A determinação da concentração de ferro hepático (CFH) possui importantes implicações no diagnóstico clínico e na pesquisa dos estados de sobrecarga de ferro. O método de escolha para a quantificação de ferro hepático é a espectroscopia por absorção atômica (EAS), e a sua disponibilidade é restrita a centros de referência. Geralmente, são utilizados fragmentos de tecido hepático fresco obtidos por biópsias. Uma alternativa de grande interesse na prática clínica é a utilização de tecido conservado em parafina. O presente estudo teve como objetivos desenvolver e validar uma metodologia para a quantificação de ferro no tecido hepático através da EAS, e comparar a CFH em amostras de tecido hepático fresco e naquelas conservadas em parafina. A pesquisa foi desenvolvida em duas fases. Primeiramente, foram feitos experimentos para a validação do método, utilizando solução-padrão de ferro e padrão de referência para fígado bovino, do National Institute of Standards and Technology (NIST). Foram avaliados os seguintes parâmetros analíticos, seguindo-se as diretrizes de validação da International Conference on Harmonization (ICH): linearidade, exatidão e precisão (repetibilidade de injeções, precisão intra-dia e entre-dias). A 2ª fase consistiu em um estudo comparativo entre a CFH em tecido hepático bovino fresco liofilizado e tecido conservado em parafina; os fragmentos foram obtidos por biópsias "em cunha". As análises bioquímicas foram realizadas por espectrofotômetro de absorção atômica Perkin- Elmer, modelo Analyst-300, com forno de grafite. Os resultados observados mostraram uma excelente linearidade do método para a faixa de concentração entre 20 e 120 ppb, obtendo-se um coeficiente de determinação médio de 0,99. O desvio-padrão relativo (DPR) foi inferior a 15% para a exatidão, e inferior a 10% para a precisão entre-dias e para a precisão intra-dia. A precisão da repetibilidade de injeções foi 0,65%. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os valores da CFH nos grupos de tecido hepático fresco e de tecido conservado em parafina (p=0,2). Os achados do presente estudo permitem concluir que a quantificação de ferro no tecido hepático encontra-se validada, e que é possível realizar este método utilizando tecido hepático bovino fresco liofilizado. Além disso, a comparação entre a CFH em fragmentos de tecido hepático fresco e em amostras desparafinadas permite concluir que o método pode ser utilizado de forma confiável e reprodutível para a quantificação de ferro hepático em amostras estocadas em bloco de parafina. / Determination of hepatic iron concentration (HIC) has important diagnostic and research implications on iron overload states. Atomic absorption spectroscopy (AAS) is considered the method of choice, and it is only available in selected institutions. Usually, measurement of hepatic iron content is performed on fresh tissue. An important practical issue is the possibility to use paraffin-embedded tissue for this purpose. The objectives of this study were to validate hepatic iron quantitation by AAS at our setting in Brazil, and to compare HIC between fresh and paraffin-embedded tissue. The study was performed in two different phases. First, method validation was performed using the National Institutes of Standards & Technology standard reference material 1577b (bovine liver), following the guidelines of the International Conference on Harmonization (ICH). Bioanalytical procedures were performed to evaluate linearity, precision and accuracy. Biochemical analysis were performed at a Perkin-Elmer spectrometer, model Analyst-300, with graphite-furnace. In the second phase of the study, surgical biopsy samples were obtained from bovine liver and divided in two different groups (fresh tissue or paraffin-embedded tissue) for further measurement of hepatic iron content. We found an excellent correlation on the method's linearity for the concentration range between 20 and 120 parts per billion (ppb) - average r² = 0,99. The relative standard deviations (RSD) were bellow 15% for accuracy, and below 10 % for both day-to-day reproducibility and within-days precision. HIC values were similar in both fresh and deparaffinized tissue, as analysed by paired Student's t Test (p=0,2). We conclude that the determination of HIC by AAS was validated by the present study, and that it is possible to perform iron quantitation on fresh bovine liver tissue. Comparative analysis also suggest that accurate hepatic iron quantitation of deparaffinized liver tissue is possible at our setting.

A determinação da concentração de ferro hepático (CFH) possui importantes implicações no diagnóstico clínico e na pesquisa dos estados de sobrecarga de ferro. O método de escolha para a quantificação de ferro hepático é a espectroscopia por absorção atômica (EAS), e a sua disponibilidade é restrita a centros de referência. Geralmente, são utilizados fragmentos de tecido hepático fresco obtidos por biópsias. Uma alternativa de grande interesse na prática clínica é a utilização de tecido conservado em parafina. O presente estudo teve como objetivos desenvolver e validar uma metodologia para a quantificação de ferro no tecido hepático através da EAS, e comparar a CFH em amostras de tecido hepático fresco e naquelas conservadas em parafina. A pesquisa foi desenvolvida em duas fases. Primeiramente, foram feitos experimentos para a validação do método, utilizando solução-padrão de ferro e padrão de referência para fígado bovino, do National Institute of Standards and Technology (NIST). Foram avaliados os seguintes parâmetros analíticos, seguindo-se as diretrizes de validação da International Conference on Harmonization (ICH): linearidade, exatidão e precisão (repetibilidade de injeções, precisão intra-dia e entre-dias). A 2ª fase consistiu em um estudo comparativo entre a CFH em tecido hepático bovino fresco liofilizado e tecido conservado em parafina; os fragmentos foram obtidos por biópsias "em cunha". As análises bioquímicas foram realizadas por espectrofotômetro de absorção atômica Perkin- Elmer, modelo Analyst-300, com forno de grafite. Os resultados observados mostraram uma excelente linearidade do método para a faixa de concentração entre 20 e 120 ppb, obtendo-se um coeficiente de determinação médio de 0,99. O desvio-padrão relativo (DPR) foi inferior a 15% para a exatidão, e inferior a 10% para a precisão entre-dias e para a precisão intra-dia. A precisão da repetibilidade de injeções foi 0,65%. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os valores da CFH nos grupos de tecido hepático fresco e de tecido conservado em parafina (p=0,2). Os achados do presente estudo permitem concluir que a quantificação de ferro no tecido hepático encontra-se validada, e que é possível realizar este método utilizando tecido hepático bovino fresco liofilizado. Além disso, a comparação entre a CFH em fragmentos de tecido hepático fresco e em amostras desparafinadas permite concluir que o método pode ser utilizado de forma confiável e reprodutível para a quantificação de ferro hepático em amostras estocadas em bloco de parafina. / Determination of hepatic iron concentration (HIC) has important diagnostic and research implications on iron overload states. Atomic absorption spectroscopy (AAS) is considered the method of choice, and it is only available in selected institutions. Usually, measurement of hepatic iron content is performed on fresh tissue. An important practical issue is the possibility to use paraffin-embedded tissue for this purpose. The objectives of this study were to validate hepatic iron quantitation by AAS at our setting in Brazil, and to compare HIC between fresh and paraffin-embedded tissue. The study was performed in two different phases. First, method validation was performed using the National Institutes of Standards & Technology standard reference material 1577b (bovine liver), following the guidelines of the International Conference on Harmonization (ICH). Bioanalytical procedures were performed to evaluate linearity, precision and accuracy. Biochemical analysis were performed at a Perkin-Elmer spectrometer, model Analyst-300, with graphite-furnace. In the second phase of the study, surgical biopsy samples were obtained from bovine liver and divided in two different groups (fresh tissue or paraffin-embedded tissue) for further measurement of hepatic iron content. We found an excellent correlation on the method's linearity for the concentration range between 20 and 120 parts per billion (ppb) - average r² = 0,99. The relative standard deviations (RSD) were bellow 15% for accuracy, and below 10 % for both day-to-day reproducibility and within-days precision. HIC values were similar in both fresh and deparaffinized tissue, as analysed by paired Student's t Test (p=0,2). We conclude that the determination of HIC by AAS was validated by the present study, and that it is possible to perform iron quantitation on fresh bovine liver tissue. Comparative analysis also suggest that accurate hepatic iron quantitation of deparaffinized liver tissue is possible at our setting.

A determinação da concentração de ferro hepático (CFH) possui importantes implicações no diagnóstico clínico e na pesquisa dos estados de sobrecarga de ferro. O método de escolha para a quantificação de ferro hepático é a espectroscopia por absorção atômica (EAS), e a sua disponibilidade é restrita a centros de referência. Geralmente, são utilizados fragmentos de tecido hepático fresco obtidos por biópsias. Uma alternativa de grande interesse na prática clínica é a utilização de tecido conservado em parafina. O presente estudo teve como objetivos desenvolver e validar uma metodologia para a quantificação de ferro no tecido hepático através da EAS, e comparar a CFH em amostras de tecido hepático fresco e naquelas conservadas em parafina. A pesquisa foi desenvolvida em duas fases. Primeiramente, foram feitos experimentos para a validação do método, utilizando solução-padrão de ferro e padrão de referência para fígado bovino, do National Institute of Standards and Technology (NIST). Foram avaliados os seguintes parâmetros analíticos, seguindo-se as diretrizes de validação da International Conference on Harmonization (ICH): linearidade, exatidão e precisão (repetibilidade de injeções, precisão intra-dia e entre-dias). A 2ª fase consistiu em um estudo comparativo entre a CFH em tecido hepático bovino fresco liofilizado e tecido conservado em parafina; os fragmentos foram obtidos por biópsias "em cunha". As análises bioquímicas foram realizadas por espectrofotômetro de absorção atômica Perkin- Elmer, modelo Analyst-300, com forno de grafite. Os resultados observados mostraram uma excelente linearidade do método para a faixa de concentração entre 20 e 120 ppb, obtendo-se um coeficiente de determinação médio de 0,99. O desvio-padrão relativo (DPR) foi inferior a 15% para a exatidão, e inferior a 10% para a precisão entre-dias e para a precisão intra-dia. A precisão da repetibilidade de injeções foi 0,65%. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os valores da CFH nos grupos de tecido hepático fresco e de tecido conservado em parafina (p=0,2). Os achados do presente estudo permitem concluir que a quantificação de ferro no tecido hepático encontra-se validada, e que é possível realizar este método utilizando tecido hepático bovino fresco liofilizado. Além disso, a comparação entre a CFH em fragmentos de tecido hepático fresco e em amostras desparafinadas permite concluir que o método pode ser utilizado de forma confiável e reprodutível para a quantificação de ferro hepático em amostras estocadas em bloco de parafina. / Determination of hepatic iron concentration (HIC) has important diagnostic and research implications on iron overload states. Atomic absorption spectroscopy (AAS) is considered the method of choice, and it is only available in selected institutions. Usually, measurement of hepatic iron content is performed on fresh tissue. An important practical issue is the possibility to use paraffin-embedded tissue for this purpose. The objectives of this study were to validate hepatic iron quantitation by AAS at our setting in Brazil, and to compare HIC between fresh and paraffin-embedded tissue. The study was performed in two different phases. First, method validation was performed using the National Institutes of Standards & Technology standard reference material 1577b (bovine liver), following the guidelines of the International Conference on Harmonization (ICH). Bioanalytical procedures were performed to evaluate linearity, precision and accuracy. Biochemical analysis were performed at a Perkin-Elmer spectrometer, model Analyst-300, with graphite-furnace. In the second phase of the study, surgical biopsy samples were obtained from bovine liver and divided in two different groups (fresh tissue or paraffin-embedded tissue) for further measurement of hepatic iron content. We found an excellent correlation on the method's linearity for the concentration range between 20 and 120 parts per billion (ppb) - average r² = 0,99. The relative standard deviations (RSD) were bellow 15% for accuracy, and below 10 % for both day-to-day reproducibility and within-days precision. HIC values were similar in both fresh and deparaffinized tissue, as analysed by paired Student's t Test (p=0,2). We conclude that the determination of HIC by AAS was validated by the present study, and that it is possible to perform iron quantitation on fresh bovine liver tissue. Comparative analysis also suggest that accurate hepatic iron quantitation of deparaffinized liver tissue is possible at our setting.

