A glândula pineal de mamíferos não é uma estrutura oscilatória autônoma, exigindo a liberação de noradrenalina (Nor) na fase escura para que a melatonina seja circadianamente produzida. Na cultura padrão de glândula pineal, o órgão não expressa ritmicidade funcional e para mimetizar o padrão fisiológico de liberação de Nor, desenvolvemos a cultura temporizada com Nor. Logo, o objetivo desse trabalho foi investigar a manutenção do ritmo de expressão dos genes relógio pela cultura temporizada, e qual a via noradrenérgica envolvida. Para os estudos in vitro, realizaram-se culturas dos grupos: controle (sem Nor), agudo (cultura padrão) e temporizado (12h com Nor/12h sem Nor). Além disso, à cultura temporizada se adicionou Prasozin e/ou Propranolol. Analisou-se expressão dos genes relógio, atividade da enzima AANAT e conteúdo de melatonina no meio de cultura. No grupo temporizado, observou-se a manutenção da ritmicidade dos genes analisados, diferente do observado nos grupos controle, agudo e temporizado tratado com bloqueadores, além do aumento da atividade enzimática da AANAT e aumento do conteúdo de melatonina. Em suma, a cultura temporizada com Nor se mostra importante para evitar a arritmicidade encontrada na cultura padrão de glândula pineal. / The mammals pineal gland is not an autonomous oscillator, the circadian melatonin synthesis requires the release of norepinephrine (NE) on the dark phase. In standard pineal gland culture, the glands do not express any functional rhythmicity. To mimic the physiological pattern of NE release in the pineal gland culture, we developed a synchronized culture with NE. We aimed to investigate the maintenance of circadian clock genes expression within rat pineal gland under acute and synchronized culture and the noradrenergic pathway involved. In in vitro experiments, culture glands were under: control (without NE), acute (standard culture) and synchronized (12h with NE/12h without NE) conditions. Furthermore, in the synchronized group were added Prasozin and/or Propranolol. We investigated clock genes expression, AANAT activity and melatonin content. The synchronized culture was able to maintain the rhythmic clock genes expression, which didn´t occur in control, acute and synchronized treated with blockers groups, and was able to improve AANAT activity and melatonin synthesis. In conclusion, synchronized culture method showed as a useful approach to avoid disruption of rhythmic variations found in the standard culture.

A glândula pineal sintetiza o hormônio melatonina no período escuro. No rato, a ativação dos receptores a e b-adrenérgicos aumenta os níveis de AMPc, levando à síntese e ativação da enzima arilalquilamina-N-acetiltransferase (AANAT). A glândula recebe também inervação parassimpática, sendo inibitório o efeito da acetilcolina. A metilecgonidina (AEME) é o produto da pirólise da cocaína, quando esta é usada sob a forma de \"crack\". Neste trabalho estudamos os efeitos e os mecanismos de ação da AEME sobre a síntese da melatonina. Foram investigados a atividade da AANAT, o Ca2+, o AMPc e a viabilidade celular e a fragmentação do DNA. A AEME reduziu a síntese da melatonina in vivo e in vitro, sendo este efeito revertido pela atropina. A AEME induziu um aumento do Ca2+, não alterando o AMPc e a atividade da AANAT. A viabilidade celular e fragmentação do DNA não foram modificadas pela AEME. Em conclusão, a AEME reduz a síntese da melatonina, in vitro e in vivo, e a sua ação se dá por interferir com o sistema colinérgico muscarínico. / The pineal gland synthesizes the hormone melatonin in the dark. In rats, the activation of a and b-adrenergic receptors increases cAMP levels and the synthesis and activity of arylalkylamine-N-acetyltransferase enzyme (AANAT). The pineal gland is also innervated by parasympathetic fibers, being inhibitory the effect of acetylcholine. Methylecgonidine (AEME) is the pyrolysis product of cocaine when it is used as \"crack.\" In this work we studied the effects of AEME on the melatonin synthesis, in vitro and in vivo. We investigated AANAT activity, iCa2+, cAMP, cell viability and DNA fragmentation. AEME reduced melatonin synthesis in vivo and in vitro, and this effect was reversed by atropine. There was an increase in Ca2+, but not in cAMP or AANAT activity induced by AEME. Cell viability and DNA fragmentation were not affected by AEME. In conclusion, AEME reduced melatonin synthesis in vitro and in vivo, being this effect mediated by the muscarinic cholinergic system.

