Orientador: Eliana Maria Zanotti-Magalhães / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T06:14:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Allegretti_SilmaraMarques_D.pdf: 7173440 bytes, checksum: a0d4e606aad825810e374339d5ed7dce (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Este trabalho teve por objetivo verificar a ação da inoculação de hemolinfa total, hemolinfa livre de células e suspensão dc amebócitos no desenvolvimento do /..__. mansoni da linhagem BH em B. g/abrata melânica. Os parâmetros avaliados foram: taxa de infecção, taxa de mortalidade, período pré-patente, reação tecidual em tomo das larvas de S. mansoni, atividade fagocitária dos amebócitos e nÚmero de amebócitos na hemolintà. Para a determinação da taxa de infecção, taxa de mortalidade, período pré-patente, atividade fagocitária e número de amebócitos circulantes os moluscos foram infectados com 10 miracídios do tremalódeo. A reação tecidual foi observada em moluscos expostos a 100 miracídios. Os resultados indicaram que, a inoculação de hemolintà total provocou a facilitação da infecção observando-se diminuição do período pré-patente, aumento da taxa de mortalidade, pequena atividade fagocitária dos amebócitos e discreta reação amebocitária em tomo do esporocisto de ,)_. mansoni. A inoculação de hemolintà livre de células provocou um retardamento do desenvolvimento do parasita com o aumento do período pré-patente, e reação tecidual mais intensa em tomo do esporocisto de S. mansoni. A inoculação de suspensão de amebócitos produziu uma reação mais efetiva contra o parasita com aumento do período pré-patente, diminuição da mortalidade dos moluscos, aumento da atividade fagocitária, aumento das células estreladas na hemolinfa circulante e aumento das reações amebocitárias no tecido em tomo dos csporocistos. A inoculação de suspensão de células produziu maior resistência ao desenvolvimento do S. mansoni. / Abstract: The main purpose of this work was to verify the effects from the inoculation of diftercnt kinds of hemolymph on the development of SdÚS/OSOlIIll IIIlf/l lli in pigmcnted Biomphalaria glahrata. The S. mansoni belongs to the BH strain. The types of hemolymph were: complete hemolymph, cells-fTee hemolymph and amoebocyte suspenslOn. In order to achieve our purpose the following variables vere considered: intection rate, death rate, pre-patent period, tissue reactions arollnd S mansoJli larval, phagocytosis activity and number of amoebocytes in the circlIlation hemolymph R. [;/ahrala snail were infected with 10 miracidia trom the trematodes. The tissue reaction was observed on the snails that were exposed to 100 miracidia. The results have indicated that the inoculation of the complete hemolymph facilitated the infection with decrease on the pre-patent period as well as the increase on the death rate little phagocytosis activity on the amoebocytes and slight reaction around sporocyst of the S. mansoni. The inoculation of cells-tl'ee hemolymph postponed the parasite development with the increase of the pre-patent period and more intense tissue reaction arollnd sporocyst of S. mansoni. The inoculation of the amoebocytes slIspcnsion caused a more ctrcctive reaction against the parasite with the increase the pre-patent period, the decrease snails mortality, the increase phagocytosis activity the increase 01' granulocytes in the circulating hemolymph and the increase of amoebocytes reactions around sporocysts of S mansoni. The inoculation of the amoebocytes suspension produccd greater resistance to the S. mansoni development. / Doutorado / Parasitologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Eliana Maria Zanotti-Magalhães / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T18:40:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno_TreziaIedaBallerini_D.pdf: 6507064 bytes, checksum: 5515a1ea19ac4cfea55f25a3da2f2efa (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Experimentalmente, Biomphalaria glabrata pode ser utilizada como hospedeiro intermediário do nematódeo Angiostrongylus costaricensis, responsável pela angiostrongilíase abdominal. Esta zoonose, descrita no Brasil principalmente nos estados sulinos, pode acometer acidentalmente o homem, sendo que a infecção ocorre através da ingestão de moluscos parasitados ou água e alimentos contaminados com larvas de 3° estágio, eliminadas no muco dos moluscos hospedeiros. O objetivo deste trabalho foi estudar o desenvolvimento dos estágios larvais e o comportamento dos hemócitos na hemolinfa de B. glabrata infectada.Um total de 168 moluscos foi infectado com 120 larvas LI de A. costaricensis extraídas das fezes de camundongos Swiss albinos previamente infectados via oral sob tubagem esofágica com 6 larvas L3. Larvas de A. costaricensis foram recuperadas de 45 moluscos B. glabrata após 15, 22 e 29 dias de exposição ao parasita, através do método de Baermann, utilizando tecidos digeridos dos moluscos com solução de pepsina e ácido clorídrico. Constatou-se maior recuperação de larvas de A. costaricensis dos moluscos aos 29 dias de infecção. Para o estudo do desenvolvimento