A toxoplasmose, causadas por protozoário Apicomplexa, Toxoplasma gondii, é amplamente disseminada e pouco sintomática. A infecção crônica mantém cistos residuais por toda a vida, mas protege da reinfecção. Neste cenário complexo, vacinas com cistos residuais não são factíveis e vacinas de subcomponentes resultam em baixa proteção. A radiação ionizante foi usada para aprimoramento de imunógenos tanto vivos ou de subcomponentes. O uso da radiação gama em extratos solúveis de taquizoítos de T. gondii foi eficiente na proteção de camundongos contra a infecção utilizando diferentes cepas, sem adjuvantes e de fácil conservação. O antígeno irradiado passa por alterações físicas sem adição de novas moléculas, com agregação de proteínas, quebras de cadeias e reações oxidativas, que podem melhorar seu direcionamento a receptores celulares em células apresentadoras de antígeno (APC). Os extratos irradiados apresentaram alterações estruturais mínimas afetando 60% das proteínas, mas com manutenção das características antigênicas e imunogênicas. O extrato irradiado a 1500Gy (STag 1500Gy) induziu maior proteção e maior resposta humoral que o extrato nativo (p<0.05), mais evidente na dose de 10?g/animal, com altos índices de anticorpos IgG específicos e maior maturação da afinidade de IgG específica, com eficiência similar ou inferior em doses maiores. Animais imunizados com STag 1500Gy apresentaram maiores proporções de linfócitos B e T CD4+ de memória, enquanto que a imunização com taquizoítos íntegros irradiados mostrou aumento de linfócitos T CD8+, ambas muito maiores que a induzida por STag nativo. Construímos STag marcados por via biossintética ou por acoplamento a diferentes marcadores não-oxidativos. STag3H 1500Gy apresentou captação maior e mais duradoura por macrófagos, sem degradação como STag3H nativo. O uso de STags fluorescentes, mostrou que a maior ligação do STag 1500Gy não é relacionada a susceptibilidade a proteases, dada a mesma sensibilidade dos extratos para as peptidases testadas, além de permanecer na célula por muito mais tempo. Na presença de bloqueadores de receptores Scavengers Dextran sulfato (SRA) e Probucol (CD36), a ligação e captação por macrófagos do STag 1500Gy foi mais afetada por inibidores de radicais oxidados (CD36) do que por inibidores de radicais negativos (SRA). Em macrófagos peritoneais de camundongos deficientes do receptor Scavenger CD36 (KOCD36-/-), observamos uma cinética inversa a que foi obtida em macrófagos normais, com menor incorporação do STag 1500Gy, fato comprovado tanto por ensaios quantitativos como por ensaios em células individuais por citometria de fluxo. Os animais KOCD36-/- não mostram produção significativa de IgG específica em todos os imunógenos usados, e foram altamente suscetíveis ao desafio com cepas viáveis de T. gondii agressivas ou cistogênicas. O transplante de macrófagos peritoneais normais \"primados\" com STag 1500Gy em animais KOCD36-/- mostrou aumento de IgG específica em soro de animais recipientes. A melhor imunogenicidade dos antígenos irradiados deve ser relacionada a captação de proteínas oxidadas via CD36, que dirige estes antígenos para via intracelular favorável à sua apresentação para resposta imune adaptativa. Nossos resultados mostram que a radiação ionizante foi capaz de modificar proteínas dos STag tornando seu processamento por células imunes mais eficiente, sem a adição de adjuvantes ao processo. / Toxoplasmosis, caused by the protozoan Apicomplexa, Toxoplasma gondii, is widely disseminated and little symptomatic. Chronic infection maintains residual cysts throughout life, but protects from reinfection. In this complex scenario, vaccines with residual cysts are not feasible and vaccines of subcomponents result in low protection. Ionizing radiation was used for enhancement of either live or subcomponent immunogens. The use of gamma radiation in soluble extracts of T. gondii tachyzoites was efficient in protecting mice against infection using different strains, without adjuvants and easy management. The irradiated antigen undergoes physical changes without addition of new molecules, with protein aggregation, chain breaks and oxidative reactions, which can improve its targeting to cellular receptors in antigen-presenting cells (APCs). The irradiated extracts showed minimal structural alterations affecting 60% of the proteins, but with maintenance of the antigenic and immunogenic characteristics. The extracts irradiated at 1500Gy (STag 1500Gy) induced greater protection and higher humoral response than the native extract (p <0.05), more evident at a dose of 10?g/animal, with high specific IgG antibody levels and increased maturation of specific IgG affinity, with similar or lower efficiency at higher doses. Animals immunized with STag 1500Gy presented higher proportions of memory lymphocytes B and CD4+ while immunization with irradiated intact tachyzoites showed an increase in CD8+ lymphocytes, both much larger than that induced by native STag. We construct STag labeled by biosynthetic pathway or by coupling to different non-oxidative markers. STag3H 1500Gy showed greater and longer uptake by macrophages, with no degradation as STag3H native. The use of fluorescent STags showed that the greater binding of the STag 1500Gy is not related to the loss of protease susceptibility, given the same sensitivity of the extracts for peptidases, besides remaining in the cell for much longer time by fluorescence. In the presence of Scavengers receptor blockers Dextran sulfate (SRA) and Probucol (CD36), binding and uptake of STag 1500Gy in macrophages was more affected by oxidized radical (CD36) inhibitors than by negative radical inhibitors (SRA). In peritoneal macrophages of Scavenger receptor CD36 deficient mice (KOCD36-/-), we observed an inverse kinetics, with less incorporation of STag 1500Gy, as evidenced by both quantitative assays and individual cells by cytometry flow, compared to wild type macrophages. KOCD36-/- animals did not show significant production of specific IgG in all immunogens used, and were highly susceptible to challenge with viable strains of aggressive or cistogenic T. gondii strains. Transplantation of normal peritoneal macrophages \"primed\" with STag 1500Gy induced increase of specific IgG in sera from CD36-/-recipient animals. The best immunogenicity of the irradiated antigens should be related to the uptake of oxidized proteins via CD36 in APCs, which directs these antigens to the intracellular route favorable to their presentation for adaptive immune response. Our results show that ionizing radiation was able to modify STag proteins, making its processing by immune cells more efficient without the addition of adjuvants to the process.