A glândula pineal, via melatonina (MEL), desempenha uma importante função regulatória no metabolismo de carboidratos e parece ser de fundamental importância nas adaptações metabólicas dos tecidos adiposo e muscular. Evidências mostram que animais pinealectomizados são incapazes de se adaptarem a condições estressantes e não conseguem desenvolver as alterações adaptativas ao exercício. Sabendo que o animal idoso apresenta considerável redução da produção de MEL, o objetivo deste estudo foi investigar a adaptação metabólica ao treinamento físico no animal idoso com e sem reposição de MEL. Para tanto, foram utilizados ratos Wistars, com 12 meses de vida, que foram divididos em 4 grupos: controles sedentários; controles treinados; suplementados com MEL sedentários; suplementados com MEL treinados. A suplementação com MEL teve a duração de 16 semanas, enquanto o treinamento físico teve a duração de 8. Os resultados mostraram que a suplementação com MEL em animais idosos tem grande importância nas adaptações induzidas pelo treinamento físico aeróbio / The pineal gland, melatonin (MEL), plays an important physiological and regulatory function in carbohydrate metabolism and seems to be of fundamental importance in determining the metabolic adaptations of adipose and muscle tissues. Evidence shows that pinealectomized animals are unable to adapt to stressful conditions, thus fail to develop adaptive metabolic changes to aerobic exercise and therefore do not exhibit the same performance as control trained animals. Knowing that the elderly animal presents a considerable reduction in MEL production, the objective of this study was to investigate the metabolic adaptation to exercise training in aged animals with and without replacement of MEL. The animals, Male-Wistar, were divided into four groups: sedentary control, trained control, sedentary treated with MEL, trained treated with MEL. The Supplementation with MEL lasted 16 weeks, while physical training lasted 8 weeks. The results demonstrated that MEL supplementation in elderly animals is of great importance in adaptations induced by aerobic exercise.

Investigamos o efeito do exercício físico no metabolismo do tecido adiposo e muscular de ratos pinealectomizados tratados ou não com melatonina. Foram retiradas amostras de sangue, tecido adiposo peri epididimal e músculo sóleo para testes biológicos. O treinamento físico mostrou-se eficiente através do aumento da velocidade máxima, atingida no final do treinamento, e da atividade da citrato sintase no músculo. A pinealectomia alterou o padrão de mobilização e utilização dos substratos pelos adipócitos e células musculares tornando menor a adaptação dos animais ao treinamento, causando um desajuste metabólico em vários parâmetros. Quando tratados com melatonina a adaptação funcional recuperou-se plenamente, tanto no tecido adiposo como muscular. Demonstrando que a glândula pineal tem um papel na regulação do metabolismo de lipídeos e carboidratos em resposta ao treinamento físico, a remoção da glândula causa alterações na resposta adaptativa do tecido adiposo e muscular e o tratamento com melatonina reverte o desajuste metabólico instaurado pela pinealectomia. / The current study investigated the effect of exercise on muscle and adipose tissue metabolism melatonin treated or non treated pinealectomized rats. Blood samples, peri-epididymal adipose tissue and soleus muscle were collected for biological tests. The physical training was efficient in increasing the maximum speed reached at the end of training, and the activity of citrate synthase in muscle. Pinealectomy changed the pattern of mobilization and utilization of substrates adipocytes and muscle cells decreasing the adjustment to the training in these animals, causing a mismatch in several metabolic parameters. When treated with melatonin, the functional adaptation is fully recovered both in adipose tissue and muscle. Demonstrating that the pineal gland has a role in regulating the metabolism of lipids and carbohydrates in response to physical training, the removal of the gland caused changes in the adaptive response of adipose tissue and muscle and the treatment with melatonin reversed the metabolic mismatch introduced by pinealectomy.

