for HF: p=0.602 and emergency room visits for HF: p=0.119) or combined (deaths + hospitalization for HF: p=0.559). In the multivariate analysis, each copy of the D allele, was a predictor for LVSD change (p=0.023). In terms of independent predictors of death and hospitalization for HF, the following were identified: final functional class NYHA (p=0.018), final heart rate (p=0.026) and use of furosemide (p=0.041). Hence, the allele and ACEGP frequency differed from most of the international studies. The D allele was associated independently with the worst evolutive echocardiogram pattern. There were no statistically significant differences in terms of SHFM-based parameters, although genotype II seems to be associated with the best clinical profile. Finally, there were no differences in terms of the clinical outcomes among the ACEGP.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Deficiência Intelectual (DI) é uma condição definida como um funcionamento intelectual significativamente prejudicado, expresso juntamente com limitações em pelo menos duas áreas do comportamento adaptativo que se manifestam antes dos 18 anos de idade. A prevalência estimada da DI na população em geral é de 2-3% e um número expressivo de casos permanece sem um diagnóstico definitivo. Há um consenso geral de que a DI é mais comum em indivíduos do sexo masculino em relação aos do sexo feminino. Entre as explicações para este excesso está a concentração de genes específicos para a habilidade cognitiva no cromossomo X. MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não codificador que modulam a expressão gênica pós-transcricional de RNAs mensageiros alvo. Recentemente, estudos têm demonstrado a importância essencial dos miRNAs para o desenvolvimento e funcionamento cerebrais e sabe-se que o cromossomo X tem uma alta densidade de genes de miRNAs. Neste contexto, os miRNAs são candidatos potenciais como fatores genéticos envolvidos na Deficiência Intelectual Ligada ao X (DILX). Neste estudo, foram analisadas as regiões genômicas de 17 genes de miRNAs expressos no cérebro localizados no cromossomo X, com o objetivo de investigar o possível envolvimento de variantes na sequência destes miRNAs na DILX. Para este fim, selecionamos amostras de DNA genômico (sangue periférico) de 135 indivíduos do sexo masculino portadores de DI sugestiva de DILX de um grupo de mais de 1.100 pacientes com DI encaminhados ao Serviço de Genética Humana da UERJ. O critério de inclusão para este estudo era de que os probandos apresentassem um ou mais parentes do sexo masculino afetados pela DI que fossem interligados por via materna. As amostras de DNA dos pacientes foram amplificadas utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase, seguida por purificação e sequenciamento direto pelo método de Sanger dos fragmentos amplificados. Para avaliar a conservação dos 17 miRNAs foi realizada uma análise filogenética in silico incluindo sequências dos miRNAs selecionados de humanos e de outras 8 espécies de primatas estreitamente relacionadas. Não foram encontradas alterações nas sequências nos genes de 17 miRNAs analisados, mesmo diante do padrão genético altamente heterogêneo da população brasileira. Adicionalmente, a análise filogenética destes miRNAs revelou uma alta conservação entre as espécies comparadas. Considerando o papel dos miRNAs como reguladores da expressão gênica, a ausência de alterações e a alta conservação entre primatas sugerem uma forte pressão seletiva sobre estas moléculas, reforçando a sua importância funcional para o organismo em geral. Apesar de não termos encontrado variantes de sequência nos miRNAs estudados, o envolvimento de miRNAs na DI não pode ser completamente descartado. Alterações fora da molécula de miRNA precursor, nos fatores de processamento, nos sítios alvo e variações no número de cópias de genes de miRNAs podem implicar em alteração na expressão dos miRNAs e, consequentemente, na funcionalidade do miRNA maduro. Sendo assim, uma análise sistemática da expressão de miRNAs em pacientes com DILX é urgentemente necessária, a fim de desvendar novos genes/mecanismos moleculares relacionados a esta condição. / Intellectual Disability (ID) is defined as a significantly impaired intellectual functioning, along with limitations in at least two areas of adaptive behavior appearing before 18 years of age. The estimated prevalence of ID in the general population is 2-3% and a significant number of cases remain without a definite diagnosis. There is a general consensus that ID is more common in males compared to females. Among the explanations for this excess it is the concentration of specific genes for cognitive ability on the chromosome X. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that modulate post-transcriptional gene expression of target messenger RNAs. Recently, studies have demonstrated the essential importance of miRNAs for brain development and function and chromosome X has a high density of miRNA genes. In this context, miRNAs are potential candidates as genetic factors involved in X-Linked Intellectual Disability (XLID). In this study, the genomic regions of 17 brain-expressed miRNA genes located on the chromosome X were analyzed, aiming to investigate the possible involvement of sequence variants in these miRNAs in XLID. For this purpose, genomic DNA samples (peripheral blood) were obtained from 135 male patients with ID suggestive of XLID that were selected from a group of over 1,100 patients with ID referred to to the Human Genetics Laboratory of the State University of Rio de Janeiro. Inclusion criteria were at least two affected males in different generations related through maternal lineage. DNA samples from patients were amplified using the polymerase chain reaction technique, followed by purification and direct sequencing by Sanger method. To assess the conservation of the 17 miRNAs, in silico phylogenetic analysis was performed, including sequences of the chosen miRNAs from human and from other 8 closely related primate species. No sequence changes were found for the 17 miRNA genes analyzed, even in light of the highly heterogeneous genetic nature of the Brazilian population. Furthermore, phylogenetic analysis of the selected miRNAs revealed a high conservation among the compared species. Considering the role of miRNAs as regulators of gene expression, the absence of variations and the high conservation among primates suggest a strong selective pressure on these molecules, emphasizing their functional importance for the body in general. Although we have found no sequence variants in the miRNAs studied, the involvement of miRNAs in ID cannot be completely rejected. Alterations outside the precursor miRNA molecules, in the processing factors, in the target sites and changes in copy number of miRNA genes can result in abnormal expression of miRNAs and, consequently, in the functionality of the mature miRNA. Thus, a systematic analysis of miRNAs expression in patients with XLID is urgently needed in order to uncover new genes/molecular mechanisms related to this condition.

O uso de marcadores do tipo STR e SNP tem se revelado de grande importância na discriminação entre indivíduos de uma mesma população, assim como para estudos evolutivos. A utilização de um conjunto de 17 STRs e 46 SNPs específicos de cromossomo Y permitiu a caracterização de um conjunto de amostras representativas das populações do Rio de Janeiro e do oeste africano, com uma avaliação mais ampla sobre a ancestralidade de origem paterna. Na primeira parte deste estudo foram analisados 605 indivíduos do sexo masculino do estado do Rio de Janeiro. Como resultado, não foram observadas diferenças significativas entre as populações do sudeste e do Rio de Janeiro, que apresentou uma alta diversidade de haplótipos (0,9999 0,0001) e de haplogrupos (0,7589 0,0171). A comparação da população miscigenada do Rio de Janeiro com diferentes grupos étnicos ou populacionais mostrou que a frequência de indivíduos com marcadores tipicamente Europeus é de 77%, africanos é de 14,87% e em ameríndios é de 2,31%. A segunda parte do estudo revelou uma grande diversidade haplotípica (1,0000 0,0018) numa amostra do Oeste africano. Quanto ao valor da diversidade de haplogrupos (0,6895 0,0200), este foi similar aos observados em populações de origem Bantu do oeste e centro africanos, principalmente de Benin, Nigéria e Costa do Marfim. A terceira parte deste estudo mostrou que não existem diferenças significativas entre o componente africano da amostra do Rio de Janeiro e as populações africanas do sudeste, oeste e centro oeste. Por outro lado, observamos diferenças significativas quando comparamos o componente africano do Rio de Janeiro e o oeste africano com populações de Uganda, Quênia e África do Sul. A ampliação de estudos genéticos nas populações da África se fazem necessários para o entendimento da diversidade genética no mundo. Este trabalho contribuiu para fornecer mais alguns dados genéticos, que podem ser somados aos estudos mundiais que