A toxoplasmose é uma zoonose de ampla distribuição mundial afetando homens e diversas espécies animais. Levantamentos sorológicos indicam elevados índices de infecção, porém relatos de doença severa é rara. A infecção pelo T. gondii induz uma intensa resposta imune mediada pelo interferon-&#947; (IFN-&#947;) que rapidamente controla a multiplicação parasitária. Com o objetivo de explorar a resistência da espécie suína à toxoplasmose como modelo de estudo para a compreensão dos mecanismos de defesa a infecção, foram realizadas infecções orais com 4,5 x 105; oocistos (cepa VEG) e colheitas de amostras de linfonodo hepato-esplênico (LN HS), mesentérico (LN M) e íleo-cólico (LN IC), fígado, sangue, íleo, jejuno, baço e timo aos 2, 4, 7 e 14 dias pós-infecção (DPI). Analisou-se a expressão de 69 genes ligados a resposta de defesa às infecções pela Real-Time RT-PCR*. LN M, LN HS e fígado foram as amostras que apresentaram a maior quantidade de genes e maior intensidade de ativação enquanto que células mononucleares de sangue periférico (CMSP) e timo apresentaram reduzida resposta à infecção. A expressão e a produção de IFNG foram mais altas nas amostras de LN M e LN HS comparadas às amostras de LN traqueo-bronquial e CMSP, indicando diferentes níveis de resposta local. Intensa indução de resposta inata e inflamatória foi observada em vários tecidos, envolvendo os genes IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1, MYD88, TLR2, TLR4; estimulação de resposta Th1, mediada por IFNG incluiu os genes IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanceada pela expressão de citocinas regulatórias IL10, TGFB1 e TGFB3. Uma proeminente indução de ARG1, INDO and SLC11A1 indica ativação de mecanismos de proteção do hospedeiro envolvendo metabolismo de aminoácidos (arginina, triptofano) e ferro. A presença de parasitas foi detectada no LN M aos 2DPI pela Real-Time PCR e pela imunohistoquímica. Aumento do número de parasitas no 4DPI foi seguida de intensa resposta inflamatória, edema e necrose tecidual no 7DPI principalmente no fígado e no LN M. Elevados níveis de AST sérico no 7DPI confirmam a lesão de hepatócitos. A diminuição da inflamação e da quantidade de parasitas no 14DPI sugerem controle da proliferação parasitária. Elevados níveis de haptoglobina e óxido nítrico séricos detectados aos 4DPI (&#945;=0,05) indicam respectivamente a ativação de proteínas de fase aguda e de macrófagos. A análise de citometria de fluxo mostra elevação da porcentagem de células CD2/CD16 DP sugerindo envolvimento de células NK e não foram observadas alterações na porcentagem de células CD4+/CD8+, CD3+/CD25+. A estimulação na expressão gênica, a produção de IFN-&#947;, as determinações séricas e lesões histológicas apresentam padrão similar, com início de resposta no 2DPI, elevação no 4DPI e 7DPI e diminuição no 14DPI. A análise da expressão de mRNA nos tecidos revelou alguns dos mecanismos de defesa do hospedeiro ativados durante a infecção pelo T. gondii. Observou-se uma equilibrada ativação de citocinas pró- e anti-inflamatórias envolvendo uma intrincada rede de mecanismos co-estimulatórios e regulatórios coordenando a resposta do tipo Th1. *Siglas dos genes segundo o Human Gene Nomenclature Committee (HGNC) / Toxoplasmosis is a widespread zoonosis affecting humans and large range of animal species worldwide. Serological surveillance indicates high infection rates, but rarely is associated to severe disease. T. gondii (Tg) infection induces a strong IFN-&#947; dominated immune response that rapidly controls parasite replication. Pig resistance to toxoplasmosis was explored as an experimental model to evaluate host defense mechanisms. Pigs were fed 4.5 x 105 oocysts (VEG strain) and hepato-splenic (HS LN), mesenteric (MLN) and ileal lymph nodes (I LN), liver, blood, ileum, jejunum, spleen and thymus samples were collected at 2, 4, 7 and 14 days after infection (DAI). Gene expression analysis for a panel of 69 immune related genes were performed by Real-Time RT-PCR*. Most intense response were detected in MLN, HS LN and liver samples, whereas low changes were observed in periferic blood monocytes (PBMC) and thymus. IFNG mRNA expression and protein production were higher in MLN and HSLN cells than in tracheo-bronchial LN and PBMC, suggesting different levels of local response. Intense innate and inflammatory induction were observed in most of the tissues involving IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1, MYD88, TLR2, TLR4; stimulation of IFNG dominated Th1 response included IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanced by expression of regulatory cytokines IL10, TGFB1 and TGFB3. Prominent ARG1, INDO and SLC11A1 upregulation indicate activation of host amino acid (arginine and tryptophan) and iron protective mechanisms. Tg parasites were detected by Real-Time PCR and immunohistochemistry in MLN as early as 2DAI. Increase of parasite burden at 4DPI was followed by an intense inflammatory response, edema and tissue necrosis in liver and LNM at 7DPI. Increased serum AST levels at 7DPI confirmed liver damage. Reduced parasite numbers and inflammatory response suggest control of parasite replication at 14 DPI. High serum haptoglobin and nitric oxide at 4DAI (&#945;=0.05) indicate acute phase protein and macrophage activation, respectively. Flow citometry analysis showed increased percentage of CD2/CD16 DP suggesting involvement of NK cells, whereas no changes were observed at CD4+/CD8+, CD3+/CD25+ cells. Gene expression stimulation, IFN-&#947; production, serum determinations and histological lesions showed similar pattern, of induction at 2DPI, increasing at 4DPI and 7DPI and decreasing at 14DPI. Tissue mRNA expression analysis revealed some of the host defense mechanisms activated during T. gondii infection. A balance of pro- and anti-inflammatory cytokine activation, involving an intricated co-stimulatory and regulatory mechanisms that coordinates Th1 response was observed.*Gene names according to Human Gene Nomenclature Committee (HGNC)

