Made available in DSpace on 2016-06-02T19:29:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_doutorado_cleoni_santos_carvalho.pdf: 1593052 bytes, checksum: 54ecf221a0707b5f706385205ef8b616 (MD5) Previous issue date: 2003-03-20 / Universidade Federal de Minas Gerais / Considering that the pollutants in fish and other animals begin at enzymatic levels, and may alter the cell function and structure, the main goal of the present study was to analyze the influence of the water pH and temperature on the copper effects in liver and blood of the freshwater fish, Prochilodus scrofa via hematological, morphological and enzymatic analysis. Juveniles specimens of P. scrofa acclimated to 20 and 30ºC were exposed to copper (acute exposure) in static systems at water pH 4.5 and 8.0 to determine the 96h-LC50. Them groups of fish were exposed to 96h-LC50 in the same water conditions for hematological analysis, determination of activity of regulatory and associated glycolitic enzymes from liver and blood in vivo and in vitro and liver morphological analysis. Groups of fish acclimated at 20 and 30ºC were kept a water pH 7.0 and serve as control for the controls groups pH 4.5 and 8.0. The 96h-LC50 were calculated as 98 ± 0.9 and 16 ± 0.2 µgCu.L-1 respectively at pH 4.5 e 8.0 a 20ºC and 88 ± 0.8 e 14 ± 0.5 µgCu.L-1 em pH 4.5 e 8.0 a 30ºC. The change in water pH caused na increase in the hematocrit (Hct) in both water pH and temperatures, reduction of hemoglobin concentration ([Hb]) at water pH 4.5 at 20 and 30ºc and an increase in the number of erythrocytes (RBC) at pH 4.5 at 30ºC (p<0.05). Copper exposure caused an increase in [Hb] and RBC at 20ºC in both pHs and a reduction in the [Hb] at pH 4.5 and RBC at pH 8.0 a 30ºC. In vivo studies showed an increase in the plasma glucose concentration of the control group pH 4.5 and in fish exposed to copper in pH 4.5 at 30ºC (p<0.05). Hepatic glycogen concentration was higher at 20ºC (p<0.05). The activity of PFK enzyme in liver was reduced in the control group pH4.5 at 20ºC and increased after copper exposure. In vitro studies showed high influence of temperature on the regulatory enzymes. The activity of HK, PFK, PK, LDH and G6PHD was reduced in the control groups at 30ºC. After copper exposure the activity of these enzymes increased reaching values similar of the controls pH 7.0. In the erythrocit the increase of enzyme activity after copper exposure was more evident in the HK and PFK enzymes. Copper accumulation in liver was higher at 20ºC however, the metallothionein induction that was isolated using DEAE-Sepharoese and identified by SDS-PAGE, was more evident in fish exposed to low copper concentration in water but pH 8.0 (LC50-96h at water pH8.0). Liver histopathologies (hyperemia, cytoplasmic vacuolization, cellular and nuclear degeneration, focal necrosis and melanomacrophages) in P. scrofa was more related to the changes in water pH than copper exposure. These results evidenced that the changes in hematology and in the enzyme activities in response to pH and copper in the environment are complex. However, it is possible to conclude that: 1) the anaerobic metabolism prevailed in liver in fish acclimated to 20ºC, in vivo, while, in vitro, the enzyme activity was kept without change, except for HK and PK that increased their activity. The activity decrease of the regulatory and associated enzymes suggest the use of glycolitic via for energy at 30ºC; 2) copper decrease the activity of these enzymes in both temperatures; 3) the activities of regulatory enzymes at 20ºC, in the erythrocit from control groups, in vivo, suggest the mobilization of glucose. Copper addition in it showed activity stimulation in low pH (PFK) and inhibition in high pH (PFK) suggesting that in this pH the energy probably come from lactate produced by the LDH; 4) in the erythrocit, at 20ºC, the pH and copper effect suggest that the aerobic metabolism was stimulated at low pH and that the anaerobic metabolism was stimulated at high pH; it was evidenced by the increase of PFK and LDH activities, respectively; 5) the energetic demand at high temperature was maintained by the activity of PFK and LDH in the control groups and in the presence of copper prevailed the anaerobe at low pH and the aerobe at high pH; 6) the increase of metallothionein concentration suggests an increase of metabolism with the increase of temperature that increased the