estão sendo realizados, ampliando os nossos conhecimentos sobre a formação das populações que também foram influenciadas pelo fenômeno da Diáspora Africana. / The use of STR and SNP markers has proved to be of great importance to discriminate individuals of the same population as well as for evolutionary studies. The use of a set of 17 STRs and 46 SNPs specific from the Y chromosome allowed the characterization of a group of samples representative of the Rio de Janeiro and the West African populations, with a deep assessment of the paternal ancestry. The first part of this study focused in the analysis of 605 males of the state of Rio de Janeiro. The results showed no significant differences between the Brazilian southeastern populations and Rio de Janeiro, which showed high values of haplotype (0.9999 0.0001) and haplogroup (0.7589 0.0171) diversities. The second part of the study revealed a high haplotype diversity (1.0000 0.0018) in a sample from West Africa. The value of haplogroup diversity (0.6895 0.0200) was similar to those previously seen in the West and Center African Bantu populations, mainly from Benin, Nigeria and Ivory Coast. The third part of this study showed no significant differences between the African component of our sample from Rio de Janeiro and the Southeastern, Western and Midwestern African populations. On the other hand, significant differences were observed when comparing the samples of the African component in Rio de Janeiro and of West Africa with population samples from Uganda, Kenya and South Africa. The increase of genetic studies in African populations is important for a better understanding of world genetic diversity. This work provided new genetic data, which can be added to those already available, expanding our knowledge about the formation of other populations also influenced by the African Diaspora.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais frequente, depois da doença de Alzheimer, com uma incidência de aproximadamente 3,3% na população brasileira acima dos 60 anos. Ela é caracterizada por uma perda dos neurônios dopaminérgicos da parte compacta da substância negra e pela presença de inclusões protéicas intracelulares denominadas corpúsculos de Lewy nos neurônios sobreviventes. A DP tem uma etiologia complexa que envolve interações genes-ambiente e múltiplos genes de susceptibilidade. Nesse contexto, mutações de perda de função no gene da glicocerebrosidase (GBA) têm sido bem validadas como importantes fatores de risco para a DP. Esse gene está localizado na região 1q21 e compreende 11 exons que codificam a enzima lisossômica glicocerebrosidase. O principal objetivo deste estudo foi investigar se alterações no gene GBA constituem um fator de predisposição para o desenvolvimento da DP na população brasileira. Para isso, um grupo de 126 pacientes brasileiros, não-aparentados, com DP (24 casos familiares e 102 isolados; idade média 66,4 11,4) foram analisados para mutações no GBA através do seqüenciamento completo de todos os exons e alguns íntrons. Sete alterações e um alelo recombinante, anteriormente encontrados em pacientes com a DP analisados em outros estudos, foram detectados (K(-)27R, IVS2+1G>A, N370S, L444P, T369M, A456P, E326K e RecNciI), assim como, uma variante nunca antes identificada associada à DP (G325G) e uma nova mutação (W378C), num total de 18 pacientes (14,3%). Além disso, foram encontradas três alterações intrônicas (c.454+47G>A, c.589-86A>G e c.1225-34C>A), que constam do banco de SNPs, entretanto, não foram associadas a nenhuma doença. Dentre todas as variantes identificadas, três são comprovadamente patogênicas (IVS2+1G>A, L444P e N370S) e foram encontradas em 5,5% da amostra, não sendo detectadas na amostra controle, indicando uma freqüência significativamente alta dessas mutações em pacientes com DP quando comparadas aos controles (P=0,0033). Esses resultados reforçam a associação entre o gene GBA e a DP na população brasileira, além de apoiar a hipótese de que alterações nesse gene representam um importante fator de susceptibilidade ao desenvolvimento da DP / Parkinsons disease is the second most common neurodegenerative disorder, after Alzheimers disease, with an incidence of 3.3% in Brazilian population over the age of 60 years. Its characterized by the degeneration of dopaminergic neurons within the substantia nigra pars compacta and the presence of intracellular protein inclusions called Lewy bodies in the surviving neurons. PD has a complex etiology which may involve