A toxoplasmose afeta 1/3 da população humana e só existe uma vacina para uso veterinária. A radiação gama altera as proteínas tornando-as mais imunogênicas, por oxidação e melhor apresentação de antígenos na ausência de adjuvantes. Irradiamos extrato solúvel de taquizoítos da cepa RH de T. gondii (AgTg), e avaliamos seu uso como vacina em camundongos BALB/c. Doses abaixo de 500Gy não afetavam e doses acima de 2000Gy destruíam o extrato, sendo que animais imunizados com extrato irradiado a 1000, 1500 e 2000Gy tinham mais IgG especifica de maior avidez, comparado ao AgTg nativo (p<0.05). Animais imunizados pelo AgTg 1500Gy tiveram aumento da proliferação de esplenócitos, fenotipados como CD3+CD4+, CD3+CD8+ e de linfócitos B, comparados com animais imunizados pelo AgTg nativo. Animais imunizados pelo AgTg 1500Gy após desafio com cepa ME-49 cistogênica apresentaram menor numero de cistos cerebrais e maior sobrevida pós-desafio com cepa virulenta RH. A radiação ionizante em extratos de T.gondii aumenta a resposta imune e a memória imunológica na ausência de adjuvantes. / Toxoplasmosis affects 1/3 of the human population and only a vaccine for veterinary use. Gamma radiation alters the proteins making them more immunogenic by oxidation and better antigen presentation in the absence of adjuvants. Radiate soluble extract of RH strain tachyzoites of T. gondii (AgTg ) , and evaluate its use as a vaccine in BALB/c . Doses below 500Gy not affected and destroyed 2000Gy doses above extract, whereas animals immunized with irradiated extract at 1000, 1500 and 2000Gy had more of specific IgG avidity, compared to native AgTg (p < 0, 05). AgTg 1500GY the immunized animals had increased proliferation of splenocytes, phenotyped as CD3+CD4+,CD3+CD8+ and B-lymphocytes immunized animals compared to the native AgTg . Animals immunized by AgTg 1500GY after challenge with strain ME- 49 cystogenic showed lower number of brain cysts and greater survival after challenge with virulent RH. Ionizing radiation in extracts of T. gondii increases the immune response and immune memory in the absence of adjuvants.

A maioria dos estudos da interação parasito-hospedeiro tem focado na interação de um único patógeno. Porém, o hospedeiro em um ambiente natural é comumente exposto a múltiplos patógenos sequencialmente ou mesmo simultaneamente. Diversos estudos têm utilizado o modelo de Ligadura e perfuração do Ceco (CLP) para estudar a sepse, mas nenhum deles apresentou modelo de coinfecção ou estudo avaliando o papel de infecções prévias no desfecho da sepse polimicrobiana experimental. Neste contexto, nossa hipótese é de que a infecção crônica por parasitos poderia alterar o curso da resposta durante a sepse polimicrobiana. Para testar essa hipótese, animais C57BL/6 ou BALB/c foram infectados com 5 ou 20 cistos da cepa ME 49 de Toxoplasma gondii e 40 dias após a infecção os animais foram induzidos à sepse polimicrobiana. Em nosso estudo, 100% dos animais cronicamente infectados por T. gondii morreram num período de 24 horas após CLP. O mesmo não foi observado quando animais foram infectados cronicamente com os parasitos Leishmania major e Trypanosoma cruzi ou com o fungo Paracoccidioides brasiliensis. Um dado interessante em nosso estudo foi que, nos animais previamente infectados com T. gondii, constatamos melhora na eliminação de bactérias liberadas pela CLP e aumento do recrutamento celular para o sítio da infecção. Apesar de esses animais apresentarem melhora na resposta contra as bactérias, verificamos a presença de lesão intestinal e maior infiltrado inflamatório neste órgão, associado a um aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias (IFN-, TNF-, IL-6 e IL-1) e consequente aumento de óxido nítrico (NO), num período de 24 horas depois da CLP. Verificamos que as células TCD4+ e TCD8+ são responsáveis pela produção de IFN- e TNF- nesse modelo de coinfecção, e em modelo in vitro, que macrófagos podem ser responsáveis pela produção de IL-1 dependente de ativação do inflamassoma NLRP3/ASC/Caspase 1. Neste estudo, observamos que a rápida resposta contra a CLP acontece em função da presença de células de memória de padrão Th1, induzidas na infecção por T. gondii. Dessa forma, esse trabalho mostra que a infecção crônica por T. gondii agrava a sepse polimicrobiana subletal, por aumentar a produção de citocinas pró-inflamatórias IL-6, TNF- e IL-1, com a indução de hipotensão, predispondo ao choque séptico. / Most studies of parasite-host interaction have focused on the interaction of a single pathogen with cells or organism of the host. However, in a natural enviroment, the host is commonly exposed to multiple pathogens sequentially or even simultaneously. Several studies have used the model of cecal ligation and puncture (CLP) to study sepsis, but none of them evaluated the effect of the presence of previous infections to the outcome of polymicrobial sepsis. In this context, we hypothesized that chronic infection with Toxoplasma gondii could alter the course of host response against polymicrobial sepsis. To test this hypothesis, C57BL/6 or BALB/c mice were orally