La perméabilité membranaire joue un rôle important dans la résistance aux antibiotiques chez lesbactéries à Gram négatif.L’objectif de notre travail était de caractériser la fonction tenue par les deux régulateurs globaux dela perméabilité membranaire chez Enterobacer aerogenes: mar et ram. L’objectif initial futd’identifier le répresseur spécifique de RamA qui manquait en tant qu’élément de la cascade derégulation actuellement définie. La sélection de 60 souches nous a permis de confirmer le rôlecentral joué par RamA dans la régulation, ainsi qu’identifier des mutations pouvant être critiques, auniveau de RamR. Ainsi, l’absence variations observées dans le régulon marRAB et l’expressionmodérée des transcrits montrée par qRT-PCR laisse penser, que RamA a un rôle clef dans larégulation de l’expression des porines et des pompes d’efflux chez E. aerogenes.L’autre partie de notre travail reposait sur l’étude de la translocation des antibiotiques au traversdes porines. L’étude des interactions porine-carbapénèmes s’est faite sur la porine sauvage OmpFd'Escherichia coli et deux mutations. Les résultats indiquent également l'importance de l'aspartateen position 113 dans la sélectivité de translocation des carbapénèmes au sein de la porine OmpF.Ce travail montre ainsi que la translocation des pénicillines est aussi sous la dépendance desinteractions qui se créent entre le substrat et le résidu en position 113 de OmpF et limitent alorsleur passage au niveau du canal porine. Nous avons recherché la contribution attribuée à la porineOmp36 d'E. aerogenes dans la translocation de certaines béta-lactamines. Les mesures ont permisde conclure que les deux beta-lactamin / Genetic permeability plays an important role in antibiotic resistance of Gram-negative bacteria.Our work was to characterize and better understand of the genetic regulation of membranepermeability in E. aerogenes. We focused on two global regulators, mar and ram, in about 60clinical isolates. Alterations in the upstream region of ramA and in ramR but no mutations in marAnor marR were observed. Overexpression of ramA or ramR led to an altered antibiotic susceptibilityassociated to decrease of porins expression and over-expression of efflux-pumps. qRT-PCR pointedout the estimated importance of the ram-regulon in the regulation cascade.Another part of this work was to characterize the translocation of compounds through porins andthe role of porins in drug uptake in general. Measurement of the rate of antibiotic action of threecarbapenems in an E. coli strain solely expressing OmpF as porin clearly indicated the importanceof the aspartate at position 113 in antibiotic translocation. A multi-disciplinary three way approachof computer modeling, black-lipid-bilayer assays and measurement of antibiotic action, suggestedthat interactions with residue D113 of E. coli porin OmpF are rate-limiting for transport throughthe porin channel. Combination of biological and biophysical measurements with E. aerogenesporin Omp36 denoted that interactions between the porin channel and the antibiotic facilitate andaccelerate transport.

Le but de ce travail est d’étudier le lien suspecté entre l’inflammation buccale et la survenue des AVC ischémiques. Dans les pays occidentaux, l’incidence des infarctus cérébraux est en augmentation malgré les campagnes de prévention visant à limiter l’exposition aux facteurs de risque classiques des pathologies ischémiques. Près de 9% des accidents vasculaires cérébraux sont sans étiologie connue. Le facteur déclenchant de l’AVC ischémique ou le « key trigger » reste inconnu. Des études récentes montrent qu’un AVC ischémique est plus susceptible de se déclencher dans la semaine qui suit un événement infectieux. De ce fait, l’inflammation buccale entraînant une élévation de différents biomarqueurs inflammatoires est susceptible de favoriser la survenue des AVC. Dans un premier temps, une méta-analyse a été effectuée afin de faire la synthèse des données étudiant la relation entre l’inflammation buccale et la survenue des AVC. Elle a montré que le risque d’avoir un AVC ischémique fatal augmente de 38% chez les sujets atteints de parodontite sévère. Dans un deuxième temps, deux études cliniques observationnelles ont été mises en place afin de renforcer la validité des liens épidémiologiques supposés et d’apporter de nouveaux éléments dans la compréhension des mécanismes physiopathologiques liant l’inflammation buccale et la survenue des AVCI. Les résultats montrent une relation entre le degré d’inflammation buccale et les marqueurs biologiques athéromateux et inflammatoires. En effet, nos résultats montrent une augmentation des taux de CRP, de VLDL, de triglycérides et une diminution des taux de HDL lors d’une atteinte parodontale sévère. C’est la perte osseuse parmi les marqueurs cliniques de l’inflammation buccale aisément évaluable sur un panoramique dentaire, qui est la plus significativement liée au risque de la survenue des AVC ischémiques. Les résultats de cette thèse suggèrent que la présence d’un contexte buccal inflammatoire favoriserait la survenue le développement d’un AVCI. En outre, nos résultats confirment la nécessité