gene-environment interactions and multiple susceptibility genes. In this context, loss-of-function mutations in the glucocerebrosidase gene (GBA) have been well-validated as important susceptibility factors for PD. This gene is located on 1q21 and comprises 11 exons that encode them lysosomal enzyme glucocerebrosidase. The main objective of our study was to investigate if alterations in the GBA gene constitute a predisposing factor for the development of PD in the Brazilian population. For this, a Brazilian cohort of 126 unrelated PD patients (24 familial and 102 sporadic cases; mean age: 66.4 11.4) were screened for GBA mutations by complete sequencing of the genes exons and some introns. Seven alterations and one recombinant allele, previously found in PD patients performed in other studies, were detected (K(-)27R, IVS2+1G>A, N370S, L444P, T369M, A456P, E326K e RecNciI), as well as, a variant never identified in PD patients (G325G) and one newly identified variant (W378C), in a total of 18 patients (14.3%). In addition, were found three intronic changes (c.454 +47 G>A, c.589- 86A>G and c.1225-34C>A), which are present in the database of SNPs, however, were not associated with any disease. Among all the variants identified, three are proven pathogenic (IVS2 +1 G>A, N370S and L444P) and were found in 5.5% of the sample and not detected in the control sample, indicating a significantly higher frequency of these mutations in patients with PD compared to controls (P = 0.0033). Our results, have strengthened the association between the GBA gene and PD in the Brazilian population, in addition to support the hypothesis that alterations in this gene represent a significant genetic susceptibility factor for the development of PD

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLFR.pdf: 1075822 bytes, checksum: f9dc443682a3269a2f32e2a5579089a0 (MD5) Previous issue date: 2005-06-10 / Financiadora de Estudos e Projetos / The ubiquitin system represents a selective mechanism for intracellular proteolysis in eukaryotic cells that involves the sequential activity of three enzymes, E1 (Ubiquitin activating enzyme), E2 (Ubiquitin-conjugating enzyme), and E3 (Ubiquitin-protein ligase). The identification of these proteins and their targets as well as structural data is essential to understand their function in the eukaryotic cell. In the present study the open reading frame of human Ubiquitin- conjugating enzyme UBE2G2 was isolated from a human brain cDNA panel, cloned into pET28 vector and expressed in Escherichia coli. His-tagged protein was then purified by nickel-affinity chromatography and subjected to structural and functional studies using circular dichroism (CD) and an in vitro ubiquitin-binding assay, respectively. The affinity chromatography assay rendered approximately the 27 mg of the soluble recombinant HisUBE2G2 after expressed in bacteria at low amounts of IPTG (0,1mM) in 3 hours of induction. The CD spectra of recombinant pure protein showed a secondary structure content according with the expected for a member of the E2 family (Ubiquitin-conjugating enzyme), with 35 % of α-Helix, 21 % of β sheets and 23 % of turns. Moreover, purified protein was able to bind ubiquitin molecules when mixed with a HeLa cell extract during the pull-down assay. Taken together the results presented in this work allow inferring that HisUBE2G2 was expressed in their active form. / O Sistema de Ubiquitinação representa o mecanismo de degradação protéica intracelular mais importantes em todos nas células eucarióticas e envolve a atividade seqüencial de três enzimas conhecidas como E1, enzima ativadora de ubiquitina, a E2 enzima conjugante de ubiquitina e a E3 enzima ligante de ubiquitina. A identificação destas proteínas e seus alvos protéicos, assim como as obtenções de dados estruturais são essenciais para entender a função deste sistema dentro da célula eucariótica. No presente trabalho, a fase de leitura aberta (ORF) do gene humano ube2g2 foi isolado de um painel de cDNA de cérebro humano, foi clonado no vetor pET28a e expressado em bactérias Escherichia coli. A proteína de 18,5 kDa em fusão com uma cauda de histidinas foi posteriormente purificada por cromatografia de afinidade e submetido a ensaios estruturais e funcionais a traves do medição do CD e a traves do ensaio de pull-down, respectivamente. A cromatografia de afinidade rendeu 27 mg de proteína solúvel, logo após de tê-la expressado heterologamente a baixas concentrações de indutor IPTG 0,1 mM em três horas de indução. O espectro de CD da proteína purificada mostrou o conteúdo de estrutura secundaria de acordo ao esperado para um membro típico da família de enzimas E2, apresentando um 35 % de hélices α, 21 % de folhas β e 23 % de giros. Alem do mais, a proteína purificada foi capaz de ligar molécula de ubiquitina quando misturada com um extrato de células HeLa, durante o ensaio de pull-down. Desta maneira e com esses resultados apresentados aqui pode se inferir que a proteína humana UBE2G2 foi expressa na sua forma ativa.