infected with 5 or 20 cysts of ME-49 strain of T. gondii and 40 days post infection, they were subjected to CLP. When mice were chronically infected with T. gondii, 100% of the animals died within 24 hours after CLP. The same phenomenons were not observed in animals previously infected with other parasites, such as Leishmania major and Trypanosoma cruzi or the fungus Paracoccidioides brasiliensis. Interestingly, when we evaluated the response against the CLP in animals that were infected with T. gondii, we found an improvement in the killing of bacteria released by CLP and an increase in recruitment of inflammatory cells to the site of infection. However, despite the fact that these animals have improved response against the bacterial infection, they presented intestinal damage and increased inflammatory infiltrate in this organ. The animals also had increased pro-inflammatory cytokines (IFN-, TNF-, IL-6 and IL-1), and nitric oxide (NO) detected within 24 hours after CLP. We also found that the TCD4+ and TCD8+ cells were responsible to produce IFN- and TNF-, and, using an in vitro model, we verified that macrophages are primarily responsible for the production of IL-1 in a pathway dependent on the activation of NLRP3/ASC/Caspase 1 inflamassoma. In this study, we found that early response against CLP happens due to the presence of mainly Th1 memory cells, induced by T. gondii infection. Finally, we found that chronic infection with T. gondii aggravates sublethal polymicrobial sepsis by increasing the cytokines IL-6, TNF- and IL-1, with induction of hypotension that predispose to septic shock.

Toxoplasma gondii est un parasite protozoaire intracellulaire obligatoire, responsable d'une infection cosmopolite très répandue, la toxoplasmose. Les différents schémas de traitement de la toxoplasmose reposent sur l'association de la pyriméthamine et d'un sulfamide qui agissent en synergie pour bloquer la voie de synthèse des folates. Cependant des échecs thérapeutiques ont été rapportés dans la littérature, et trois souches naturellement résistantes à la sulfadiazine, TgA 103001 (Type I), TgH 32006 (Type II) et TgH 32045 (Type II variant), ont été décrites. Notre travail a porté sur l'étude des mécanismes de résistance à la sulfadiazine chez T. gondii. Nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l'implication des gènes cibles, dhps et dhfr, ainsi que les ABC transporteurs TgABC.B1, TgABC.B2, TgABC.C1 et TgABC.C2 dans la résistance à la sulfadiazine chez T. gondii. Cependant aucun polymorphisme ni surexpression de ces gènes n'a pu être relié aux mécanismes de résistance. Nous avons ensuite comparé les protéomes des souches naturellement résistantes aux protéomes des souches sensibles RH (Type I) et ME-49 (Type II) par DIGE. Parmi les 31 protéines différentiellement exprimées entre souches sensibles et résistantes, quatre protéines, ROP2, MIC2, ENO2 et IMC1, nous ont semblé intéressantes. Afin de s'affranchir des variations liées aux différences de fond génétique des souches, les souches sensibles RH et ME-49 ont été rendues résistantes in vitro à la sulfadiazine par pression médicamenteuse croissante, résistance validée in vitro grâce à la mise au point d'un nouveau test de chimiosensibilité. Nous avons ensuite, par 2-DE, comparé les protéomes des souches de type II sensible (ME-49), et résistantes (ME-49-RSDZ et TgH 32006) sans identifier le ou les candidat(s) impliqué(s) dans la résistance médicamenteuse. Cependant, l'analyse des souches ME-49 sensible et ME-49-RSDZ résistante, par microarrays, nous a permis d'identifier une cible appartenant à la voie de synthèse des folates : la folylpolyglutamate synthase. / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite responsible of a widespread infection, toxoplasmosis. Treatment options for toxoplasmosis are generally limited to combinations of sulfonamide and pyrimethamine which have a synergistic action on T. gondii folate synthesis by inhibiting two major enzymes: dihydropteroate synthase (DHPS) and dihydrofolate reductase (DHFR). However treatment failures have been reported, and three naturally sulfadiazine resistant strains, TgA 103001 (Type I), TgH 32006 (Type II) and TgH 32045 (Type II variant), have been described. In this work, we studied resistance mechanisms to sulfadiazine on T. gondii. We are interested, in a first time, on the involvement of target genes, dhps and dhfr, and ABC transporters, TgABC.B1, TgABC.B2, TgABC.C1 and TgABC.C2, in the sulfadiazine resistance on T. gondii. However, neither polymorphisms nor overexpression of these genes has been linked to resistance mechanisms. Then, we compared proteomes of naturally resistant strains to sensitive strains RH (Type I) and ME-49 (Type II) by DIGE. Among the 31 proteins differentially expressed between sensitive and resistant strains, four proteins, ROP2, MIC2, ENO2 and IMC1, seemed to be interesting. In order to avoid variations due to differences from genetic background, sensitive strains RH and ME-49 have been made resistant in vitro by gradual increase in sulfadiazine concentration. This resistance was checked in vitro by the development of a new chemosensitivity assay. We compared then, by 2-DE, proteomes of the type II strains, sensitive (ME-49) and resistant (ME-49-RSDZ and TgH 32006), without identifying candidates implicated in sulfadiazine resistance mechanisms. However, analysis of the sensitive strain ME-49 and the resistant strain ME-49-RSDZ, by microarrays, allowed us to identify a candidate belonging to folate synthesis pathways: folylpolyglutamate synthase.

