A esquistossomose é uma doença causada por trematódeos do gênero Schistosoma. Dentre os genes identificados no transcriptoma do parasita, membros da família gênica SmVAL (Schistosoma mansoni Venom Allergen-Like) foram apontados como candidatos vacinais. SmVALs foram identificadas em secreções de cercárias e esquistossômulos cultivados in vitro, os transcritos SmVAL4 e 24 foram localizados nas glândulas acetabulares de germ ball e a proteína nativa SmVAL4 foi identificada em extrato de cercárias, indicando funções durante a penetração da pele. Já os transcritos SmVAL13 e 14 foram localizados na glândula esofágica anterior de vermes adultos, sugerindo papéis no processo de alimentação sanguínea. A imunização com as proteínas rSmVAL4, 6, 7, 13, 14 e 18 coadministradas não protegeu camundongos contra o desafio experimental, porém, observou-se uma diminuição do número de fêmeas e do número de ovos no grupo imunizado. A investigação de funções para as proteínas secretadas mostrou que a rSmVAL18 interage com plasminogênio in vitro favorecendo a invasão do hospedeiro. / Schistosomiasis is a disease caused by trematodes of the genus Schistosoma. Among the genes identified in the parasite transcriptome, members of SmVAL (Schistosoma mansoni Venom Allergen-Like) gene family were proposed as vaccine candidates. SmVALs were identified in cercariae and schistosomule secretions in vitro, the SmVAL4 and 24 transcripts were located to the germ ball acetabular glands and SmVAL4 native protein was identified in cercariae extract, indicating functions in skin penetration. On the other hand, SmVAL13 and 14 transcripts were located to the anterior esophageal gland of adult worms, suggesting roles in the blood feeding processes. Immunization with rSmVAL4, 6, 7, 13, 14 and 18 proteins co-administered did not protected mice against experimental challenge, however, there was a decrease in the number of females and the number of eggs in the immunized group. The investigation of functions for secreted proteins showed that rSmVAL18 interacts with plasminogen in vitro thus favoring the host invasion.

Nos casos de hiperparatireoidismo secundário onde não é possível o tratamento clínico, é indicada a paratireoidectomia. No Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, o tipo de cirurgia utilizada é a paratireoidectomia total com auto-implante de paratireóide em membro superior. Nesses casos, ao contrário da paratireoidectomia total, pode haver recidiva do hiperparatireoidismo no sítio do implante, com sintomas sistêmicos e com necessidade de intervenção para retirada do tecido hiperplásico. Já na paratireoidectomia total, há hipoparatireoidismo definitivo e risco de doença óssea adinâmica. O presente estudo tem como escopo avaliar os pacientes submetidos a paratireoidectomia com implante e esclarecer se há fatores clínicos e de imunohistoquímica que possam indicar antes da cirurgia algum risco de recidiva no implante / When clinical treatment of secondary hyperparathyroidism fails, parathyroidectomy is mandatory. Total parathyroidectomy and immediate parathyroid autotransplantation in the forearm is the treatment of choice at Head and Neck Surgery of Hospital das Clínicas of University of São Paulo Medical School. In this cases, recurrent hyperparathyroidism may be caused by hyperplastic graft tissue. Without autotransplantation, adinamic bone disease may occur. The present study seek to evaluate patients submitted to total parathyroidectomy and autotransplantation and try to clarify clinical or immunohistochemical

Nos casos de hiperparatireoidismo secundário onde não é possível o tratamento clínico, é indicada a paratireoidectomia. No Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, o tipo de cirurgia utilizada é a paratireoidectomia total com auto-implante de paratireóide em membro superior. Nesses casos, ao contrário da paratireoidectomia total, pode haver recidiva do hiperparatireoidismo no sítio do implante, com sintomas sistêmicos e com necessidade de intervenção para retirada do tecido hiperplásico. Já na paratireoidectomia total, há hipoparatireoidismo definitivo e risco de doença óssea adinâmica. O presente estudo tem como escopo avaliar os pacientes submetidos a paratireoidectomia com implante e esclarecer se há fatores clínicos e de imunohistoquímica que possam indicar antes da cirurgia algum risco de recidiva no implante / When clinical treatment of secondary hyperparathyroidism fails, parathyroidectomy is mandatory. Total parathyroidectomy and immediate parathyroid autotransplantation in the forearm is the treatment of choice at Head and Neck Surgery of Hospital das Clínicas of University of São Paulo Medical School. In this cases, recurrent hyperparathyroidism may be caused by hyperplastic graft tissue. Without autotransplantation, adinamic bone disease may occur. The present study seek to evaluate patients submitted to total parathyroidectomy and autotransplantation and try to clarify clinical or immunohistochemical

