Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire responsable de la toxoplasmose. Il appartient au phylum des Apicomplexes, qui regroupe les espèces de Plasmodium responsables de la malaria. Les Apicomplexes ont un mécanisme d’invasion unique, impliquant la formation d’une interaction étroite entre la membrane plasmique du parasite et celle de la cellule hôte, appelée « jonction mobile » (MJ). Cette jonction est composée de la protéine AMA1 exposée à la surface du parasite qui interagit avec le complexe de protéines parasitaires RON2/RON4/RON5/RON8 injecté dans la cellule hôte. Les objectifs de ma thèse ont été d’étayer la composition moléculaire de la MJ et d’étudier la contribution de la cellule hôte dans l’invasion au travers de la recherche de partenaires de l’hôte pour les RONs. Quatre protéines de l’hôte, ALIX, TSG101, CD2AP et CIN85, ont été identifiées à la MJ. Les sites d’interactions ont été cartographiés sur RON2, RON4 et RON5. Des parasites mutants déficients pour le recrutement de ces partenaires ont été générés, et ont permis de montrer l’importance de l’association d’ALIX, TSG101, CD2AP et CIN85 à la MJ pour l’invasion de T. gondii et sa virulence dans un modèle murin. Le rôle de ces protéines dans le maintien des jonctions intercellulaires mais aussi leur participation à des processus de déformation membranaire, suggère que le parasite les recrute afin de favoriser son attachement et son internalisation. Nous avons également identifié un nouveau membre du complexe de RONs, appelé RON14. RON14 n’est pas essentielle pour la survie du parasite in vitro mais contribue à sa virulence in vivo. / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite responsible for toxoplasmosis. It belongs to the phylum Apicomplexa, which include Plasmodium species responsible for malaria. Apicomplexa has developed a unique invasion mechanism, involving the formation of a tight connection between the parasite and the host cell plasma membranes called moving junction (MJ). This junction is composed of AMA1 exposed at the surface of the parasite which interacts with a complex of parasite proteins RON2/RON4/RON5/RON8 injected into the host cell. The objectives of my thesis were to decipher the molecular composition of the MJ and to study the contribution of the host cell during invasion though the search of hosts partners for RONs. Four host proteins, ALIX, TSG101, CIN85 and CD2AP, have been identified at the MJ. Binding sites has been mapped on RON2, RON4 and RON5. By generating mutant parasites deficient for host partners recruitment, we show the importance of ALIX, TSG101, CIN85 and CD2AP association at the MJ for invasion and virulence in a mouse model. The role of these proteins in maintaining the intercellular junctions and inducing membrane deformation suggest that the parasite recruits them in order to favor its attachment and its internalization. We also identified a new member of the RON complex, called RON14. RON14 is not essential for the parasite survival in vitro but contributes to its virulence in vivo.

Toxoplasma gondii est un protiste apicomplexe responsable de la toxoplasmose. Ce parasite intracellulaire obligatoire possède des organites sécrétoires apicaux dont les rhoptries qui contiennent des facteurs de virulence essentiels à l'invasion et à la modulation de la cellule hôte qu'il infecte. Au cours de la division cellulaire de T. gondii, les protéines de rhoptries sont synthétisées selon la même cinétique. Dans le but d'identifier de nouvelles protéines dont la fonction est potentiellement liée aux rhoptries, nous avons recherché à partir des bases de données du génome de T. gondii, les protéines présentant ce profil particulier d'expression. La localisation subcellulaire de 12 candidats a été réalisée puis une caractérisation phénotypique de quatre d'entre eux a été entreprise. Nous avons identifié une nouvelle protéase de rhoptries, DegP, essentielle à la virulence du parasite in vivo. Nous montrons que DegP contrôle la phase aigüe de l'infection en modulant la réponse immune de l'hôte contribuant ainsi à la dissémination du parasite in vivo. Nous identifions également deux protéines homologues, Claw1 et Claw2, présentant une localisation atypique à l'extrémité apicale du parasite. Notre incapacité à déléter ces gènes pourrait indiquer un rôle essentiel de ces protéines au niveau du complexe apical de T. gondii. Enfin, bien que n'étant pas reliée aux rhoptries, ce crible a permis d'identifier la première protéine associée aux jonctions des vésicules constituant le complexe membranaire interne de Toxoplasma. La délétion de cette protéine, SIP, affecte la forme du parasite, entrainant un défaut de motilité, d'invasion et de virulence in vivo. / Toxoplasma gondii is an apicomplexan protist and the causative agent of toxoplasmosis. This obligate intracellular parasite harbors apical secretory organelles such as rhoptries that contain essential virulence factors responsible of the invasion and the modulation of the infected host cell. Along the cell cycle of T. gondii, rhoptry proteins share the same timing of expression. In order to identify new proteins involve in rhoptry content, biogenesis or secretion, we screened the genome database of T. gondii to isolate proteins that present this particular profile. We obtained the subcellular localization of 12 candidates and we investigated the biological functions for 4 of them. We showed that DegP, a rhoptry protease is essential for the in vivo virulence of T. gondii. DegP controls the acute phase during infection and modulate the host immune response leading to better parasite dissemination in vivo. Also, we identified Claw1 and its paralog Claw2 that present an atypical localization at the apical end of the parasite. To date, we were unable to disrupt the genes encoding these proteins suggesting that they may have an essential function related to the apical complex in T. gondii. Finally, we also examined a ‘hit' of this screening that was not related to rhoptries and we identified SIP, the first protein associated with the transversal junctions of the inner membrane complex in T. gondii. The disruption of SIP affects the shape of the parasite leading to an aberrant motility, defect in invasion and impaired parasite virulence in mice.