de Ao costaricensis, 60 moluscos infectados foram destinados a recuperação larval durante 30 dias consecutivos. Foi observada a mudança larval de LI para L2 aos 13 dias de infecção e L2 para L3 aos 18 dias de infecção. Hemolinfa de 45 moluscos infectados e não infectados com A. costaricensis foi coletada para verificação da resposta hemocitária durante 4 semanas. Os hemócitos foram distinguidos em hialinócitos e granulócitos. Enquanto nos moluscos não infectados predominaram os hialinócitos, naqueles infectados os granulócitos foram mais evidentes, principalmente entre o 18° ao 25° dia de infecção. Foi confirmada a ocorrência tanto da infecção percutânea como por via oral. Os locais mais parasitados foram: região cefalopodal, a preferida pelo nematódeo, seguida do intestino, rim e pulmão. Todas as larvas encontradas estavam viáveis e rodeadas por reação do tipo granulomatosa, independentes de sua localização / Abstract: Biomphalaria glabrata can be experimentally used as an intermediate host of the nematode Angiostrongylus costaricensis, responsible for abdominal angiostrongyliasis. This zoonosis, found in Brazil mainly in the southem states, can accidentally infect man through the ingestion of parasitized mollusks or contaminated water and food containing third-stage larvae, eliminated in the mucous secretion of the mollusks. The objective of this work was to study the development of larval stages and the behavior of hemocytes in the hemolymph of infected B. glabrata. A total of 168 mollusks were infected with 120 LI larvae of A. costaricensis, extracted ftom excrement of albino Swiss mice previously infected via the oral route by esophageal tube with 6 L3 larvae. The A. costaricensis larvae had been recovered from 45 B. glabrata mollusks at 15, 22 and 29 days after exposure to the parasite, by means of the method of Baermann, using molluscan tissues digested with pepsin and hydrochloric acid solution. A larger recovery of A. costaricensis larvae from the mollusk was found at 29 days after infection. For the study of the development of A. costaricensis, 60 infected mollusks were allocated for larval recovery during a period of 30 consecutive days. It was observed that there was a larval stage change, from L1 to L2, at the 13th day after infection and from L2 to L3 on the 18th day after infection.The hemolymph of 45 mollusks, both infected and not infected with A. costaricensis, was collected for verification of the hemocyte response during 4 weeks. The hemocytes were differentiated into hyalinocytes and granulocytes. While in the non infected mollusks the hyalinocytes had predominated, in those infected granulocytes were more evident, mainly between the 18th and the 25th day after infection. The occurence of infection, both via percutaneous and via oral routes, was confirmed. The most parasitized sites were the cephalopodan mass, preferred by the nematodes, folIowed by the intestines, kidneys and lungs. AlI the larvae found were viable and surrounded by reaction of the granulomatous type, independent of their situation / Doutorado / Mestre em Parasitologia

Orientador: Eliana Maria Zanotti-Magalhaes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T03:44:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guerino_LauraRocha_M.pdf: 645841 bytes, checksum: c75feb38c5a946cf3347791584c0e3e8 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Moluscos terrestres de várias espécies têm sido relatados como hospedeiros naturais do Angiostrongylus costaricensis. Experimentalmente, Biomphalaria glabrata pode ser utilizada como hospedeira intermediária deste nematódeo, responsável pela angiostrongilíase abdominal. Os moluscos se infectam pela ingestão ou penetração ativa das larvas L1 de A. costaricensis. O objetivo deste trabalho foi verificar a capacidade de atração exercida por B. glabrata infectada com A. costaricensis sobre miracídios de Schistosoma mansoni da linhagem BH e verificar a suscetibilidade de B. glabrata submetida à infecção concomitante com A. costaricensis e S. mansoni. Para o estudo da atração miraxonal utilizamos B. glabrata infectada com 120 larvas L1 de A. costaricensis e após 20 dias de infecção os moluscos foram utilizados nos experimentos. Nesses experimentos foi utilizado um artefato de vidro composto por duas câmaras unidas por um canal e preenchido com água declorada. Os moluscos ou sua água de condicionamento (SCW) foram colocados aleatoriamente em uma das câmaras e dez miracídios foram colocados no centro do canal e seu comportamento foi observado por 15 minutos. De acordo com os resultados obtidos, pudemos observar que B. glabrata infectada ou não com A. costaricensis ou sua SCW atraíram miracídios de S. mansoni. Verificamos ainda, haver maior atração miraxonal frente à SCW de B. glabrata infectada com A. costaricensis (89%) do que o próprio molusco infectado com A. costaricensis (71%). No estudo da suscetibilidade exemplares de B. glabrata foram expostos a 10 miracídios de S. mansoni BH e a 120 larvas L1 de A. costaricensis. Após 30 dias de infecção os moluscos foram examinados para a