Orientador : Profª. Drª. Silvia Maria Suter Correia Cadena / Coorientador : Prof. Dr. Attilio di Pietro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 16/10/2015 / Inclui referências: fls.138-150 / Resumo: O carcinoma hepatocelular (CHC) possui uma alta taxa de mortalidade e apenas um quimioterápico, com eficiência limitada, está disponível para seu tratamento. Buscando potenciais drogas para o tratamento do CHC, neste estudo foram avaliados os efeitos de derivados 1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos (MI-D, MI-J, MI-F e MI-2,4diF) em células de hepatocarcinoma humano (HepG2) e em hepatócitos de rato em cultura. A viabilidade das células HepG2, avaliada pelo método do MTT, foi reduzida em ~50% pelos derivados (25 ?M para MI-J, MI-F, MI-2,4diF e 50 ?M para MI-D - 24h). Esta citotoxicidade foi confirmada pelo aumento da atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH) no meio extracelular, em ? 55, 24 e 16% após incubação com MI-D, MI-J e MI-F (25 ?M - 24 h), respectivamente. Nestas condições, análises por citometria de fluxo mostraram um aumento no número de células marcadas com anexina V e iodeto de propídio, de ?11, 76, 25 e 25 para MI-D, MI-J, MI-F e MI-2,4diF, respectivamente. O aumento na fragmentação do DNA também foi observado, em ?12, 9 e 8% para MI-J, MI-F e MI-2,4diF, respectivamente. Alterações morfológicas características de indução de apoptose foram observadas após incubação com todos os derivados (3h - 5 ?M). Nenhuma citotoxicidade foi observada quando células não-tumorais (hepatócitos de ratos) foram tratadas com os compostos na concentração de 25 ?M por 24 h. Neste estudo também se investigou a interação destes derivados com os principais transportadores responsáveis pela resistência aos tratamentos quimioterápicos: Pgp, ABCG2 e MRP1. MI-D, MI-4F e MI-2,4diF foram substratos de Pgp (RR= 2,4; 2,8 e 5,2), cuja atividade transportadora foi inibida por MI-J (? 13% - 30min). Todos os derivados inibiram tanto a atividade de ABCG2 (? 37, 21, 12 e 18 % para MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF - 30min) quanto de MRP1 (? 8, 36, 10 e 20% para MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF -30min). Ainda neste estudo, novos inibidores de ABCG2 foram desenvolvidos através de substituições apropriadas nos anéis do núcleo indeno[1,2-b]indol. Foram obtidos potentes inibidores de ABCG2 (4c, 4h, 4i, 4j, 4k - IC50= 0,21-0,49 ?M - N5 = fenetila) ou da caseína quinase II (CK2) (4a, 4p, 4e - IC50= 0,0025-0,36 ?M N5 = isopropila) quando o núcleo cetônico indeno[1,2-b]indol foi utilizado. Os derivados 4h, 4j, 4l e 4d apresentaram baixa citotoxicidade intrínseca (IG50 28-100 ?M), o que resultou em índices terapêuticos (IT) aceitáveis para utilização em modelos in vivo (IT= 98-430), entretanto, 4h, 4j, 4k não foram seletivos em relação à atividade inibitória em MRP1 (44, 87 e 86% - 10 ?M). A utilização de um núcleo fenólico indeno[1,2-b]indol resultou em inibidores com maior potência (5c, 5f, 5h- IC50= 0,15-0,16 ?M) e seletividade em CK2, Pgp e MRP1. Baixa citotoxicidade intrínseca (5c, 5f, 5h- IG50= 42-54 ?M) e alto IT (267-360) também foram encontrados. A partir dos resultados obtidos, conclui-se que derivados 1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos e indeno[1,2-b]indóis fenólicos são candidatos promissores para futuras investigações in vivo visando o tratamento do CHC e a quimiosensibilização de tumores superexpressando ABCG2, respectivamente. Palavras-chave: Carcinoma hepatocelular. Células HepG2. Cultura primária de hepatócitos. Derivados 1,3,4-tiadiazóis mesoiônicos. Derivados indeno[1,2-b]indóis. Inibidores de ABCG2. / Abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) has a high mortality rate and only one chemotherapy drug is available for its treatment, which has limited efficacy. Aiming to find potential drugs for HCC treatment, in this study the effects of 1,3,4-thiadiazolium mesoionic derivatives (MI-D, MI-J, MI-F and MI-2,4diF) were evaluated on human hepatocellular carcinoma cells (HepG2) and primary rat hepatocytes. The viability of HepG2 was reduced by ~ 50% after treatment with derivatives (25 ?M for MI-J, MI-F and MI-2,4diF and 50 ?M for MI-D- 24h), as shown by MTT assay. The cytotoxicity was confirmed by the increase of lactate dehydrogenase (LDH) in cells supernatant at 55, 24 and 16% for MI-J, MI-4F and MI-2,4diF, respectively (at 25 ?M after 24 h). Under same conditions, all compounds increased the number of cell doubly-stained with annexin V and PI (76% for MI-J, 25% for MI-4F and MI-2,4diF, and 11% for MI-D), as demonstrated by flow cytometry. DNA fragmentation was also observed upon MI-J, MI-4F and MI-2,4diF treatment (by 12%, 9% and 8%, respectively). Morphological features of apoptosis induction were observed after incubation with all derivatives (3h - 5 ?M). It was not observed cytotoxicity when non-tumor hepatocytes were treated with derivatives (25 ?M - 24h). This study also investigated the interaction of these derivatives with the main transporters related to chemotherapy resistance: Pgp, ABCG2 and MRP1. MI-D, MI-4F e MI-2,4diF were Pgp substrates (RR = 2.4; 2.8 and 5.2), and MI-J inhibited the transporter activity of Pgp by 13% (30 min). All derivatives inhibited both ABCG2 (by ? 37, 21, 12 and 18 % for MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF - 30min) and MRP1(? 