O uso de vacinas seguras e eficazes é uma intervenção em saúde pública bem consolidada nas últimas décadas com grande impacto na queda da prevalência das doenças infecciosas. O controle sorológico do estado vacinal e de proteção de uma população é essencial, entretanto precisamos de alternativas para estes estudos. Escolares são um grupo em que o acesso para coleta de sangue é problemático. A saliva pode ser um material alternativo perfeitamente aceitável para crianças e outros grupos protegidos. Para controle de vacinação e incidência de toxoplasmose, nós promovemos uma exposição interativa sobre higiene em escolas públicas para coletar saliva de 249 estudantes do 7º a 9º anos do ensino fundamental, de onde detectamos a prevalência de resposta IgG específica e, portanto, proteção vacinal para a vacina tríplice viral ou detecção de infecção pelo T. gondii. Para evitar a variabilidade da concentração de IgG em saliva, nós desenvolvemos e validamos um ensaio de captura de IgG por proteína A de S. aureus na fase sólida, com revelação da especificidade da IgG pelo uso de antígenos recombinantes de vírus do sarampo, rubéola e caxumba, além de extrato antigênico de T. gondii. Estes antígenos biotinilados ligados a IgG foram obtidos por sistema avidina-biotina-peroxidase. Foram 249 salivas de escolares, 47 soros e salivas da graduação e, para validação, cinquenta soros positivos e quarenta soros negativos para controle, sendo eles soros de infantes, entre 8 e 12 meses de idade. Os testes tinham reprodutibilidade maior que 98% e sensibilidade e especificidade maior que 95%. Detectamos na população de estudantes uma prevalência de toxoplasmose de 8,5% (I.C. 95% 5-11,9%), uma proteção vacinal para sarampo de 96,8% (I.C. 95% 94,6-99%), para rubéola de 59,1% (I.C. 95% 53-65%) e para caxumba de 57.5% (I.C. 95% 51,3-63,6%). Nossa abordagem foi eficiente em todos os aspectos, desde a exposição itinerante, o uso de saliva e no desenvolvimento de ensaios confiáveis para a determinação da proteção vacinal de estudantes e na prevenção da toxoplasmose. Com este conhecimento, medidas adequadas de saúde pública, como revacinação, podem ser adequadamente planejadas. / The use of safe vaccines and are a well-established public health intervention in recent years with great impact on the last of the infectious diseases. Serological control of the vaccination status and protection of a population is essential, the study alternatives for these studies. Schoolchildren are a group in which access to blood collection is problematic. Saliva may be an appropriate alternative material for children and other protected groups. The disclosure of vaccination and analysis on an extinguishment is one of the projected lectures of the community lectures of the education of Equality of Equality and, therefore, vaccine a viral vaccine or detection of T. gondii infection. In order to avoid IgG variability in saliva, we developed and validated an IgA capture assay by continuous-phase S. aureus protein A with IgG specificity revealed by the use of recombinant measles, rubella and mumps, as well as the antigenic extract of T. gondii. These biotinylated antigens linked an IgG antibody to the avidin-biotin-peroxidase system. 249 saliva from schoolchildren, 47 serums and graduation salutations and, for validation, fifty positive sera and forty negative sera for the control, being sera of infants between 8 and 12 months of age. The tests had greater reproducibility than 98% and sensitivity and specificity greater than 95%. We detected a prevalence of toxoplasmosis of 8.5% (95% CI 5-11.9%), measles vaccine protection from 96.8% (95% CI: 94.6-99%), for rubella of 59.1% % (95% CI 53-65%) and for mumps 57.5% (95% CI 51.3-63.6%). The approach was effective in all aspects, from the traveling exhibition, to the use of saliva and the development of research for the identification of temporary vaccination and the prevention of toxoplasmosis. With this knowledge, public health measures such as revaccination can be planned.