A doença de Chagas é um problema de saúde pública, com dados preocupantes do número de pessoas contaminadas e que ainda irão se contaminar. O objetivo desta investigação é avaliar o efeito da melatonina sobre o sistema imune na infecção chagásica experimental. Produzida pela glândula pineal possui várias ações fisiológicas, entre elas a mais importante, controlar o ritmo circadiano na grande maioria dos seres vivos. A melatonina foi administrada por via oral, tendo seu efeito avaliado através da quantificação dos níveis parasitêmicos, leucograma, histopatologia cardíaca e por ensaios imunológicos como IFN, TNF, IL-2, IL-12. A parasitemia foi drasticamente diminuída nos animais infectados e tratados com melatonina refletindo em uma diminuição ou quase ausência da presença de ninhos de amastigotas nas fibras cardíacas desses animais. A melatonina promoveu uma leucocitose com aumento dos neutrófilos e linfócitos. Não foi observada morte em nenhum dos grupos infectados tratados ou não com melatonina. Os ensaios imunológicos mostraram que as citocinas quantificadas apresentaram uma ação imunoestimuladora aumentada em relação aos grupos infectados que certamente foi responsável pela diminuição da carga parasitária sanguícola e tecidual. Dessa forma conclui-se que a melatonina exerceu um papel imunoestimulador importante, agindo sobre o eixo HHA que se refletiu em uma melhor resposta do hospedeiro durante o curso da infecção experimental. / Chagas disease is still considered a major problem in public health, with an alarming number of bearing parasite people and the risk of future contamination. The aim of this investigation is to evaluate a possible immunostimulatory effect of melatonin during the evolution of the experimental disease in Wistar rats infected with the Y strain of T. cruzi. Produced by pineal gland, it has a wide range of physiological functions, among them to control the circadian rhythm in most of the species. In this work melatonin was orally administrated being its effects evaluated by the number of blood trypomastigotes, leucogram, heart hystopathologyn and immunologic assays such IFN-, TNF-, Il-2, Il-12. Parasitemia was drastically reduced in melatonin treated infected animals consequently leading to a drop in the number of amastiogoter burdens being sacarcely found among heart fibers. Melatonin promoted a leucocytosis with enhanced levels of neutrophils and lymphocites. Absence of death was observed in all groups. Immuno-enhanced effects were observed with assays of IL-2, IL12, IFN- and TNF-. when compared to non treated animals. According to our data we conclude that Melatonin displayed an immunostimatory effect over the HHA axis, reducing blood and tecidual parasite consequently avoiding parasite replication during the evolution of the experimental infection in rats.

O objetivo geral da presente tese é testar a hipótese que a pineal faz parte integrante da resposta ao estresse, da mesma forma que está integrada ao processo inflamatório. Dois modelos de estresse, contenção e frio, foram aplicados aos ratos por 30 min ou 2 horas. Os resultados foram: ausência de úlceras gástricas e TNF em nível sérico por ambos os estresses, apenas aumento de corticosterona; somente em duas horas qualquer um dos estresses aumentou significativamente melatonina da pineal; tratamento tanto com metirapona como com mifepristone aboliram indistintamente os efeitos dos estresses; tratamento tanto com talidomida como com fenilefrina não modificaram os efeitos dos estresses. Concluímos que, o estresse moderado agudo, pela ação da corticosterona, promove modulação da pineal na dependência do estado fisiológico da mesma. Confirmamos a existência de uma relação entre as glândulas adrenais e pineal. Afirmamos que a glândula pineal exerce, além de suas clássicas funções cronobióticas, um papel de grande sensor do estado geral ao organismo inteiro. / The objective of this thesis is to test the hypothesis that the pineal is a player on stress response, likewise that it is one player in inflammatory process. Two stress models, restraint and cold, were applied to the rats for 30 min or 2 hous. The results were: absence of gastric ulcers and TNF serum levels in both stresses, just enhancement of corticosterone plasma levels; only in two hours anyone stress increased significantly pineal melatonin; metyrapone or mifepristone treatment abolish indistinctly the effects of the stresses; thalidomide or phenylephrine treatment did not modify the effects of the stresses. We conclude that the acute moderate stress by the corticosterone action promote modulation of pineal on the dependence of the physiological status of itself. We confirm the existence of a network between the adrenal and pineal glands. We affirm that the pineal gland performs, beyond of its chronobiotical classical functions, one role of the great sensor of internal body state to the whole organism.