8, 36, 10 and 20% for MI-D, MI-J, MI-4F e MI-2,4diF - 30min) transporter activity. New ABCG2 inhibitors were developed through substitutions in indeno[1,2-b]indoles scaffold. Potent ABCG2 (4c, 4h, 4i, 4j, 4k - IC50= 0.21-0.49 ?M - N5 = phenethyl) or casein kinase II (CK2) (4a, 4p, 4e - IC50= 0.0025-0.36 ?M N5 = isopropyl) inhibitors were obtained with a cetonic indeno[1,2-b]indoles scaffold. The derivatives 4j, 4l and 4d showed low intrinsic cytotoxicity (IG50 28-100 ?M), resulting in therapeutic ratio (TR) suitable for use on in vivo models (TR = 98-430). However, the derivatives 4h, 4j, 4k were not selective to ABCG2, also inhibiting MRP1 activity (44, 87 e 86% - 10 ?M). The derivatives of phenolic indeno[1,2-b]indoles were more potent (5c, 5f, 5h- IC50= 0.15-0.16 ?M) and selective to ABCG2 than cetonic derivatives. Low intrinsic cytotoxicity (5c, 5f, 5h- IG50= 42-54 ?M) and high TR (267-360) were also observed. These results suggest that 1,3,4-thiadiazolium mesoionic derivatives and indeno[1,2-b]indoles are promising candidates for future investigations on in vivo, targeting HCC treatment and chemosensitization of tumors overexpressing ABCG2, respectively. Keywords: Hepatocellular carcinoma. HepG2 cells. Primary rat hepatocytes. 1,3,4-thiadiazolium mesoionic derivatives. Indeno[1,2-b]indoles derivatives. ABCG2 inhibitors.

O transplante de hepatócitos é uma modalidade terapêutica atrativa para as doenças hepáticas, assim como uma alternativa para o transplante hepático. O objetivo do presente estudo é investigar a efetividade do transplante de hepatócitos de ratos nos modelos de hepatotoxicidade aguda induzida por paracetamol (1g/kg e 1,5g/kg). Os hepatócitos foram isolados de ratos Wistar machos e transplantados 24 horas após em receptoras fêmeas com hepatotoxicidade de 1g/kg. Os ratos fêmeas receberam 1x107 hepatócitos (grupo 1, n=20) ou PBS (grupo 2, n=24) através da veia porta ou no baço. A análise de sobrevida em 3 dias demonstrou que todos os animais do grupo 1 sobreviveram, enquanto 5 animais do grupo 2 morreram (P=0,03), todas as mortes ocorreram nos ratos que receberam PBS através da veia porta (P=0,001). Os níveis de alanina aminotransferase e fator V que foram medidos no experimento não mostraram diferença entre o grupo 1 e o grupo 2 em nenhum momento. A análise molecular e a histologia mostraram a presença de hepatócitos no fígado de animais transplantados através da veia porta ou pelo baço. O modelo de hepatotoxicidade aguda induzida por paracetamol (1g/kg) demonstrou que o transplante de hepatócitos de ratos aumenta a sobrevida quando o local de injeção é na veia porta. No modelo de hepatotoxicidade aguda induzida por paracetamol (1,5g/kg), os hepatócitos foram isolados de ratos Wistar machos, e transplantados 6 horas após em receptoras fêmeas. Os ratos fêmeas receberam 1x107 hepatócitos (grupo 1, n=33) ou PBS (grupo 2, n=24) no baço. A análise de sobrevida em 3 dias demonstrou que 9 animais do grupo 1, e 9 animais do grupo 2 morreram no dia 2. Não houve diferença estatística significativa na análise de sobrevida entre o grupo 1 e o grupo 2. Nossos dados demonstram que o isolamento de hepatócitos é um procedimento factível. O transplante de hepatócitos é uma técnica que pode ser aplicada em modelos animais de IHA levando ao aumento da sobrevida. Entretanto, o modelo utilizado no presente estudo apresentou um alto grau de variabilidade, tornando necessária a avaliação do transplante de hepatócitos em um modelo mais reprodutível. / Hepatocyte transplantation is an attractive therapeutic modality for liver disease as an alternative for liver transplantation. The aim of the current study was to investigate the effectiveness of rat hepatocyte transplantation in the acetaminophen-induced acute hepatotoxicity models (1g/kg and 1,5g/kg). Hepatocytes were isolated from male Wistar rats and transplanted 24 hours later in female recipients with hepatotoxicity of 1g/kg of acetaminophen. Female rats received either 1x107 hepatocytes (group1, n=20) or PBS (group 2, n=24) through the portal vein or into the spleen. Survival analyses in 3 days showed that all animals from group 1 survived, whereas 5 rats from group 2 died (P=0.03), all deaths occurred in rats that received PBS into the portal vein (P=0.001). Alanine aminotransferase and factor V levels measured within the experiment did not differ between groups 1 and 2 at any time point. Molecular analysis and histology showed presence of hepatocytes in liver of transplanted animals injected either through portal vein or spleen. Our data in acetaminophen-induced hepatotoxicity model (1g/kg) demonstrate that rat hepatocyte transplantation increases survival when the site of injection is into portal vein in this hepatotoxicity model. In the acetaminophen-induced acute hepatotoxicity model (1,5g/kg), hepatocytes were isolated from male Wistar rats and transplanted 6 hours later in female recipients. Female rats received either 1x107 hepatocytes (group1, n=33) or PBS (group 2, n=24) into the spleen. Survival analyses in 3 days showed that 9 rats from group 1 and 9 rats from group 2 died at day 2. There was no statistical significance in survival between group 1 and group 2. Our data demonstrate that hepatocyte isolation is a feasible procedure. Hepatocyte transplantation can be used in animal models of acute liver failure increasing survival. The model of the present study show a higher variability, therefore it´s necessary to evaluate hepatocyte transplantation in a more reproducible model.