Neospora caninum é um parasito intracelular obrigatório, formador de cistos, que acomete vários animais domésticos e silvestres, tendo maior importância nas espécies canina e bovina, nas quais causa problemas nervosos e reprodutivos. Os canídeos do gênero Canis são os únicos reconhecidos como hospedeiros definitivos do N. caninum até o momento, nos quais ocorre a fase sexuada de multiplicação, resultando na eliminação de oocistos pelas fezes. Toxoplasma gondii também é um coccídio responsável por uma das zoonoses de maior importância e ocorrência em todo o mundo. A fase assexuada de desenvolvimento do T. gondii ocorre nos mamíferos e aves (hospedeiros intermediários) com formação de cistos teciduais e a fase sexuada de desenvolvimento ocorre no intestino delgado dos hospedeiros definitivos, que são os membros da família Felidae. Este estudo teve por objetivo determinar a soroprevalência de anticorpos contra Neospora spp. e T. gondii em equídeos de diferentes regiões do Brasil e o isolamento e caracterização genética destes coccídios em amostras de tecidos de equídeos. A sorologia para T. gondii e Neospora spp. foi realizada em 453 amostras de soros por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta com ponto de corte de 50 para Neospora spp e 64 para T. gondii. Deste total, oito (1,75%) amostras (sete de jumentos e um de cavalo) foram positivas para Neospora spp. e 129 (28,47%) amostras (82 jumentos, 32 cavalos e 15 mulas) para T. gondii. Para o isolamento do T. gondii foram realizados 29 bioensaios em camundongos, sendo 19 de animais soropositivos e 10 de pools de tecidos de cavalos soronegativos. Por meio dessa prova biológica, foi possível o isolamento em uma amostra de jumento (Equus asinus) de Mossoró, RN, ocorrendo a morte dos dois únicos camundongos infectados, no 16o e 17o dia pós-inoculação. A caracterização genotípica do isolado foi realizada pela PCR-RFLP utilizando 12 marcadores genotípicos. A genotipagem dessa amostra evidenciou o genótipo #60 TgCkBr220, já isolado em galinha do Arquipélago de Fernando de Noronha, PE, Brasil. O isolamento de Neospora spp em gerbilos não pode ser feito uma vez que não foi possível a obtenção de tecidos dos equídeos soropositivos. / Neospora caninum is an obligate intracellular parasite, forming cysts that affect many domestic and wild animals, having greater importance in canine and bovine species due neurological and reproductive problems. Canids of the genus Canis are recognized as the only definitive hosts of N. caninum until the moment in which sexual phase occurs multiplication, resulting in the elimination of oocysts in the feces. Toxoplasma gondii is also a coccidian parasite responsible for a zoonotic disease of great importance and occurrence around the world. The asexual developmental stage of T. gondii occurs in mammals and birds, the intermediate hosts, resulting in the formation of cysts and the sexual stage occurs in the small intestine of definitive hosts, which are the felids, occurring oocysts formation. This study aimed to determine the seroprevalence of antibodies against Neospora spp. and Toxoplasma gondii in equids from different regions of Brazil and the isolation and genetic characterization of these parasites from equids tissue. Serology for T. gondii and Neospora spp. was performed in 453 serum samples by Immunofluorescence Antibody Test (IFAT). Of this total, eight (1.75%) samples (seven of donkeys and one of horse) were positive to Neospora spp. antibodies and 129 (28.47%) samples (82 donkeys, 32 horses, 15 mules) were T. gondii seropositive. For the isolation of T. gondii, bioassay was performed in mice. A sample of one donkey (Equus asinus) from Mossoró, RN, was obtained with two of the 20 inoculated mouse infected. The mouse died at day 16th and 17th post inoculation. The genotypic characterization of the isolate was performed by PCR-RFLP using 12 genotypic markers. Genotyping showed the genotype #60 TgCkBr220, already described in chickens from Fernando de Noronha, PE, Brazil. Due the impossibility of acquisition of tissue from Neospora spp seropositive equids, isolation of this coccidian by gerbil bioassay was not possible to be done.

O uso de vacinas seguras e eficazes é uma intervenção em saúde pública bem consolidada nas últimas décadas com grande impacto na queda da prevalência das doenças infecciosas. O controle sorológico do estado vacinal e de proteção de uma população é essencial, entretanto precisamos de alternativas para estes estudos. Escolares são um grupo em que o acesso para coleta de sangue é problemático. A saliva pode ser um material alternativo perfeitamente aceitável para crianças e outros grupos protegidos. Para controle de vacinação e incidência de toxoplasmose, nós promovemos uma exposição interativa sobre higiene em escolas públicas para coletar saliva de 249 estudantes do 7º a 9º anos do ensino fundamental, de onde detectamos a prevalência de resposta IgG específica e, portanto, proteção vacinal para a vacina tríplice viral ou detecção de infecção pelo T. gondii. Para evitar a variabilidade da concentração de IgG em saliva, nós desenvolvemos e validamos um ensaio de captura de