d’une coopération entre l’odontologue et le neurologue afin d’améliorer la prise en charge du risque vasculaire chez un patient ayant un AVCI avec une inflammation buccale. / The aim of this work is to investigate the suspected link between oral inflammation and the occurrence of ischemic stroke. In Western countries, the incidence of ischemic stroke is rising despite prevention campaigns aiming at limiting the exposure to common risk factors for ischemic diseases. Nearly 9% of strokes are of unknown etiology. The triggering factor for ischemic stroke or "trigger key" remains unknown. Recent studies have shown that ischemic stroke is more likely to occur in the week following an infectious event. Therefore, oral inflammation, that causes a rise in various inflammatory biomarkers is studied as potentially increasing the risk of stroke. Firstly, a meta-analysis was performed to synthesize data about the relationship between oral inflammation and the occurrence of stroke. It has shown that the risk of fatal ischemic stroke increases by 38% in patients with severe periodontitis. Secondly, two observational clinical studies have been implemented to strengthen the validity of the supposed epidemiological links and bring new elements in our understanding about the pathophysiological mechanisms linking oral inflammation and the occurrence of ischemic stroke. The results show a proportional relationship between the degree of oral-inflammation and biological assessments that demonstrate pro-atherosclerotic and pro-inflammatory state. Indeed, we observe an increase in CRP levels, VLDL triglycerides and a decrease in HDL in patients with severe periodontal disease. Bone loss, that is easily measurable on a dental panoramic radiograph, appears to be the main risk factor of the occurrence of ischemic stroke.The results of this thesis show that the presence of an inflammatory oral environment is an additional marker for the discovery of a cardiovascular risk in patients combining other conventional risk factors of ischemic stroke. In addition, our results suggest the need for cooperation between the neurologists and odontologists to improve the management of cardiovascular risk in patients with ischemic stroke and oral inflammation.

MSc (Microbiology) / Department of Microbiology / Background: The high on-going incidences of infectious diseases, specifically those caused by multi-drug resistant bacteria in the last decade has made it a necessity to investigate a variety of antimicrobial drug sources, such as plants. Medicinal plants have played a significant role in drug discovery for western pharmaceuticals recently and have also been used successfully by traditional healers and herbalists to treat various infectious diseases for centuries. Currently, a few medicinal plants are commercialized, reason being most medicinal plants phytochemicals have not been studied yet, although they have been traditionally used by healers. Due to the constant development of multi-drug resistance of bacteria to antibiotics, S. africana extracts can provide an opportunity to finding new antibacterial compounds that can be used as the foundation for formulating new antimicrobial drugs. Objectives: The aim of this study was to screen antibacterial activity of the crude extract and fractions of S. africana against multi-drug resistant bacteria and to also evaluate other biological properties. Methods: Preliminary screening of phytochemical constituents of S. africana and fractions was done using standard qualitative and quantitative methods. Antibacterial activity of the extracts was evaluated using the agar well diffusion method and the microdilution assay against MDR bacterial strains. Antioxidant activities of the MCE and its fractions were measured by DPPH and reducing power assays, and the toxicity of the MCE and its fractions was tested on Vero cells using Cell-based high content screening assay. Results: Phytochemical analysis of the MCE and fractions obtained in this study showed the presence of phenolics, flavonoids, alkaloids, steroids, saponins, cardiac glycosides and terpenoids in most of S. african’s test samples. Fraction F1 and F2 both lacked alkaloids and saponins. The micro-plate dilution assay demonstrated that the MCE and all its fractions can inhibit the growth of all selected MDR bacterial strains tested against at different concentrations (0.1mg/ml to >12.5mg/ml), wherein the lowest MIC averages were obtained from fractions F3 and F6, with 0.59 mg/ml and 0.71 mg/ml MIC averages respectively. Contrary to the micro-plate dilution assay, the well diffusion assay demonstrated that MCE and all its fractions were not active against all the selected MDR bacterial strains tested against, as no inhibition was shown against the growth of K. pneumonia by any of S. african’s test samples. For DPPH assay, the IC50 of S. african’s test samples ranged between 0.01 ±0.34 mg/ml to 0.62 ± 0.05 mg/ml, whiles for the reducing power assay, EC50 measured ranged between 0.61 ± 0.01 mg/ml and 11.30 ± 0.04 mg/ml. The MCE and fraction F2 exhibited the highest toxicity to Vero cells. Conclusion: The MCE and fractions of the plant S. africana have antibacterial activity against MDR bacterial strains, beneficial biological properties and contains potential antibacterial compounds that may be valuable in the discovery of new potential drugs for treatment of infectious diseases / NRF