synthesis of this protein and the higher accumulation of copper at 20ºC may evidence higher copper excretion in fish acclimated to 30ºC; 7) the more frequent changes in the hepatic tissue found in all experiments showed low specificity of lesions as most of them occurred in response to change in water pH. / Considerando que o efeito de poluentes em peixes e outros organismos se iniciam nos níveis enzimáticos podendo alterar a função das células e sua estrutura, o presente estudo teve como objetivo verificar a influência do pH e temperatura da água sobre os efeitos do cobre no fígado e sangue de Prochilodus scrofa através das análises hematológica, morfológica e enzimática. Exemplares jovens foram expostos (96 h) ao cobre dissolvido na água, em pH 4,5 e 8,0 a 20 e 300C. A CL50-96h para o cobre a 20 oC foi determinada como 98 ± 0,9 µg.L-1 em pH 4,5 e 16 ± 0,2 µg.L-1 em pH 8,0. A 30 oC, CL50-96 h foi 88 ± 0,8 µg.L-1 em pH 4,5 e 14 ± 0,5 µg.L-1 em pH 8,0. Um grupo de animais foi mantido em pH 7,0 para avaliarmos apenas o efeito do pH. A mudança do pH da água causou aumento no hematócrito (Hct) em ambos os pHs e temperaturas, houve redução na concentração de hemoglobina ([Hb])em água com pH 4,5 a 20 e 30 oC e aumento no número de eritrócitos (RBC) em pH 4,5 a 30 oC (p < 0,05). A exposição ao cobre causou aumento na [Hb] e RBC a 20 oC em ambos pHs e uma diminuição na [Hb] em pH 4,5 e RBC em pH 8,0 a 30 oC. Nos estudos in vivo, a concentração de glicose plasmática aumentou em pH 4,5 nos grupos controle e na presença do cobre em pH 4,5 a 30 oC (p,0,05). A concentração de glicogênio hepático foi maior a 20 oC (p<0,05). A atividade da PFK do fígado diminuiu nos grupos controles pH 4,5 a 20 oC e aumentou após a exposição ao cobre. Os estudos in vitro mostraram influência da temperatura e pH da água na atividade das enzimas regulatórias. A atividade das enzimas HK, PFK, PK, LDH e G6PDH diminuiu nos grupos controles em a 30 oC . Após a exposição ao cobre a atividade destas enzimas aumentou alcançando valores próximos ao controle pH 7,0. Na solução de eritrócitos o aumento na atividade da enzimas foi mais evidente na HK e PFK. Em relação as duas temperaturas o acúmulo de cobre foi maior na temperatura de 20 oC, entretanto, a indução da metalotionina (MT) isolada por DEAE-Sepharose e identificada por eletroforese em SDS-PAGE, foi mais evidente em peixes expostos a menor concentração de cobre em água com pH 8,0 (CL50 96h em água com pH 8,0). As alterações histopatológicas (hiperemia, vacuolização citoplasmática, degeneração celular e nuclear, necrose focal e aumento de melanomacrófagos) em P. scrofa foram relacionadas com a mudança do pH da água do que a exposição ao cobre. Estes resultados indicam que as mudanças na hematologia e na atividade de enzimas em resposta à variação do pH e presença do cobre no ambiente aquático são complexas. Entretanto, é possível concluir que: 1) o metabolismo anaeróbio prevaleceu no fígado de peixes aclimatados a 20 oC, in vivo, enquanto que, in vitro, a atividade das enzimas foi mantida sem alteração, exceto para a HK e PK que aumentaram a atividade. O aumento da atividade das enzimas regulatórias e associadas sugerem o uso da via glicolítica a 30 oC.; 2) o cobre diminuiu a atividade destas enzimas em ambas temperaturas; 3) a atividade das enzimas regulatórias a 20 oC, na solução de eritrócitos dos grupos controle, in vivo, sugere preferência pelo metabolismo aeróbio. A adição do cobre estimulou a atividade da PFK em pH baixo e inibiu em pH alto sugerindo que neste pH a energia provavelmente provém do lactato formado pela LDH; 4) na solução de eritrócitos, a 20 oC, o cobre e o pH estimularam o metabolismo aeróbio em pH baixo e o metabolismo anaeróbio em pH alto, os quais foram evidenciados pelo aumento da atividade da PFK e da LDH, respectivamente; 5) a demanda de energia em altas temperaturas foi mantida pela atividade da PFK e LDH nos grupos controle e na presença de cobre prevaleceu o metabolismo anaeróbio em pH baixo e o metabolismo aeróbio em pH alto; 6) o aumento da concentração de MT sugere aumento do metabolismo com o aumento da temperatura que aumentou a síntese desta proteína e o maior acúmulo de cobre a 20 oC evidencia maior excreção de cobre nos peixes aclimatados a 30 oC; 7) as mudanças mais freqüentes no tecido hepático observadas em todos os tratamentos mostrou que as lesões ocorreram em resposta à mudança do pH da água.