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-26Bitstream added on 2015-04-09T12:47:33Z : No. of bitstreams: 1 000809536.pdf: 1473123 bytes, checksum: 2b308f972c7df5bb7d769f1d2a9e03f6 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Mesmo com toda evolução de estratégias moleculares de investigação, a etiologia dos Transtornos do Espectro do Autismo (TEA) ainda é bastante discutida, devido a sua variação e complexidade. São doenças que se manifestam nos três primeiros anos de vida, caracterizadas por alterações na comunicação, socialização, comportamento repetitivo e estereotipias, isolados ou associados a defeitos congênitos, doenças genéticas ou outras afecções. Em indivíduos com estas alterações do comportamento, dismórficos ou não dismórficos, já foram descritas alterações em todos os cromossomos e há genes propostos como candidatos de estarem envolvidos na etiopatogenia. Há relatos de casos com alterações, como mutações e variações no número de cópias (CNVs), envolvendo genes expressos no sistema nervoso central. Este estudo investigou por MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), mutações e CNVs nos genes sinápticos UBE3A, GRM5, DLGAP2, NEDD4, NRXN1, CASP3, MAGI2, SHANK1, SHANK2 e PTEN, que também estão envolvidos na formação, manutenção sináptica e neurotransmissão. Também investigou indiretamente outros genes e regiões gênicas possíveis de serem investigadas pelos kits comerciais utilizados. Foram estudados 300 indivíduos com Transtornos do Espectro do Autístismo e encontrados 23(8%) com alterações, em oito dos dez genes selecionados, além de outras três regiões como em PTENP1, KLLN e 16p11.2. Não foram observadas alterações nos genes UBE3A, PTEN e SHANK1. Nenhum paciente apresentou mais do que uma alteração. Nos casos possíveis, foi realizada a investigação da alteração nos progenitores para verificar se foram herdados ou de novo. Em alguns casos os achados genotípicos e fenotípicos puderam ser diretamente relacionados. Os dados mostraram que mutações, duplicações, mas especialmente deleções exônicas não são eventos raros em autistas e parecem participar na patogênese ... / Even with all of molecular evolution research strategies, the etiology of Autism Spectrum Disorders (ASD) is still widely debated, due to its complexity and variation. These are disorders that manifest in the first three years of life, characterized by changes in communication, socialization, repetitive and stereotypic behavior, isolated or associated with birth defects, genetic disorders or other conditions. In individuals with these behavioral changes, dysmorphic or not dysmorphic, changes have been described in all chromosomes and genes proposed there as candidates to be involved in the pathogenesis. There are reports of cases with changes such as mutations and Copy Number Variations (CNVs) involving genes expressed in the central nervous system. This study investigated by MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), CNVs and mutations in synaptic genes UBE3A, GRM5, DLGAP2, NEDD4, NRXN1, CASP3, MAGI2, SHANK1, SHANK2 and PTEN, which are also involved in the formation, maintenance and synaptic neurotransmission. Also indirectly investigated other possible genes and gene regions being investigated by commercial kits. The 300 individuals with the Autism Spectrum Disorders were studied and found 23 (8%) with alterations in eight of the ten selected genes, beyond three others regions as PTENP1, KLLN and 16p11.2. No alterations in UBE3A, PTEN and SHANK1 genes were observed. No patient had more than one alteration. When possible, to investigate the alteration in the parents was performed to determine whether they were inherited or de novo. In some cases the genotypic and phenotypic findings could be directly related. The data showed that mutations, duplications, but especially exonic deletions are not uncommon in autistic events and seem to participate in the pathogenesis of this psychiatric disorder. These alterations may contribute to the predisposition to ASD