Hiperplasia congênita de suprarrenal (CAH) compreende um grupo de transtornos hereditários decorrentes de erros inatos do metabolismo dos esteróides adrenais. O aumento das dimensões das glândulas suprarrenais é um marco morfológico na CAH que pode ser avaliado por métodos de imagem com signifitiva correlação com o controle hormonal dos pacientes. Porém, técnicas de imagem que forneçam informações qualitativas e quantitativas relativas à citoarquitetura das glândulas ainda não foram estabelecidas neste contexto. A difusão por ressonância magnética (DWI) é uma técnica que pode fornecer informações quantitativas dos tecidos através do valor do coeficiente de difusão aparente (ADC). O papel do ADC na avaliação de lesões tumorais adrenais já foi estudado, no entanto, o valor do ADC das glândulas suprarrenais normais ainda não foi descrito. O objetivo geral desta tese foi investigar a utilidade dos métodos de imagem na avaliação da CAH. Os objetivos específicos foram apresentar uma revisão dos métodos por imagem já estabelecidos para avaliação da CAH, validar o cálculo do ADC da glândula suprarrenal e avaliar se o ADC e as dimensões das glândulas suprarrenais poderiam auxiliar no manejo de pacientes com CAH, correlacionando-os com controle hormonal. Esta tese é baseada em artigos, nos quais estão mostrados a metodologia, resultados e discussões relativos a cada uma das etapas. O primeiro artigo, The role of imaging in congenital adrenal hyperplasia, trata de uma revisão sistemática de imagem em CAH, com ênfase em genitografia, ultrassonografia, tomografia computadorizada e ressonância magnética (MRI). O segundo artigo, Apparent Diffusion Coefficient (ADC) of the normal adrenal glands: premilinary results, teve como principal objetivo validar o método de medida do ADC das glândulas suprarrenais. No terceiro artigo, Quantitative magnetic resonance imaging in the evaluation of adrenal glands in children and young adults with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency, foram estudados os parâmetros quantitativos por MRI (ADC, volume e medidas lineares) das glândulas suprarrenais que poderiam estar relacionados ao controle hormonal dos pacientes com CAH. Medir o ADC das suprarrenais normais é factível e reprodutível. Em indivíduos saudáveis após a adrenarca o ADC é significativamente menor. Todavia, o ADC não foi capaz de diferenciar indivíduos controles de pacientes com CAH, assim como não apresentou correlação com o status hormonal dos pacientes. O volume e as medidas lineares das glândulas adrenais foram os melhores parâmetros quantitativos por MRI para diferenciar pacientes de indivíduos controles, com correlação positiva com o status hormonal recente dos pacientes com CAH. As dimensões das glândulas suprarrenais avaliadas por MRI podem ser utilizadas como ferramenta auxiliar no acompanhamento dos pacientes e mostrar rapidamente os efeitos da exposição a altos níveis de hormônio adrenocorticotrópico. Apesar de ocorrerem modificações celulares na CAH e de ter sido mostrado neste estudo que em pacientes sem doença hormonal conhecida o ADC é mais baixo após a adrenarca, estas alterações celulares que ocorrem na CAH não foram detectadas pelas medidas de ADC. / Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is an autossomic recessive disorder caused by impaired steroidogenesis. A morphological hallmark in CAH is enlarged adrenal glands. Imaging studies have addressed mainly morphological aspects and dimensions of the adrenal glands, which correlate to the patients hormonal statuses. However, no imaging technique was used to evaluate changes in the adrenal glands at a cellular level in these patients. Diffusion-weighted magnetic resonance imaging (DWI) is a magnetic resonance imaging (MRI) technique with the ability to provide quantitative information about intracellular and extracellular space, given by the apparent diffusion coefficient (ADC) values. The role of ADC in evaluation of adrenal lesions has already been studied. However, ADC of the normal adrenals has not yet been described. The main purposes of this study were: to investigate the role of imaging in CAH, to validate the method of calculating ADC values of the normal adrenal glands and to assess hormonal status in patients with CAH and its correlation to quantitative MRI. This is an article-based thesis divided in three articles. The first article, The role of imaging in congenital adrenal hyperplasia, is a systematic review of imaging in congenital adrenal hyperplasia, with emphasis on genitography, ultrasonography, computed tomography and MRI. The article Apparent diffusion coefficient (ADC) of the normal adrenal glands: premilinary results aimed to validate the method of measuring ADC of the adrenal glands. The study of quantitative parameters (ADC, volume and linear measurements) of the adrenals evaluated by MRI that correlate with hormonal status in patients with CAH is described in the third article, Quantitative magnetic resonance imaging in evaluation of the adrenal glands in children and young adults with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Measuring ADC of the normal adrenal glands is feasible and reproducible. In healthy subjects, ADC values were significantly lower after adrenarche. However, neither a difference between ADC values of controls and patients, nor correlations with patients hormonal statuses were found. Volume and linear measurements of the adrenal glands were the best parameter to differentiate patients from controls. Moreover, a positive correlation was found between short-term hormonal control status and adrenal size. Adrenal size assessed by MRI might be a useful tool in the follow-up of patients with CAH. Although adrenal cell structure modifications in patients with CAH have been described, they were not detectable by DWI.