&#946;-glicosidases da família 1 das glicosídeo hidrolases (GH 1) são um dos mais importantes grupos de enzimas, estando envolvidas em diversos processos biológicos. Neste trabalho o objetivo principal foi o estudo das bases moleculares da especificidade pelo substrato em &#946;-glicosidases GH 1 utilizando como modelo experimental uma &#946;-glicosidase pertencente a larva de Spodoptera frugiperda (Sf&#946;gli50). Na primeira etapa procurou-se analisar através de mutagênese sítio-dirigida e cinética enzimática o papel na modulação da especificidade pelo substrato e na catálise dos resíduos E190, E194, K201 e M453 da Sf&#946;gli50 , os quais correspondem aos encontrados no sítio de ligação do aglicone das &#946;-glicosidases de milho e de sorgo. Os resultados mostraram que E190 favorece a ligação da porção inicial de aglicones do tipo alquil inicial e também da primeira unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos. E194 favorece a ligação de radicais alquil, enquanto K201 é mais relevante para a ligação de unidades de glicose em detrimento de radicais alquil. O balanço entre as interações com E194 e K201 determina a preferência entre unidades de glicose versus radicais alquil. M453 favorece a ligação da segunda unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos e também da porção inicial de aglicones do tipo alquil. Nenhum destes resíduos interage com a porção terminal de aglicones do tipo alquil. Demonstrou-se que todos estes resíduos contribuem de forma similar e individualmente fraca na estabilização do complexo ES&#8225; e suas interações com o aglicone não influenciam na ligação do glicone. Na segunda etapa, procurou-se identificar resíduos ou regiões da Sf&#946;gli50 que participem do processo de modulação da especificidade pelo substrato e que ainda não tivessem sido descritos na literatura. Assim, selecionou-se 14 Sf&#946;gli50 mutantes a partir de uma \"biblioteca\" de mutantes geradas por mutagênese aleatória in vivo. As análises de \"contatos\" e de ligações de hidrogênio envolvendo estes resíduos mutados possibilitaram a identificação de outros resíduos e, consequentemente, a construção de mais 32 Sf&#946;gli50 mutantes. Estas 46 Sf&#946;gli50 mutantes foram produzidas em sistema heterólogo de expressão em bactéria, purificadas e caracterizadas cineticamente. A análise dos resultados obtidos sugere que alguns resíduos mutados devem participar da modulação da especificidade pelo substrato formando \"vias de conexão\", de tal forma que mutações em resíduos que compõem uma \"via\" podem ter efeitos propagados através de suas conexões e, assim, atingirem outras porções da Sf&#946;gli50, como o sítio ativo. Esta propagação pode se dar através de alterações no posicionamento espacial e no conjunto das interações não-covalentes entre os resíduos envolvidos. Finalmente um ponto em comum aos efeitos mutacionais analisados parece ser uma alteração na plataforma basal do glicone, W444, o que causaria modificações na preferência relativa pelos substratos fucosídeos e glucosídeos. / The &#946;-glycosidases of family 1 of the glycoside hydrolases (GH 1) are one of the most important groups of enzymes. These enzymes are involved in a high diversity of physiological functions. The main objective of this study was the analysis of the molecular bases of the specificity for substrate of a &#946;-glycosidase from the larvae of Spodoptera frugiperda (Sf&#946;gli50). Initially the role of residues E190, E194, K201 and M453 of Sf&#946;gli50 in modulation of the specificity for the substrate was investigated through site-directed mutagenesis experiments and enzyme kinetic analysis. These residues corresponds to the those found in the aglycone binding site of Zea mays and Sorghum bicolor &#946;-glycosidases. The results showed that E190 favors the binding of the initial portion of alkyl-type aglycones (up to the sixth methylene group) and also