As zoonoses urbanas, doenças que afetam muitos indivíduos em países tropicais, especialmente crianças, são infecções que podem ser adquiridas pelo homem através do contato com animais de estimação, pela ingestão de carne ou água contaminada. Para sua prevenção, é fundamental a educação para medidas de higiene e profilaxia com relação ao manuseio dos alimentos, animais de estimação e higiene pessoal. Isto poderia ser feito através de ensino intensivo, ministrado por profissionais treinados durante o primeiro ciclo do Ensino Fundamental. No presente trabalho, estudamos este tipo de ensino e a prevalência destas doenças, usando a toxoplasmose como modelo, em 164 alunos do primeiro ciclo do ensino fundamental da Escola Estadual Antonio de Pádua Vieira, com coleta de saliva. Foi desenvolvido ELISA de alta sensibilidade em saliva concentrada por etanol. Após 12 (doze) meses, a fixação do conteúdo foi avaliada por questionário. Havia uma prevalência de 50% de contato com Toxoplasma gondii nessa população, mostrando a relevância do problema. As crianças sob intervenção mostraram fixação do conhecimento, para ambas as fontes principais de contaminação mostrando a importância da intervenção, em comparação com crianças sem intervenção. As crianças sem toxoplasmose mostraram uma melhor eficiência na fixação da informação. Nossos dados sugerem que intervenções curtas têm um grande efeito de fixação de informações em escolares e que a saliva pode ser um material para a detecção de contato com a toxoplasmose. / Urban zoonoses affect large proportion of the population in tropical countries, specially school children. Those infections could be acquired by contact with pets, or ingestion of water or meat contaminated by agents. Education in preventive hygiene measures, as adequate cleaning and cooking are essential in this age group. Intensive teaching during short interventions by trained personal could be effective. Here, we study this type of educational intervention, using toxoplasmosis as a model, in 164 school children in the first years of elementary grades in a public São Paulo school, E.E.P.G. Antonio de Pádua Vieira, with saliva sampling. We had standardize a specific anti T. gondii IgG assay in etanol concentrade saliva. After 12 months, the knowledge of this population was tested by questionnaire. There are a 50% prevalence of contact with T.gondii during the intervention, showing the importance of zoonosis in this group. After one year, most children who assisted the intervention recalled correctly the main transmission ways of the zoonosis, showing fixation by short intervention, as compared to non-intervened shoolchildren of the same age group. Children who had no contact with T.gondii show higher recall proportion. Our data suggest that shorts interventions are effective in the knowledge fixation in schoolchildren and that saliva, a non invasive sampling, could be an alternative material for detection of contact with toxoplasmosis.