O hormônio adrenocorticotrópico, ACTH, regula função (esteroidogênese) e proliferação das células da córtex das glândulas adrenais através de um único receptor específico, ACTHR, que pertence à superfamília GPCR (G-protein coupled receptors). Embora o ACTHR tenha sido clonado há 8 anos, os mecanismos moleculares das ações mitogênica e anti-mitogênica de ACTH permanecem obscuros, cuja elucidação é objeto de estudo deste trabalho. A abordagem experimental consistiu na clonagem do ACTHR de células adrenocorticais Y-1 de camundongo e expressão funcional em fibroblastos 3T3 e células AR-1. Clones transfectantes, expressando estavelmente ACTHR, mostraram-se responsivos a ACTH através de: a) ativação de adenilato ciclase e b) indução de genes das famílias fos e jun. Por outro lado, medidas de síntese de DNA e proliferação celular indicam que ACTH não tem nenhum efeito mitogênico ou anti-mitogênico nos transfectantes ACTHR. O gene c-fos foi usado como alvo para testar vias de transdução de sinal ativadas por ACTH nos transfectantes 3T3 ACTHR. Estes testes mostraram que PKA, PKC e MAPK tem pouca ou nenhuma participação na indução de c-fos por ACTH nos clones 3T3 ACTHR, sugerindo que ACTHR pode ativar vias ainda não identificadas e motivando a busca de novas vias ativadas por ACTH nas células Y-1. Verificou-se que células Y-1 apresentam níveis constitutivamente elevados de AKT/PKB ativada (fosforilada), dependentes de PI3K e SRC, e que ACTH promove rápida desfosforilação de AKT via Gs/Adenilato Ciclase/cAMP/PKA. Ao promover a inativação de AKT, ACTH promove simultaneamente a indução da proteína p27'IND.Kip1', um mecanismo que contribui para a atividade anti-mitogênica de ACTH. / The adrenocorticotropic hormone, ACTH, regulates both function and proliferation of adrenocortical cells binding to a specific receptor, ACTHR, which belongs to superfamily of GPCR (G-protein coupled receptors). ACTHR was cloned a few years ago, but the molecular mechanisms underlying the mitogenic and anti-mitogenic actions of ACTH remain unknown, whose elucidation is aim of this project. The experimental approach was to clone the ACTHR from mouse Y-1 adrenocortical cells and to express the functional receptor in Balb 3T3 fibroblasts and AR-1 cells. Transfectant clones stably expressing the ACTHR respond to ACTH treatments by: a) adenylate cyclase activation and b) induction of fos and jun genes. On the other hand, experiments of DNA synthesis and cellular proliferation showed that ACTH has not mitogenic or anti-mitogenic effects in ACTHR transfectants. c-fos gene was used as a target to test signal transduction pathways activated by ACTH into 3T3 ACTHR transfectants. The results showed that PKA, PKC and MAPK have no relevant contribution on the ACTH c-fos induction in 3T3 ACTHR transfectants suggesting that ACTHR can activate signal transduction pathways still not identified. This conclusion prompted us to search for another signal transduction pathways triggered by ACTHR in Y-1 adrenocortical cells. This search led to the detection of high constitutive levels of activated AKT/PKB in Y-1 adrenocortical cells, which are dependent on PI3K and SRC. ACTH causes a strong and rapid downregulation of activated AKT in a Gs/Adenylate Cyclase/cAMP/PKA dependent manner. Apparently, dephosphorylation of AKT promoted by ACTH releases transcription factors that induce p27'IND.Kip1', a likely mechanism underlying ACTH anti-mitogenic effects in adrenocortical cells.

Mosquitos são os mais importantes vetores de patógenos humanos, transmitindo um amplo espectro de doenças infecciosas emergentes e reemergentes. Nesse cenário, o mosquito Aedes aegypti está entre as espécies mais relevantes. No presente estudo investigamos as atividades do extrato de glândula salivar (EGS) desse mosquito vetor na biologia das células dendríticas e dos linfócitos T. Nossos dados revelam que o EGS não interfere na diferenciação, maturação e função de células dendríticas murinas. Entretanto, componentes salivares desse mosquito possuem um efeito direto sobre linfócitos. O mecanismo de ação do EGS envolveu a apoptose de células T naïve, enquanto células de memória foram mais resistentes a essa atividade. Uma molécula com peso molecular acima de 400 kDa é provavelmente a responsável por esse efeito. Em conjunto, os resultados gerados por esse trabalho contribuem com a elucidação dos efeitos biológicos da saliva de Ae. aegypti na imunidade de seus hospedeiros e, conseqüentemente, seu papel na transmissão de doenças. / Mosquitoes are the most important vectors of human pathogens, transmitting a wide range of emerging and re-emerging infectious diseases. In this scenario, Aedes aegypti is a relevant mosquito species. In the present study, we have investigated the activities of the salivary gland extract (SGE) of this mosquito vector on the dendritic cell and T lymphocyte biology. Our data reveals that the SGE does not interfere on the differentiation, maturation and function of murine dendritic cells. However, salivary components of these mosquitoes have a direct effect on lymphocytes. The mechanism of action of SGE involved apoptosis of naïve T cells, while memory cells were more resistant to this activity. A molecule with molecular weight above 400 kDa is likely responsible for this effect. .Taken together, the results generated by this work contribute to the understanding of the biological effects of Ae. aegypti saliva on the host and, consequently, its role on the transmission of diseases.