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-28Bitstream added on 2015-04-09T12:47:32Z : No. of bitstreams: 1 000809770_20160228.pdf: 127023 bytes, checksum: e3a0523bbaa7ed5c9b3d989ded7cf7b3 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-29T12:16:12Z: 000809770_20160228.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-29T12:17:18Z : No. of bitstreams: 1 000809770.pdf: 6881987 bytes, checksum: 601724eafc5f568c54bebb14ffac19d6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Defeitos congênitos são observados em cerca de 3 a 5% dos recémnascidos e na maioria das perdas gestacionais, contribuem com 50% das mortes neonatais espontâneas e são considerados entre as principais causas de mortalidade infantil. Embora existam muitos estudos poucos foram realizados em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento, e a maioria é de base hospitalar. O objetivo deste estudo caso-controle prospectivo de base populacional foi analisar todos os recém-nascidos e natimortos com defeitos congênitos nascidos no município de São José do Rio Preto/SP, durante um ano, para identificar os tipos de defeitos, etiologias, fatores de risco e consequências. Além disso, avaliar a notificação oficial sobre anomalias congênitas da Declaração de Nascido Vivo. O estudo envolveu equipes multidisciplinares, com a participação de todos os hospitais e parceria com a Secretaria de Saúde do Município. Foram estudadas 5.204 crianças. Destas, 169 apresentaram defeitos congênitos. Os dados foram comparados com 169 crianças controles, sem defeitos. A incidência foi de 3,2%, o que corrobora os dados da literatura. Idade materna avançada, recorrência familial do defeito, ingestão de álcool durante a gestação, diabetes gestacional e abortos anteriores foram alguns dos fatores de risco significantes. As crianças com defeitos congênitos tiveram períodos de internação pós-parto, custos hospitalares e taxa de óbito em menores de um ano de idade significativamente mais elevados do que as do grupo controle. A presença de defeitos congênitos em recém-nascidos do município foi subnotificada em 40,5% dos casos. O conhecimento sobre anomalias congênitas possibilita estratégias preventivas e terapêuticas / Birth defects are observed in around 3 to 5% of newborn babies and most miscarriages and contribute in 50% of spontaneous newborn deaths and thus are considered one of the main causes of infant mortality. Although there have been many studies about birth defects, few have been carried out in under-developed and developing countries and most are hospital based. The objective of this prospective case-controlled population-based study was to analyze all newborns and still-births with birth defects in the municipal of São José do Rio Preto, São Paulo during one year, to identify the types of defects, etiologies, risk factors and consequences. A second objective was to evaluate the official notification of birth defects on the Birth Certificate. The study involved multidisciplinary teams with the participation of all the hospitals of the city in a partnership with the City Health Department. In total 5204 children were studied. Of these, 169 presented birth defects. The data were compared with 169 controls without birth defects. The incidence was 3.2% which corroborates published data. Advanced maternal age, family recurrence of the defect, alcohol ingestion during pregnancy, gestational diabetes and previous miscarriages were some of the most important risk factors. Post-partum hospitalization, hospital costs and death rates of under one-year-old children with birth defects were significantly higher for children with birth defects than for the control group. The under-notification rate of defects in newborn babies of the city was 40.5%. Knowledge about birth defects allows the planning of preventive and therapeutic strategies and adequate public healthcare policies