IgG por proteína A de S. aureus na fase sólida, com revelação da especificidade da IgG pelo uso de antígenos recombinantes de vírus do sarampo, rubéola e caxumba, além de extrato antigênico de T. gondii. Estes antígenos biotinilados ligados a IgG foram obtidos por sistema avidina-biotina-peroxidase. Foram 249 salivas de escolares, 47 soros e salivas da graduação e, para validação, cinquenta soros positivos e quarenta soros negativos para controle, sendo eles soros de infantes, entre 8 e 12 meses de idade. Os testes tinham reprodutibilidade maior que 98% e sensibilidade e especificidade maior que 95%. Detectamos na população de estudantes uma prevalência de toxoplasmose de 8,5% (I.C. 95% 5-11,9%), uma proteção vacinal para sarampo de 96,8% (I.C. 95% 94,6-99%), para rubéola de 59,1% (I.C. 95% 53-65%) e para caxumba de 57.5% (I.C. 95% 51,3-63,6%). Nossa abordagem foi eficiente em todos os aspectos, desde a exposição itinerante, o uso de saliva e no desenvolvimento de ensaios confiáveis para a determinação da proteção vacinal de estudantes e na prevenção da toxoplasmose. Com este conhecimento, medidas adequadas de saúde pública, como revacinação, podem ser adequadamente planejadas. / The use of safe vaccines and are a well-established public health intervention in recent years with great impact on the last of the infectious diseases. Serological control of the vaccination status and protection of a population is essential, the study alternatives for these studies. Schoolchildren are a group in which access to blood collection is problematic. Saliva may be an appropriate alternative material for children and other protected groups. The disclosure of vaccination and analysis on an extinguishment is one of the projected lectures of the community lectures of the education of Equality of Equality and, therefore, vaccine a viral vaccine or detection of T. gondii infection. In order to avoid IgG variability in saliva, we developed and validated an IgA capture assay by continuous-phase S. aureus protein A with IgG specificity revealed by the use of recombinant measles, rubella and mumps, as well as the antigenic extract of T. gondii. These biotinylated antigens linked an IgG antibody to the avidin-biotin-peroxidase system. 249 saliva from schoolchildren, 47 serums and graduation salutations and, for validation, fifty positive sera and forty negative sera for the control, being sera of infants between 8 and 12 months of age. The tests had greater reproducibility than 98% and sensitivity and specificity greater than 95%. We detected a prevalence of toxoplasmosis of 8.5% (95% CI 5-11.9%), measles vaccine protection from 96.8% (95% CI: 94.6-99%), for rubella of 59.1% % (95% CI 53-65%) and for mumps 57.5% (95% CI 51.3-63.6%). The approach was effective in all aspects, from the traveling exhibition, to the use of saliva and the development of research for the identification of temporary vaccination and the prevention of toxoplasmosis. With this knowledge, public health measures such as revaccination can be planned.

Toxoplasma gondii é um agente disseminado com um ciclo de vida complexo que envolve gatos e hospedeiros de sangue quente, incluindo o homem. Componentes vacinais são imunógenos pobres e vacinas atenuadas causam doenças crônicas. Taquizoítos irradiados à 255Gy induzem uma imunidade similar a infecção, com proteção parcial, sem estudos sobre memória. Estudamos a produção de IgG in vitro por células do baço e medula óssea de camundongos imunizados com taquizoítos irradiados e infectados. A medula óssea contém um número maior de células específicas do que o baço. As células de memória são de alta afinidade, mas IgG sérica apresentaram baixa avidez. Há também anticorpos específicos IgA nas fezes. Todas as vacinas indutoras de proteção parcial contra o desafio, que foi mais evidente em alta patogenicidade da cepa ME-49. A proteção foi proporcional tanto à quantidade de anticorpos IgG no soro ou produzidos por células da medula óssea. Nossos dados mostram claramente que os anticorpos de alta afinidade estão relacionados com a sobrevida específica de memória celular. / Toxoplasma gondii is a disseminated agent with a complex life cycle involving cats and warm blood hosts, including man. Component vaccines are poor immunogens and attenuated vaccines cause chronic disease. 255Gy irradiated tachyzoites induce the same immunity as natural infection, with partial protection, without studies on immunological memory. We studied in vitro production of specific IgG by spleen and bone marrow cells of mice immunized with irradiated tachyzoites, comparing with chronically infected animals. Bone marrow contains larger numbers of specific cells than spleen. Memory cells were of high affinity, but serum presented low avidity IgG. We also show presence of specific IgA antibodies in stools. All immunizations induce partial protection against challenge, which was more evident in highly pathogenic ME-49 strain. The protection was proportional both to the amount of IgG antibodies in serum or produced by bone marrow cells. Our data clearly shows that high affinity antibodies are related to specific memory cell survival.