the first glucose unit of oligosaccharidic aglycones, whereas a balance between interactions with E194 and K201 determines the preference for glucose units versus alkyl moieties. E194 favors the binding of alkyl moieties, while K201 is more relevant for the binding of glucose units, in detriment of its favorable interaction with alkyl moieties. In addition, M453 favors the binding of the second glucose unit of oligosaccharidic aglycones and also of the initial portion of alkyl-type aglycones. None of these residues interact with the terminal portion of alkyl-type aglycones. It was also demonstrated that E190, E194, K201 and M453 similarly contribute to stabilize ES&#8225;. Their interactions with aglycone are individually weaker than those formed by residues interacting with glycone, but their joint catalytic effects are similar. Finally, these interactions with aglycone do not influence glycone binding. In the second part of this study, new Sf&#946;gli50 residues or portions that participated in the modulation of the substrate specificity were identified. In order to reach this objective, 14 Sf&#946;gli50 mutants were seleted from a \"library\" generated by random mutagenesis in vivo. Based on the \"contacts\" or hydrogen bounds involving these 14 mutated residues 32 additional mutant Sf&#946;gli50 were constructed. These 46 Sf&#946;gli50 mutant were produced in bacteria, purificated and characterized. The results suggest that these residues ways be grouped in \"connective pathways\", a set of residues that contact each other. Mutations in residues that compose a \"pathways\" may be propagated through its connections reaching the Sf&#946;gli50 active site. This propagation may be mediated by alterations in the spatial positioning and the set of non covalent interactions of these residues. Finally, several of these \"connective pathways\" contact a common point in the active site, the basal platform of the glycone subsite, W444.

&#946;-glicosidases da família 1 das glicosídeo hidrolases (GH 1) são um dos mais importantes grupos de enzimas, estando envolvidas em diversos processos biológicos. Neste trabalho o objetivo principal foi o estudo das bases moleculares da especificidade pelo substrato em &#946;-glicosidases GH 1 utilizando como modelo experimental uma &#946;-glicosidase pertencente a larva de Spodoptera frugiperda (Sf&#946;gli50). Na primeira etapa procurou-se analisar através de mutagênese sítio-dirigida e cinética enzimática o papel na modulação da especificidade pelo substrato e na catálise dos resíduos E190, E194, K201 e M453 da Sf&#946;gli50 , os quais correspondem aos encontrados no sítio de ligação do aglicone das &#946;-glicosidases de milho e de sorgo. Os resultados mostraram que E190 favorece a ligação da porção inicial de aglicones do tipo alquil inicial e também da primeira unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos. E194 favorece a ligação de radicais alquil, enquanto K201 é mais relevante para a ligação de unidades de glicose em detrimento de radicais alquil. O balanço entre as interações com E194 e K201 determina a preferência entre unidades de glicose versus radicais alquil. M453 favorece a ligação da segunda unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos e também da porção inicial de aglicones do tipo alquil. Nenhum destes resíduos interage com a porção terminal de aglicones do tipo alquil. Demonstrou-se que todos estes resíduos contribuem de forma similar e individualmente fraca na estabilização do complexo ES&#8225; e suas interações com o aglicone não influenciam na ligação do glicone. Na segunda etapa, procurou-se identificar resíduos ou regiões da Sf&#946;gli50 que participem do processo de modulação da especificidade pelo substrato e que ainda não tivessem sido descritos na literatura. Assim, selecionou-se 14 Sf&#946;gli50 mutantes a partir de uma \"biblioteca\" de mutantes geradas por mutagênese