A prevalência do diabetes mellitus tem aumentado exponencialmente, o estilo de vida noturna e o avanço na idade estão envolvidos neste mecanismo, influenciando também a produção de melatonina. O animal pinealectomizado apresenta resistência insulínica e redução na síntese de GLUT4. Mostramos que no músculo sóleo, houve um aumento na taxa de oxidação de glicose e síntese de glicogênio em todos os grupos treinados. Corroboramos com a literatura mostrando que o diabetes prejudica a sensibilidade da musculatura esquelética a ação da insulina. Tal evento, contudo, é corrigido pela suplementação com melatonina. A combinação destas terapias tem apresentado um efeito positivo do ponto de vista metabólico. / The prevalence of diabetes mellitus has increased, the nocturnal lifestyle and advancing age are involved in this mechanism, influencing the production of melatonin. The pinealectomized animal shows insulin resistance and reduced synthesis of GLUT4. Our results showed that in skeletal muscle (soleus) there was an increase in the rate of glucose oxidation and glycogen synthesis in all groups trained. Our data are consistent with the literature, showing that diabetes mellitus affect the sensitivity of skeletal muscle insulin action, reducing glucose uptake and glycogen synthesis. Nevertheless, this event is corrected by daily supplementation with melatonin. the combination of these therapies have shown a positive effect on metabolism.

Este estudo investigou o efeito protetor da melatonina sobre os danos ao DNA induzidos pela ciclofosfamida (20 e 50mg/kg) sobre as aberrações cromossômicas, fragmentação do DNA, ciclo celular e os sítios sensíveis a Fpg pelo Ensaio Cometa. Os níveis de RNAm de MGMT, p53, p21, Bax, Bcl-2, Top1, CSB e XPF foram analisados por qPCR. Após a remoção cirúrgica da glândula pineal, os animais foram tratados com 1 mg/kg de mel via oral durante 15 dias. Como resultados demonstramos que a melatonina foi capaz de reverter completamente o quadro de aberrações cromossômicas induzidas pela ciclofosfamida, indicando uma possibilidade de uso terapêutico quando da necessidade de uso de medicação quimioterápica. Esse quadro repetiu-se e ficou mais evidente com o estudo específico das lesões oxidativas pelo uso da Fpg. De todos os genes estudados, aquele que teve de forma mais consistente, sua expressão aumentada, sempre, pela melatonina foi XPF. Dessa forma, os mecanismos envolvidos com o reparo do DNA mobilizados pela melatonina parecem, em parte, mobilizar a expressão do gene XPF. / This study investigated the protetive effect of melatonin over DNA damage-induced by cyclophosphamide (20 and 50mg/kg) characterizing chromosomal aberrations, DNA fragmentation, cell cycle and determination of Fpg-sensitives sites by comet assay. The levels of MGMT, p53, p21, Bax, Bcl-2, Top1, CSB and XPF mRNA were examined by qPCR. After pineal gland surgical removal, animals were treated orally with 1 mg/kg of melatonin during 15 days. Results have shown that melatonin treatment was able to completelly revert chromossomal aberrations cyclophosphamide-induced, posssibly indicating a therapy use of melatonin in chemoterapic treatment. This effect was also demonstrated with the studies of oxidative lesions by Fpg-sensitives assay. From all studied genes, XPF showed the most increased expression. Thereby, DNA repair mechanisms triggered by melatonin, seems to mobilize XPF gene expression.