OBJETIVO: Examinar o efeito do meio condicionado da linhagem HepG2 nas célulastronco mesenquimais in vitro no que se refere à sua diferenciação em hepatócito. MATERIAIS E MÉTODOS: As CTM foram isoladas da medula óssea de ratas Wistar combinando a centrifugação por gradiente de densidade e a aderência à superfície de cultivo. As CTM foram cultivadas em meio de diferenciação osteogênico e adipogênico e coradas com Alizarin Red S e Oil Red-O respectivamente. Para induzir a diferenciação hepática, CTM foram cultivadas com 70% de meio condicionado de HepG2 ou com 50 ng/mL de fator de crescimento de hepatócito (HGF) durante 3 semanas. Foram realizadas RT-PCR e analises imunocitoquímica para marcadores de células-tronco (Thy-1) e marcadores hepáticos como ALB, AFP, CK-8 e CK-18. Adicionalmente foram realizadas colorações de Oil Red-O em CTM tratadas com meio condicionado de HepG2. RESULTADOS: Combinando a centrifugação por gradiente de densidade com a aderência à superfície de contacto, isolamos uma população homogênea de CTM nas quais as colorações de Alizarin Red S e Oil Red-O foram positivas quando tratadas. Logo de 3 semanas de tratamento, com meio condicionado de HepG2 ou HGF, não foram observados câmbios morfológicos nem expressão gênica (RT-PCR ou análise imunocitoquímica) para proteínas hepáticas (AFP, ALB, CK8 e CK18). A expressão de Thy-1 foi positivo antes e depois do tratamento em ambos grupos. Surpreendentemente as CTM tratadas com meio condicionado de HepG2 apresentaram acúmulos de lipídeos perinucleares corados com Oil Red-O. Estes acúmulos de gordura foram distintos às observados nas CTM tratadas com meio adipogênico, mas seu fenótipo foi similar às células HepG2 quando coradas com o mesmo método. CONCLUSÕES: Apesar de que o meio condicionado de HepG2 não foi capaz de induzir a diferenciação de CTM a hepatócitos, ele tem algum efeito sobre as CTM conduzindo a um fenótipo que se assemelha a uma esteatose microgoticular. / AIM: In the present study, we examined the effect of conditioned medium from the HepG2 cell line upon mesenchymal stem cells and their ability to differentiate into hepatocyte-like cells in vitro. METHODS: MSCs were isolated from bone marrow of Wistar rats by combining gradient density centrifugation with plastic adherence. The cells were cultured in osteogenic or adipogenic differentiation medium and analyzed by Alizarin Red S and Oil Red-O staining. To induce hepatic differentiation, MSC were cultured with 70% of HepG2-CM or with 50 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) for 3 weeks. RT-PCR and immunocytochemistry analysis for the stem cell marker Thy-1 and hepatic markers, ALB, AFP, CK-8 and CK-18 were performed. In addition, Oil Red-O and Alizarin Red S staining were also performed in the MSC treated with HepG2-CM. RESULTS: By combining gradient density centrifugation with plastic adherence, we isolated a homogeneous population of MSC and differentiated them into osteocytes and adipocytes. After 3 weeks of treatment no changes in morphology were observed in either group (HepG-CM or HGF). RT-PCR and antibody staining for hepatic proteins (AFP, ALB, CK8 and CK18) were also negative. Expression of Thy-1, a marker of mesenchymal stem cell was positive both before and after treatment in both groups. Surprisingly MSC treated with HepG2-CM for 3 weeks presented lipid droplets that were stained with Oil Red-O. These droplets were very distinct from the ones observed in MSC treated with adipogenic medium but resembled those seen in HepG2 cells stained by the same method. CONCLUSIONS: However, HepG2-CM was not able to induce differentiation of MSC in a hepatocyte-like, they had an effect upon MSC leading to a phenotype resembling mild steatosis.

