Orientador: Luiz Augusto Magalhães / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T01:26:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santana_JoseValfridode_M.pdf: 1309942 bytes, checksum: 71c1062aacbbfd893a8562679f343946 (MD5) Previous issue date: 1976 / Resumo: Populações de B. tenagophila e de B. glabrata, apresentando elevados índices de infecção às linhagens de S.mansoni de são José dos Campos e de Belo Horizonte, foram - obtidas por seleção, utilizando-se a auto-fecundação através de várias gerações. Para a obtenção dessas populações altamente suscetíveis, partimos de uma população inicial de cada espécie, a qual denominamos de parental "P". Os moluscos da geração parental, revelaram-se menos suscetíveis à infecção pelo S. mansoni. A partir da geração F1 para B. glabrata e F2 para B. tenagophila, foram obtidos no 100° dia da exposição aos miracidios, índices de infecção acima de 90,0%. Nossos estudos foram realizados até a 4a. geração¿Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

No description available.

Moluscos têm sido empregados como bioindicadores em estudos de contaminação ambiental. Nesse contexto, o caramujo de água doce Biomphalaria glabrata tem sido avaliado como um bom modelo laboratorial, e estudos prévios apontaram sua aplicação na pesquisa ambiental. A proteína HSP70 é uma molécula de 70 kDa, pertencente a uma família de proteínas com papel na manutenção da homeostase dos seres vivos: as proteínas de choque térmico (HSPs); e vem sendo estudada como potencial biomarcador de dano ambiental, indicando estresse e protegendo os organismos dos danos às proteínas. Neste trabalho, foi caracterizada a proteína HSP70 de B. glabrata pelo Western blot, com o objetivo de seu emprego em aplicações ambientais futuras. Para isso, caramujos de 5-6 meses de idade, com diâmetro de concha de 14,4 (±1,7) mm, foram expostos ao calor e ao cloreto de cádmio (CdCl2) a fim de se verificar a resposta desta proteína frente a esses estresses. Os animais foram dissecados para investigação da indução da HSP70. As proteínas foram extraídas dos tecidos com tampão RIPA, separadas em eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida, transferidas para uma membrana de nitrocelulose e detectadas com anticorpo específico para HSP70. A CL50/96h foi determinada como sendo 0,34 (0,30-0,37) ppm para o CdCl2 e serviu de referência para os experimentos de indução da proteína. Foi observado que a exposição a temperaturas subletais aumentou a resistência dos caramujos à temperatura letal de 42 °C. Exposições prévias ao calor de 33 °C e ao CdCl2 a 0,22 ppm aumentou a sobrevivência dos caramujos B. glabrata à concentração letal de CdCl2 (0,7 ppm) e à temperatura letal (42 °C), respectivamente. Os achados do Western blot apontaram para um possível papel da HSP70 nesse processo. Os resultados mostraram relação entre a proteína HSP70 e o aumento na sobrevivência aos estímulos letais após prévia exposição a estresses moderados. O Western blot mostrou uma indução da HSP70 nos grupos pré-expostos, se comparados aos grupos controles. A glândula digestiva foi o tecido mais responsivo, no que concerne à indução da proteína HSP70, comparando com tecidos de cabeça/pé e ovoteste. Foi encontrado o pico de indução da HSP70 nos caramujos B. glabrata após 48 horas de exposição ao calor de 33 °C, e após 96 horas de exposição ao CdCl2 a 0,22 ppm. Apesar do bem conhecido papel da HSP70 na termotolerância e tolerância a outros agentes estressores nos organismos vivos, esta foi a primeira vez que isto foi demonstrado no B. glabrata, oferecendo subsídios para a sua aplicação em estudos de monitoramento ambiental. Os resultados apresentados aqui abrem o caminho para estudos futuros dessa proteína no molusco, e fornecem mais bases para o conhecimento do B. glabrata. / Molluscs have been employed as bioindicators in studies of environmental stress. In this way the freshwater snail Biomphalaria glabrata has been evaluated as a good laboratory model, and previous studies have pointed for its application in environmental research. The HSP70 protein is a molecule of 70 kDa from a family of proteins with role in maintaining homeostasis: the Heat Shock Proteins (HSPs), and it has been studied as a potential biomarker for environmental injury indicating stress and providing protection against the protein damage. In this work, the protein HSP70 was characterized in B. glabrata by Western blotting aiming its employment in future environmental applications. To this purpose, 5-6 months old snails, with shell diameter of 14,4 (±1,7) mm, were exposed to heat and to cadmium chloride (CdCl2) in order to verify the response of this protein to the stresses. Animals were dissected to investigate induction of HSP70. Proteins were extracted from tissues with RIPA buffer, fractionated in denaturing polyacrilamide gel electrophoresis, transferred to nitrocellulose