aleatória in vivo. As análises de \"contatos\" e de ligações de hidrogênio envolvendo estes resíduos mutados possibilitaram a identificação de outros resíduos e, consequentemente, a construção de mais 32 Sf&#946;gli50 mutantes. Estas 46 Sf&#946;gli50 mutantes foram produzidas em sistema heterólogo de expressão em bactéria, purificadas e caracterizadas cineticamente. A análise dos resultados obtidos sugere que alguns resíduos mutados devem participar da modulação da especificidade pelo substrato formando \"vias de conexão\", de tal forma que mutações em resíduos que compõem uma \"via\" podem ter efeitos propagados através de suas conexões e, assim, atingirem outras porções da Sf&#946;gli50, como o sítio ativo. Esta propagação pode se dar através de alterações no posicionamento espacial e no conjunto das interações não-covalentes entre os resíduos envolvidos. Finalmente um ponto em comum aos efeitos mutacionais analisados parece ser uma alteração na plataforma basal do glicone, W444, o que causaria modificações na preferência relativa pelos substratos fucosídeos e glucosídeos. / The &#946;-glycosidases of family 1 of the glycoside hydrolases (GH 1) are one of the most important groups of enzymes. These enzymes are involved in a high diversity of physiological functions. The main objective of this study was the analysis of the molecular bases of the specificity for substrate of a &#946;-glycosidase from the larvae of Spodoptera frugiperda (Sf&#946;gli50). Initially the role of residues E190, E194, K201 and M453 of Sf&#946;gli50 in modulation of the specificity for the substrate was investigated through site-directed mutagenesis experiments and enzyme kinetic analysis. These residues corresponds to the those found in the aglycone binding site of Zea mays and Sorghum bicolor &#946;-glycosidases. The results showed that E190 favors the binding of the initial portion of alkyl-type aglycones (up to the sixth methylene group) and also the first glucose unit of oligosaccharidic aglycones, whereas a balance between interactions with E194 and K201 determines the preference for glucose units versus alkyl moieties. E194 favors the binding of alkyl moieties, while K201 is more relevant for the binding of glucose units, in detriment of its favorable interaction with alkyl moieties. In addition, M453 favors the binding of the second glucose unit of oligosaccharidic aglycones and also of the initial portion of alkyl-type aglycones. None of these residues interact with the terminal portion of alkyl-type aglycones. It was also demonstrated that E190, E194, K201 and M453 similarly contribute to stabilize ES&#8225;. Their interactions with aglycone are individually weaker than those formed by residues interacting with glycone, but their joint catalytic effects are similar. Finally, these interactions with aglycone do not influence glycone binding. In the second part of this study, new Sf&#946;gli50 residues or portions that participated in the modulation of the substrate specificity were identified. In order to reach this objective, 14 Sf&#946;gli50 mutants were seleted from a \"library\" generated by random mutagenesis in vivo. Based on the \"contacts\" or hydrogen bounds involving these 14 mutated residues 32 additional mutant Sf&#946;gli50 were constructed. These 46 Sf&#946;gli50 mutant were produced in bacteria, purificated and characterized. The results suggest that these residues ways be grouped in \"connective pathways\", a set of residues that contact each other. Mutations in residues that compose a \"pathways\" may be propagated through its connections reaching the Sf&#946;gli50 active site. This propagation may be mediated by alterations in the spatial positioning and the set of non covalent interactions of these residues. Finally, several of these \"connective pathways\" contact a common point in the active site, the basal platform of the glycone subsite, W444.