As zoonoses urbanas, doenças que afetam muitos indivíduos em países tropicais, especialmente crianças, são infecções que podem ser adquiridas pelo homem através do contato com animais de estimação, pela ingestão de carne ou água contaminada. Para sua prevenção, é fundamental a educação para medidas de higiene e profilaxia com relação ao manuseio dos alimentos, animais de estimação e higiene pessoal. Isto poderia ser feito através de ensino intensivo, ministrado por profissionais treinados durante o primeiro ciclo do Ensino Fundamental. No presente trabalho, estudamos este tipo de ensino e a prevalência destas doenças, usando a toxoplasmose como modelo, em 164 alunos do primeiro ciclo do ensino fundamental da Escola Estadual Antonio de Pádua Vieira, com coleta de saliva. Foi desenvolvido ELISA de alta sensibilidade em saliva concentrada por etanol. Após 12 (doze) meses, a fixação do conteúdo foi avaliada por questionário. Havia uma prevalência de 50% de contato com Toxoplasma gondii nessa população, mostrando a relevância do problema. As crianças sob intervenção mostraram fixação do conhecimento, para ambas as fontes principais de contaminação mostrando a importância da intervenção, em comparação com crianças sem intervenção. As crianças sem toxoplasmose mostraram uma melhor eficiência na fixação da informação. Nossos dados sugerem que intervenções curtas têm um grande efeito de fixação de informações em escolares e que a saliva pode ser um material para a detecção de contato com a toxoplasmose. / Urban zoonoses affect large proportion of the population in tropical countries, specially school children. Those infections could be acquired by contact with pets, or ingestion of water or meat contaminated by agents. Education in preventive hygiene measures, as adequate cleaning and cooking are essential in this age group. Intensive teaching during short interventions by trained personal could be effective. Here, we study this type of educational intervention, using toxoplasmosis as a model, in 164 school children in the first years of elementary grades in a public São Paulo school, E.E.P.G. Antonio de Pádua Vieira, with saliva sampling. We had standardize a specific anti T. gondii IgG assay in etanol concentrade saliva. After 12 months, the knowledge of this population was tested by questionnaire. There are a 50% prevalence of contact with T.gondii during the intervention, showing the importance of zoonosis in this group. After one year, most children who assisted the intervention recalled correctly the main transmission ways of the zoonosis, showing fixation by short intervention, as compared to non-intervened shoolchildren of the same age group. Children who had no contact with T.gondii show higher recall proportion. Our data suggest that shorts interventions are effective in the knowledge fixation in schoolchildren and that saliva, a non invasive sampling, could be an alternative material for detection of contact with toxoplasmosis.

Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, podendo causar diferentes formas da doença, entre elas, a toxoplasmose congênita cuja frequência varia significativamente de acordo com o país estudado. Na França, foi estimada em 1-3 casos/1.000 nativivos, enquanto nos EUA cerca de 1/10.000, porém não existem estimativas da prevalência de infecção congênita no Brasil. Toxoplasma gondii possui três linhagens clonais conhecidas como genótipos I, II e III que se relacionam aos três tipos descritos de acordo com a classificação da patogenicidade do parasita em camundongos, estando os três tipos associados a infecções humanas de maior patogenicidade, menor patogenicidade e patogenicidade intermediária, respectivamente. Os três genótipos já foram identificados na América do Norte e Europa, sendo o genótipo II predominante em infecções congênitas. O presente estudo teve como objetivo determinar a freqüência dos genótipos I, II e III de T. gondii em 85 amostras de líquido amniótico de gestantes brasileiras com toxoplasmose confirmada e adquirida durante a gestação, todas oriundas de São Paulo. Para tal, foi utilizada a técnica de multiplexnested- PCR-RFLP com amplificação simultânea de quatro fragmentos pertencentes a três genes do parasita: 3-SAG2, 5-SAG2, SAG3 e GRA6 Das 85 amostras iniciais, 76 foram positivas pelo sistema de multiplexnested- PCR (92,7%), tendo sido possível analisar o maior número de amostras no sistema que amplifica a região do gene SAG3 (69,7%), seguido do sistema 3-SAG2 (44,7%), do sistema 5-SAG2 (40,8%), e finalmente do sistema GRA6 (25%). Nas 76 amostras submetidas à genotipagem foram encontrados: 1,3% (1 amostra) do genótipo I; 71,1% (54 amostras) do genótipo II; 6,6% (5 amostras) do genótipo III; e 21% (16 amostras) para as quais não foi possível definir o genótipo parasitário após clivagem enzimática, tendo sido as mesmas submetidas ao sequenciamento. Das 16 amostras, duas não puderam seqüenciadas por falta de DNA remanescente e das 14 analisadas: duas foram definidas como tipo III, apresentando 100% de homologia com o protótipo VEG, e duas foram definidas como tipo II apresentando 100% de homologia com o protótipo ME49. Em 10 amostras foram observadas misturas de duas ou mais bases, em uma ou mais posições nucleotídicas da sequência de DNA do fragmento amplificado, sendo identificadas como recombinantes. Além disso, seis amostras identificadas pela técnica