Toxoplasma gondii é um agente disseminado com um ciclo de vida complexo que envolve gatos e hospedeiros de sangue quente, incluindo o homem. Componentes vacinais são imunógenos pobres e vacinas atenuadas causam doenças crônicas. Taquizoítos irradiados à 255Gy induzem uma imunidade similar a infecção, com proteção parcial, sem estudos sobre memória. Estudamos a produção de IgG in vitro por células do baço e medula óssea de camundongos imunizados com taquizoítos irradiados e infectados. A medula óssea contém um número maior de células específicas do que o baço. As células de memória são de alta afinidade, mas IgG sérica apresentaram baixa avidez. Há também anticorpos específicos IgA nas fezes. Todas as vacinas indutoras de proteção parcial contra o desafio, que foi mais evidente em alta patogenicidade da cepa ME-49. A proteção foi proporcional tanto à quantidade de anticorpos IgG no soro ou produzidos por células da medula óssea. Nossos dados mostram claramente que os anticorpos de alta afinidade estão relacionados com a sobrevida específica de memória celular. / Toxoplasma gondii is a disseminated agent with a complex life cycle involving cats and warm blood hosts, including man. Component vaccines are poor immunogens and attenuated vaccines cause chronic disease. 255Gy irradiated tachyzoites induce the same immunity as natural infection, with partial protection, without studies on immunological memory. We studied in vitro production of specific IgG by spleen and bone marrow cells of mice immunized with irradiated tachyzoites, comparing with chronically infected animals. Bone marrow contains larger numbers of specific cells than spleen. Memory cells were of high affinity, but serum presented low avidity IgG. We also show presence of specific IgA antibodies in stools. All immunizations induce partial protection against challenge, which was more evident in highly pathogenic ME-49 strain. The protection was proportional both to the amount of IgG antibodies in serum or produced by bone marrow cells. Our data clearly shows that high affinity antibodies are related to specific memory cell survival.

Einleitung: Toxoplasma (T.) gondii zählt zu den häufigsten intrazellulären Parasiten weltweit. Alleinige Endwirte im fakultativ heteroxenen Lebenszyklus sind die Feliden. Als Zwischenwirte können jedoch zahlreiche Säugetier- und Vogelarten dienen, in denen sich parasitäre Gewebezysten entwickeln. Einer der Hauptübertragungswege auf den Menschen stellt der Verzehr von T. gondii-haltigem Fleisch infizierter Nutztiere dar. Inwieweit Putenfleisch ein potentielles Infektionsrisiko birgt und welche Bedeutung Puten in der Epidemiologie der humanen Toxoplasmose besitzen ist nicht ausreichend geklärt. Ziel der Untersuchungen: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein reproduzierbares Infektionsmodell bei Puten für T. gondii zu entwickeln, um die Verteilung und Persistenz des Parasiten im Gewebe zu ermitteln. Es wurden verschiedene Parameter, wie Infektionsstadium, Infektionsdosis, Applikationsmodus und Untersuchungszeitpunkt hinsichtlich ihres Einflusses auf die Entwicklung parasitärer Gewebestadien verglichen. Material und Methoden: Insgesamt wurden 74 Puten nach einer Aufzuchtperiode von 4 bis 8 Wochen experimentell mit T. gondii-Tachyzoiten oder Oozysten infiziert. Je nach Versuchsgruppe wurden Tachyzoiten vom Stamm ME49 intravenös und/oder intramuskulär appliziert oder Oozysten vom Stamm ME49, DX oder Hannover 1 oral verabreicht. Die Verifikation der Infektion erfolgte über den Nachweis T. gondii-spezifischer Antikörper mit Hilfe eines kinetischen ELISA. Drei bis acht Puten jeder Versuchsgruppe wurden 6 bis 8 oder 10 bis 12 Wochen nach der Infektion getötet. Von jedem Tier wurden folgende Gewebeproben entnommen: Brust-, Oberschenkel- und Unterschenkelmuskulatur, Herz, Leber, Muskel- und Drüsenmagen, Gehirn, Lunge, Milz, Nieren, Darm, Pankreas und Hoden (sofern vorhanden). Die Organe wurden getrennt vollständig homogenisiert. Bei den Muskeln wurden Proben von verschiedenen Lokalisationen entnommen und ebenfalls einzeln homogenisiert. Der Nachweis von T. gondii-DNA in den Gewebeproben erfolgte mittels konventioneller PCR, basierend auf der Amplifizierung eines 469 bp Fragments des B1-Gens, und anschließender nested PCR (Länge Zielfragment: 375 bp). Zusätzlich wurden zu Beginn der Studie lichtmikroskopische Untersuchungen einzelner Organe in Form nativer Quetschpräparate (400fache Vergrößerung) auf T. gondii-Zysten durchgeführt. Ergebnisse: Ungeachtet der Infektionsdosis und des inokulierten Parasitenstadiums konnten bei keinem der Versuchstiere klinische Symptome einer Toxoplasmose beobachtet werden. Die unterschiedlich hohen Infektionsdosen hatten im Allgemeinen keinen signifikanten Einfluss auf die Anzahl positiv getesteter Puten oder Organproben. Lediglich die Anzahl positiver Gehirnproben nahm mit ansteigender Oozystendosis signifikant zu. Bei der Betrachtung aller Versuchsgruppen fiel auf, dass die Befallshäufigkeit der Organe sowohl zwischen den Tieren verschiedener Infektionsgruppen als auch innerhalb einer Infektionsgruppe stark schwankte. So variierte die Anzahl positiv getesteter Organe bei den Tachyzoiten-infizierten Puten zwischen 0 und 7, bei den Oozysten-infizierten Puten zwischen 0 und 9 Organen pro Tier. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, dass sich T. gondii heterogen in der Pute verteilt und mindestens 12 Wochen persistieren kann. Bezogen auf alle Versuchstiere gab es kein Organ, dass durchgängig negativ blieb. Nach der Tachyzoiteninfektion waren am häufigsten Leber (43,3%), gefolgt von Brustmuskel (26,7%) und Herz (20,0%) infiziert, während bei den Oozysten-infizierten Tieren der Erreger am häufigsten im Gehirn (47,2%), gefolgt von Oberschenkelmuskulatur (25,0%) und Herz und Unterschenkelmuskulatur (je 22,2%) nachgewiesen werden konnte. Schlussfolgerungen: Tachyzoiten und Oozysten erwiesen sich als gleichermaßen geeignete Infektionsmedien und führten hinsichtlich der systemischen Verteilung des Parasiten in der Pute zu vergleichbaren Ergebnissen. Ein spezifischer Organtropismus des Erregers konnte nicht festgestellt werden. Aus Sicht der Lebensmittelhygiene und des Verbraucherschutzes bedeuten die Ergebnisse, dass im Fall einer T. gondii-Infektion ein potentielles Infektionsrisiko für den Menschen durch infiziertes Putenfleisch nicht ausgeschlossen werden kann.

Das Ziel der Untersuchungen in der vorliegenden Arbeit bestand in der Erarbeitung von Datenmaterial zur Bestimmung der Prävalenz von Toxoplasma-gondii-Antikörpern bei Schlachtschweinen und in handelsüblichen Hackfleischproben vom Schwein. Um den Einfluss unterschiedlicher Haltungsbedingungen zu ermitteln, wurde jeder Betrieb anhand einer Checkliste im Rahmen einer Feldstudie überprüft. Die Einteilung der Bestände erfolgte in 5 Kategorien (Kategorie 1: >1000 Tiere, Kategorie 2: >500-1000 Tiere, Kategorie 3: 100-500 Tiere, Kategorie 4: Tiere aus Ökobetrieben, Kategorie 5: Tiere aus einzelbäuerlicher Haltung). Im Zeitraum von Februar 2001 bis August 2002 wurden 1028 Schlachtschweine aus 104 Beständen (958 Mastschweine, 66 Sauen, 4 Spanferkel) schwerpunktmäßig aus dem Landkreis Wittenberg mit Ausnahme der Tiere aus Ökobetrieben in den Schlachtbetrieben beprobt. Als Probematerial dienten Blutserum und aus der Zwerchfellpfeilermuskulatur gewonnener Fleischsaft der Schlachtschweine. Des Weiteren wurden 240 Hackfleischprodukte aus dem Handel beprobt, von denen ebenfalls der Fleischsaft untersucht wurde. Eine weitere Aufgabenstellung der Arbeit bestand darin zu prüfen, ob der als serologischer Test verwendete ELISA neben der Eignung für Blutseren auch zur Untersuchung des Fleischsaftes verwendet werden kann. Es wurde ein ELISA nach SEINEKE (1996) auf der Grundlage eines Tachyzoitenlysates als Antigen verwendet. Die Detektion der gebundenen Antikörper erfolgte durch POD (Meerettichperoxidase)-markierte Anti-Schwein-Antikörper von der Ziege. Zur Bewertung der Messergebnisse wurde ein Indexverfahren herangezogen. Blutserum wurde 1:400, Fleischsaft 1:40 verdünnt. Die Ergebnisse der Studien lassen sich wie folgt zusammenfassen: 1. Die Untersuchungen mit dem verwendeten ELISA bieten eine akzeptable Sicherheit (Korrelationskoeffizient von rs = 0,841) bei hoher Signifikanz, wie aus den Doppelbestimmungen bei 711 Blutproben ermittelt werden konnte. 2. Fleischsaft ist grundsätzlich für die Anwendung des ELISA bei Ermittlung des Toxoplasmagondii- Antikörperstatus geeignet (Korrelationskoeffizient rs = 0,472; p < 0,01). 3. Die Gesamtprävalenz der Serumproben beträgt 20,6% mit dem Cut-off-Wert bei einem Index > 20. Diese Ergebnisse weisen aus, dass ein beachtliches Toxoplasmoserisiko besteht, wenn Schweinefleisch roh verzehrt wird. 4. Bei Betrachtung der einzelnen Bestandskategorien wurden folgende Seroprävalenzen bei Mastschweinen ermittelt: Kategorie 1: 15,4%, Kategorie 2: 7,3%, Kategorie 3: 16,4%, Kategorie 4: 15,1%. Höchste Prävalenzen ergaben sich bei unter individuellen, einzelbäuerlichen Bedingungen gehaltenen Schweinen der Kategorie 5: 52,0%. 5. Bei Sauen muss auf Grund des Alters generell von höheren Prävalenzen ausgegangen werden. Es wurde ein Wert von 27,2% für alle überprüften Sauen ermittelt. 6. Ein reelles Bild über das Vorkommen von Toxoplasma-gondii-Antikörpern kann nur durch die Betrachtung der Einzelbestände ermittelt werden. So findet man in der Gruppe der Ökotiere (Kategorie 4) Prävalenzschwankungen von 1,4% bis 34,6%, sowie zwischen den Mastschweinebeständen der Kategorien 1 bis 3 von 1,6% bis 20,5%. Insofern kann allein aus der Kenntnis der Haltungsform nicht sicher auf ein geringes oder hohes Vorkommen des Parasiten geschlossen werden. 7. Die Feldstudien in den einzelnen Beständen belegen eindeutig den Einfluss der Haltungsbedingungen der Schweine auf die ermittelten Prävalenzen für Toxoplasma gondii. Grundsätzlich konnte festgestellt werden, dass unabhängig von Bestandsgröße und Haltungskategorie der direkte oder indirekte Einfluss von Katzen (z.B. über Ausläufe, Futter, Einstreu) als wesentliche Ursache für die Präsenz des Parasiten angesehen werden muss. 8. Beim Hackfleisch wurde eine Gesamtprävalenz für Toxoplasma-gondii-Antikörper von 5,3% nachgewiesen. Dies belegt das Risiko für Infektionen mit Toxoplasma gondii insbesondere beim Verzehr von rohen bzw. unzureichend erhitzten Schweinefleischerzeugnissen. Die vorliegenden Untersuchungen liefern für ein begrenztes Territorium Datenmaterial zu Prävalenzen von Toxoplasma gondii sowohl für Proben von Schlachtschweinen als auch für Hackfleischproben aus dem Handel. Zur Bewertung des deutschlandweit zu erwartenden Risikos sind jedoch weitere flächendeckende Untersuchungen erforderlich.

Une caractéristique majeure de l’infection par Toxoplasma gondii est le contrôle rapide de la population parasitaire par une réponse immunitaire engageant des cellules résidentes et recrutées ainsi que des cytokines pro- et anti-inflammatoire. Dans ce contexte, l’IFNγ active une multitude d’activité anti- T. gondii des cellules immunes et non-immunes, mais peut aussi contribuer à l’immunopathologie. T. gondii a élaboré des mécanismes pour contrer les défenses de l’hôte en interférant avec la transcription des gènes stimulés par l’IFNγ. Nous avons identifié TgIST (T. gondii inhibitor of STAT1 transcriptional activity) comme un interrupteur moléculaire exporté par les parasites intracellulaires et qui est localisé dans le noyau des cellules hôtes, où il inhibe l’expression des gènes pro-inflammatoires dépendants de STAT1. Nous avons montré que TgIST séquestre STAT1 à des sites spécifiques, et promeut la formation de chromatine non permissive grâce à sa capacité à recruter le remodeleur chromatinien NuRD. Nous avons montré que durant l’infection aiguë en souris, les parasites déficients pour TgIST sont rapidement éliminés par les monocytes pro-inflammatoires GR1+, ce qui montre le rôle protecteur de TgIST contre les défenses médiées par l’IFNγ. En révélant les fonctions de TgIST, cette étude montre de nouvelles évidences sur la façon dont T.gondii a élaboré une arme moléculaire de choix pour prendre le contrôle sur la réponse immune, de façon à promouvoir le parasitisme à long terme / An early hallmark of Toxoplasma gondii infection is the rapid control of the parasite population by a potent multifaceted innate immune response that engages resident and homing immune cells along with pro- and counter-inflammatory cytokines. In this context, IFN-γ activates a variety of T. gondii–targeting activities in immune and nonimmune cells but can also con- tribute to host immune pathology. T. gondii has evolved mechanisms to timely counteract the host IFN-γ defenses by interfering with the transcription of IFN-γ–stimulated genes. We now have identified TgIST (T. gondii inhibitor of STAT1 transcriptional activity) as a critical molecular