Introdução: Os ovos de Zebrafish que não são fertilizados podem ser uma fonte de alimento para o peixe. O objetivo deste estudo é avaliar a influência do acesso aos ovos de Zebrafish no Índice de Massa Corporal, níveis séricos de colesterol e triglicérides e acúmulo de gordura no hepatócito. Materiais e métodos: Zebrafish adultos de ambos sexos foram divididos em dois grupos: grupo 1 com acesso livre aos próprios ovos e grupo 2 com o fundo do aquário coberto de bolas de vidro para evitar o acesso aos ovos por duas semanas. Para a coleta de sangue, ambos os grupos foram mantidos em jejum pelo período de 24 horas antes da coleta. O IMC foi medido em gramas por centímetro quadrado (g/cm²). Para coletar as amostras sanguíneas, os animais foram anestesiados e uma incisão, anterior a cauda, foi realizada para acessar a veia dorsal. Uma pipeta automática foi utilizada para coletar o sangue que foi centrifugado obtendo soro para análises. Os níveis séricos de triglicérides e colesterol foram analisados com testes colorimétricos. O fígado foi coletado para análise histológica. O n utilizado foi 4 para cada grupo. Para as análises bioquímicas foram utilizados pools de 10 peixes. Resultados: Os resultados estão expressos em média ± erro padrão. Não houve diferença significativa no IMC (grupo 1 0,037 ± 0,009 g/cm² e grupo 2 0,035 ± 0,008 g/cm²) nem nos níveis de colesterol (colesterol total: grupo 1 362 ± 73 mg/dL e grupo 2 357 ± 23 mg/dL; HDL – colesterol: grupo 1 91,22 ± 1,79 grupo 2 72,14 ± 2,89; LDL – colesterol: grupo 1 55,68 ± 10,88 grupo 2 44,18 ± 9,84 ). No entanto, houve diferença significativa nos níveis de triglicérides séricos (grupo 1 457 ± 43 mg/dL e grupo 2 292 ± 111 mg/dL P=0,03). Não foi observado acúmulo de lipídeos nos hepatócitos. Conclusões: O acesso aos próprios ovos alterou os níveis de triglicérides sem modificar os níveis de colesterol, alterar o IMC nem acumular gordura nos hepatócitos. / Introduction: The Zebrafish eggs that are not fertilized can be a food source for the fish. The aim of this study was to measure the influence of accessing eggs in Body Mass Index, cholesterol and triglycerides serum levels and lipid accumulation in hepatocyte of Zebrafish. Material and Methods: Adult Zebrafish of both genders were divided into two groups: group 1 free access to their own eggs and group 2 with the bottom of the aquarium filled with glass balls to prevent them to access their eggs for two weeks. To the blood collection, both groups were kept fasting for 24 hours before the blood collection. The body mass index (BMI) was measure in gram per square centimeter (g/cm²). To collect the blood samples, animals were anesthetized and an incision was made before the tail to access the dorsal vein. We used an automatic pipette to collect the blood. It was centrifuged and serum was obtained for analysis. Triglycerides and cholesterol seric levels were analyzed with colorimetric tests. The liver was collected to histological analysis. The n used was 4 for each group. Pools with serum of 10 animals were used to biochemical analysis. Results: The results are expressed in mean ± standard error. There was no significant difference in BMI (group 1 0,037 ± 0,009 g/cm² and group 2 0,035 ± 0,008 g/cm²) neither in cholesterol levels (total cholesterol: group 1 362 ± 73 mg/dL and group 2 357 ± 23 mg/dL; HDL – cholesterol: group 1 91,22 ± 1,79 group 2 72,14 ± 2,89; LDL – cholesterol: group 1 55,68 ± 10,88 group 2 44,18 ± 9,84 ). However, there was a significant difference in triglycerides levels (group 1 457 ± 43 mg/dL and group 2 292 ± 111 mg/dL P=0,03). Lipid accumulation was not observed in hepatocytes. Conclusion: Having access to eggs seams to influence the Zebrafish´s triglycerides serum levels without modifying the BMI and cholesterol serum levels neither lipid accumulation in hepatocytes.

OBJETIVO: Examinar o efeito do meio condicionado da linhagem HepG2 nas célulastronco mesenquimais in vitro no que se refere à sua diferenciação em hepatócito. MATERIAIS E MÉTODOS: As CTM foram isoladas da medula óssea de ratas Wistar combinando a centrifugação por gradiente de densidade e a aderência à superfície de cultivo. As CTM foram cultivadas em meio de diferenciação osteogênico e adipogênico e coradas com Alizarin Red S e Oil Red-O respectivamente. Para induzir a diferenciação hepática, CTM foram cultivadas com 70% de meio condicionado de HepG2 ou com 50 ng/mL de fator de crescimento de hepatócito (HGF) durante 3 semanas. Foram realizadas RT-PCR e analises imunocitoquímica para marcadores de células-tronco (Thy-1) e marcadores hepáticos como ALB, AFP, CK-8 e CK-18. Adicionalmente foram realizadas colorações de Oil Red-O em CTM tratadas com meio condicionado de HepG2. RESULTADOS: Combinando a centrifugação por gradiente de densidade com a aderência à superfície de contacto, isolamos uma população homogênea de CTM nas quais as colorações de Alizarin Red S e Oil Red-O foram positivas quando tratadas. Logo de 3 semanas de tratamento, com meio condicionado de HepG2 ou HGF, não foram observados câmbios morfológicos nem expressão gênica (RT-PCR ou análise imunocitoquímica) para proteínas hepáticas (AFP, ALB, CK8 e CK18). A expressão de Thy-1 foi positivo antes e depois do tratamento em ambos grupos. Surpreendentemente as CTM tratadas com meio condicionado de HepG2 apresentaram acúmulos de lipídeos perinucleares corados com Oil Red-O. Estes acúmulos de gordura foram distintos às observados nas CTM tratadas com meio adipogênico, mas seu fenótipo foi similar às células HepG2 quando coradas com o mesmo método. CONCLUSÕES: Apesar de que o meio condicionado de HepG2 não foi capaz de induzir a diferenciação de CTM a hepatócitos, ele tem algum efeito sobre as CTM conduzindo a um fenótipo que se assemelha a uma esteatose microgoticular. / AIM: In the present study, we examined the effect of conditioned medium from the HepG2 cell line upon mesenchymal stem cells and their ability to differentiate into hepatocyte-like cells in vitro. METHODS: MSCs were isolated from bone marrow of Wistar rats by combining gradient density centrifugation with plastic adherence. The cells were cultured in osteogenic or adipogenic differentiation medium and analyzed by Alizarin Red S and Oil Red-O staining. To induce hepatic differentiation, MSC were cultured with 70% of HepG2-CM or with 50 ng/mL hepatocyte growth factor (HGF) for 3 weeks. RT-PCR and immunocytochemistry analysis for the stem cell marker Thy-1 and hepatic markers, ALB, AFP, CK-8 and CK-18 were performed. In addition, Oil Red-O and Alizarin Red S staining were also performed in the MSC treated with HepG2-CM. RESULTS: By combining gradient density centrifugation with plastic adherence, we isolated a homogeneous population of MSC and differentiated them into osteocytes and adipocytes. After 3 weeks of treatment no changes in morphology were observed in either group (HepG-CM or HGF). RT-PCR and antibody staining for hepatic proteins (AFP, ALB, CK8 and CK18) were also negative. Expression of Thy-1, a marker of mesenchymal stem cell was positive both before and after treatment in both groups. Surprisingly MSC treated with HepG2-CM for 3 weeks presented lipid droplets that were stained with Oil Red-O. These droplets were very distinct from the ones observed in MSC treated with adipogenic medium but resembled those seen in HepG2 cells stained by the same method. CONCLUSIONS: However, HepG2-CM was not able to induce differentiation of MSC in a hepatocyte-like, they had an effect upon MSC leading to a phenotype resembling mild steatosis.