de multiplex-nested-PCR-RFLP como tipo II foram selecionadas aleatoriamente para a confirmação dos resultados e, em quatro das seis amostras, foi observada mistura de bases em outras posições nucleotídicas do fragmento amplificado, regiões estas não analisadas pela RFLP. A técnica de multiplex-nested-PCR seguida de RFLP mostrou-se útil, porém apresenta limitações no que se refere à genotipagem de amostras de líquido amniótico, uma vez que, após sequenciamento, foram reveladas várias recombinações genéticas nos fragmentos amplificados que haviam sido previamente identificados como tipo II. Sendo assim, sugerimos que, a genotipagem de T. gondii, diretamente de amostras biológicas ou após isolamento do parasita deva ser realizada pela amplificação de múltiplos genes de T. gondii e sequenciamento de todos os fragmentos amplificados / Toxoplasma gondii is the etiologic agent of toxoplasmosis and may cause different forms of the disease, including congenital toxoplasmosis whose frequency varies significantly according to the country. In France, it was estimated in 1-3 cases/1,000 live births, while in the U.S. it is 1/10.000. The prevalence of congenital infection in Brazil is unknown. Toxoplasma gondii has three clonal lineages known as genotypes I, II and III which are related to the three types described according to the pathogenicity in mice, associated with human infections of high pathogenicity, low pathogenicity and intermediate pathogenicity, respectively. The three genotypes have been identified in North America and Europe, and the genotype II is the predominant one in congenital infections. This study aimed at determining the frequency of genotypes I, II and III of T. gondii in 85 amniotic fluid samples from pregnant women living in Sao Paulo, Brazil who presented with seroconversion to Toxoplasma gondii during gestation. The multiplex-nested- PCR-RFLP was performed using four different markers: 3\'-SAG2, 5\'-SAG2, SAG3 and GRA6. Eighty-five samples were initially included, but only 76 were positive in the multiplex-nested-PCR (92.7%). It was possible to examine the larger number of samples by the SAG3 gene system (69.7%), followed by 3\'-SAG2 gene (44.7%), 5\'-SAG2 gene (40.8%), and finally GRA6 gene (25%). From the 76 samples that were genotyped by the multiplexnested- PCR-RFLP, 1.3% (1 sample) was genotype I; 71.1% (54 samples) were genotype II; 6,6% (5 samples) were genotype III, and 21% (16 samples) could not be identified by RFLP and were therefore sequenced. Sequencing analysis revealed: two genotype II samples, presenting with 100% of homology with the ME49 prototype, and two were genotype III showing 100% of homology with the VEG prototype. Ten samples presented with mixture of two or more nucleotide bases in one or more nucleotide positions of the total amplified DNA sequence, so they were classified as recombinant. In addition, six samples identified by the multiplex-nested-PCR-RFLP as type II were randomly selected to confirm the results, and in four of the six samples, we observed a mixture of nucleotide bases in positions that were not analyzed by the RFLP. The technique of multiplex-nested-PCR-RFLP has proved to be useful, however, it is limited when amniotic fluid samples genotyping is concerned because after sequencing, several genetic recombinations were evidenced in samples that had been previously identified as genotype II. Therefore, we suggest that the genotyping of T. gondii, directly from biological samples or after isolation of the parasite should be performed using different targets to amplify multiple T. gondii genes followed by sequencing of all amplified fragments

A toxoplasmose é uma infecção que pode causar graves lesões fetais quando adquirida durante a gestação. O diagnóstico é sobretudo sorológico e deve ser feito por acompanhamento mensal em gestantes soronegativas, que tem aumentado nos últimos anos. A triagem sorológica para estas gestantes demanda metodologias de alto desempenho e eficiência, que permitam a introdução rápida do tratamento evitando a doença. Para este fim, desenvolvemos um ensaio sorológico fluorescente de fase sólida para a detecção conjunta de IgG, IgM e IgA contra Toxoplasma gondii (FISAt). Nosso grupo tem desenvolvido novos testes fluorimétricos de fase sólida com conjugados fluorescentes refinados sensíveis e específicos com possibilidade de detecções simultâneas numa mesma reação. Para a construção do FISAt, foram selecionados e produzidos conjugados marcados com fluorocromos de emissão não interferente, com alta eficiência e similares à reatividade de conjugados comerciais enzimáticos. Esta seleção de conjugados fluorescentes detectados com filtros de excitação e emissão adequados permitiram um aumento da intensidade do sinal de fluorescência e maior discriminação entre soros positivos e negativos. A reação foi realizada com extrato total de T. gondii adsorvido em fase sólida e para o controle positivo das reações, utilizamos a adsorção de classes de imunoglobulinas purificadas, evitando o uso de raros soros positivos controles. A validação do FISAt foi feita com 500 amostras de soro em sua maioria gestantes do HCFMUSP previamente analisadas por ensaios comerciais realizados em outro laboratório (Elecsys Toxo IgG/IgM, e IFAT IgM) ou ELISA IgG/IgM/IgA. Comparado com o Elecsys Toxo IgG/IgM, o FISAt IgG mostrou boa concordância (Kappa=0.77), com