A síntese noturna de melatonina pela glândula pineal é inibida por padrões moleculares associados à patógenos ou à danos, como por exemplo lipopolissacarídeo (LPS) ou peptídeo β-amilóide. A interação destas moléculas com receptores toll 4 (TLR4) ativa o eixo imune-pineal, favorecendo a migração de leucócitos para o local da injúria. Heparan sulfato (HS) é um glicosaminoglicano da matrix extracelular que por dano tecidual, inflamação generalizada ou migração de células tumorais, liberam dissacarídeos que podem ligar a TLR4, levando a formação de uma resposta inflamatória. Avaliamos se HS poderia prejudicar a atividade da melatonina. HS é capaz de inibir a síntese noturna de melatonina, através da supressão da expressão gênica e do conteúdo enzimático de acetilserotonina O-metiltransferase (ASMT). Este efeito é modulado pela interação de HS com TLR4, mas não envolve a via de translocação nuclear de NF-κB. Estes dados sugerem que um aumento de moléculas de HS na matriz da glândula pineal é traduzido a todo o organismo por uma redução no pico noturno de melatonina. / The nocturnal synthesis of melatonin by the pineal gland is inhibited by pathogen or damage-associated molecular patterns, such as lipopolysaccharide (LPS) and β-amyloid peptide. The interaction of these molecules with toll like receptors 4 (TLR4) activates the immune-pineal axis, favoring the migration of leukocytes for the site of lesion. Heparan sulfate (HS), a glycosaminoglycan of the extracellular matrix, that in case of tissue injury, generalized inflammation or migration of tumor cells, releases disaccharide, which can bind to TLR4 triggering an inflammatory response. Here we evaluated if HS could impair nocturnal melatonin activity. HS is capable of inhibit the melatonin synthesis by the suppression of the gene expression and enzymatic content of acetylserotonin O-methyltransferase (ASMT). This effect is modulated by the interaction of HS with TLR4, but does not involve the NF-κB nuclear translocation pathway. This data suggest that the increase in HS in pineal gland matrix is translated to the whole organism by a reduction in the nocturnal melatonin peak.

A glândula pineal de mamíferos sintetiza o hormônio melatonina exclusivamente durante o período noturno. A síntese é regulada primordialmente pela via retino-hipotalâmico-pineal e modulada por vários fatores, incluindo o sistema peptidérgico. Assim, o papel da insulina na regulação da síntese de melatonina foi estudado a partir da realização de culturas de glândulas pineais estimuladas com noradrenalina, insulina e noradrenalina associada à insulina, em culturas temporizadas ou não pela noradrenalina, avaliando: a produção de melatonina por HPLC com detecção eletroquímica; as atividades das enzimas envolvidas na síntese da melatonina, por radiometria; assim como, a expressão gênica das enzimas quantificada por Real-Time PCR. Os resultados sugerem uma interação entre as vias de sinalização da noradrenalina e da insulina, com a respectiva potencialização da síntese da melatonina, induzida por noradrenalina, observada pela adição da insulina, efeito esse, que se dá, provavelmente através de mecanismos pós-transcricionais. / The mammalian pineal gland synthesizes the neurohormone melatonin exclusively during the dark phase. Its synthesis is primarily regulated via a retino-hypothalamic-pineal pathway and modulated by many factors, including the peptidergic system. Thus, the role of insulin on the regulation of melatonin synthesis was studied using cultured gland treated with norepinephrine, insulin and norepinephrine associated to insulin. The cultures were also synchronized or not by norepinephrine. Melatonin content was assayed by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) with electrochemical detection, melatonin synthesis enzymes activities by radiometry and enzymes gene expressions by Real-Time PCR. The results suggest an interaction between norepinephrine and insulin signaling pathway, with insulinic potentialization on melatonin synthesis norepinephrine-mediated, and this effect, seems to accurs potentially through post-transcriptional events.