Orientador : Drª. Silvia Maria Suter Correia Cadena / Coorientadoras : Drª. Amanda do Rocio Andrade Pires ; Drª. Julie St-Pierre / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 26/10/2016 / Inclui referências: f. 78-97 / Resumo: Diferentes atividades biológicas têm sido atribuídas aos compostos mesoiônicos. Para a sidnona SYD-1 (3-[4-cloro-3-nitrofenil]-1,2,3-oxadiazolio-5-olato) foi descrita significativa atividade antitumoral contra Sarcoma 180, carcinoma de Erlich e Walker-256. Neste estudo foram avaliados os efeitos do SYD-1 em células de hepatocarcinoma humano (HepG2), considerando sua elevada taxa de mortalidade e a existência de apenas um quimioterápico para o seu tratamento. Os efeitos do mesoiônico foram avaliados em células cultivadas em meio DMEM alta glucose (AG) e DMEM sem glucose e com galactose/glutamina (GAL) para direcionar o metabolismo destas células para a via glicolítica e fosforilação oxidativa, respectivamente. Ainda, com o fim de estabelecer uma possível seletividade, alguns ensaios também foram realizados em hepatócitos de rato em cultura mantidos em meio DMEM AG. SYD-1 reduziu de forma concentração dependente a viabilidade das células HepG2, avaliada por quatro metodologias diferentes. Pelo método do MTT, as reduções foram de ~22% e ~49% para 50 ?M de SYD-1, para células cultivadas em meio AG e GAL, respectivamente. Resultado similar foi obtido com a coloração com cristal violeta e atividade da enzima LDH no meio extracelular. No entanto, nenhum efeito foi observado utilizando a metodologia de exclusão do azul de tripan. Todos os estados da respiração (basal, leak e desacoplado), em células cultivadas, foram inibidos após o tratamento das células HepG2 com SYD-1 (25 e 50 ?M), sendo mais acentuado o efeito nas culturas mantidas em meio GAL. Nas mesmas condições, foi observada a diminuição nos níveis celulares de ATP (~29%). Os níveis de piruvato, por sua vez, diminuíram nas células tratadas com 50 ?M do SYD-1, com consequente aumento dos níveis de lactato. Em células cultivadas em meio AG, SYD-1 (50 ?M), após 24h de tratamento, também foi capaz de aumentar a expressão de PGC1? e reduzir a expressão de PGC1?. Após 72h de tratamento, com a mesma concentração de SYD-1, houve um aumento na expressão de PGC1?, bem como seus alvos downstream NFR1, NFR2 e Ndufb5 e, também da expressão de genes relacionados com a atividade antioxidante celular: CAT, PRX5, GSS, GPX3, GCLC, TRX2, SOD2, SOD3). SYD-1 (50 ?M) aumentou a expressão de caspase 3 em células HepG2 mantidas em meio AG, mas houve uma diminuição quando as células foram mantidas em meio GAL. Os níveis dos metabólitos piruvato, citrato ?-cetoglutarato e succinato também se apresentaram aumentados após tratamento com o composto (50 ?M meio AG). SYD-1 (25 ?M) inibiu ABCG2 e não foi substrato para transportadores relacionados à resistência aos tratamentos quimioterápicos (Pgp, ABCG2 e MRP1). SYD-1 diminuiu a viabilidade dos hepatócitos não tumorais somente na maior concentração (50 ?M) após 18h de tratamento. Ensaios com anexina V e iodeto de propídio sugeriram que esta redução deve-se à indução de apoptose nestas células. Considerados em conjunto, os resultados sugerem que o comprometimento de funções mitocondriais pelo SYD-1 está relacionado com sua toxicidade em células HepG2 e que o mesoiônico é um candidato promissor para futuras investigações in vivo, visando sua aplicação para o tratamento do carcinoma hepatocelular (CHC). Palavras-chave: Células HepG2; hepatócitos; SYD-1; bioenergética mitocondrial; família de coativadores PGC1; transportadores ABC. / Absract: Several biological activities have been described for mesoionic compounds. The sydnone SYD-1 (3-[4-chloro-3-nitrophenyl]-1,2,3-oxadiazolium-5-olate) has shown a significant antitumour activity against Ehrlich carcinoma, Sarcoma 180 and Walker-256. In this study the effects of the mesoionic compound SYD-1 were evaluated in human hepatocellular carcinoma cells (HepG2), considering its high mortality rate and that only one drug is available for its treatment. The effects of SYD-1 were evaluated on cells grown in high glucose DMEM (AG) or DMEM without glucose and with galactose/glutamine (GAL), with the aim to force the metabolism to glycolytic or oxidative phosphorylation, respectively. Further, in order to establish its selectivity, some assays were also performed in rat hepatocytes grown in AG DMEM. SYD-1 reduced the viability of HepG2 cells in a dose-dependent manner, assessed from four different methods. MTT method showed reductions of ~22% and ~49% in viability after treatment with SYD-1 (50?M) for cells grown in AG and GAL, respectively. Similar results were obtained from staining with crystal violet and release of LDH in the culture medium. However, no effect was observed when the methodology was the exclusion of trypan blue. The respiration states (basal, leak and uncoupled) were inhibited after treatment with SYD-1 (25 and 50 ?M), being the effects more pronounced in cells grown in GAL medium in comparison to AG medium. At the same conditions, it was observed the decrease of ATP levels (~29%). In turn, the levels of pyruvate decreased by the treatment with 50 ?M of SYD-1 while lactate levels increased. In cells grown in AG, SYD-1 (50 ?M) was also able to increase the expression of PGC1? and reduce the expression of PGC1?, after 24h of treatment. After 72h of treatment, SYD-1 (50 ?M) increased the expression of PGC1? as well as its downstream targets NFR1, NFR2 and Ndufb5. The expression of genes related to the antioxidant activity (CAT PRX5, GSS, GPX3, GCLC, TRX2, SOD2, SOD3) were also increased by SYD-1 (50 ?M). The expression of caspase 3 increased in HepG2 cells maintained in AG medium and decreased in cells at GAL medium. The levels of the metabolites pyruvate, citrate, ?-ketoglutarate and succinate were also increased after treatment with the compound (50 ?M - AG medium). SYD-1 (25 ?M) inhibited ABCG2 and was not a substrate of transporters associated to chemotherapy resistance (Pgp, MRP1 and ABCG2). SYD-1 decreased the viability of non-tumour hepatocytes only at the highest concentration (50 ?M) after 18h of treatment. Results of assays with anexin-V and PI suggested that the mesoionic was able to induce apoptosis in these cells. Taken together, these results show that the effects of SYD-1 on mitochondrial functions are related to its cytotoxicity on HepG2 cells and suggest that the mesoionic is a promising candidate for future in-vivo investigations aiming to its use for the treatment of hepatocellular carcinoma. Keywords: HepG2 cells; hepatocytes; SYD-1; mitochondrial bioenergetics, PGC1 family coactivators, ABC transportes.

O transplante de hepatócitos é uma modalidade terapêutica atrativa para as doenças hepáticas, assim como uma alternativa para o transplante hepático. O objetivo do presente estudo é investigar a efetividade do transplante de hepatócitos de ratos nos modelos de hepatotoxicidade aguda induzida por paracetamol (1g/kg e 1,5g/kg). Os hepatócitos foram isolados de ratos Wistar machos e transplantados 24 horas após em receptoras fêmeas com hepatotoxicidade de 1g/kg. Os ratos fêmeas receberam 1x107 hepatócitos (grupo 1, n=20) ou PBS (grupo 2, n=24) através da veia porta ou no baço. A análise de sobrevida em 3 dias demonstrou que todos os animais do grupo 1 sobreviveram, enquanto 5 animais do grupo 2 morreram (P=0,03), todas as mortes ocorreram nos ratos que receberam PBS através da veia porta (P=0,001). Os níveis de alanina aminotransferase e fator V que foram medidos no experimento não mostraram diferença entre o grupo 1 e o grupo 2 em nenhum momento. A análise molecular e a histologia mostraram a presença de hepatócitos no fígado de animais transplantados através da veia porta ou pelo baço. O modelo de hepatotoxicidade aguda induzida por paracetamol (1g/kg) demonstrou que o transplante de hepatócitos de ratos aumenta a sobrevida quando o local de injeção é na veia porta. No modelo de hepatotoxicidade aguda induzida por paracetamol (1,5g/kg), os hepatócitos foram isolados de ratos Wistar machos, e transplantados 6 horas após em receptoras fêmeas. Os ratos fêmeas receberam 1x107 hepatócitos (grupo 1, n=33) ou PBS (grupo 2, n=24) no baço. A análise de sobrevida em 3 dias demonstrou que 9 animais do grupo 1, e 9 animais do grupo 2 morreram no dia 2. Não houve diferença estatística significativa na análise de sobrevida entre o grupo 1 e o grupo 2. Nossos dados demonstram que o isolamento de hepatócitos é um procedimento factível. O transplante de hepatócitos é uma técnica que pode ser aplicada em modelos animais de IHA levando ao aumento da sobrevida. Entretanto, o modelo utilizado no presente estudo apresentou um alto grau de variabilidade, tornando necessária a avaliação do transplante de hepatócitos em um modelo mais reprodutível. / Hepatocyte transplantation is an attractive therapeutic modality for liver disease as an alternative for liver transplantation. The aim of the current study was to investigate the effectiveness of rat hepatocyte transplantation in the acetaminophen-induced acute hepatotoxicity models (1g/kg and 1,5g/kg). Hepatocytes were isolated from male Wistar rats and transplanted 24 hours later in female recipients with hepatotoxicity of 1g/kg of acetaminophen. Female rats received either 1x107 hepatocytes (group1, n=20) or PBS (group 2, n=24) through the portal vein or into the spleen. Survival analyses in 3 days showed that all animals from group 1 survived, whereas 5 rats from group 2 died (P=0.03), all deaths occurred in rats that received PBS into the portal vein (P=0.001). Alanine aminotransferase and factor V levels measured within the experiment did not differ between groups 1 and 2 at any time point. Molecular analysis and histology showed presence of hepatocytes in liver of transplanted animals injected either through portal vein or spleen. Our data in acetaminophen-induced hepatotoxicity model (1g/kg) demonstrate that rat hepatocyte transplantation increases survival when the site of injection is into portal vein in this hepatotoxicity model. In the acetaminophen-induced acute hepatotoxicity model (1,5g/kg), hepatocytes were isolated from male Wistar rats and transplanted 6 hours later in female recipients. Female rats received either 1x107 hepatocytes (group1, n=33) or PBS (group 2, n=24) into the spleen. Survival analyses in 3 days showed that 9 rats from group 1 and 9 rats from group 2 died at day 2. There was no statistical significance in survival between group 1 and group 2. Our data demonstrate that hepatocyte isolation is a feasible procedure. Hepatocyte transplantation can be used in animal models of acute liver failure increasing survival. The model of the present study show a higher variability, therefore it´s necessary to evaluate hepatocyte transplantation in a more reproducible model.