O uso de marcadores do tipo STR e SNP tem se revelado de grande importância na discriminação entre indivíduos de uma mesma população, assim como para estudos evolutivos. A utilização de um conjunto de 17 STRs e 46 SNPs específicos de cromossomo Y permitiu a caracterização de um conjunto de amostras representativas das populações do Rio de Janeiro e do oeste africano, com uma avaliação mais ampla sobre a ancestralidade de origem paterna. Na primeira parte deste estudo foram analisados 605 indivíduos do sexo masculino do estado do Rio de Janeiro. Como resultado, não foram observadas diferenças significativas entre as populações do sudeste e do Rio de Janeiro, que apresentou uma alta diversidade de haplótipos (0,9999 0,0001) e de haplogrupos (0,7589 0,0171). A comparação da população miscigenada do Rio de Janeiro com diferentes grupos étnicos ou populacionais mostrou que a frequência de indivíduos com marcadores tipicamente Europeus é de 77%, africanos é de 14,87% e em ameríndios é de 2,31%. A segunda parte do estudo revelou uma grande diversidade haplotípica (1,0000 0,0018) numa amostra do Oeste africano. Quanto ao valor da diversidade de haplogrupos (0,6895 0,0200), este foi similar aos observados em populações de origem Bantu do oeste e centro africanos, principalmente de Benin, Nigéria e Costa do Marfim. A terceira parte deste estudo mostrou que não existem diferenças significativas entre o componente africano da amostra do Rio de Janeiro e as populações africanas do sudeste, oeste e centro oeste. Por outro lado, observamos diferenças significativas quando comparamos o componente africano do Rio de Janeiro e o oeste africano com populações de Uganda, Quênia e África do Sul. A ampliação de estudos genéticos nas populações da África se fazem necessários para o entendimento da diversidade genética no mundo. Este trabalho contribuiu para fornecer mais alguns dados genéticos, que podem ser somados aos estudos mundiais que estão sendo realizados, ampliando os nossos conhecimentos sobre a formação das populações que também foram influenciadas pelo fenômeno da Diáspora Africana. / The use of STR and SNP markers has proved to be of great importance to discriminate individuals of the same population as well as for evolutionary studies. The use of a set of 17 STRs and 46 SNPs specific from the Y chromosome allowed the characterization of a group of samples representative of the Rio de Janeiro and the West African populations, with a deep assessment of the paternal ancestry. The first part of this study focused in the analysis of 605 males of the state of Rio de Janeiro. The results showed no significant differences between the Brazilian southeastern populations and Rio de Janeiro, which showed high values of haplotype (0.9999 0.0001) and haplogroup (0.7589 0.0171) diversities. The second part of the study revealed a high haplotype diversity (1.0000 0.0018) in a sample from West Africa. The value of haplogroup diversity (0.6895 0.0200) was similar to those previously seen in the West and Center African Bantu populations, mainly from Benin, Nigeria and Ivory Coast. The third part of this study showed no significant differences between the African component of our sample from Rio de Janeiro and the Southeastern, Western and Midwestern African populations. On the other hand, significant differences were observed when comparing the samples of the African component in Rio de Janeiro and of West Africa with population samples from Uganda, Kenya and South Africa. The increase of genetic studies in African populations is important for a better understanding of world genetic diversity. This work provided new genetic data, which can be added to those already available, expanding our knowledge about the formation of other populations also influenced by the African Diaspora.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Marcadores genéticos presentes no cromossomo Y, como os microssatélites (Y-STRs) e polimorfismos de único nucleotídeo (Y-SNPs) são utilizados na caracterização de linhagens masculinas, visto que são transmitidos às gerações seguintes sem alterações, a menos que ocorram mutações (Singh et al., 2011; Mitchell & Hammer, 1996; Butler, 2009). Por isso, esses marcadores são amplamente empregados em diversas situações, destacando-se o uso constante dos Y-STRs na genética forense por apresentarem alta capacidade de discriminar linhagens. Recentemente, foram descritos 13 marcadores com taxas de mutação substancialmente superiores àquelas verificadas para loci STR do cromossomo Y, denominados Rapidly Mutating (RM) Y-STRs (Ballantyne et al., 2010; Kayser et al., 2012). Devido às taxas de mutação elevadas, os RM-YSTRs apresentam maior eficiência na discriminação entre indivíduos proximamente relacionados, pertencentes à mesma linhagem patrilínea. O presente trabalho buscou aprofundar o conhecimento acerca das características populacionais e mutacionais dos loci RM-YSTRs em amostra do Rio de Janeiro, contribuindo com estudos desta natureza na população brasileira. Realizou-se a análise de 13 loci do cromossomo Y em 258 indivíduos do sexo