A manipulação comportamental é uma das principais correntes teóricas utilizadas para explicar as alterações comportamentais presentes em roedores parasitados pelo Toxoplasma gondii. Vários estudos propõem que o parasitismo pelo protozoário provoca mudanças metabólicas, imunológicas e neuropatológicas que possibilitam o desenvolvimento de mudanças no comportamento dos indivíduos infectados. Contudo, alguns fatores relacionados ao desenvolvimento da manipulação comportamental, ainda, não estão bem elucidados, entre eles, destaca-se o possível efeito do genótipo da cepa infectante nas modificações comportamentais. Neste trabalho, avaliamos o efeito da infecção crônica por cepas cistogênicas geneticamente distintas de T. gondii no comportamento de camundongos. Foram desenvolvidos modelos de infecção experimental com as cepas ME-49 (tipo II) e VEG (tipo III) em camundongos isogênicos BALB/c para avaliação da resposta imune humoral por ELISA, quantificação de parasitas em cistos cerebrais por PCR em tempo real e testes comportamentais como Esquiva Inibitória, Labirinto de Barnes, Labirinto em Cruz Elevado, Campo Aberto e Labirinto em Y visando, respectivamente, a avaliação da aprendizagem - memória, ansiedade, atividade locomotora e aversão ao odor do felino. Nossos dados mostram que camundongos infectados pela cepa VEG apresentaram redução mais acentuada da capacidade de recuperação de memória de longo prazo e alterações motoras mais proeminentes do que os animais infectados pela cepa ME-49. Na avaliação da aversão ao odor do felino, verificamos que a infecção pela cepa VEG induziu uma alteração comportamental mais acentuada no hospedeiro, nas fases iniciais da infecção, do que a infecção pela cepa ME-49, sendo este efeito observado tanto na presença de urina pura de gato como do aminoácido L-felinina. Nossos resultados sugerem que o genótipo da cepa infectante pode influenciar o desenvolvimento de alterações comportamentais em animais infectados pelo T. gondii, tornando o hospedeiro mais suscetível e exposto ao predador, sobretudo em infecções causadas por cepas do tipo III. / The behavioral manipulation is the main theoretical current used to explain the behavioral changes present in rodents parasitized by Toxoplasma gondii. Several studies suggest that protozoan parasitism causes metabolic, immunological and neuropathological changes that allow the development of changes in the behavior of infected individuals. However, some factors related to the development of behavioral manipulation are still not well understood, among them, the possible effect of the genotype of the infecting strain on behavioral modifications is highlighted. In this study, we evaluated the effect of chronic infection by genetically distinct cystogenic strains of T. gondii on the behavior of mice. Experimental models were developed with the ME-49 (type II) and VEG (type III) strains in isogenic BALB / c mice to evaluate the humoral immune response by ELISA, quantification of parasites in brain cysts by real-time PCR and behavioral tests as Passive Avoidance, Barnes Maze, Elevated Plus Maze, Open Field and Y - Maze aiming, respectively, evaluation of learning - memory, anxiety, locomotor activity and aversion to feline odor. Our data showed that mice infected with the VEG strain showed a more pronounced reduction in long-term memory retrieval capacity and more prominent motor alterations than the animals infected with the ME-49 strain. In the evaluation of feline odor aversion, we observed that infection by the VEG strain induced a more marked behavioral change in the host in the early stages of infection than the infection by the ME-49 strain, and this effect was observed both in the presence of urine pure cat as the amino acid L-felinine. Our results suggest that the genotype of the infecting strain may influence the development of behavioral changes in T. gondii infected animals, making the host more susceptible and exposed to the predator, especially in infections caused by type III strains.

Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório que causa a toxoplasmose. Em modelo experimental, camundongos C57BL/6 infectados por via oral com 100 cistos de T. gondii, cepa ME-49, desenvolvem sérias lesões intestinais similares as observadas em doenças inflamatórias intestinais. Ao invadir as células epiteliais intestinais, o parasito induz uma resposta inflamatória de padrão T helper (Th) 1 elevada, ativada pela produção de quimiocinas e citocinas envolvidas na migração e ativação celular. Para que ocorra essa migração celular para o sítio de infecção é necessário a presença de receptores de quimiocinas. O receptor de quimiocinas CCR5 é muito importante para o recrutamento celular em algumas infecções e está envolvido com a migração de vários subtipos celulares como células dendríticas, células T e, em particular, células T reguladoras. CCR5 pode estar relacionado também a mecanismos independentes da migração celular, no qual a sinalização intracelular e ativação de NF-B podem levar a intensificação da resposta imunológica. Ainda não está claro o papel do receptor CCR5 no modelo de infecção oral por T. gondii. Dessa forma, animais C57BL/6 e deficientes em CCR5 foram infectados por via oral com 5 cistos de T. gondii, cepa ME-49, e alguns parâmetros imunológicos e bioquímicos foram avaliados no 8º dia de infecção. Os resultados mostraram que animais CCR5-/- apresentaram alta suscetibilidade à infecção oral por T. gondii, exibindo um intenso infiltrado inflamatório no íleo e regiões de ulceração epitelial, quando comparados com animais C57BL/6. Independentemente de serem deficientes ou não de CCR5, os camundongos apresentaram focos inflamatórios dispersos pelo parênquima do fígado, entretanto camundongos CCR5-/- apresentaram uma extensiva vacuolização dos hepatócitos, com excessivo acúmulo de lipídeos no órgão e elevada concentração sérica de triglicérides e de transaminases. A carga parasitária foi significativamente mais elevada no intestino delgado e no fígado dos animais CCR5-/- em comparação com animais C57BL/6. Foi observada também uma menor migração de células NK no intestino delgado, bem como um aumento na frequência de células T CD4+ neste órgão e uma menor concentração de IFN- e IL-12p40 no macerado do fígado dos animais CCR5-/- em comparação com C57BL/6. Análise de expressão gênica no fígado revelou redução na formação de transcritos para PPAR nos animais deficientes em CCR5, e quando os camundongos foram tratados com Gemfibrozil, um agonista de PPAR, houve reversão na vacuolização hepática e na concentração de triglicérides no soro dos animais CCR5-/-. Estes dados sugerem que a migração celular dependente de CCR5 é essencial para a modulação da resposta inflamatória induzida por T. gondii no intestino delgado. Além do mais, a ausência de CCR5 compromete a integridade hepática durante a infecção oral por T. gondii e os mecanismos moleculares envolvidos podem estar relacionados à expressão de PPAR. / T. gondii is an obligate intracellular protozoan parasite which is the causative agent of toxoplasmosis. In experimental model, C57BL/6 mice orally infected with a high parasitic load develop serious intestinal lesions, whose injuries are similar to those observed in Inflammatory Bowel Disease. This inflammation is caused due to parasite invasion of intestinal epithelial cells that elicit a robust Th1 type immune response. Moreover, chemokines produced by intestinal epithelial cells are involved in the migration and activation of inflammatory cells. In particular, the chemokine receptor CCR5 is important for cell recruitment in some infections and is involved with the migration of various cells subsets such as dendritic cells, T cells and, in particular regulatory T cells. CCR5 may also be related to mechanisms independent of cell migration, in which the intracellular signaling and activation of NF-B may lead to intensification of the immune response. The role of CCR5 has not been clear in the experimental oral T. gondii infection. Thus, wild type C57BL/6 mice and CCR5-/- littermates were infected with T. gondii by gavage and immune and biochemical parameters, were analyzed at day 8 after infection. The CCR5-/- mice showed to be highly susceptible to the parasite, with intense inflammatory infiltration in the ilea and regions of epithelial ulcerations in comparison with WT mice. Both strain of mice presented inflammatory foci scattered by parenchyma of the liver, however the CCR5-/- mice presented an extensive hepatocyte vacuolization with an excessive accumulation of lipids in the organ and elevated serum triglycerides and transaminases concentration. The parasite load was significantly higher on small intestine and liver samples of CCR5-/- in comparison with WT mice. There was also a minor migration of NK cells in the small intestine, as well as greater frequency of CD4+ T cells in this organ and a lower IFN- and IL-12p40 levels in liver homogenate samples in the CCR5-/- mice compared with WT mice. Gene expression analysis revealed a reduction in the formation of transcripts for PPAR in mice deficient in CCR5, and when the animals were treated with Gemfibrozil, a PPAR agonist, there was an improvement in the level of vacuolization and reduced triglycerides. These data suggest that a CCR5-dependent cell migration is essential for the modulation of T. gondii-induced inflammatory response in the small intestine. In addition, hepatic integrity during T. gondii oral infection is compromised in the absence of CCR5, and the molecular mechanisms involved can be related to PPAR expression.