verificação de eliminação de cercárias. Após 60 dias de infecção os moluscos sobreviventes tiveram seu corpo digerido por pepsina e ácido clorídrico para a recuperação de larvas L3 de A. costaricensis. A infecção prévia de B. glabrata com A. costaricensis (com intervalo de 48 horas), facilitou a infecção pelo S. mansoni. Foi constatada maior taxa de infecção por S. mansoni (96,7%), maior número de cercárias liberadas (4955 cercárias/molusco) e baixa mortalidade dos moluscos (20%). A exposição prévia de B. glabrata ao A. costaricensis e posteriormente ao S mansoni, também facilitou o desenvolvimento do A. costaricensis, uma vez que na nona semana de infecção foi recuperada maior quantidade de larvas L3 (12 larvas/molusco), se comparado com moluscos expostos somente ao A. costaricensis (8 larvas/molusco). Entretanto a pré-infecção de B. glabrata com S. mansoni (com intervalo de 24 horas) e posteriormente com A. costaricensis mostrou-se muito prejudicial à B. glabrata provocando grande mortalidade dos moluscos (83%). A maior mortalidade dos moluscos provocou menor taxa de infecção pelo S. mansoni (63,3%), menor recuperação de larvas L3 de A. costaricensis (10 larvas/molusco) e menor número de cercárias liberadas (2722 cercárias/molusco) / Abstract: Several species of land mollusks are natural hosts of the Angiostrongylus costaricensis. Experimentally, Biomphalaria glabrata can be used as an intermediate host for this nematode, responsible for the abdominal angiostrongyliasis. The mollusks are infected through the ingestion or activate penetration by the first-stage larvae (L1) of A. costaricensis. The objective of this work was to verify the ability of B. glabrata, infected with A. costaricensis, to attract miracidia of the BH strain of Schistosoma mansoni and to verify the susceptibility of B. glabrata infected concomitantly with A. costaricensis and S. mansoni. For the study of the miraxonal attraction we used B. glabrata infected with 120 first-stage larvae of A. costaricensis and the mollusks were used in the experiments after twenty days of infection. In these experiments we used a glass apparatus consisting of two circular chambers connected by a channel and filled with chlorine free water. Aleatorily, the snails or their conditioning water (SCW) were placed in one chamber and ten miracidia were placed in the center of the channel and their behavior was observed for 15 minutes. According to the results obtained, we could observe that B. glabrata infected or not infected with A. costaricensis and their SCW attracted S. mansoni miracidia. We also verified, a larger miraxonal attraction to the SCW of B. glabrata infected with A. costaricensis (89%) than to the actual mollusk infected with A. costaricensis (71%). In the study of the susceptibility samples of B. glabrata were exposed to 10 miracidia of the BH strain of S. mansoni and to 120 first-stage larvae of A. costaricensis. After thirty days of infection the mollusks were examined for the cercariae elimination. After sixty days of infection the surviving mollusks had their bodies digested by pepsin and hydrochloric acid for the recovery of third-stage larvae of A. costaricensis. The prior infection of B. glabrata with A. costaricensis (with an interval of 48 hours), facilitated the infection with S. mansoni. A larger infection rate to S. mansoni was verified (96.7%), a larger number of liberated cercariae (4955 cercariae/mollusk) and a lower mortality of the mollusks (20%). The prior infection of B. glabrata with A. costaricensis and posteriorly to S. mansoni, also facilitated the development of the A. costaricensis, because in the ninth week of infection a larger amount of third-stage larva was recovered (12 larvae/mollusk), if compared with mollusks exposed only to the A. costaricensis (8 larvae/mollusk). However the prior infection of B. glabrata with S. mansoni (with an interval of 24 hours) and posteriorly with A. costaricensis it was shown to be very harmful to B. Glabrata causing a great mortality of the mollusks (83%). The larger mortality of the mollusks caused a smaller infection rate for the S. mansoni (63.3%), a smaller recovery of thirdstage larvae of A. costaricensis (10 larvae/mollusk) and a smaller number of liberated cercariae (2722 cercariae/mollusk) / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Parasitologia