sensibilidade de 76.2% e especificidade de 96.8%, enquanto que o FISAt IgM mostrou boa concordância (Kappa=0.63), menor sensibilidade de 62.1% e especificidade de 97.6%. O FISAt foi mais concordante com o ELISA tanto na detecção de IgG, quanto de IgM anti-T. gondii (Kappa>70%), com maior sensibilidade de 82% e similar especificidade. E o FISAt IgA obteve excelente concordância com o ELISA (Kappa=0.77), com sensibilidade de 92.0% e especificidade de 98.3%. Em comparação com o método confirmatório IFAT IgM, o FISAt IgM mostrou sensibilidade de 100% e especificidade de 94.6%. Das 420 gestantes, 0.7% obtiveram resultado de baixa avidez de anticorpos IgG anti-T. gondii e foram identificadas na triagem como IgG, IgM e/ou IgA positivas em todos os testes avaliados, mostrando a eficiência discriminante do FISAt. O FISAt mostrou excelente reprodutibilidade (r2>0.82) e alto rendimento na triagem de grande número de amostras. Este novo teste múltiplo rápido e de detecção quantitativa pode ser usado em sistemas robóticos e tem uma aplicabilidade essencial para a triagem e tratamento de gestantes em risco de toxoplasmose congênita, ou para outras abordagens diagnosticas de alto volume de amostras. / Toxoplasmosis is an infection that can cause serious fetal damage when obtained during pregnancy. The diagnosis is mainly serological and should be done monthly monitoring seronegative pregnant women, which has increased in recent years. The serological screening for these pregnant women demands high performance and efficiency methodologies which allow the rapid introduction of the treatment avoiding the disease manifestation. With this in mind, our goal was to develop a solid phase fluorescent serological assay for IgG, IgM and IgA detection against Toxoplasma gondii (FISAt). Our group has been develop new solid phase fluorimetric assays with sensitive and specific refined fluorescent conjugates with the possibility of simultaneous detection in the same reaction. For the construction of the FISAt, conjugates labeled with non-interfering emission fluorochromes were designed and produced with high efficiency and similar reactivity of enzymatic commercial conjugates. This design of conjugates with suitable filters generated an increase in fluorescence intensity with a higher signal between positives and negatives sera. The reaction was made with total extract of T. gondii adsorbed solid phase. Also, for the positive control of the reactions, we have used the adsorption of purified classes of immunoglobulins, avoiding the use of rare positive control sera. FISAt validation was performed with 500 serum samples, mostly from HCFMUSP pregnant women previously analyzed by commercial tests (Elecsys Toxo IgG/IgM, and IFAT IgM) or ELISA IgG/IgM/IgA. In comparation to Elecsys Toxo IgG/IgM, FISAt IgG has shown excellent agreement (Kappa=0.77), with a sensitivity of 76.2% and specificity of 96.8%, whereas IgM FISAt has shown a good agreement (Kappa=0.63), with a lower sensitivity (62.1%) and similar specificity (97.6%). FISAt was more consistent with ELISA in both anti-T. gondii IgG and IgM detection (Kappa> 70%), with greater sensitivity (82%) and similar specificity. FISAt IgA obtained excellent agreement with the ELISA (Kappa = 0.77), showing 92.0% of sensitivity and 98.3% of specificity. In comparison with the IFAT IgM confirmatory method, FISAt IgM showed excellent sensitivity of 100% and specificity of 94.6%. Amongst 420 pregnant women, 0.7% had a low avidity anti-T. gondii IgG antibody result and were identified in the screening as IgG, IgM and/or IgA positive in all the evaluated tests, showing the discriminant efficiency of the FISAt. FISAt showed excellent reproducibility (r2>0.82) and a great income for high throughput screening. This new rapid and quantitative multiple detection assay can be used in robotic systems and has an essential applicability for screening and treatment of pregnant women at congenital toxoplasmosis risk, as well as for others diagnostic approaches of high volume samples.

A toxoplasmose é uma zoonose de ampla distribuição mundial afetando homens e diversas espécies animais. Levantamentos sorológicos indicam elevados índices de infecção, porém relatos de doença severa é rara. A infecção pelo T. gondii induz uma intensa resposta imune mediada pelo interferon-γ (IFN-γ) que rapidamente controla a multiplicação parasitária. Com o objetivo de explorar a resistência da espécie suína à toxoplasmose como modelo de estudo para a compreensão dos mecanismos de defesa a infecção, foram realizadas infecções orais com 4,5 x 105; oocistos (cepa VEG) e colheitas de amostras de linfonodo hepato-esplênico (LN HS), mesentérico (LN M) e íleo-cólico (LN IC), fígado, sangue, íleo, jejuno, baço e timo aos 2, 4, 7 e 14 dias pós-infecção (DPI). Analisou-se a expressão de 69 genes ligados a resposta de defesa às infecções pela Real-Time RT-PCR*. LN M, LN HS e fígado foram as amostras que apresentaram a maior quantidade de genes e maior intensidade de ativação enquanto que células mononucleares de sangue periférico (CMSP) e timo apresentaram reduzida resposta à infecção. A expressão e a produção de IFNG foram mais altas nas amostras de LN M e LN HS comparadas às amostras de LN traqueo-bronquial e CMSP, indicando diferentes níveis de resposta local. Intensa indução de resposta inata e inflamatória foi observada em vários