A deficiência da 21-hidroxilase é uma doença genética comum, causada por mutações no gene CYP21A2, que codifica a enzima 21-hidroxilase (P450c21). A deficiência da 21-hidroxilase afeta a síntese de cortisol e aldosterona e promove acúmulo de precursores, que são desviados para a síntese de andrógenos. Observa-se três principais fenótipos: a forma clássica virilizante simples (VS), na qual as meninas nascem com virilização da genitália externa e ambos os sexos apresentam virilização pós-natal; a forma perdedora de sal (PS), na qual além da virilização, ambos os sexos apresentam crise de perda de sal no período neonatal; e a forma não clássica (NC), na qual os sintomas de hiperandrogenismo iniciam-se mais tardiamente, na infância, adolescência ou idade adulta. Os estudos in vitro das mutações do CYP21A2 demonstram que existe uma boa correlação do grau de comprometimento da atividade enzimática conferido pelo genótipo com o fenótipo. Entretanto, existem algumas divergências como: pacientes que apresentam quadro clínico e hormonal de forma não clássica, nos quais mutações não são identificadas em um ou em ambos os alelos do CYP21A2, e pacientes que apresentam o fenótipo mais leve do que o predito pelo genótipo. Essas divergências sugerem a presença de fatores moduladores do fenótipo na deficiência da 21-hidroxilase. A primeira hipótese foi de que houvesse mutações no gene P450 óxido-redutase (POR), que codifica uma flavoproteína que doa elétrons para as enzimas microssomais P450, inclusive a P450c21, passo fundamental para a atividade enzimática das mesmas. A segunda hipótese foi de que outras enzimas P450, que não a P450c21, tivessem a capacidade de realizar a 21-hidroxilação extra-adrenal da progesterona e 17OH-progesterona (17OHP), sendo então capazes de modular o fenótipo da perda de sal e/ou virilização. Os citocromos P450 hepáticos CYP2C19 e CYP3A4, responsáveis pelo metabolismo de drogas, são capazes de realizar 21-hidroxilação da progesterona, porém essa atividade nunca foi comparada com a atividade de 21-hidroxilação da P450c21, a fim de que se possa extrapolar a importância dessa atividade extra-adrenal in vivo. A casuística desse estudo constou de 11 pacientes com a forma NC e genótipo incompleto, e 6 pacientes com fenótipo discordante do genótipo (5 com genótipo predizendo forma PS e manifestando forma VS, e 1 com genótipo predizendo VS e apresentando forma NC). O gene POR foi sequenciado em todos 17 pacientes e 10/30 alelos não relacionados apresentavam o polimorfismo A503V. O estudo funcional foi realizado através da expressão em bactéria do P450c21, do POR selvagem (PORwt) e da variante do POR A503V, e de estudo enzimático in vitro comparando a 21-hidroxilação da P450c21 promovida pela PORwt e POR A503V. Essa comparação foi realizada através de cálculos dos parâmetros que avaliam cinética enzimática (Km, Vmax e Vmax/Km). Apesar da variante POR A503V diminuir significativamente a atividade da P450c17 in vitro, nosso estudo demonstrou que ela não altera a capacidade de 21-hidroxilase da P450c21. Portanto, não existem substituições no POR que justifiquem as discordâncias de fenótipo/genótipo na deficiência da 21-hidroxilase nesta casuística. Para avaliarmos o papel da 21-hidroxilação extra-adrenal, as enzimas P450c21, as enzimas P450 hepáticas CYP2C19 e CYP3A4 e o POR foram expressos em bactéria. A capacidade das enzimas P450c21, CYP2C19 e CYP3A4 de 21- hidroxilar progesterona e 17OHP foram avaliadas in vitro e medidas através dos mesmos parâmetros de cinética enzimática. Comparado com a P450c21, o Vmax/Km da 21-hidroxilação da progesterona pelos CYP2C19 e CYP3A4 foram 17% e 10%, respectivamente. Os citocromos hepáticos não apresentaram atividade de 21-hidroxilação da 17OHP. Considerando que uma atividade residual mínima de 21-hidroxilação da progesterona é satisfatória para produzir quantidades suficientes de aldosterona para se evitar a perda de sal, este estudo sugere que a atividade de 21-hidroxilação extra-adrenal do CYP2C19 e CYP3A4 é capaz de melhorar o fenótipo de perda de sal, mas não o da deficiência de glicocorticóide. O gene CYP2C19, ao contrário do CYP3A4, é extremamente polimórfico, e são descritos vários haplótipos com diferentes atividades enzimáticas, os quais explicam as diferenças no metabolismo de várias drogas utilizadas na prática clínica. O único polimorfismo ultra-metabolizador é o CYP2C19*17, representado por duas substituições na região promotora que aumentam a transcrição do gene em 2-4 vezes. Os indivíduos que apresentam o haplótipo ultra-metabolizador podem ter maior atividade de 21-hidroxilação extraadrenal da progesterona e, dessa forma, não apresentarem a crise de perda de sal. O gene CYP2C19 foi sequenciado nos cinco pacientes com genótipo de forma perdedora de sal e que não desidrataram como predito, e encontramos o haplótipo ultra-metabolizador em homozigose em 1/5 pacientes e em heterozigose em 1/5 pacientes. Heterozigose para o CYP2C19*17 também foi encontrada no grupo controle (indivíduos perdedores de sal com genótipo/fenótipo concordantes). Portanto, o haplótipo