Submitted by Celso Magalhaes (celsomagalhaes@ufrrj.br) on 2017-05-31T11:58:11Z No. of bitstreams: 1 2015 - Victor Menezes Tunholi Alves.pdf: 1068543 bytes, checksum: f36d6e4d78a70514a148e30e4249805b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-31T11:58:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015 - Victor Menezes Tunholi Alves.pdf: 1068543 bytes, checksum: f36d6e4d78a70514a148e30e4249805b (MD5) Previous issue date: 2015-10-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / Parasites belonging to the Echinostoma genus are characterized by having a complex biological cycle, with two intermediate hosts and a final habitat restricted to the intestinal lumen of the definitive hosts. These hosts include aquatic birds, mammals (including humans) and occasionally some reptile and fish species. Their first intermediate hosts are freshwater snails, into which the miracidia actively penetrate for development of the next three stages (sporocysts, rediae and cercariae). Freshwater crustaceans, amphibians, fish and snails act as the second intermediate hosts, enabling the formation of metacercariae, the infective larval stage to the definitive host. In this work, Biomphalaria glabrata specimens were experimentally infected with different doses (5 or 50) of E. paraensei miracidia. The snails were dissected one, two, three and four weeks after infection to collect the hemolymph, shells and tissues (gonad-digestive gland complex- GDG). In the hemolymph were quantified glucose concentrations and carboxylic acids (succinic, pyruvic, lactic and oxalic acids), as well as the activity of lactate dehydrogenase (LDH). The storage of tissues was measured glycogen content and oxygen consumption (O2). Changes were observed in glycemia of the snails, in both situations parasitism, with significant increase in glucose levels observed from the third week post infection when compared to the control group. Changes have also been described in relation to the activity of lactate dehydrogenase and are characterized by the increase of its activity in the later periods of infection. In parallel, there was a decrease in glycogen content in storage tissues, being such greater reduction in the digestive gland (larval development site) in comparison to the cephalopedal mass. In addition, the infection by both miracidiais doses resulted in increased levels of oxalic acid and lactic acid, as well as a decline in the content of pyruvic and succinic acids in B. glabrata. The prepatent infection by this equinostomatideo still significantly suppressed the phosphorylation state (state 3 respiration) and basal oxygen consumption (state 1 and 2) in B. glabrata, demonstrating that infection by E. paraensei decreases the capacity of the intermediate host in performing aerobic oxidative reactions. These results demonstrate the reduction in oxidative decarboxylation rate of the reactions that are part of the tricarboxylic acid cycle and acceleration of the process of anaerobic degradation of carbohydrates in the infected snails by lactic acid fermentation, it is essential to ensure the obtaining of energy and the success of the infection. Thus, the results observed in this study demonstrate that infection with five or 50 miracidia of E. paraensei caused significant metabolic changes in B. glabrata snails being exposed to the largest load miracidial showed the greatest damage, featuring a dose-dependent response / Parasitos pertencentes ao g?nero Echinostoma caracterizam por apresentar um ciclo biol?gico complexo, com dois hospedeiros intermedi?rios e s?tio final de infec??o restrito ao l?men intestinal de seus hospedeiros definitivos. Estes hospedeiros s?o representados principalmente por aves aqu?ticas e semi-aqu?ticas, mam?feros, incluindo o homem, e ocasionalmente algumas esp?cies de r?pteis e peixes. Possuem como primeiros hospedeiros intermedi?rios moluscos l?mnicos, onde os mirac?dios penetram ativamente e desenvolvem at? os est?gios de esporocistos, r?dias e cerc?rias. Por sua vez, crust?ceos, anf?bios, peixes e moluscos l?mnicos atuam como segundos hospedeiros intermedi?rios onde ocorre a forma??o de metacerc?rias, est?gios infectantes ao hospedeiro definitivo. Neste estudo, Biomphalaria glabrata foi experimentalmente infectada com diferentes doses miracidiais (5 ou 50) de E. paraensei. Os moluscos foram dissecados ap?s uma, duas, tr?s e quatro semanas de infec??o para a coleta da hemolinfa e tecidos (complexo g?nada-gl?ndula digestiva- GGD e massa cefalopediosa). Na hemolinfa foram quantificadas as concentra??es de glicose e de ?cidos carbox?licos (succ?nico, pir?vico, l?tico e ox?lico), bem como a atividade da lactato desidrogenase (LDH). Nos tecidos de estocagem foram mensurados os conte?dos de glicog?nio e consumo de oxig?nio (O2). Altera??es foram observadas na glicemia dos moluscos, em ambas as situa??es de parasitismo, com significativo aumento dos n?veis de glicose verificado a partir da terceira semana de infec??o quando comparado ao grupo controle. Mudan?as foram tamb?m descritas em rela??o ? atividade da lactato desidrogenase, sendo caracterizadas pelo aumento de sua atividade nos per?odos mais tardios da infec??o. Em paralelo, verificou-se um decr?scimo nos conte?dos de glicog?nio em tecidos de armazenamento, sendo tal redu??o maior na gl?ndula digestiva (s?tio de desenvolvimento larval), em compara??o ? massa cefalopediosa. A infec??o por ambas as doses miracidiais ainda resultou em um aumento dos n?veis de ?cidos ox?lico e l?tico, bem como em um decl?nio nos conte?dos de ?cidos pir?vico e succ?nico em B. glabrata. Significativa supress?o no estado fosforilativo (estado 3 respirat?rio) e no consumo basal de oxig?nio (estado 1 e 2) em B. glabrata infectada por E. paraensei foi demonstrada, indicando que a infec??o por este equinostomat?deo diminui a capacidade do hospedeiro intermedi?rio em realizar rea??es oxidativas aer?bias. Varia??es relevantes relacionadas ao estado mitocondrial desacoplado (estado 3u) de B. glabrata infectada por tal tremat?deo foram tamb?m descritas. Tais resultados demonstram redu??o na taxa de descarboxila??o oxidativa das rea??es que integram o ciclo do ?cido tricarbox?lico e acelera??o do processo de degrada??o anaer?bia de carboidratos nos moluscos infectados, atrav?s da fermenta??o l?tica, essencial para garantir a obten??o de energia e o sucesso da infec??o. Assim, os resultados observados neste estudo demonstram que a infec??o com cinco ou 50 mirac?dios de E. paraensei provocou consider?veis altera??es metab?licas em B. glabrata, sendo que os moluscos expostos a maior carga miracidial apresentaram os maiores danos, caracterizando uma resposta dosedependente.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Widespread and prolonged usage of azoles in recent years has led to the rapid development of drug resistance in Candida species. In Candida albicans, resistance to fluconazole causes cross-resistance to other antifungals and an increase in virulence, making treatment still more difficult because of the limited therapeutical options. Nonetheless, similar phenomenon has been observed for Candida glabrata, specie that has emerged as a pathogen of clinical importance. Fluconazole resistance has been clinically described in Candida glabrata isolates and it is easily induced by in vitro exposure to the drug, but little is known about its consequences. In the present study, two groups of C. glabrata isolates were evaluated. One group was composed by fluconazole-susceptible clinical isolates (FS), and the other was composed by fluconazole-resistant (FR) laboratory derivatives from the former through an in vitro method of fluconazole resistance induction, in order to compare the activitie of the three major antifungal agent classes azoles, echinocandins and poliens. Resistant derivatives showed minimal inhibitory concentrations equal or higher than 64 μg/mL. All yeasts were tested by the broth microdilution method. Based on susceptibility parameters (MIC range, MIC50, MIC90 and geometric mean), the fluconazole-susceptible C. glabrata group (FS) was susceptible to amphotericin B (MIC90 of 0.125 μg/ml). For inhibition, the fluconazole-resistant C. glabrata group (FR) required higher concentrations of amphotericin B (MIC90 of 2 μg/ml). C. glabrata FR group showed cross-resistance with voriconazole (MIC90 of 16 μg/ml). Echinocandins showed the lowest MICs against to both group, flucoanzole-susceptible and resistant. Micafungin demostrated the lowest MIC values among all antifungal agents evaluated (MIC90 of 0.008 μg/ml in FS and 0.015 μg/ml in FR). Our results showed that resistance to fluconazole affected voriconazole susceptibility but not the echinocandin susceptibility, which demonstrated excellent activitie against tested C. glabrata groups. / O uso prolongado e indiscriminado dos azólicos nos últimos anos permitiu um rápido desenvolvimento de resistência aos fármacos nas espécies de Candida. Em Candida albicans, a resistência ao fluconazol causa resistência cruzada a outros antifúngicos e aumento na virulência, tornando o tratamento ainda mais complicado por causa das opções terapêuticas limitadas. Ainda assim, fenômeno semelhante tem sido observado para Candida glabrata, espécie que emergiu como patógenos de importância clínica. A resistência ao fluconazol tem sido clinicamente descrita em isolados de Candida glabrata, e é facilmente induzida pela exposição in vitro ao azólico, mas pouco se conhece sobre suas conseqüências. No presente estudo, dois grupos de isolados de C. glabrata foram avaliados. Um grupo era composto de isolados clínicos sensíveis ao fluconazol (FS), e o outro, derivado do primeiro através de técnica de indução de resistência, era composto de isolados resistentes ao fluconazol (FR), com o intuito de comparar a atividade das três maiores classes de agentes antifúngicos azóis, equinocandinas e poliênicos. Os derivados resistentes obtidos evidenciaram concentrações inibitórias mínimas (CIMs) maiores ou iguais a 64 μg/mL. Foram realizados testes de suscetibilidade aos antifúngicos através da técnica de microdiluição em caldo. Com base nos parâmetros de suscetibilidade (faixa de CIM, CIM50, CIM90 e média geométrica), o grupo FS foi suscetível à anfotericina B (CIM90 de 0,125 μg/ml). Entretanto, o grupo FR requereu doses maiores do antifúngico para ser inibido (CIM90 de 2 μg/ml). O grupo de C. glabrata FR evidenciou resistência cruzada com voriconazol (CIM90 de 16 μg/ml). As equinocandinas mostraram os melhores resultados frente a ambos os grupos, sensíveis e resistentes. Micafungina demonstrou os menores valores de CIM entre todos os agentes antifúngicos estudados (CIM90 de 0.008 μg/ml para FS e 0.015 μg/ml para FR). Os resultados deste estudo mostraram que a resistência ao fluconazol afeta a suscetibilidade do voriconazol, mas não das equinocandinas, as quais mostraram excelente atividade frente aos grupos de C. glabrata testados.

In the present study, in vitro antifungal activity of essential oils obtained from Origanum vulgare (oregano), Cinnamomum zeylanicum (cinnamon), Lippia graveolens (Mexican oregano), Thymus vulgaris (thyme), Salvia officinalis (sage), Rosmarinus officinalis (rosemary), Ocimum basilicum (basil) e Zingiber officinale (ginger) was assessed against Candida glabrata isolates. A group of 36 fluconazole-susceptible C. glabrata isolates were used and another group, derived from the first, obtained after in vitro induction of the fluconazole-resistance, totalizing 72 isolates tested. The methodology used was broth microdilution, cancentrations of 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 400 μg/mL, 800 μg/mL, 1600 μg/mL and 3200 μg/mL were used, through which Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal Concentration (MFC) were determined. Thyme, sage, rosemary, basil and ginger essential oils showed no antifungal activity on the tested concentrations. Antimicrobial activity lower than or equal to 3200 μg/mL was observed for oregano, Mexican oregano and cinnamon essential oils, being oregano essential oil the most potent. Oregano essential oil has shown the best antifungal activity against fluconazole-susceptible C. glabrata group. Likely, Mexican oregano essential oil has shown the best antifungal activity against fluconazole-susceptible C. glabrata group. And cinnamon essential oil has shown the best antifungal activity against fluconazole-resistant isolates of C. glabrata. / No presente estudo, avaliou-se a atividade antimicrobiana in vitro dos óleos essenciais obtidos de Origanum vulgare (orégano), Cinnamomum zeylanicum (canela), Lippia graveolens (orégano mexicano), Thymus vulgaris (tomilho), Salvia officinalis (sálvia), Rosmarinus officinalis (alecrim), Ocimum basilicum (manjericão) e Zingiber officinale (gengibre) frente aos isolados de Candida glabrata. Foi utilizado um grupo de 36 isolados de C. glabrata sensíveis ao fluconazol e outro grupo, derivado do primeiro, obtido após indução a resistência ao fluconazol in vitro, totalizando 72 isolados testados. Empregou-se a metodologia de microdiluição em caldo, utilizando-se concentrações de 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 400 μg/mL, 800 μg/mL, 1600 μg/mL e 3200 μg/mL, através do qual se determinou Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM). Os óleos essenciais de tomilho, sálvia, alecrim, manjericão e gengibre não evidenciaram atividade antifúngica nas concentrações testadas. Atividade antimicrobiana inferior ou igual à máxima testada (3200 μg/mL) foi observada para os óleos essenciais de orégano, orégano mexicano e canela. O óleo essencial de orégano apresentou a atividade antimicrobiana mais potente. Quando analisada a diferença entre os dois grupos de micro-organismos, C. glabrata sensível ao fluconazol mostrou-se mais suscetível ao óleo essencial de orégano e orégano mexicano, e C. glabrata resistente ao fluconazol mostrou-se mais suscetível ao óleo essencial de canela.

A participação das espécies reativas de oxigênio (ERO) no mecanismo de ação dos antifúngicos azólicos, bem como a relação entre resistência aos antifúngicos e resposta ao estresse oxidativo, têm sido sugeridos. Entretanto, os dados ainda são inconclusivos e diferem entre os micro-organismos. Neste estudo estão apresentados os resultados da geração de ERO pelo fluconazol em isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes a esse antifúngico e a resposta antioxidante da levedura. Nesses isolados, tratados e não tratados com fluconazol em concentração subinibitória, de acordo com sua concentração inibitória mínima (CIM), até fase de crescimento estacionário, foi avaliado se o fluconazol geraria ERO. Subsequentemente, foram analisadas as defesas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), superóxido dismutase (SOD), glutationa-S-transferase (GST), consumo de peróxido de hidrogênio e glutationa total, bem como possível dano oxidativo causado pelo fluconazol em lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos e os níveis de nitritos e nitratos. Os resultados mostram que nos isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes ao fluconazol, na presença do antifúngico, houve um aumento da geração ERO e maior atividade enzimática da GPx e SOD comparada a dos isolados não tratados com fluconazol, não havendo diferença estatística entre isolados sensíveis e resistentes nesses três parâmetros citados. Em relação à enzima GST, os isolados sensíveis mostraram maior atividade enzimática comparada aos resistentes, e quando as células sensíveis foram tratadas com fluconazol, a atividade da GST diminuiu. O fluconazol não induziu dano oxidativo em proteínas e em lipídeos, entretanto foi observado dano oxidativo ao DNA. Diante disso, sugere-se que o fluconazol gera ERO como parte do seu mecanismo antifúngico em C. glabrata em fase de crescimento estacionário, induzindo dano oxidativo no DNA. Como resposta, observa-se aumento na atividade enzimática da SOD e da GPx na levedura. O entendimento da resposta antioxidante de leveduras patogênicas tem importante interesse clínico, uma vez que o desenvolvimento racional de novas drogas antifúngicas requer conhecimento do metabolismo fúngico. / The participation of reactive oxygen species (ROS) in azoles antifungal mechanism of action has been suggested, as well as the relation between antifungal resistance and oxidative stress response. However, data are still inconclusive and differ between microorganisms. This study presents the results of ROS generation by fluconazole in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains and their antioxidant response. It was evaluated whether fluconazole generates ROS in those isolates treated and untreated with fluconazole at sub-inhibitory concentration according to their minimal inhibitory concentration (MIC). This treatment was conducted until stationary growth phase was reached. Subsequently, the antioxidant defenses glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), glutathione-S-transferase (GST), consumption of hydrogen peroxide and total glutathione, the possible oxidative damage in lipids, proteins and nucleic acids and the levels of nitrites and nitrates were analyzed. Results showed increased ROS generation in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains treated with fluconazole, and also higher GPx and SOD enzymatic activity, compared to untreated cells. No statistical difference of those three parameters was observed between susceptible and resistant strains. In relation to GST, susceptible strains demonstrated higher activity compared to the resistant ones, and when susceptible cells were treated with fluconazole the GST activity decreased compared to untreated. Fluconazole did not induce oxidative damage in proteins and in lipids, however oxidative DNA damage was observed. Therefore, it is suggested that fluconazole generates ROS as part of its antifungal mechanism in C. glabrata at stationary growth phase, inducing oxidative DNA damage. In response, there was increase in the enzymatic activity of SOD and GPx in yeast. The understanding of the pathogenic yeast antioxidant response has important clinical interest, since the rational development of new antifungal drugs requires knowledge about the fungal metabolism.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2017-07-14T18:15:10Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE - ficha catalográfica (Roberto Lima).pdf: 2704286 bytes, checksum: 196684c3e7fdeb681a04b47be121d8d8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-14T18:15:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE - ficha catalográfica (Roberto Lima).pdf: 2704286 bytes, checksum: 196684c3e7fdeb681a04b47be121d8d8 (MD5) Previous issue date: 2014-06-16 / Capes / Avanços tecnológicos buscam recursos naturais adequados e disponíveis para obtenção de produtos sustentáveis e economicamente viáveis. Neste trabalho foi estudada a produção de metabólitos como os biossurfactante, lipídeos e Coenzima Q10 por Candida glabrata (UCP 1002 e 1556), por processo biotecnológico. O cultivo foi realizado em meio de baixo custo a base de resíduos agroindustriais (milhocina e soro de leite). Inicialmente neste estudo foi realizado um processo de produção de biossurfactante por C. glabrata (UCP 1002 e 1556), utilizando resíduos agroindustriais como fonte de carbono e nitrogêncio em substituição ao meio sintético, sendo observado que as duas linhagens produziram similares quantidades de biossurfactante. Foi realizado um processo de otimização do meio a base de resíduos agroindustriais por Delineamento Composto Central (DCC) 22. Os resultados obtidos evidenciaram que no segundo planejamento com 40% de soro de leite e 20% de milhocina foi mais eficiente na produção de biossurfactante utilizando a C. glabrata 1556, com uma redução da tensão superficial de 72 para 28,8mN/m. O biossurfactante foi caracterizado e classificado como lipoproteína e além disso demonstrou