membrane, and detected with a HSP70-specific antibody. The CL50/96h was determined as 0,34 (0,30-0,37) ppm for CdCl2 and served as reference in the experiments for protein induction. It was observed that exposure to sublethal temperatures improved the resistance of snails B. glabrata to the lethal temperature of 42 ºC. Previous sublethal exposure to heat at 33 °C and to CdCl2 at 0,22 ppm improved the survival of snails B. glabrata to a lethal concentration of CdCl2 (0,7 ppm) and to a lethal temperature (42 ºC), respectively. The findings of Western blot pointed to a possible role of HSP70 protein in this process. Results showed a correlation between HSP70 and the improvement of survival to lethal stimuli after a previous exposure to mild stresses. The Western blot showed an induction of HSP70 protein in the preexposed groups as compared to the control ones. The digestive gland was the most responsive tissue to stress regarding the HSP70 protein induction compared with heat/foot and ovotestis. An induction peak of HSP70 was found after 48 hours of exposure to heat at 33 °C, and after 96 hours of exposure to CdCl2 at 0,22 ppm. Despite of the well known role of HSP70 in thermotolerance and tolerance to other stress agents in living organisms, it was the first time it was shown in B. glabrata, supporting its application in environmental monitoring studies. The results presented here open a way to future studies of this protein in the mollusc, and provide more basements to knowledge of B. glabrata.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2014-09-19T20:22:37Z No. of bitstreams: 2 TESE LUCIANA DAMACENA SILVA (PDF).pdf: 994771 bytes, checksum: 9ea236448331d81f6039a107c7c58960 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-09-19T21:28:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 TESE LUCIANA DAMACENA SILVA (PDF).pdf: 994771 bytes, checksum: 9ea236448331d81f6039a107c7c58960 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-19T21:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE LUCIANA DAMACENA SILVA (PDF).pdf: 994771 bytes, checksum: 9ea236448331d81f6039a107c7c58960 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-03-26 / Biomphalaria snails act as intermediate hosts that harbor the Schistosoma mansoni parasite, the causative agent of schistosomiasis. As population increases, snails have their geographical distribution conditioned to the presence of calcium in the environment, which is essential for their energetic metabolism. The objective of this study was the assessment on the influence of exposure to different concentrations of CaCO3 (20, 40, 60, 80 and 100 mg/L) at different intervals (1, 14, 21 and 30 days) forthe concentrations of glucose, calcium, total proteins, urea, uric acid and creatinine in hemolymph B. glabrata. All substances were dosed using specific kits with a spectrophotometer reading at 545 nm. High performance liquid chromatography (HPLC) was the technique applied to quantify the presence of organic acids: pyruvate, oxaloacetate, citrate, succinate, fumarate, propionate, acetoacetate and βhydroxybutyrate in the hemolymph of mollusks exposed to CaCO3. Results revealed that the calcium concentration in the hemolymph did not present significant difference (p>0.05) with regard to control as well as to the concentrations assessed. The glucose concentration decreased (p<0.05) in exposures to 20mg and 40mg and increased in exposures to 80mg and 100mg of CaCO3 with regard to control. The organic acids pyruvate, oxaloacetate, citrate, succinate fumarate and lactate had their concentrations increased; propionate in turn had its concentration decreased set against control in exposure to CaCO3. In the exposures to the concentrations assessed, acetoacetate decreased and β-hidroxibutirato increased. Total proteins and urea presented decrease. The uric acid concentration increased in the exposure to 20mg of CaCO3; the creatinine concentration increased in the exposures to 40mg and 100mg of CaCO3. It was possible to conclude that snails exposed to different concentrations of CaCO3 had their major metabolic alterations occurring from the 14th day of exposure. / Moluscos do gênero Biomphalaria são conhecidos pelo seu papel como hospedeiro intermediário do parasito Schistosoma mansoni, causador da doença esquistossomose mansônica. O aumento da população desses moluscos, consequentemente sua distribuição geográfica está condicionada a presença de cálcio no mbiente, também considerado um elemento essencial no metabolismo energético do molusco. Este estudo teve por objetivo avaliar a influência da exposição às diferentes concentrações de CaCO3 (20, 40, 60, 80 e 100 mg/L), em diferentes intervalos de tempo (1, 14, 21 e 30 dias) sobre às concentrações de glicose, cálcio, proteínas totais, ureia, ácido úrico e creatinina na hemolinfa de B. glabrata, ambas as substâncias foram dosadas através de kits específicos e lidas em espectrofotômetro em 545 nm. Através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), foi quantificado a presença de ácidos orgânicos: piruvato, oxaloacetato, citrato, succinato, fumarato, propionato, acetoacetato e β-hidroxibutirato na hemolinfa dos moluscos expostos ao CaCO3. Os resultados demonstraram que a concentração de cálcio na hemolinfa não apresentou diferença significativa (p>0,05) em relação ao controle, bem como, entre as concentrações testadas. A concentração de glicose diminuiu (p<0,05) nas exposições a 20mg e 40mg e aumentou nas exposições a 80mg e 100mg de CaCO3 em relação ao controle. Os ácidos orgânicos piruvato, oxaloacetato, citrato, succinato, fumarato e lactato tiveram suas concentrações aumentadas e propionato diminuída comparada ao controle na exposição ao CaCO3. A concentração de acetoacetato diminuiu e a de β-hidroxibutirato aumentou na exposição às concentrações testadas. Houve diminuição na concentração de proteínas totais e de ureia. A concentração de ácido úrico aumentou na exposição a 20mg de CaCO3 e, a concentração de creatinina aumentou nas exposições à 40mg e 100mg de CaCO3. Concluiu-se que moluscos expostos às diferentes concentrações de CaCO3, principalmente a partir de 14 dias, alteram o metabolismo como acontece em situações de estresse fisiológico, com a finalidade de regular o sistema redox do molusco.

Moluscos têm sido empregados como bioindicadores em estudos de contaminação ambiental. Nesse contexto, o caramujo de água doce Biomphalaria glabrata tem sido avaliado como um bom modelo laboratorial, e estudos prévios apontaram sua aplicação na pesquisa ambiental. A proteína HSP70 é uma molécula de 70 kDa, pertencente a uma família de proteínas com papel na manutenção da homeostase dos seres vivos: as proteínas de choque térmico (HSPs); e vem sendo estudada como potencial biomarcador de dano ambiental, indicando estresse e protegendo os organismos dos danos às proteínas. Neste trabalho, foi caracterizada a proteína HSP70 de B. glabrata pelo Western blot, com o objetivo de seu emprego em aplicações ambientais futuras. Para isso, caramujos de 5-6 meses de idade, com diâmetro de concha de 14,4 (±1,7) mm, foram expostos ao calor e ao cloreto de cádmio (CdCl2) a fim de se verificar a resposta desta proteína frente a esses estresses. Os animais foram dissecados para investigação da indução da HSP70. As proteínas foram extraídas dos tecidos com tampão RIPA, separadas em eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida, transferidas para uma membrana de nitrocelulose e detectadas com anticorpo específico para HSP70. A CL50/96h foi determinada como sendo 0,34 (0,30-0,37) ppm para o CdCl2 e serviu de referência para os experimentos de indução da proteína. Foi observado que a exposição a temperaturas subletais aumentou a resistência dos caramujos à temperatura letal de 42 °C. Exposições prévias ao calor de 33 °C e ao CdCl2 a 0,22 ppm aumentou a sobrevivência dos caramujos B. glabrata à concentração letal de CdCl2 (0,7 ppm) e à temperatura letal (42 °C), respectivamente. Os achados do Western blot apontaram para um possível papel da HSP70 nesse processo. Os resultados mostraram relação entre a proteína HSP70 e o aumento na sobrevivência aos estímulos letais após prévia exposição a estresses moderados. O Western blot mostrou uma indução da HSP70 nos grupos pré-expostos, se comparados aos grupos controles. A glândula digestiva foi o tecido mais responsivo, no que concerne à indução da proteína HSP70, comparando com tecidos de cabeça/pé e ovoteste. Foi encontrado o pico de indução da HSP70 nos caramujos B. glabrata após 48 horas de exposição ao calor de 33 °C, e após 96 horas de exposição ao CdCl2 a 0,22 ppm. Apesar do bem conhecido papel da HSP70 na termotolerância e tolerância a outros agentes estressores nos organismos vivos, esta foi a primeira vez que isto foi demonstrado no B. glabrata, oferecendo subsídios para a sua aplicação em estudos de monitoramento ambiental. Os resultados apresentados aqui abrem o caminho para estudos futuros dessa proteína no molusco, e fornecem mais bases para o conhecimento do B. glabrata. / Molluscs have been employed as bioindicators in studies of environmental stress. In this way the freshwater snail Biomphalaria glabrata has been evaluated as a good laboratory model, and previous studies have pointed for its application in environmental research. The HSP70 protein is a molecule of 70 kDa from a family of proteins with role in maintaining homeostasis: the Heat Shock Proteins (HSPs), and it has been studied as a potential biomarker for environmental injury indicating stress and providing protection against the protein damage. In this work, the protein HSP70 was characterized in B. glabrata by Western blotting aiming its employment in future environmental applications. To this purpose, 5-6 months old snails, with shell diameter of 14,4 (±1,7) mm, were exposed to heat and to cadmium chloride (CdCl2) in order to verify the response of this protein to the stresses. Animals were dissected to investigate induction of HSP70. Proteins were extracted from tissues with RIPA buffer, fractionated in denaturing polyacrilamide gel electrophoresis, transferred to nitrocellulose membrane, and detected with a HSP70-specific antibody. The CL50/96h was determined as 0,34 (0,30-0,37) ppm for CdCl2 and served as reference in the experiments for protein induction. It was observed that exposure to sublethal temperatures improved the resistance of snails B. glabrata to the lethal temperature of 42 ºC. Previous sublethal exposure to heat at 33 °C and to CdCl2 at 0,22 ppm improved the survival of snails B. glabrata to a lethal concentration of CdCl2 (0,7 ppm) and to a lethal temperature (42 ºC), respectively. The findings of Western blot pointed to a possible role of HSP70 protein in this process. Results showed a correlation between HSP70 and the improvement of survival to lethal stimuli after a previous exposure to mild stresses. The Western blot showed an induction of HSP70 protein in the preexposed groups as compared to the control ones. The digestive gland was the most responsive tissue to stress regarding the HSP70 protein induction compared with heat/foot and ovotestis. An induction peak of HSP70 was found after 48 hours of exposure to heat at 33 °C, and after 96 hours of exposure to CdCl2 at 0,22 ppm. Despite of the well known role of HSP70 in thermotolerance and tolerance to other stress agents in living organisms, it was the first time it was shown in B. glabrata, supporting its application in environmental monitoring studies. The results presented here open a way to future studies of this protein in the mollusc, and provide more basements to knowledge of B. glabrata.

A participação das espécies reativas de oxigênio (ERO) no mecanismo de ação dos antifúngicos azólicos, bem como a relação entre resistência aos antifúngicos e resposta ao estresse oxidativo, têm sido sugeridos. Entretanto, os dados ainda são inconclusivos e diferem entre os micro-organismos. Neste estudo estão apresentados os resultados da geração de ERO pelo fluconazol em isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes a esse antifúngico e a resposta antioxidante da levedura. Nesses isolados, tratados e não tratados com fluconazol em concentração subinibitória, de acordo com sua concentração inibitória mínima (CIM), até fase de crescimento estacionário, foi avaliado se o fluconazol geraria ERO. Subsequentemente, foram analisadas as defesas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), superóxido dismutase (SOD), glutationa-S-transferase (GST), consumo de peróxido de hidrogênio e glutationa total, bem como possível dano oxidativo causado pelo fluconazol em lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos e os níveis de nitritos e nitratos. Os resultados mostram que nos isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes ao fluconazol, na presença do antifúngico, houve um aumento da geração ERO e maior atividade enzimática da GPx e SOD comparada a dos isolados não tratados com fluconazol, não havendo diferença estatística entre isolados sensíveis e resistentes nesses três parâmetros citados. Em relação à enzima GST, os isolados sensíveis mostraram maior atividade enzimática comparada aos resistentes, e quando as células sensíveis foram tratadas com fluconazol, a atividade da GST diminuiu. O fluconazol não induziu dano oxidativo em proteínas e em lipídeos, entretanto foi observado dano oxidativo ao DNA. Diante disso, sugere-se que o fluconazol gera ERO como parte do seu mecanismo antifúngico em C. glabrata em fase de crescimento estacionário, induzindo dano oxidativo no DNA. Como resposta, observa-se aumento na atividade enzimática da SOD e da GPx na levedura. O entendimento da resposta antioxidante de leveduras patogênicas tem importante interesse clínico, uma vez que o desenvolvimento racional de novas drogas antifúngicas requer conhecimento do metabolismo fúngico. / The participation of reactive oxygen species (ROS) in azoles antifungal mechanism of action has been suggested, as well as the relation between antifungal resistance and oxidative stress response. However, data are still inconclusive and differ between microorganisms. This study presents the results of ROS generation by fluconazole in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains and their antioxidant response. It was evaluated whether fluconazole generates ROS in those isolates treated and untreated with fluconazole at sub-inhibitory concentration according to their minimal inhibitory concentration (MIC). This treatment was conducted until stationary growth phase was reached. Subsequently, the antioxidant defenses glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), glutathione-S-transferase (GST), consumption of hydrogen peroxide and total glutathione, the possible oxidative damage in lipids, proteins and nucleic acids and the levels of nitrites and nitrates were analyzed. Results showed increased ROS generation in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains treated with fluconazole, and also higher GPx and SOD enzymatic activity, compared to untreated cells. No statistical difference of those three parameters was observed between susceptible and resistant strains. In relation to GST, susceptible strains demonstrated higher activity compared to the resistant ones, and when susceptible cells were treated with fluconazole the GST activity decreased compared to untreated. Fluconazole did not induce oxidative damage in proteins and in lipids, however oxidative DNA damage was observed. Therefore, it is suggested that fluconazole generates ROS as part of its antifungal mechanism in C. glabrata at stationary growth phase, inducing oxidative DNA damage. In response, there was increase in the enzymatic activity of SOD and GPx in yeast. The understanding of the pathogenic yeast antioxidant response has important clinical interest, since the rational development of new antifungal drugs requires knowledge about the fungal metabolism.

The impact of a primary infection with the incompatible digenean Plagiorchis elegans to groups composed of young, juvenile and adult Biomphalaria glabrata and a challenge infection with the compatible parasite Schistosoma mansoni was examined. Egg production of young B. glabrata was significantly reduced by P. elegans at the higher exposures of 16 eggs per snail, while egg production of adult B. glabrata was reduced at exposures of 8 and 16 eggs per snail. Egg production of juvenile B. glabrata snails was not significantly affected by any of the levels of P. elegans exposures. The survivorship of juvenile B. glabrata snails was significantly lowered by an exposure to 16 P. elegans eggs per snail. The survivorship of adult snails was significantly reduced by exposures to both 8 and 16 P. elegans eggs per snail. Interestingly enough, the survivorship of young B. glabrata snails was not significantly affected by P. elegans exposure. Snails harboring small P. elegans infections acquired a resistance to Schistosoma mansoni infection. Infection with P. elegans did not have any significant effect on the egg production of the young and adult sympatric snails, Helisoma trivolvis trivolvis. The survivorship of adult H. trivolvis trivolvis was not significantly affected by exposure to P. elegans. This being said, young H. t. trivolvis that were exposed to P. elegans had a higher survivorship than did control snails. Exposed Bulinus truncatus snails laid up to 50% fewer eggs for the first five weeks due to P. elegans infection. There was however no effect on the survivorship of the snails.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-09Bitstream added on 2014-06-13T20:27:58Z : No. of bitstreams: 1 cardoso_m_me_sjc.pdf: 644379 bytes, checksum: 1cc6342f5a099baa07f73649f18af2d4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A técnica da espectroscopia infravermelha por transformada de Fourier (FT-IR) vem sendo largamente empregada como uma abordagem rápida e simples para a identificação de microrganismos, incluindo a do gênero Candida. A proposta deste estudo foi avaliar o emprego da microespectroscopia FT-IR na identificação e discriminação de 5 cepas clínicas de Candida albicans e 3 de Candida glabrata, as quais foram identificadas previamente por meio de métodos convencionais, e mais duas cepas ATCC de cada espécie. As amostras foram analisadas em triplicata, a partir de culturas independentes, por meio de filmes finos obtidos da suspensão em solução salina estéril a 0,85% da biomassa da colônia que ficou incubada por 24 horas em placas com ágar Saboraud Dextrose. Dez espectros com 32 varreduras foram obtidos na forma de ponto em 10 regiões selecionadas aleatoriamente nas amostras. A média foi obtida dos dez espectros de cada amostra para a análise estatística multivariada, dada pela análise de cluster. Além disso os espectros foram transformados em primeira derivada e três janelas espectrais foram determinadas (900-1250 cm-1, 1300-1600 cm-1, 2800-3000 cm-1). A representação dos resultados foi dada pela construção de um dendograma. Nesse, foi possível separar em dois grupos distintos as duas espécies de Candida estudadas. Dessa forma, pode-se concluir que a microespectroscopia FT-IR foi capaz de identificar e discriminar cepas clínicas de Candida albicans e de Candida glabrata, sendo um método promissor para identificação de leveduras / The technique of infrared spectroscopy Fourier transform (FT-IR) has been widely used as a new approach for rapid identification and simple micro-organisms, including the genus Candida. The purpose of this study was to evaluate the use of FT-IR microspectroscopy for the identification and discrimination of 5 clinical strains of Candida albicans and Candida glabrata 3, which were previously identified by conventional methods, and two-standard strains of each species. The samples were analyzed in triplicate from independent cultures by means of thin films obtained from a suspension in sterile saline and 0.85% of the biomass of the colony that was incubated for 24 hours in Sabouraud dextrose agar plates. Ten spectra with 32 scans were obtained in 10 randomly selected regions in the samples.The average of ten spectra was obtained from each sample for the multivariate analysis, given by cluster analysis. In addition, three windows were determined spectral (900-1250 cm-1, 1300-1600 cm-1, 2800-3000 cm-1) and the spectra were transformed into first derivative. The representation of the results was given by the construction of a dendrogram. In this, we separated into two groups of two Candida species studied. Thus, one can conclude that the FT-IR microspectroscopy was able to identify and distinguish clinical isolates of Candida albicans and Candida glabrata is an important method for identification of yeasts

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the last decades the invasive mycoses caused by opportunistic fungi has showed a significant growth. The extensive use of azoles showed that the development of resistance of Candida species to these drugs is an emergent phenomenon. C. glabrata typically presents high degree of primary resistance to fluconazole what determine additional difficulties in the therapies. Here two groups of C. glabrata isolates were evaluated: the first formed by strains primarily fluconazole-susceptible and the second generated by the first, was composed by the same isolates after induction of the fluconazole-resistance. The susceptibility tests detected even in the first group, strains azole-resistant as against itraconazole and voriconazole. The induction of resistance to fluconazole was carried out in order to compare the susceptibilities between the two groups against combined drugs. The fluconazole-resistant strains (Group 2) showed MIC ≥ 64 μg/ml and cross-resistance was either detected with fluconazole, voriconazole and itraconazole as well as to other antifungal agents as amphotericin B and caspofungine. The more frequent interaction observed was indifference, however important synergisms were showed against fluconazole-resistant isolates. The best synergism was registered with amphotericin B+ flucytosine (G1 = 61,77% and G2=76,47%). Other synergistic interactions were amphotericin B+ketoconazole (G2=73,53%), amphotericin B+voriconazole (G2=55,88%), amphotericin B+voricoonazole (G2=55,88%), all of them without antagonisms. The highest percentage of the antagonism were observed with ketoconazole+flucytosine (G1=61,77% and G2= 55,88%). / A freqüência de micoses invasivas devido a fungos oportunistas tem evidenciado significativo aumento nas duas últimas décadas. O uso prolongado e indiscriminado dos azólicos evidenciou o desenvolvimento de resistência a estes fármacos nas espécies de Candida. A espécie C. glabrata caracteriza-se por elevados percentuais de resistência primária ao fluconazol fato que determina dificuldades terapêuticas adicionais. No presente estudo, dois grupos de isolados de C. glabrata foram avaliados: o primeiro formado por isolados clínicos sensíveis ao fluconazol, e o segundo, derivado do primeiro, foi formado pelos mesmos isolados, após terem sido induzidos a resistência ao fluconazol in vitro. Mesmo neste grupo de C. glabrata sensíveis ao fluconazol, os testes de suscetibilidade já evidenciaram resistência frente a outros azólicos como ao itraconazol e voriconazol. Os derivados resistentes ao fluconazol evidenciaram concentrações inibitórias mínimas maiores ou iguais a 64 g/mL. Neste grupo de isolados fluconazol-resistentes, os testes de suscetibilidade detectaram resistência cruzada com cetoconazol, voriconazol e itraconazol bem como com outros agentes de outras classes como a anfotericina B e caspofungina. A indução da resistência foi realizada com o objetivo de se comparar a suscetibilidade entre os dois grupos, frente a fármacos combinados. As associações de antifúngicos entre os grupos sensíveis e resistentes ao fluconazol resultaram, em maior parte, interações indiferentes. No entando as associações mostraram-se mais eficazes nos isolados resistentes ao fluconazol. Em ambos os grupos, a combinação que resultou em maior sinergismo foi anfotericina B com flucitosina (.G1 = 61,77%.% e G2 = 76,47%); outras combinações sinérgicas foram anfotericina B + cetoconazol (G2 = 73,53%), anfotericina B + voriconazol (G2 = 55,88%), todos com ausência de antagonismo. Os maiores percentuais de antagonismo foram observados na combinação cetoconazol + flucitosina (G1 = 61,77% e G2 = 55,88%).