CYP2C19*17 em heterozigose é insuficiente para modular a perda de sal e, provavelmente, em homozigose pode evitar a perda de sal. Em conclusão, pela primeira vez descrevemos o efeito modulador de uma variante alélica dos citocromos hepáticos P450 melhorando o fenótipo da forma perdedora de sal; no entanto, os demais casos permanecem com indefinição do genótipo. Estes resultados sugerem que não apenas uma única enzima, mas múltiplas enzimas extra-adrenais estão possivelmente envolvidas na modulação do fenótipo da deficiência da 21-hidroxilase. / Adrenal 21-hydroxylase deficiency is a common genetic disorder, caused by mutations in the CYP21A2 gene, which encodes the 21-hydroxylase P450c21. The 21-hydroxylase deficiency disrupts cortisol and aldosterone biosynthesis and leads to accumulation of androgen precursors. There are 3 main phenotypes: the simple virilizing (SV) form, in which girls present with virilized external genitalia at birth and both sexes present with precocious pseudopuberty; the salt wasting (SW) form, characterized by additional salt-wasting crisis in the neonatal period in both sexes; and the nonclassic (NC) form, in which the hyperandrogenic signs occur later in life, during childhood, adolescence or adulthood. In vitro studies show a good correlation between the degree of enzymatic impairment determined by genotype and phenotype. However, there are some discrepancies as: patients with clinical and hormonal profiles of nonclassic form in whom mutations are not found in one or both alleles, and patients with milder phenotype than the ones predicted by genotyping. These discrepancies suggest the existence of modulatory factors in 21- hydroxylase deficiency phenotype. The first hypothesis was that there were mutations in P450 oxidoreductase (POR), a gene which encodes a flavoprotein that donates electrons for all microsomal P450s, including P450c21, an essential step for P450s activity. The second hypothesis was that other enzymes that not P450c21 could perform extra-adrenal 21-hydroxylation of progesterone and 17OHprogesterone (17OHP), modulating salt balance and virilization. Hepatic drugmetabolizing P450 enzymes CYP2C19 and CYP3A4 can 21-hydroxylate progesterone; however, this activity was never compared to 21-hydroxylation performed by P450c21, in order to determine the importance of this extra-adrenal activity in vivo. The present cohort consisted of 11 patients with nonclassic form and incomplete genotype and 6 patients with genotype/phenotype discrepancies (genotype-predicted SW form and manifested SV form, n=5; genotyped-predicted SV form and manifested NC form, n=1). The POR gene was sequenced in these 17 patients, and 10/30 alleles presented the polymorphism A503V. P450c21, PORwt and POR A503V were expressed in bacteria, assayed in vitro, and the kinetics parameters Km, Vmax and Vmax/Km were calculated. Although POR A503V variant decreases the activity of P450c17, our study showed that it does not alter the 21-hydroxylation by P450c21. Therefore, there are no POR variants in this cohort that could explain discrepancies between genotype and phenotype in 21- hydroxylase deficiency. To evaluate the hypothesis of extra-adrenal 21- hydroxylation, P450c21, CYP2C19, CYP3A4, and POR were expressed in bacteria, assayed in vitro, and kinetic parameters assessed. Compared to P450c21, the Vmax/Km of 21-hydroxylation of progesterone by CYP2C19 and CYP3A4 was 17% and 10%, respectively. Neither CYP2C19 nor CYP3A4 were able to 21-hydroxylate 17OHP. Considering that little 21-hydroxylation activity is enough to produce sufficient amount of aldosterone to avoid the dehydration, this study suggests that extra-adrenal 21-hydroxylation by CYP2C19 and CYP3A4 may be able to ameliorate the mineralocorticoid, but not the glucocorticoid deficiency. CYP2C19 is very polymorphic, and some haplotypes can modify enzymatic activity. For example, the unique ultrametabolizer allele CYP2C19*17 has two polymorphisms in the promoter region that increase gene transcription in 2-4 times. Thus, patients harboring the CYP2C19 ultra-metabolizer allele could present an increased extraadrenal 21-hydroxylation of progesterone, and hence be able to avoid salt wasting crisis. CYP2C19 gene was sequenced in the 5 patients who did not present salt wasting crisis as expected, and 1/5 patients was homozygous and 1/5 patients was heterozygous for the CYP2C19*17 allele. Heterozygosity was also present in the control group (patients with salt wasting form and genotype/phenotype concordance). Therefore, heterozygosity for CYP2C19*17 seems to be insufficient to modulate salt balance but homozygosity might be able to avoid salt wasting crisis. In conclusion, we described for the first time the modulatory effect of an allelic variant of an extra-adrenal P450 enzyme ameliorating the salt wasting phenotype in a patient with 21-hydroxylase deficiency. Taken together with the remaining undefined genotypes, these results suggest that multiple extra-adrenal enzymes, rather than a single one, modulate the phenotypic expression of defects in 21-hydroxylase.

O hormônio adrenocorticotrópico, ACTH, regula função (esteroidogênese) e proliferação das células da córtex das glândulas adrenais através de um único receptor específico, ACTHR, que pertence à superfamília GPCR (G-protein coupled receptors). Embora o ACTHR tenha sido clonado há 8 anos, os mecanismos moleculares das ações mitogênica e anti-mitogênica de ACTH permanecem obscuros, cuja elucidação é objeto de estudo deste trabalho. A abordagem experimental consistiu na clonagem do ACTHR de células adrenocorticais Y-1 de camundongo e expressão funcional em fibroblastos 3T3 e células AR-1. Clones transfectantes, expressando estavelmente ACTHR, mostraram-se responsivos a ACTH através de: a) ativação de adenilato ciclase e b) indução de genes das famílias fos e jun. Por outro lado, medidas de síntese de DNA e proliferação celular indicam que ACTH não tem nenhum efeito mitogênico ou anti-mitogênico nos transfectantes ACTHR. O gene c-fos foi usado como alvo para testar vias de transdução de sinal ativadas por ACTH nos transfectantes 3T3 ACTHR. Estes testes mostraram que PKA, PKC e MAPK tem pouca ou nenhuma participação na indução de c-fos por ACTH nos clones 3T3 ACTHR, sugerindo que ACTHR pode ativar vias ainda não identificadas e motivando a busca de novas vias ativadas por ACTH nas células Y-1. Verificou-se que células Y-1 apresentam níveis constitutivamente elevados de AKT/PKB ativada (fosforilada), dependentes de PI3K e SRC, e que ACTH promove rápida desfosforilação de AKT via Gs/Adenilato Ciclase/cAMP/PKA. Ao promover a inativação de AKT, ACTH promove simultaneamente a indução da proteína p27'IND.Kip1', um mecanismo que contribui para a atividade anti-mitogênica de ACTH. / The adrenocorticotropic hormone, ACTH, regulates both function and proliferation of adrenocortical cells binding to a specific receptor, ACTHR, which belongs to superfamily of GPCR (G-protein coupled receptors). ACTHR was cloned a few years ago, but the molecular mechanisms underlying the mitogenic and anti-mitogenic actions of ACTH remain unknown, whose elucidation is aim of this project. The experimental approach was to clone the ACTHR from mouse Y-1 adrenocortical cells and to express the functional receptor in Balb 3T3 fibroblasts and AR-1 cells. Transfectant clones stably expressing the ACTHR respond to ACTH treatments by: a) adenylate cyclase activation and b) induction of fos and jun genes. On the other hand, experiments of DNA synthesis and cellular proliferation showed that ACTH has not mitogenic or anti-mitogenic effects in ACTHR transfectants. c-fos gene was used as a target to test signal transduction pathways activated by ACTH into 3T3 ACTHR transfectants. The results showed that PKA, PKC and MAPK have no relevant contribution on the ACTH c-fos induction in 3T3 ACTHR transfectants suggesting that ACTHR can activate signal transduction pathways still not identified. This conclusion prompted us to search for another signal transduction pathways triggered by ACTHR in Y-1 adrenocortical cells. This search led to the detection of high constitutive levels of activated AKT/PKB in Y-1 adrenocortical cells, which are dependent on PI3K and SRC. ACTH causes a strong and rapid downregulation of activated AKT in a Gs/Adenylate Cyclase/cAMP/PKA dependent manner. Apparently, dephosphorylation of AKT promoted by ACTH releases transcription factors that induce p27'IND.Kip1', a likely mechanism underlying ACTH anti-mitogenic effects in adrenocortical cells.

Os tumores adrenocorticais (TAC) são lesões que se originam do córtex da glândula suprarrenal e ocorrem tanto em crianças quanto em adultos. Técnicas de imagem que forneçam informações quantitativas relativas à citoarquitetura desses tumores ainda não foram estabelecidas neste contexto. A difusão por ressonância magnética (DWI) é uma técnica que pode fornecer informações quantitativas dos tecidos através do valor do coeficiente aparente de difusão (ADC). O papel do ADC nas lesões tumorais adrenais tem sido estudado, porém sua relação com critérios histopatológicos e prognósticos ainda não foram descritos. O objetivo geral deste estudo é investigar a utilidade dos métodos de imagem realizando um paralelo na correlação clínica, histopatológica entre TAC em crianças e carcinoma adrenocortical (CAC) nos adultos. Os objetivos específicos são correlacionar os valores do ADC tumoral a escores histopatológicos, celularidade e Ki-67 tanto em crianças quanto em adultos, avaliando ainda a concordância entre-observadores nas medidas dos ADCs em pacientes e em controles. Este trabalho será baseado em três artigos, nos quais mostrarão a metodologia, resultados e discussões relativos à cada uma das etapas. O primeiro artigo, \"Neoplasias adrenocorticais em adultos e crianças: apresentações distintas. Revisão dos aspectos clínicos, patológicos e do diagnostico por imagem\" trata-se de uma revisão da literatura e análise comparativa sobre as características clínicas, histopatológicas e por imagem dos TAC em crianças e adultos. O segundo artigo, Estudo dos parâmetros derivados do histograma do coeficiente aparente de difusão obtido pela técnica de difusão por RM na avaliação de prognóstico do carcinoma adrenocortical\", estudou CAC em adultos e buscou associar o ADC com os critérios clínicos, histopatológicos, celularidade e o Ki-67. No terceiro artigo \"Tumores Adrenocorticais Pediátricos valores de ADC na diferenciação entre adenomas e carcinomas e sua relação com critérios histopatológicos\" foi realizado em crianças com TAC buscando uma tentativa de diferenciação pelo ADC entre tumores com comportamentos benignos e malignos seja clínica ou histopatologicamente. Os valores de ADCmínimo (ADCmín) e máximo nos adultos, demonstraram ser úteis para diferenciar controles de pacientes com CAC. O ADCmín nos pacientes adultos com CACs evidenciaram que podem ser utilizados para inferir celularidade tumoral. Este estudo ainda reafirmou em adultos com CAC, os valores do Ki-67 como marcador prognóstico e demonstrou uma boa relação da celularidade com o sistema de Weiss. Já nas crianças, houve correlação inversa de alguns dos valores do ADCs com o peso tumoral. Os valores de ADCs não demonstraram relação com a celularidade e com o comportamento clínico e histopatológico dos pacientes, reafirmando, portanto, a peculiaridade dos TAC pediátricos em relação à população adulta. Apesar de neste estudo, os valores de ADCs terem sido mais baixos nos TACs e em CACs que os valores na glândula saudável e de nos adultos ter havido correlação do ADCmín e a celularidade tumoral e em criança com o peso lesional, estas alterações não foram suficientes para predizer objetivamente, critérios preditores de agressividade tumoral ou de prognóstico, podendo eventualmente no futuro, representar uma ferramenta para tal. / Adrenocortical tumors (TAC) are lesions that originate from the cortex of the adrenal gland and occur in children and also in adults. Imaging techniques that provide quantitative information about the citoarchitecture of these tumors have not been established in this context yet. The diffusion magnetic resonance imaging (DWI) is a technique that can provide quantitative information of the tissues by the value of the apparent diffusion coefficient (ADC). The role of the ADC in adrenal tumors has been studied, however its relationship with histopathological prognostic criteria has not been described yet. The aim of this study is to investigate the usefulness of imaging methods performing a parallel in the clinical and histopathologic correlation of the TACs in children and adrenocortical carcinoma (CAC) in adults. The specific objectives are to correlate the values of tumor ADC histopathologic scores, cellularity and Ki-67 in children and also in adults, still evaluating the agreement between observers in the measurements of ADCs in patients and controls. This study will be based on three articles in which show the methodology, results and discussions relating to each of the steps. The first paper, \"Adrenocortical neoplasms in adults and children: different presentations. Review of clinical, pathological and diagnostic imaging \" is about a literature review and comparative analysis of the clinical, histopathological and imaging of CT in children and adults. The second article, \"Utility of the parameters derived from the histogram of the apparent diffusion coefficient obtained by MR diffusion technique in the assessment of adrenocortical carcinoma prognosis,\" studied CAC in adults and sought to link the ADC with the clinical, histopathological, cellularity and Ki-67 of these lesions. In the third paper \"Pediatric adrenocortical tumors: ADC values to differentiate between adenomas and carcinomas and its correlation with histopathological criteria\" was conducted in children with TAC seeking an attempt to differentiate between the ADC tumors with benign and malignant behavior either in clinical or histopathological prism. The ADCmín and max values in adults proven to be useful to differentiate patients from controls. The ADC min in adult patients with CACs showed that it could be used to infer tumor cellularity. This study also reaffirmed in adults with CAC, the values of Ki-67 as a prognostic marker and demonstrated a good relationship with Weiss score and cellularity. Also in children, there was a significant inverse correlation of some of the ADCs values with tumor weight. Some ADCs values showed no relationship to the cellularity and the clinical and histopathological behavior of patients, re-affirming therefore the peculiarity of pediatric TAC relation to the adult population. Despite this study, the ADCs values were lower in TACs and CACs than the values in healthy gland and also that in adults have been correlation the ADCmín and tumor cellularity and in children with weight, these changes were not enough to predict objectively, criteria predictive of tumor aggressiveness and prognosis possibly could in the future represent a tool for such.

A doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) é uma das maiores causas de mortalidade e morbidade pós-transplante de células-tronco hematopoiéticas. A DECH, em sua manifestação crônica (DECHc), ainda não tem sua fisiopatologia totalmente esclarecida; entretanto, o envolvimento do sistema imunológico, por meio de respostas imunes inatas e adaptativas é bem estabelecido na literatura. A DECHc afeta múltiplos órgãos, incluindo as glândulas salivares, o que tem, como causa imediata, a xerostomia. Essas alterações são largamente desconhecidas e sub-relatadas. Assim, esse estudo indagou se o sintoma de xerostomia na DECHc é decorrente de alterações morfológicas e funcionais das glândulas salivares. Para responder essa pergunta analisamos de forma qualitativa e por meio da morfometria, espécimes de biopsias de glândulas salivares labiais de pacientes com DECHc e com sintoma de xerostomia. Foram utilizados como controles, espécimes de biopsias de glândulas salivares de pacientes diagnosticados com Síndrome de Sjögren (SSp) (que é um modelo clássico de xerostomia) e de pacientes com líquen plano oral (LPO) (cujas manifestações clínicas orais podem se assemelhar às da DECHc) e queixa de xerostomia. Também foram analisadas, por meio de ensaio multiplex, as citocinas relacionadas à resposta imune Th17 (importante via imunológica na patogenia da DECHc) na saliva de 21 pacientes de DECHc, 27 de SSp, 10 de LPO e 15 voluntários saudáveis. Os principais achados morfológicos nas glândulas salivares dos pacientes de DECHc foram a extensa fibrose, fibroplasia periductal, atrofia ductal e acinar; alterações vasculares representadas pela congestão e formação de trombos hialinos; e infiltrado inflamatório intersticial difuso de aspecto leve a moderado. As glândulas salivares de SSp, entretanto, apresentaram um infiltrado inflamatório na forma de focos de linfócitos ao redor dos ductos excretores de intensidade moderada a severa; os ductos excretores apresentaram-se atróficos, ectásicos, exibindo metaplasia oncocítica e fibroplasia periductal; as alterações vasculares, por sua vez, se apresentaram em maior proporção na forma de vasculite. No LPO as alterações teciduais foram menos intensas. Quando analisadas as concentrações das citocinas, na DECHc, foram encontradas maiores concentrações de IL-17A, IL-4, IL-17F e IL-10, em relação aos grupos controles, essas citocinas estão envolvidas em mecanismos prófibróticos, o que permitiu a correlação dessa expressão aos eventos escleróticos nas glândulas salivares dos pacientes de DECHc. Entre elas, a IL-17F apresentou uma tendência de aumento em relação a proporção da área de fibrose nas glândulas salivares destes pacientes. A CD40L, que também esteve presente em maior concentração nos pacientes de DECHc, é uma molécula de ligação capaz de amplificar a resposta imunológica no mecanismo de rejeição do enxerto no hospedeiro, além de regular o mecanismo de apoptose e ativar o endotélio para a formação de trombos. As citocinas IL-31, IL-23 e IL-22, também apresentaram relevância na saliva dos pacientes de DECHc, sendo participantes do mecanismo das alterações liquenóides no LPO. Através das análises comparativas foi possível correlacionar a presença de citocinas envolvidas na resposta Th17 com as alterações glandulares e consequente xerostomia nos pacientes de DECHc. / The graft versus host disease (GVHD) is one of the biggest causes of mortality and morbidity after hematopoietic stem cells transplantation. The pathophysiology in the chronical manifestation of the disease (cGVHD), is not entirely elucidated, however the involvement of the immunological system, by means of the innate and adaptive responses are depicted in the literature concerning the disease development. The cGVHD affects multiple organs, including the salivary glands, leading to xerostomia. These alterations are under reported and mostly unknown. Therefore, this study investigated if the symptom of xerostomia in cGVHD is triggered by functional e morphological changes in minor salivary glands. To answer this inquiry specimens of biopsied labial salivary glands from patients of cGVHD and xerostomia were analyzed qualitatively and through morphometry. Specimens of biopsied salivary glands from patients with Sjögren\'s Syndrome (SS) (which is a classic model of xerostomia) and from patients with oral lichen planus (OLP) (whose clinical oral manifestations resemble the cGVHD lesions) were used as controls. Also, the cytokines related to the immunological response Th17 (important immune pathway in cGVHD pathophysiology) in the saliva of 21 cGVHD patients, 27 of SS, 10 patients of OLP and 165 healthy individuals were analyzed using the multiplex assay. The major morphological findings revealed on the salivary glands of cGVHD patients were the extensive fibrosis, periductal fibrosis, ductal and acinar atrophy. Congestion and hyaline thrombi formation were the most important vascular changes shown among these specimens. A diffuse interstitial inflammatory infiltrate was observed, with varied intensity. The SS salivary glands, however, portrayed a focal inflammatory infiltrate, with moderate to severe intensity around the excretory ducts. These ducts exhibited atrophy, ectasia, periductal fibrosis and oncocytic metaplasia. The main vascular change presented in these patients was the manifestation of vasculitis. The salivary glands from the OLP patients showed a lesser amount of alterations. The multiplex assay revealed a higher concentration of the cytokines IL-17A, IL-4, IL-17F and IL-10 in the cGVHD samples, when compared to the other groups. These cytokines are involved within the promotion of fibrosis, which endorsed the association of these secretions with the salivary glands sclerotic mechanisms. The secretion of CD40L was higher in cGVHD samples; this membrane protein is capable of amplifying the immunological response in graft rejection, besides the capacity to regulate apoptosis and activate the endothelium in thrombi formation. The cytokines IL-31, IL-23 and IL-22, also presented a higher concentration in cGHVD patients\' saliva, these secretions are actively involved in the mechanisms of lichenoid lesions in OLP, corroborating the perceived morphological changes. The comparative analysis of the morphological and salivary changes in cGVHD confirmed the correlation of Th17 immunological response within the minor salivary glands injuries and consequent xerostomia in these patients.