O uso de vacinas seguras e eficazes é uma intervenção em saúde pública bem consolidada nas últimas décadas com grande impacto na queda da prevalência das doenças infecciosas. O controle sorológico do estado vacinal e de proteção de uma população é essencial, entretanto precisamos de alternativas para estes estudos. Escolares são um grupo em que o acesso para coleta de sangue é problemático. A saliva pode ser um material alternativo perfeitamente aceitável para crianças e outros grupos protegidos. Para controle de vacinação e incidência de toxoplasmose, nós promovemos uma exposição interativa sobre higiene em escolas públicas para coletar saliva de 249 estudantes do 7º a 9º anos do ensino fundamental, de onde detectamos a prevalência de resposta IgG específica e, portanto, proteção vacinal para a vacina tríplice viral ou detecção de infecção pelo T. gondii. Para evitar a variabilidade da concentração de IgG em saliva, nós desenvolvemos e validamos um ensaio de captura de IgG por proteína A de S. aureus na fase sólida, com revelação da especificidade da IgG pelo uso de antígenos recombinantes de vírus do sarampo, rubéola e caxumba, além de extrato antigênico de T. gondii. Estes antígenos biotinilados ligados a IgG foram obtidos por sistema avidina-biotina-peroxidase. Foram 249 salivas de escolares, 47 soros e salivas da graduação e, para validação, cinquenta soros positivos e quarenta soros negativos para controle, sendo eles soros de infantes, entre 8 e 12 meses de idade. Os testes tinham reprodutibilidade maior que 98% e sensibilidade e especificidade maior que 95%. Detectamos na população de estudantes uma prevalência de toxoplasmose de 8,5% (I.C. 95% 5-11,9%), uma proteção vacinal para sarampo de 96,8% (I.C. 95% 94,6-99%), para rubéola de 59,1% (I.C. 95% 53-65%) e para caxumba de 57.5% (I.C. 95% 51,3-63,6%). Nossa abordagem foi eficiente em todos os aspectos, desde a exposição itinerante, o uso de saliva e no desenvolvimento de ensaios confiáveis para a determinação da proteção vacinal de estudantes e na prevenção da toxoplasmose. Com este conhecimento, medidas adequadas de saúde pública, como revacinação, podem ser adequadamente planejadas. / The use of safe vaccines and are a well-established public health intervention in recent years with great impact on the last of the infectious diseases. Serological control of the vaccination status and protection of a population is essential, the study alternatives for these studies. Schoolchildren are a group in which access to blood collection is problematic. Saliva may be an appropriate alternative material for children and other protected groups. The disclosure of vaccination and analysis on an extinguishment is one of the projected lectures of the community lectures of the education of Equality of Equality and, therefore, vaccine a viral vaccine or detection of T. gondii infection. In order to avoid IgG variability in saliva, we developed and validated an IgA capture assay by continuous-phase S. aureus protein A with IgG specificity revealed by the use of recombinant measles, rubella and mumps, as well as the antigenic extract of T. gondii. These biotinylated antigens linked an IgG antibody to the avidin-biotin-peroxidase system. 249 saliva from schoolchildren, 47 serums and graduation salutations and, for validation, fifty positive sera and forty negative sera for the control, being sera of infants between 8 and 12 months of age. The tests had greater reproducibility than 98% and sensitivity and specificity greater than 95%. We detected a prevalence of toxoplasmosis of 8.5% (95% CI 5-11.9%), measles vaccine protection from 96.8% (95% CI: 94.6-99%), for rubella of 59.1% % (95% CI 53-65%) and for mumps 57.5% (95% CI 51.3-63.6%). The approach was effective in all aspects, from the traveling exhibition, to the use of saliva and the development of research for the identification of temporary vaccination and the prevention of toxoplasmosis. With this knowledge, public health measures such as revaccination can be planned.

Neospora caninum é um parasito intracelular obrigatório, formador de cistos, que acomete vários animais domésticos e silvestres, tendo maior importância nas espécies canina e bovina, nas quais causa problemas nervosos e reprodutivos. Os canídeos do gênero Canis são os únicos reconhecidos como hospedeiros definitivos do N. caninum até o momento, nos quais ocorre a fase sexuada de multiplicação, resultando na eliminação de oocistos pelas fezes. Toxoplasma gondii também é um coccídio responsável por uma das zoonoses de maior importância e ocorrência em todo o mundo. A fase assexuada de desenvolvimento do T. gondii ocorre nos mamíferos e aves (hospedeiros intermediários) com formação de cistos teciduais e a fase sexuada de desenvolvimento ocorre no intestino delgado dos hospedeiros definitivos, que são os membros da família Felidae. Este estudo teve por objetivo determinar a soroprevalência de anticorpos contra Neospora spp. e T. gondii em equídeos de diferentes regiões do Brasil e o isolamento e caracterização genética destes coccídios em amostras de tecidos de equídeos. A sorologia para T. gondii e Neospora spp. foi realizada em 453 amostras de soros por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta com ponto de corte de 50 para Neospora spp e 64 para T. gondii. Deste total, oito (1,75%) amostras (sete de jumentos e um de cavalo) foram positivas para Neospora spp. e 129 (28,47%) amostras (82 jumentos, 32 cavalos e 15 mulas) para T. gondii. Para o isolamento do T. gondii foram realizados 29 bioensaios em camundongos, sendo 19 de animais soropositivos e 10 de pools de tecidos de cavalos soronegativos. Por meio dessa prova biológica, foi possível o isolamento em uma amostra de jumento (Equus asinus) de Mossoró, RN, ocorrendo a morte dos dois únicos camundongos infectados, no 16o e 17o dia pós-inoculação. A caracterização genotípica do isolado foi realizada pela PCR-RFLP utilizando 12 marcadores genotípicos. A genotipagem dessa amostra evidenciou o genótipo #60 TgCkBr220, já isolado em galinha do Arquipélago de Fernando de Noronha, PE, Brasil. O isolamento de Neospora spp em gerbilos não pode ser feito uma vez que não foi possível a obtenção de tecidos dos equídeos soropositivos. / Neospora caninum is an obligate intracellular parasite, forming cysts that affect many domestic and wild animals, having greater importance in canine and bovine species due neurological and reproductive problems. Canids of the genus Canis are recognized as the only definitive hosts of N. caninum until the moment in which sexual phase occurs multiplication, resulting in the elimination of oocysts in the feces. Toxoplasma gondii is also a coccidian parasite responsible for a zoonotic disease of great importance and occurrence around the world. The asexual developmental stage of T. gondii occurs in mammals and birds, the intermediate hosts, resulting in the formation of cysts and the sexual stage occurs in the small intestine of definitive hosts, which are the felids, occurring oocysts formation. This study aimed to determine the seroprevalence of antibodies against Neospora spp. and Toxoplasma gondii in equids from different regions of Brazil and the isolation and genetic characterization of these parasites from equids tissue. Serology for T. gondii and Neospora spp. was performed in 453 serum samples by Immunofluorescence Antibody Test (IFAT). Of this total, eight (1.75%) samples (seven of donkeys and one of horse) were positive to Neospora spp. antibodies and 129 (28.47%) samples (82 donkeys, 32 horses, 15 mules) were T. gondii seropositive. For the isolation of T. gondii, bioassay was performed in mice. A sample of one donkey (Equus asinus) from Mossoró, RN, was obtained with two of the 20 inoculated mouse infected. The mouse died at day 16th and 17th post inoculation. The genotypic characterization of the isolate was performed by PCR-RFLP using 12 genotypic markers. Genotyping showed the genotype #60 TgCkBr220, already described in chickens from Fernando de Noronha, PE, Brazil. Due the impossibility of acquisition of tissue from Neospora spp seropositive equids, isolation of this coccidian by gerbil bioassay was not possible to be done.

O uso de vacinas seguras e eficazes é uma intervenção em saúde pública bem consolidada nas últimas décadas com grande impacto na queda da prevalência das doenças infecciosas. O controle sorológico do estado vacinal e de proteção de uma população é essencial, entretanto precisamos de alternativas para estes estudos. Escolares são um grupo em que o acesso para coleta de sangue é problemático. A saliva pode ser um material alternativo perfeitamente aceitável para crianças e outros grupos protegidos. Para controle de vacinação e incidência de toxoplasmose, nós promovemos uma exposição interativa sobre higiene em escolas públicas para coletar saliva de 249 estudantes do 7º a 9º anos do ensino fundamental, de onde detectamos a prevalência de resposta IgG específica e, portanto, proteção vacinal para a vacina tríplice viral ou detecção de infecção pelo T. gondii. Para evitar a variabilidade da concentração de IgG em saliva, nós desenvolvemos e validamos um ensaio de captura de IgG por proteína A de S. aureus na fase sólida, com revelação da especificidade da IgG pelo uso de antígenos recombinantes de vírus do sarampo, rubéola e caxumba, além de extrato antigênico de T. gondii. Estes antígenos biotinilados ligados a IgG foram obtidos por sistema avidina-biotina-peroxidase. Foram 249 salivas de escolares, 47 soros e salivas da graduação e, para validação, cinquenta soros positivos e quarenta soros negativos para controle, sendo eles soros de infantes, entre 8 e 12 meses de idade. Os testes tinham reprodutibilidade maior que 98% e sensibilidade e especificidade maior que 95%. Detectamos na população de estudantes uma prevalência de toxoplasmose de 8,5% (I.C. 95% 5-11,9%), uma proteção vacinal para sarampo de 96,8% (I.C. 95% 94,6-99%), para rubéola de 59,1% (I.C. 95% 53-65%) e para caxumba de 57.5% (I.C. 95% 51,3-63,6%). Nossa abordagem foi eficiente em todos os aspectos, desde a exposição itinerante, o uso de saliva e no desenvolvimento de ensaios confiáveis para a determinação da proteção vacinal de estudantes e na prevenção da toxoplasmose. Com este conhecimento, medidas adequadas de saúde pública, como revacinação, podem ser adequadamente planejadas. / The use of safe vaccines and are a well-established public health intervention in recent years with great impact on the last of the infectious diseases. Serological control of the vaccination status and protection of a population is essential, the study alternatives for these studies. Schoolchildren are a group in which access to blood collection is problematic. Saliva may be an appropriate alternative material for children and other protected groups. The disclosure of vaccination and analysis on an extinguishment is one of the projected lectures of the community lectures of the education of Equality of Equality and, therefore, vaccine a viral vaccine or detection of T. gondii infection. In order to avoid IgG variability in saliva, we developed and validated an IgA capture assay by continuous-phase S. aureus protein A with IgG specificity revealed by the use of recombinant measles, rubella and mumps, as well as the antigenic extract of T. gondii. These biotinylated antigens linked an IgG antibody to the avidin-biotin-peroxidase system. 249 saliva from schoolchildren, 47 serums and graduation salutations and, for validation, fifty positive sera and forty negative sera for the control, being sera of infants between 8 and 12 months of age. The tests had greater reproducibility than 98% and sensitivity and specificity greater than 95%. We detected a prevalence of toxoplasmosis of 8.5% (95% CI 5-11.9%), measles vaccine protection from 96.8% (95% CI: 94.6-99%), for rubella of 59.1% % (95% CI 53-65%) and for mumps 57.5% (95% CI 51.3-63.6%). The approach was effective in all aspects, from the traveling exhibition, to the use of saliva and the development of research for the identification of temporary vaccination and the prevention of toxoplasmosis. With this knowledge, public health measures such as revaccination can be planned.