switch that is secreted by intracellular parasites and traffics to the host cell nucleus where it inhibits STAT1-dependent proinflammatory gene expression. We show that TgIST not only sequesters STAT1 on dedicated loci but also promotes shaping of a nonpermissive chromatin through its capacity to recruit the nucleosome remodeling deacetylase (NuRD) transcriptional repressor. We found that during mice acute infection, TgIST-deficient parasites are rapidly eliminated by the homing Gr1+ inflammatory monocytes, thus highlighting the protective role of TgIST against IFN-γ–mediated killing. By uncovering TgIST functions, this study brings novel evidence on how T. gondii has devised a molecular weapon of choice to take control over a ubiquitous immune gene expression mechanism in metazoans, as a way to promote long-term parasitism.

Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

Apicomplexa, einschließlich Plasmodium sp. (Erreger der Malaria) und Toxoplasma gondii (Erreger der Toxoplasmose), sind ein großes Phylum einzelliger, obligat intrazellulärer Parasiten, welche ein essenzielles, Plastiden ähnliches Organell, den sogenannten Apicoplast, beherbergen. Aufgrund der Beteiligung an mehreren essenziellen Stoffwechselprozessen stellt das Ferredoxin Redoxsystem innerhalb der Apicomplexa ein vielversprechendes potentielles Wirkstoffziel dar. Eine kürzlich veröffentlichte Arbeit zeigt, dass ptFd in T. gondii (TgFd) ein essenzielles Protein ist. In der vorliegenden Arbeit konnte durch eine gezielte Analyse von Metaboliten der Isoprenoid-Biosynthese gezeigt werden, dass T. gondii Fd eine essenzielle physiologische Funktion als Elektronendonor für die letzten beiden Enzyme dieses Stoffwechselweges hat. Weiterhin zeigen im Zusammenhang mit dieser Arbeit generierte Daten, das der Einfluss auf die Isoprenoid-Biosynthese einen zusätzlichen Effekt auf die Proteinprenylierung hat. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Hemmung der Isoprenoid Biosynthese des Wirtes zum langsamen Einsetzen des Absterbens bei TgFd Knockdown-Parasiten beiträgt, was darauf hindeutet, dass der Mangel an Isoprenoid Vorstufen nach induziertem Fd Knockdown bis zu einem gewissen Grad durch vom Wirt stammende Isoprenoide kompensiert werden kann. Zusammenfassend tragen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zu einem besseren Verständnis der metabolischen Rolle von Ferredoxin in T. gondii und P. falciparum bei und zeigen dessen Bedeutung für den Parasitenstoffwechsel und verdeutlichen damit das Potenzial Ferredoxins als Wirkstoffziel gegen das große Phylum der Apicomplexa. / Apicomplexan parasites, including Plasmodium sp. (the causative agent of malaria) and Toxoplasma gondii (causing toxoplasmosis), are a large phylum of unicellular, obligate intracellular organisms. The plant type ferredoxin redox system in apicomplexan parasites is a promising drug target due to its potential involvement in several essential metabolic processes. Recently published work demonstrated that ptFd in T. gondii (TgFd) is an essential protein. A tetracycline-inducible knock-down (ikd) approach was used to replace the endogenous single copy of TgFd with a myc-tagged copy (TgFdmyc) by double cross-over homologous recombination, and severe growth inhibition of parasites was observed upon Fd depletion. Metabolomic analyses show a 30% decrease in C14:0 fatty acids and a significantly lower gliding motility (20%) in the TgFd ikd strain compared to the TgFd ikd complemented (TgFd cikd) strain. In this thesis, targeted metabolomic analysis of the isoprenoid biosynthesis metabolites demonstrates that T. gondii Fd has an essential physiological function as an electron donor for the last two enzymes of the pathway. Furthermore, results of this work show that inhibition of the host isoprenoid biosynthesis contributes to the slow onset of death in TgFd knockdown parasites, indicating that the lack of isoprenoid precursors after induced Fd knockdown can to some extent be compensated by host-derived isoprenoids. Together, the findings of this study contribute to a better understanding of the metabolic role of Fd in T. gondii and P. falciparum, supporting its importance for the parasite’s metabolism and underlining its potential as a drug target in apicomplexan parasites.