A participação das espécies reativas de oxigênio (ERO) no mecanismo de ação dos antifúngicos azólicos, bem como a relação entre resistência aos antifúngicos e resposta ao estresse oxidativo, têm sido sugeridos. Entretanto, os dados ainda são inconclusivos e diferem entre os micro-organismos. Neste estudo estão apresentados os resultados da geração de ERO pelo fluconazol em isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes a esse antifúngico e a resposta antioxidante da levedura. Nesses isolados, tratados e não tratados com fluconazol em concentração subinibitória, de acordo com sua concentração inibitória mínima (CIM), até fase de crescimento estacionário, foi avaliado se o fluconazol geraria ERO. Subsequentemente, foram analisadas as defesas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), superóxido dismutase (SOD), glutationa-S-transferase (GST), consumo de peróxido de hidrogênio e glutationa total, bem como possível dano oxidativo causado pelo fluconazol em lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos e os níveis de nitritos e nitratos. Os resultados mostram que nos isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes ao fluconazol, na presença do antifúngico, houve um aumento da geração ERO e maior atividade enzimática da GPx e SOD comparada a dos isolados não tratados com fluconazol, não havendo diferença estatística entre isolados sensíveis e resistentes nesses três parâmetros citados. Em relação à enzima GST, os isolados sensíveis mostraram maior atividade enzimática comparada aos resistentes, e quando as células sensíveis foram tratadas com fluconazol, a atividade da GST diminuiu. O fluconazol não induziu dano oxidativo em proteínas e em lipídeos, entretanto foi observado dano oxidativo ao DNA. Diante disso, sugere-se que o fluconazol gera ERO como parte do seu mecanismo antifúngico em C. glabrata em fase de crescimento estacionário, induzindo dano oxidativo no DNA. Como resposta, observa-se aumento na atividade enzimática da SOD e da GPx na levedura. O entendimento da resposta antioxidante de leveduras patogênicas tem importante interesse clínico, uma vez que o desenvolvimento racional de novas drogas antifúngicas requer conhecimento do metabolismo fúngico. / The participation of reactive oxygen species (ROS) in azoles antifungal mechanism of action has been suggested, as well as the relation between antifungal resistance and oxidative stress response. However, data are still inconclusive and differ between microorganisms. This study presents the results of ROS generation by fluconazole in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains and their antioxidant response. It was evaluated whether fluconazole generates ROS in those isolates treated and untreated with fluconazole at sub-inhibitory concentration according to their minimal inhibitory concentration (MIC). This treatment was conducted until stationary growth phase was reached. Subsequently, the antioxidant defenses glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), glutathione-S-transferase (GST), consumption of hydrogen peroxide and total glutathione, the possible oxidative damage in lipids, proteins and nucleic acids and the levels of nitrites and nitrates were analyzed. Results showed increased ROS generation in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains treated with fluconazole, and also higher GPx and SOD enzymatic activity, compared to untreated cells. No statistical difference of those three parameters was observed between susceptible and resistant strains. In relation to GST, susceptible strains demonstrated higher activity compared to the resistant ones, and when susceptible cells were treated with fluconazole the GST activity decreased compared to untreated. Fluconazole did not induce oxidative damage in proteins and in lipids, however oxidative DNA damage was observed. Therefore, it is suggested that fluconazole generates ROS as part of its antifungal mechanism in C. glabrata at stationary growth phase, inducing oxidative DNA damage. In response, there was increase in the enzymatic activity of SOD and GPx in yeast. The understanding of the pathogenic yeast antioxidant response has important clinical interest, since the rational development of new antifungal drugs requires knowledge about the fungal metabolism.