masculino, compondo 129 pares de pais e filhos, nascidos no estado do Rio de Janeiro. O DNA das amostras foi extraído, conforme os protocolos vigentes na rotina do LDD-UERJ. As sequências genéticas de interesse foram amplificadas pela técnica de reação em cadeira da polimerase (PCR) através da realização de três PCR multiplex, cujos produtos de amplificação foram separados por eletroforese em sequenciador automático ABI-3500 (Applied Biosystems). Para os pares pai/filho que apresentaram haplótipos mutados, empregou-se a técnica de sequenciamento para confirmação das mutações. Os loci RM-YSTR geraram um poder de discriminação de 1,0 na amostra analisada, o que significa que todos os 129 indivíduos da amostra populacional apresentaram haplótipos diferentes para tais marcadores, com frequências de 0,0077 e diversidade haplotípica igual a 1. Além disso, foram obtidos valores elevados de diversidade gênica para os 13 marcadores. A análise de distância genética e os resultados de AMOVA baseados nos valores de Fst demonstraram que os RM-YSTR não indicam subdivisão populacional e traços ancestrais comuns. Tais valores estão associados às elevadas taxas de mutação encontradas, cuja média foi de 2,11 x 10-2. Foi possível observar que os loci RM-YSTR são muito discriminativos na amostra miscigenada analisada, além de terem maior capacidade de diferenciar indivíduos do que outros conjuntos de marcadores normalmente usados em estudos populacionais e análises forenses. Sendo assim, é possível concluir que os marcadores RM-YSTR são promissores para discriminar indivíduos da mesma linhagem patrilínea, visto que devido às suas elevadas taxas mutacionais e poder de discriminação, são capazes de diferenciar indivíduos de maneira mais eficiente do que os outros conjuntos de STR. Porém, é necessário maior número de estudos para melhor caracterização destes loci em diferentes populações. / Genetic markers on Y chromosome, as microsatellites (Y-STRs) and single nucleotide polymorphisms (Y-SNPs) are used for the characterization of male lineages, since they are fully transmitted to next generations unless mutations occurs (Singh et al., 2011; Mitchell & Hammer, 1996; Butler, 2009). Therefore, these markers are widely applied in several situations, highlighting the constant use of Y-STRs in the field of forensic genetics because of their high capacity of discriminate lineages. Recently, 13 rapidly mutating markers were described due to their highly mutation rates in comparison to other common Y-chromosome STRs, being called as Rapidly Mutating Y-STR (RM-YSTR) (Ballantyne et al., 2010; Kayser et al., 2012). As a result of their high mutation rates, RM-YSTRs display high efficiency in discriminating paternally related males. The present work aimed to deepen the knowledge about population and mutational RM-YSTR loci characteristics in Rio de Janeiro sample, and then, contribute to other studies with this purpose in Brazilian population. Y chromosome 13 STRs analysis was realized in 258 males born in Rio de Janeiro state, grouped in 129 fathers/sons pairs. The extraction of DNA from biological samples was performed according to routine protocols from LDD-UERJ. Target sequences were amplified by three polimerase chain reactions (PCR) and the amplicons were separated through electrophoresis on automated sequencer ABI-3500 (Applied Biosystems). When mutations were detected, they were confirmed by sequencing. Among the investigated sample, RM-YSTR loci showed a discrimination capacity of 1,0 which means that all 129 analyzed individuals have different haplotypes for these markers, displaying frequencies of 0,0077 and haplotype diversity of 1,0. Moreover, high values of genetic diversities were obtained for the 13 markers. Distance genetic analysis and AMOVA values based on Fst results did not show population substructure and common ancestral traits. These results are associated with high mutation rates found, with an average rate about 2,11 x 10-2. RM-YSTR showed to be very discriminative at this mixed sample, besides proving to be more discriminative than other markers commonly used in population studies and forensic analysis. Thus, it is possible to conclude that RM-YSTR markers are promising to discriminate individuals of the same male strain and due to their high mutation rates and discrimination capacity, they are able to differentiate individuals better than other common markers. Nevertheless, for a better characterization of these loci in different populations more studies are needed.