se seu caráter aniônico. O meio otimizado empregou se na produção e caracterização da CoQ10 por C. glabrata (UCP 1556), ficando evidenciado a presença significativa do composto e sua ação antioxidante. Neste meio foi testado o potencial das duas linhagens de C. glabrata (UCP 1002 e 1556) na produção de lipídeos e ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) e uma quantidade elevada de ácido γ-ácido linolênico (ω6) e α-ácido linolênico (ω3) foi detectada. Os resíduos agroindustriais são substratos nutritivos que representam uma redução econômica para a produção compostos limpos que podem ser aplicados na indústria de cosmética e farmacêutica. / Technological advances seek appropriate natural resources and available for achieving of sustainable products and viable economically. In this work was studied the production of metabolites as biosurfactant, Coenzyme Q10 and lipids by Candida glabrata (UCP 1002 and 1556) for biotechnological process. The cultivation was carried in medium of low cost the base of agroindustrial waste (whey and corn steep liquor). Initially this study was performed a process of biosurfactant production by C. glabrata (UCP 1002 and 1556), using agroindustrial residues as a carbon source and nitrogen replacing the synthetic medium, it was observed that both strains produced similar amounts of biosurfactant. It was performed a optimization process of the medium the base of agroindustrial waste by Central Composite Design (CCD) 22. The results showed that the second planning with 40% of whey and 20% of corn steep liquor it was more efficient in the biosurfactant production using C. glabrata (UCP 1556), with a reduction in surface tension from 72 to 28,8mN/m. The biosurfactant was characterized and classified as lipoprotein and furthermore it was demonstrated its anionic character. The optimized medium was performed in the production and characterization of CoQ10 by C. glabrata (UCP 1556), getting evidenced the significant presence of the compound and its antioxidant action. In this medium was tested the potential of two strains of C. glabrata (UCP 1002 e 1556) in the production of lipids and polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and a high quantity of γ-linoleic acid (ω6) and e α- linoleic acid (ω3) was detected. The agroindustrial wastes are nutritious substrates which represent an economic cost reduction in the production of clean compounds that it can be applied in cosmetic and pharmaceutical industry.

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Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können. / Morphological development of the fungal pathogen C. albicans is profoundly affected by environmental signals. This morphological flexibility is considered an essential factor for pathogenicity of C. albicans. One of the important signals that regulates morphology of C. albicans is the ambient pH. Acidic pH restricts growth to the yeast form, whereas neutral pH permits development of the filamentous form. Superimposed on the pH restriction is a temperature requirement of approximately 37°C for filamentation. C. albicans responds to changes in environmental pH by differential expression of several genes including PHR1 and PHR2. PHR2 is an acid expressed gene that is not expressed at detectable levels above pH 6.5. Mutants lacking PHR2 are unable to grow at acidic pH and exhibit morphological defects. PHR1 is an alkaline expressed gene with the inverse pattern of expression. PHR1 and PHR2 encode functionally homologous proteins involved in cell wall biosynthesis, which is pivotal in determining cell shape changes during morphogenesis. The role of pH in development was investigated in this work by selecting revertants of phr2D mutants that had gained the ability to grow at acid pH. The extragenic suppressors in two independent revertants were identified as nonsense mutations in the pH response regulator RIM101 that resulted in a carboxy-terminal truncation of the open reading frame. These dominant active alleles conferred the ability to filament at acidic pH, to express PHR1, an alkaline expressed gene, at acidic pH and to repress the acid expressed gene PHR2. This indicates that RIM101 is a key regulator of the pH-dependent dimorphism in C. albicans. Furthermore these results suggest that the molecular mechanisms which control pH-dependent gene expression in Aspergillus nidulans and other fungi are also conserved in C. albicans. It was also observed that both the wild type and mutant alleles could act as multicopy suppressors of the temperature restriction on filamentation, allowing extensive filamentation at 29°C. This observation suggests that two environmental signals, pH and temperature, converge on common molecular targets. The ability of the activated alleles to promote filamentation was dependent upon the developmental regulator EFG1. The results suggest that RIM101 is responsible for the pH-dependence of hyphal development. C. albicans and C. glabrata are opportunistic pathogens which are able to colonize and infect many tissues and organs. This indicates that these organisms are well adapted for survival within the diverse environmental niches of the human host. C. albicans responds to different environmental signals, as described above, with the expression of certain genes, e.g. PHR1, PHR2 and RIM101. In contrast to C. albicans the gene regulation in the emerging pathogen C. glabrata is poorly understood. In order to develop a reporter system allowing studies on regulated gene expression in C. glabrata the functionality of the E. coli lacZ gene as a reporter of gene expression in C. glabrata was investigated. C. glabrata shuttle vectors suitable for the construction of translational fusions of a gene of interest to the E. coli lacZ reporter were generated. By fusing different promoters to the lacZ gene it could be shown that the E. coli lacZ gene provides a sensitive and inducible reporter displaying b-galactosidase activity in C. glabrata.