Toxoplasma gondii ist einer der häufigsten intrazellulären Protozoen weltweit und ein wichtiger Krankheitserreger des Menschen. Er kommt in drei Lebensstadien vor: Sporozoiten, Tachyzoiten und Bradyzoiten. Während Sporozoiten nach sexueller Vermehrung im Endwirt (Katzenartige) und Freisetzung in die Umwelt gebildet werden, entstehen Tachyzoiten und Bradyzoiten asexuell durch Endodyogenie in Zwischenwirten wie Vögeln, Säugetieren und dem Menschen. Tachyzoiten sind schnell replizierende Parasiten, die nahezu jede nukleäre Zelle des Körpers infizieren können. Dagegen bilden die nach Differenzierung von Tachyzoiten entstehenden, weitgehend ruhenden Bradyzoiten Gewebszysten und persistieren bevorzugt in neuronalen oder muskulären Geweben der Zwischenwirte. Der Verzehr von Bradyzoiten-haltigem, rohem oder ungegartem Fleisch von T. gondii-infizierten Nutztieren ist einer der Hauptübertragungswege des Parasiten auf den Menschen und kann zum Ausbruch der Toxoplasmose-Krankheit führen. Die Toxoplasmose ist vor allem bei immunsupprimierten Patienten und erstmalig infizierten Schwangeren nach Übertragung auf den Fötus klinisch gefährlich und kann sogar tödlich enden. Da Fleischverzehr infizierter Nutztiere einen der Hauptinfektionswege darstellt, weisen Skelettmuskelzellen (SkMZ) eine enorme Bedeutung für die Übertragung von Toxoplasma auf den Menschen auf. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, zelltyp-spezifische Faktoren zu identifizieren und zu charakterisieren, die die Toxoplasma-Entwicklung und Bradyzoitenbildung in SkMZ regulieren. Die Untersuchungen wurden mithilfe der murinen C2C12-SkMZ-Linie in vitro durchgeführt, die von proliferierenden Myoblasten in Pferdeserum-haltigem Medium oder aufgrund erhöhter Zelldichte effektiv zu polykernigen Myotuben differenzierten. Die Effektivität der terminalen Differenzierung von C2C12-SkMZ wurde durch den Nachweis muskelspezifischer Marker wie MyoD, Myogenin und Myosin Heavy Chain (MyHC) mittels Reverse Transkriptase-qPCR (RT qPCR), Immunfluoreszenz sowie Nachweis des Zellzyklusarrests mittels BrdU-Markierung validiert. Die Infektion von terminal differenzierten C2C12-Myotuben, proliferierenden C2C12-Myoblasten und murinen NIH3T3-Kontrollfibroblasten mit T. gondii zeigte, dass der Parasit in Myotuben deutlich mehr bradyzoitenspezifische ENO1- bzw. BAG1-Transkripte exprimierte als in Myoblasten und Fibroblasten. Außerdem war die Gewebszystenbildung bei gleichzeitig reduzierter Parasitenreplikation in terminal differenzierten C2C12-Myotuben deutlich erhöht. Demgegenüber förderten proliferierende C2C12-Myoblasten und NIH3T3-Fibroblasten die Replikation von Toxoplasma bei gleichzeitig geringer Bradyzoitenbildung. Diese Daten weisen erstmalig auf die Bedeutung des Zelltyps und dessen Differenzierung für die Parasitenentwicklung und die Stadienkonversion in SkMZ hin. Für genauere Untersuchungen von Zelltyp-spezifischen Interaktionen mit T. gondii wurden die Transkriptome von terminal differenzierten C2C12-Myotuben und Neuronen sowie von proliferierenden NIH3T3-Fibroblasten und Astrozyten vor und nach Infektion mit T. gondii für 24 Stunden mittels High-Throughput RNA-Sequenzierung ermittelt. Die Analysen zeigten einen deutlich größeren Einfluss der zelltyp-spezifische Genexpression auf das Gesamttranskiptom der vier Zelltypen als die Expressionsveränderungen aufgrund der Toxoplasma-Infektion. Allerdings wurden auch Gengruppen identifiziert, die in den terminal differenzierten SkMZ und Neuronen im Vergleich zu Fibroblasten und