A conversão enzimática da sacarose pela ação sucessiva da invertase e da glicose oxidase (GOD), permite obter produtos de maior valor agregado, a saber, frutose e o ácido glicônico, dois produtos de amplo uso na indústria farmacêutica, alimentícia e química. Foi estudada a aplicação da invertase imobilizada em resinas aniônicas do tipo Dowex&#174; (um copolímero de poliestireno-divinilbenzeno) sobre a hidrólise da sacarose bem como a oxidação da glicose pela glicose oxidase solúvel ou imobilizada no mesmo suporte em separado (sistema bifásico), utilizando-se um reator de membrana acoplado à membrana de ultrafiltração (100kDa) ou de microfiltração (5&#181;m). Posteriormente, avaliou-se o desempenho de ambas as formas de enzimas, solúveis ou imobilizadas num sistema monofásico empregando o mesmo reator. A bioconversão executada em sistema bifásico permitiu a obtenção de xarope de frutose da ordem de 70% através da separação de glicose e frutose utilizando-se a resina catiônica 50W:8-100. O rendimento de 96,6% e 67,4% para as formas solúveis e imobilizadas respectivamente foram obtidas em sistema monofásico. O não desprendimento das enzimas dos suportes viabilizou o uso da membrana de microfiltração, trazendo vantagens à operação de biorreator com membrana. / The enzymatic conversion of sucrose through a successive action of invertase and glucose oxidase (GOO) allows the obtainment of products with higher commercial value, fructose and gluconic acid, which are widely used in pharmaceutical, food and chemical industries. Invertase and GOO immobilized on Dowex&#174; anionic resin (a polystyrene divinylbenzene copolymer) as well as soluble GOD were used in a membrane bioreactor (MS) for sucrose hydrolysis and glucose oxidation. The MB was coupled with a UF-membrane (100kDa) or a MF-membrane (5&#181;m). The bioconversion was conducted in two steps (biphasic system) as well as in one step (monophasic system). The bioconversion operated in a biphasic system permitted obtaining a fructose syrup with a concentration of about 70% through a separation of glucose and fructose using a cationic resin, 50W:8-100. As for the monophasic system, the yield of 96.6% and 67.4% for soluble and immobilized forms were attained respectively. No leakage of the enzymes from the support allowed the use of a microfiltration membrane, adding advantages to the membrane bioreactor operation.

A conversão enzimática da sacarose pela ação sucessiva da invertase e da glicose oxidase (GOD), permite obter produtos de maior valor agregado, a saber, frutose e o ácido glicônico, dois produtos de amplo uso na indústria farmacêutica, alimentícia e química. Foi estudada a aplicação da invertase imobilizada em resinas aniônicas do tipo Dowex&#174; (um copolímero de poliestireno-divinilbenzeno) sobre a hidrólise da sacarose bem como a oxidação da glicose pela glicose oxidase solúvel ou imobilizada no mesmo suporte em separado (sistema bifásico), utilizando-se um reator de membrana acoplado à membrana de ultrafiltração (100kDa) ou de microfiltração (5&#181;m). Posteriormente, avaliou-se o desempenho de ambas as formas de enzimas, solúveis ou imobilizadas num sistema monofásico empregando o mesmo reator. A bioconversão executada em sistema bifásico permitiu a obtenção de xarope de frutose da ordem de 70% através da separação de glicose e frutose utilizando-se a resina catiônica 50W:8-100. O rendimento de 96,6% e 67,4% para as formas solúveis e imobilizadas respectivamente foram obtidas em sistema monofásico. O não desprendimento das enzimas dos suportes viabilizou o uso da membrana de microfiltração, trazendo vantagens à operação de biorreator com membrana. / The enzymatic conversion of sucrose through a successive action of invertase and glucose oxidase (GOO) allows the obtainment of products with higher commercial value, fructose and gluconic acid, which are widely used in pharmaceutical, food and chemical industries. Invertase and GOO immobilized on Dowex&#174; anionic resin (a polystyrene divinylbenzene copolymer) as well as soluble GOD were used in a membrane bioreactor (MS) for sucrose hydrolysis and glucose oxidation. The MB was coupled with a UF-membrane (100kDa) or a MF-membrane (5&#181;m). The bioconversion was conducted in two steps (biphasic system) as well as in one step (monophasic system). The bioconversion operated in a biphasic system permitted obtaining a fructose syrup with a concentration of about 70% through a separation of glucose and fructose using a cationic resin, 50W:8-100. As for the monophasic system, the yield of 96.6% and 67.4% for soluble and immobilized forms were attained respectively. No leakage of the enzymes from the support allowed the use of a microfiltration membrane, adding advantages to the membrane bioreactor operation.