tecidos, envolvendo os genes IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1, MYD88, TLR2, TLR4; estimulação de resposta Th1, mediada por IFNG incluiu os genes IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanceada pela expressão de citocinas regulatórias IL10, TGFB1 e TGFB3. Uma proeminente indução de ARG1, INDO and SLC11A1 indica ativação de mecanismos de proteção do hospedeiro envolvendo metabolismo de aminoácidos (arginina, triptofano) e ferro. A presença de parasitas foi detectada no LN M aos 2DPI pela Real-Time PCR e pela imunohistoquímica. Aumento do número de parasitas no 4DPI foi seguida de intensa resposta inflamatória, edema e necrose tecidual no 7DPI principalmente no fígado e no LN M. Elevados níveis de AST sérico no 7DPI confirmam a lesão de hepatócitos. A diminuição da inflamação e da quantidade de parasitas no 14DPI sugerem controle da proliferação parasitária. Elevados níveis de haptoglobina e óxido nítrico séricos detectados aos 4DPI (α=0,05) indicam respectivamente a ativação de proteínas de fase aguda e de macrófagos. A análise de citometria de fluxo mostra elevação da porcentagem de células CD2/CD16 DP sugerindo envolvimento de células NK e não foram observadas alterações na porcentagem de células CD4+/CD8+, CD3+/CD25+. A estimulação na expressão gênica, a produção de IFN-γ, as determinações séricas e lesões histológicas apresentam padrão similar, com início de resposta no 2DPI, elevação no 4DPI e 7DPI e diminuição no 14DPI. A análise da expressão de mRNA nos tecidos revelou alguns dos mecanismos de defesa do hospedeiro ativados durante a infecção pelo T. gondii. Observou-se uma equilibrada ativação de citocinas pró- e anti-inflamatórias envolvendo uma intrincada rede de mecanismos co-estimulatórios e regulatórios coordenando a resposta do tipo Th1. *Siglas dos genes segundo o Human Gene Nomenclature Committee (HGNC) / Toxoplasmosis is a widespread zoonosis affecting humans and large range of animal species worldwide. Serological surveillance indicates high infection rates, but rarely is associated to severe disease. T. gondii (Tg) infection induces a strong IFN-γ dominated immune response that rapidly controls parasite replication. Pig resistance to toxoplasmosis was explored as an experimental model to evaluate host defense mechanisms. Pigs were fed 4.5 x 105 oocysts (VEG strain) and hepato-splenic (HS LN), mesenteric (MLN) and ileal lymph nodes (I LN), liver, blood, ileum, jejunum, spleen and thymus samples were collected at 2, 4, 7 and 14 days after infection (DAI). Gene expression analysis for a panel of 69 immune related genes were performed by Real-Time RT-PCR*. Most intense response were detected in MLN, HS LN and liver samples, whereas low changes were observed in periferic blood monocytes (PBMC) and thymus. IFNG mRNA expression and protein production were higher in MLN and HSLN cells than in tracheo-bronchial LN and PBMC, suggesting different levels of local response. Intense innate and inflammatory induction were observed in most of the tissues involving IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1, MYD88, TLR2, TLR4; stimulation of IFNG dominated Th1 response included IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanced by expression of regulatory cytokines IL10, TGFB1 and TGFB3. Prominent ARG1, INDO and SLC11A1 upregulation indicate activation of host amino acid (arginine and tryptophan) and iron protective mechanisms. Tg parasites were detected by Real-Time PCR and immunohistochemistry in MLN as early as 2DAI. Increase of parasite burden at 4DPI was followed by an intense inflammatory response, edema and tissue necrosis in liver and LNM at 7DPI. Increased serum AST levels at 7DPI confirmed liver damage. Reduced parasite numbers and inflammatory response suggest control of parasite replication at 14 DPI. High serum haptoglobin and nitric oxide at 4DAI (α=0.05) indicate acute phase protein and macrophage activation, respectively. Flow citometry analysis showed increased percentage of CD2/CD16 DP suggesting involvement of NK cells, whereas no changes were observed at CD4+/CD8+, CD3+/CD25+ cells. Gene expression stimulation, IFN-γ production, serum determinations and histological lesions showed similar pattern, of induction at 2DPI, increasing at 4DPI and 7DPI and decreasing at 14DPI. Tissue mRNA expression analysis revealed some of the host defense mechanisms activated during T. gondii infection. A balance of pro- and anti-inflammatory cytokine activation, involving an intricated co-stimulatory and regulatory mechanisms that coordinates Th1 response was observed.*Gene names according to Human Gene Nomenclature Committee (HGNC)

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Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose, podendo causar diferentes formas da doença, entre elas, a toxoplasmose congênita cuja frequência varia significativamente de acordo com o país estudado. Na França, foi estimada em 1-3 casos/1.000 nativivos, enquanto nos EUA cerca de 1/10.000, porém não existem estimativas da prevalência de infecção congênita no Brasil. Toxoplasma gondii possui três linhagens clonais conhecidas como genótipos I, II e III que se relacionam aos três tipos descritos de acordo com a classificação da patogenicidade do parasita em camundongos, estando os três tipos associados a infecções humanas de maior patogenicidade, menor patogenicidade e patogenicidade intermediária, respectivamente. Os três genótipos já foram identificados na América do Norte e Europa, sendo o genótipo II predominante em infecções congênitas. O presente estudo teve como objetivo determinar a freqüência dos genótipos I, II e III de T. gondii em 85 amostras de líquido amniótico de gestantes brasileiras com toxoplasmose confirmada e adquirida durante a gestação, todas oriundas de São Paulo. Para tal, foi utilizada a técnica de multiplexnested- PCR-RFLP com amplificação simultânea de quatro fragmentos pertencentes a três genes do parasita: 3-SAG2, 5-SAG2, SAG3 e GRA6 Das 85 amostras iniciais, 76 foram positivas pelo sistema de multiplexnested- PCR (92,7%), tendo sido possível analisar o maior número de amostras no sistema que amplifica a região do gene SAG3 (69,7%), seguido do sistema 3-SAG2 (44,7%), do sistema 5-SAG2 (40,8%), e finalmente do sistema GRA6 (25%). Nas 76 amostras submetidas à genotipagem foram encontrados: 1,3% (1 amostra) do genótipo I; 71,1% (54 amostras) do genótipo II; 6,6% (5 amostras) do genótipo III; e 21% (16 amostras) para as quais não foi possível definir o genótipo parasitário após clivagem enzimática, tendo sido as mesmas submetidas ao sequenciamento. Das 16 amostras, duas não puderam seqüenciadas por falta de DNA remanescente e das 14 analisadas: duas foram definidas como tipo III, apresentando 100% de homologia com o protótipo VEG, e duas foram definidas como tipo II apresentando 100% de homologia com o protótipo ME49. Em 10 amostras foram observadas misturas de duas ou mais bases, em uma ou mais posições nucleotídicas da sequência de DNA do fragmento amplificado, sendo identificadas como recombinantes. Além disso, seis amostras identificadas pela técnica de multiplex-nested-PCR-RFLP como tipo II foram selecionadas aleatoriamente para a confirmação dos resultados e, em quatro das seis amostras, foi observada mistura de bases em outras posições nucleotídicas do fragmento amplificado, regiões estas não analisadas pela RFLP. A técnica de multiplex-nested-PCR seguida de RFLP mostrou-se útil, porém apresenta limitações no que se refere à genotipagem de amostras de líquido amniótico, uma vez que, após sequenciamento, foram reveladas várias recombinações genéticas nos fragmentos amplificados que haviam sido previamente identificados como tipo II. Sendo assim, sugerimos que, a genotipagem de T. gondii, diretamente de amostras biológicas ou após isolamento do parasita deva ser realizada pela amplificação de múltiplos genes de T. gondii e sequenciamento de todos os fragmentos amplificados / Toxoplasma gondii is the etiologic agent of toxoplasmosis and may cause different forms of the disease, including congenital toxoplasmosis whose frequency varies significantly according to the country. In France, it was estimated in 1-3 cases/1,000 live births, while in the U.S. it is 1/10.000. The prevalence of congenital infection in Brazil is unknown. Toxoplasma gondii has three clonal lineages known as genotypes I, II and III which are related to the three types described according to the pathogenicity in mice, associated with human infections of high pathogenicity, low pathogenicity and intermediate pathogenicity, respectively. The three genotypes have been identified in North America and Europe, and the genotype II is the predominant one in congenital infections. This study aimed at determining the frequency of genotypes I, II and III of T. gondii in 85 amniotic fluid samples from pregnant women living in Sao Paulo, Brazil who presented with seroconversion to Toxoplasma gondii during gestation. The multiplex-nested- PCR-RFLP was performed using four different markers: 3\'-SAG2, 5\'-SAG2, SAG3 and GRA6. Eighty-five samples were initially included, but only 76 were positive in the multiplex-nested-PCR (92.7%). It was possible to examine the larger number of samples by the SAG3 gene system (69.7%), followed by 3\'-SAG2 gene (44.7%), 5\'-SAG2 gene (40.8%), and finally GRA6 gene (25%). From the 76 samples that were genotyped by the multiplexnested- PCR-RFLP, 1.3% (1 sample) was genotype I; 71.1% (54 samples) were genotype II; 6,6% (5 samples) were genotype III, and 21% (16 samples) could not be identified by RFLP and were therefore sequenced. Sequencing analysis revealed: two genotype II samples, presenting with 100% of homology with the ME49 prototype, and two were genotype III showing 100% of homology with the VEG prototype. Ten samples presented with mixture of two or more nucleotide bases in one or more nucleotide positions of the total amplified DNA sequence, so they were classified as recombinant. In addition, six samples identified by the multiplex-nested-PCR-RFLP as type II were randomly selected to confirm the results, and in four of the six samples, we observed a mixture of nucleotide bases in positions that were not analyzed by the RFLP. The technique of multiplex-nested-PCR-RFLP has proved to be useful, however, it is limited when amniotic fluid samples genotyping is concerned because after sequencing, several genetic recombinations were evidenced in samples that had been previously identified as genotype II. Therefore, we suggest that the genotyping of T. gondii, directly from biological samples or after isolation of the parasite should be performed using different targets to amplify multiple T. gondii genes followed by sequencing of all amplified fragments