Astrozyten differentiell exprimiert waren. Des Weiteren bewirkte die T. gondii-Infektion eine signifikante Expressionssteigerung u. a. von Zellzyklus-regulierenden Transkripten spezifisch in terminal differenzierten SkMZ und Neuronen, was auf ihre mögliche Beteiligung an der Toxoplasma-Stadienkonversion hindeutete. Daher wurden anschließend die Expressionsprofile ausgesuchter Zellzyklusregulatoren im Laufe der terminalen C2C12-SkMZ-Differenzierung und der Toxoplasma-Infektion mittels RT qPCR- und Western Blot-Analysen untersucht. Während die Transkription der negativen Zellzyklus-Modulatoren Tspyl2 und dem ‚down stream‘-liegenden Targetgen p21 im Laufe der terminalen Differenzierung von C2C12-Myoblasten zunahm, sank begleitend die Transkription der Uhrf1- und Ccnb1- (CyclinB1) Aktivatoren. Nach Infektion wurde spezifisch in Myotuben, nicht aber in Myoblasten oder Fibroblasten, eine weitere Steigerung der Tspyl2-Transkripte durch RT-qPCR-Analysen nachgewiesen. Gleichzeitig reagierten C2C12-Myotuben auch mit Hochregulation der Uhrf1- und Ccnb1-Transkription auf Toxoplasma-Infektion. Allerdings wurde durch BrdU-Markierung nachgewiesen, dass die spezifische Modulation von Zellzyklusregulatoren nach Infektion von Myotuben den Zellzyklusarrest nicht aufhob und C2C12-Myotuben nicht zur Zellteilung anregte. Da Überexpression von CDA-1 (humanes Tspyl2-Ortholog) in humanen Fibroblasten die Stadienkonversion von T. gondii fördert, wurde die Funktion des Tspyl2-Zellzyklusregulators in SkMZ analysiert. ‚Knock-down‘ von Tspyl2 mittels shRNA unterdrückte effektiv die terminale C2C12-Myoblastendifferenzierung. Bemerkenswerterweise führte dies nach T. gondii-Infektion zweier ausgesuchter Tspyl2 shRNA-C2C12-Transfektanten zu einer verstärkten Toxoplasma-Replikation im Vergleich zu Kontrolltransfektanten und WT Myotuben. Gleichzeitig war in Tspyl2-‚Knock-down‘-Mutanten die Parasitendifferenzierung zum Bradyzoitenstadium sowie die Gewebezystenbildung vermindert. Diese Ergebnisse zeigen erstmalig, dass in SkMZ die spontane Differenzierung von T. gondii zum Bradyzoiten wesentlich von dem Zellzyklusregulator Tspyl2 und der terminalen Myotubendifferenzierung abhängt. Differenzierung von SkMZ führte u.a. auch zu veränderten Expressionsprofilen von Zytokinen und Chemokinen in C2C12-Myotuben, -Myoblasten und Kontrollfibroblasten. So wurden mehrere pro-inflammatorischen Zytokine in Myotuben deutlich stärker als in Myoblasten oder Fibroblasten exprimiert. Nach Infektion von C2C12-Myotuben stiegen die Transkriptmengen von IL-23, IL 1α und IL 1β an. Diese Ergebnisse könnten neben Zellzyklusregulatoren auch auf den Einfluss von Immunfaktoren bei der Zelltyp-spezifischen Stadienkonversion in differenzierten SkMZ hindeuten In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass der Differenzierungsstatus der SkMZ die Stadienkonversion und die Gewebszystenbildung eindeutig beeinflusst. Da die terminale SkMZ-Differenzierung von Zellzyklusregulatoren eingeleitet wird und ihre Expressionen offensichtlich unter dem Einfluss der T. gondii-Infektion stehen, könnten sie einen Einflus auf die Induktion der Stadiendifferenzierung von schnell replizierenden Tachyzoiten zu persistierenden Bradyzoiten ausüben, was am Beispiel des negativen Zellzyklusregulators Tspyl2 in dieser Arbeit nachgewiesen wurde. Des Weiteren wurde gezeigt, dass Myotuben mit der Produktion von proinflammatorischen Molekülen aktiv auf die Toxoplasma-Infektion reagieren und ihre Expression zur lokalen Immunantwort der SkMZ beitragen dürften.