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Les systèmes d’efflux tripartite de type Resistance, Nodulation and cell-Division (RND) sont essentiels dans le maintien de phénotypes de résistance multidrogues et contre les métaux lourds dans nombreuses bactéries Gram-négatives. Le transport de ces composés toxiques hors de la cellule est permis par l’assemblage d’une protéine de type antiporteur cation/proton (unité RND) insérée dans la membrane interne, connectée à une protéine insérée dans la membrane externe, pour former un canal de sorti qui traverse l’entièreté de l’enveloppe cellulaire. Le troisième composant du système, la protéine de type membrane fusion protein (MFP) qui est aussi appelée periplasmic adaptor protein (PAP), est requis pour permettre l’assemblage de tout ce complexe à trois composants. Cependant, les MFPs sont supposées jouer un rôle important et actif dans le mécanisme d’efflux du substrat. Pour mieux comprendre le rôle des MFPs au sein des systèmes d’efflux de type RND, nous avons étudié les protéines ZneB (précédemment appelée HmxB) et SilB, les composants périplasmiques des systèmes ZneCBA et SilABC responsables de la résistance aux métaux lourds chez Cupriavidus metallidurans CH34. Nous avons identifié la spécificité de liaison au substrat de ces protéines, montrant leur capacité à fixer le zinc (ZneB), ou le cuivre et l’argent (SilB). De plus, nous avons résolu la structure cristalline de ZneB à une résolution de 2.8 Å dans la forme apo- et avec un ion zinc fixé. La structure de ZneB possède une architecture générale composée de quatre domaines caractéristiques des MFPs, et la présence du site de coordination au zinc dans une région très flexible à l’interface des domaines β-barrel et membrane proximal. Les modifications structurales que la protéine subit lors de la fixation du zinc on été observée dans le cristal mais aussi en solution, ce qui suggère un rôle actif des MFPs dans le mécanisme d’efflux des métaux, vraisemblablement via la fixation et le relargage de l’ion à l’antiporteur. Les études de sélectivité de transport des antiporteurs ZneA et SilA montre que ces dernières et leurs protéines périplasmiques respectives ont des affinités similaires pour les métaux lourds. De plus, les études de transport ont apportés des arguments en faveur de l’hypothèse de capture cytoplasmique du substrat par l’antiporteur, tandis que la capacité des protéines périplasmiques à fixer les métaux lourds a apporté des arguments en faveur de l’hypothèse de capture périplasmique du substrat par l’antiporteur. Les deux modes de capture pourraient en réalité coexister ;cependant, le débat autour du compartiment cellulaire de capture du substrat par l’antiporteur est complexe et requiert de plus amples efforts afin d’être cerné. / Tripartite resistance nodulation cell division (RND)-based efflux complexes are paramount for multidrug and heavy metal resistance in numerous Gram-negative bacteria. The transport of these toxic compounds out of the cell is driven by the inner membrane proton/substrate antiporter (RND protein) connected to an outer membrane protein to form an exit duct that spans the entire cell envelope. The third component, a membrane fusion protein (MFP) also called periplasmic adaptor protein, is required for the assembly of this complex. However, MFPs are also proposed to play an important active role in substrate efflux. To better understand the role of MFPs in RND-driven efflux systems, we studied ZneB (formerly HmxB) and SilB, the MFP components of the ZneCAB and SilABC heavy metal RND-driven efflux complexes from Cupriavidus metallidurans CH34. We have identified the substrate binding specificity of the proteins, showing their ability to selectively bind zinc (ZneB), or copper and silver cations (SilB). Moreover, we have solved the crystal structure of the apo- and the metal-bound forms of ZneB to 2.8 Å resolution. The structure of ZneB displays a general architecture composed of four domains characteristic of MFPs, and it reveals the metal coordination site at the very flexible interface between the β-barrel and the membrane proximal domains. Structural modifications of the protein upon zinc binding were observed in both the crystal structure and in solution, suggesting an active role of MFPs in substrate efflux possibly through binding and release. The selectivity assays of the antiporter proteins ZneA and SilA demonstrated similar specificities in relation to their cognate MFPs toward heavy metal cations. Moreover, antiporter transport assays provide evidence for cytoplasmic substrate capture by this protein, whereas MFP substrate binding provides evidence for periplasmic substrate capture. Therefore, both modes of capture might co-exist; nevertheless, the substrate capture issue is a complex topic still needing consequent efforts to understand it. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished