Com o aumento da expectativa de vida, estima-se um aumento na incidência de doenças neurodegenerativas, como a Doença de Alzheimer (DA). Vários processos fisiopatológicos interligados estão envolvidos tanto no processo do envelhecimento, quanto na etiologia das desordens neurodegenerativas, como por exemplo, o estresse oxidativo e a neuroinflamação. Têm sido descrito que mecanismos epigenéticos podem estar relacionados com o processo de envelhecimento, ocasionando modificações na expressão gênica em diferentes regiões do cérebro, como por exemplo, a acetilação de histonas que é responsável em parte, pela transcrição gênica, sendo esse processo controlado por duas enzimas, a histona acetiltransferase (HAT) e a histona desacetilase (HDAC). A HAT é responsável por ocasionar um relaxamento da cromatina e com isso uma maior acessibilidade para o processo de transcrição gênica enquanto que a HDAC causa uma maior compactação da cromatina, resultando uma supressão na transcrição gênica. Considerando o papel da acetilação de histonas no processo de envelhecimento, em especial em doenças neurodegenerativas, tem sido sugerido o uso de estratégias que aumentem a acetilação com finalidade neuroprotetora como, por exemplo, o uso de inibidores de HDAC. Diversos estudos demonstram que os inibidores da HDAC são capazes de melhorar as funções cognitivas e a formação de memória. Nesse contexto, a curcumina, um composto polifenólico encontrado no açafrão (Curcuma longa) tem demonstrado ser capaz de atuar sobre os mecanismos epigenéticos, sendo sugerido como um potente inibidor da HDAC. Assim, o objetivo desse trabalho foi investigar o tratamento agudo com extrato etanólico de Curcuma longa sobre a atividade da enzima histona desacetilase em estruturas cerebrais, hipocampo e córtex frontal, de ratos Wistar. Ratos Wistar machos adultos (3 e 20 meses de idade) foram aleatoriamente distribuídos nos seguintes grupos: salina, veículo (DMSO), extrato etanólico de Curcuma longa 10mg/Kg e 50mg/Kg. A atividade da histona desacetilase (HDAC) foi mensurada após 2 e 18 horas da administração, utilizando kit de ELISA específico. A ANOVA de três vias indicou um efeito do tempo (F(1,71)=4.238,p=0.044) após a administração do extrato etanólico de Curcuma longa e um efeito da idade em hipocampos (F(1,71) =10.430, p=0.002), ou seja, animais com 20 meses apresentaram atividade maior da HDAC quando comparados com os animais de 3 meses de idade. Em córtex frontal, a ANOVA de três vias indicou um efeito da idade (F(1,75)=4.438,p=0.039) e uma interação entre idade e tempo (F(1,75)=1.765,p=0.001). Em ambas as estruturas analisadas, não houve efeito da administração com extrato de Curcuma longa. Nossos resultados demonstram que a atividade da histona desacetilase foi aumentada em ambas as estruturas testadas de ratos com 20 meses de idade, sugerindo que no processo de envelhecimento cerebral ocorra uma redução na acetilação de histonas, o que pode reduzir a transcrição gênica. Além disso, a atividade da HDAC parece ser influenciada pelo ritmo circadiano, uma vez que houve um efeito do tempo nos níveis da atividade da HDAC em ambas as estruturas analisadas. A atividade da HDAC foi maior no tempo de 18 horas (correspondendo ao período da manhã) quando comparado ao tempo de 2 horas, que corresponde ao turno da tarde, este dado pode estar relacionado à cronobiologia, onde a organização circadiana permite que o organismo mantenha a homeostase em resposta a variações diárias decorrentes do ambiente externo e do próprio organismo. Cabe descrever que os ratos Wistar são notívagos, onde o período da manhã é o início do período de sono; assim poderíamos sugerir uma redução da acetilação e consequentemente uma redução na expressão gênica nesse período. / With the increase of life expectancy, an increase in the incidence of neurodegenerative diseases, for example, the Alzheimer‟s disease (AD),is estimated. Several interconnected pathophysiological processes are involved both in the aging process and neurodegenerative diseases, oxidative stress and neuroinflammation. It has been described that epigenetic alterations may be related to the aging process, causing changes in gene expression in different regions of the brain, such as, histone acetylation (HAT), and histones deacetylases (HDAT). The HAT is responsible for causing a relaxation of chromatin and, thus, a better accessibility to the process of gene transcription, while HDAC causes further compactation of chromatin, resulting in gene transcription suppression. Considering the role of histone acetylation in the aging process, especially in neurodegenerative diseases, it has been suggested the use of strategies to increase the acetylation with neuroprotective purposes, such as, for example, the use of HDAC inhibitors. Several studies have shown that HDAC inhibitors are capable of improving the cognitive functions and memory formation. In this context, curcumin, a polyphenolic compound found in turmeric (Curcuma longa) has been shown to be capable of acting on epigenetic mechanisms, being suggested as potent inhibitor of HDAC. The aim of this work was to investigate the effect of acute treatment with ethanol extract of Curcuma longa on the activity of histone deacetylases enzymes in brain structures, hippocampus and frontal cortex of Wistar rats. Male Wistar rats (3 and 20 months old) were randomly distributed into four groups: saline, vehicle (DMSO), Curcuma longa ethanol extract (10mg/kg and 50mg/Kg.) The histone deacetylase (HDAC) activity was measured 2 and 18 hours after administration, using specific ELISA kit. The three-way ANOVA showed a time effect (F(1,71)=4.238,p=0.044) after the administration of Curcuma longa ethanol extract and an age effect in hippocampus (F(1,71)=10.430,p=0.002), that is, 20-months Wistar rats presented a higher HDAC activity when compared to 3-months Wistar rats. In frontal cortex, the three-way ANOVA showed an age effect (F(1,75)=4.438,p=0.039) and an interaction between age and time (F(1,75)=1.765,p=0.001). In both structures, there was no effect of Curcuma longa extract administration. Our results show that the activity of histone deacetylase was increased in both structures of 20-months Wistar rats, suggesting that in the brain aging process it occurs a reduction in histone acetylation, which can reduce gene transcription. Furthermore, as there was a time effect on the levels of HDAC activity in both analyzed structures, the HDAC activity may be influenced by the circadian rhythm. The HDAC activity was higher in 18 – hour period (corresponding to the morning period) as compared to 2 - hour period (corresponding to the afternoon period). This finding may be related to chronobiology, in which the circadian organization allows the body to maintain homeostasis in response to daily changes arising from the external environment and the body itself. It is important to highlight that Wistar rats are nocturnal creatures, having the morning as the beginning of the sleep period. So, they can present a reduction in acetylation and a consequent reduction in gene expression during this period.

A redução na secreção de hormônios ovarianos, principalmente os estrógenos, é uma consequência da menopausa. Os estrógenos atuam principalmente como hormônios sexuais femininos, mas exercem também efeitos sobre diferentes sistemas fisiológicos, incluindo o sistema nervoso central. O tratamento normalmente utilizado para reduzir os sintomas da menopausa é a terapia hormonal, a qual parece ser eficaz no tratamento de sintomas, porém não está livre de efeitos adversos. Com base nisso, há uma crescente procura de terapias alternativas que minimizem os sinais e sintomas da menopausa. No presente estudo, investigamos o efeito da ovariectomia e/ou do exercício físico sobre as atividades das seguintes enzimas relacionadas ao metabolismo energético cerebral: creatina cinase (frações citosólica e mitocondrial), piruvato cinase, succinato desidrogenase, complexo II, citocromo c oxidase, bem como sobre os níveis de ATP em hipocampo de ratas. Ratas Wistar fêmeas adultas com noventa dias foram submetidas à ovariectomia (um modelo animal amplamente utilizado para mimetizar as alterações pós-menopausa). Trinta dias após o procedimento cirúrgico, as ratas foram submetidas ao protocolo de exercício, realizado em esteira adaptada para roedores, três vezes por semana, durante trinta dias. Doze horas após a última sessão de treinamento, os animais foram decapitados para posteriores análises bioquímicas. Os resultados mostraram que a ovariectomia não afetou as atividades da piruvato cinase, succinato desidrogenase e do complexo II, mas diminuiu as atividades da creatina cinase (frações citosólica e mitocondrial) e da citocromo c oxidase em hipocampo. Os níveis de ATP também foram reduzidos. O exercício físico foi capaz de reverter parcialmente apenas o declínio na atividade da creatina cinase fração citosólica. A falta de efeito do exercício sobre os outros parâmetros analisados não é clara, o tempo do treinamento pode não ter sido suficiente para promover uma adaptação do sistema de energia. Os resultados deste estudo sugerem que a deficiência estrogênica, que ocorre como resultado da ovariectomia, afeta os sistemas de geração e homeostase energética em hipocampo de ratas Wistar fêmeas adultas, contribuindo para a disfunção neuronal que pode ser observada na menopausa. / The reduction in the secretion of ovarian hormones, principally estrogen, is a consequence of menopause. Estrogens act primarily as female sex hormones, but also exert effects on different physiological systems including the central nervous system. The treatment normally used to reduce the symptoms of menopause is the hormone therapy, which seems to be effective in treating symptoms, although it may be responsible for adverse effects. Based on this, there is an increasing demand for alternative therapies that minimize signs and symptoms of menopause. In the present study, we investigated the effect of ovariectomy and/or physical exercise on the following activities related to brain energy metabolism enzymes: creatine kinase (cytosolic and mitochondrial fractions), pyruvate kinase, succinate dehydrogenase, complex II, cytochrome c oxidase, as well as on ATP levels in the hippocampus of adult rats. Adult female Wistar rats with 90 days of age were subjected to ovariectomy (an animal model widely used to mimic the postmenopausal changes). Thirty days after the procedure, the rats were submitted to the exercise protocol, which was performed in treadmill adapted for rodents three times a week for thirty days. Twelve hours after the last training session, the rats were decapitated for subsequent biochemical analyzes. Results showed that ovariectomy did not affect the activities of pyruvate kinase, succinate dehydrogenase and complex II, but decreased the activities of creatine kinase (cytosolic and mitochondrial fractions) and cytochrome c oxidase in hippocampus of adult female rats. ATP levels were also reduced. Exercise was only able to partially reverse the activity of creatine kinase cytosolic fraction. The lack of effect of exercise on the other parameters analyzed is not clear, the training time may not have been sufficient to promote adaptation of the energy system. The results of this study suggest that estrogen deficiency that occurs as a result of ovariectomy affects production systems and energy homeostasis in the hippocampus of adult female Wistar rats, contributing to neuronal dysfunction which can be observed in menopause.

Orientador: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T00:49:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_AlineVilardaSilva_M.pdf: 2487506 bytes, checksum: ec15fc1b78bef814d6d459499276cdf5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A ritmicidade circadiana, expressa na alteração do comportamento e em aspectos morfofisiológicos e moleculares ao longo das 24 horas do dia, é uma das funções básicas dos organismos vivos. Os processos comportamentais e os mecanismos moleculares no hipocampo, que estão envolvidos na aprendizagem e memória, demonstram oscilação circadiana. Vários estudos sugeriram que o condicionamento clássico aversivo é afetado pelo sistema de temporização circadiana e que a oscilação circadiana de vias moleculares específicas é requerida para a consolidação da memória aversiva. O presente trabalho investigou a oscilação circadiana da expressão da nNOS e da atividade da proteína NOS no hipocampo de pombos e as suas relações com a modulação temporal do condicionamento contextual aversivo. Na Parte I, caracterizou-se o padrão temporal da expressão da nNOS, que foi detectada por Western Blotting e o padrão temporal da atividade enzimática da NOS, determinada pela quantidade de L-citrulina produzida por minuto e por micrograma de proteína na reação. Na Parte II, nos horários de mínima e máxima atividade enzimática da proteína, pombos foram treinados e testados em condicionamento aversivo ao contexto. As sessões foram gravadas para posterior análise comportamental. Após o teste foi realizada a imunoistoquímica para marcação da nNOS em neurônios do hipocampo. Foi evidenciada ritmicidade circadiana significativa (p < 0,05) na expressão protéica da nNOS e na atividade enzimática da NOS, segundo os valores fornecidos pelo método Cosinor para caracterização do padrão temporal. As médias da densitometria óptica dos grupos com horários mais próximos da acrofase - ZT04 (10hs; 0,944 ± 0,12) e a batifase - ZT16-(22hs; 0,572 ± 0,16) foram significativamente diferentes (F5,18 p < 0,0001). Os grupos condicionados, em ambos os horários, mostraram maior duração e maior ocorrência do comportamento de congelamento do que os controles (p < 0,05). Houve uma variação dia-noite para o comportamento de congelamento nos grupos controles (p < 0,05). A marcação de células nNOS-positivas foi maior no hipocampo dos grupos condicionados sendo que o total de células nNOS-positivas na área dorsal do grupo experimental testado à noite foi maior do que aquele observado nos grupos controles e no experimental da manhã (p < 0,05). Os dados mostraram que a expressão protéica da nNOS e da atividade enzimática da NOS no hipocampo de pombos mostram uma oscilação que caracteriza um padrão temporal circadiano. Tanto no horário de máxima como no de mínima atividade da nNOS, o condicionamento contextual aversivo resultou em medo condicionado ao contexto e em expressão de células nNOS-positivas no hipocampo que foi maior nos pombos condicionados do que nos controles. Contudo, no hipocampo do grupo testado à noite houve um maior número de células nNOS-positivas. Esse dado estimula questionamento sobre se ocorreria a ativação de mecanismos compensatórios para o aumento da expressão da proteína nNOS, quanto essa é requisitada em situações de baixa disponibilidade / Abstract: The circadian rhythm, expressed in changing behavior and the morphophysiologic and molecular aspects over 24 hours of the day is one of the basic functions of living organisms. The behavioral processes and molecular mechanisms in the hippocampus, which are involved in learning and memory, show circadian oscillation. Several studies have suggested that classical fear conditioning is affected by the circadian timing system and the circadian oscillation of specific molecular pathways is required for the consolidation of aversive memory. This study investigated the circadian oscillation of nNOS expression and activity of NOS protein in the hippocampus of pigeons and their relationship with the temporal modulation of aversive contextual conditioning. In Part I, we have characterized the temporal pattern of nNOS expression, which was detected by Western blotting and temporal pattern of NOS enzyme activity, determined by the amount of L-citrulline produced per minute and per microgram of protein in the reaction. In Part II, at the times of minimum and maximum activity of the protein, pigeons were trained and tested in aversive conditioning to context. The sessions were taped for later behavioral analysis. After the test was performed immunohistochemical for labeling of nNOS in neurons in the hippocampus. Circadian rhythm was evident (p <0.05) in nNOS protein expression and enzyme activity of NOS, according to figures provided by Cosinor method to characterize the temporal pattern. The mean optical density of groups with times closer to the acrophase - ZT04 (10hrs; 0.944 ± 0.12) and nadir - ZT16-(22hs; 0.572 ± 0.16) were significantly different (F5, 18 p <0.0001 ). The groups conditioned in both schedules, showed more frequent and longer duration of freezing behavior than controls (p <0.05). There was a day-night variation for freezing behavior in control groups (p <0.05). Labeling of nNOS-positive cells was higher in the hippocampus of the groups conditioned with total nNOS-positive cells in the dorsal area of the experimental group tested at night was higher than that observed in control groups and experimental group in the morning (p <0.05). The data showed that nNOS protein expression and enzymatic activity of NOS in the hippocampus of pigeons show an oscillation that characterizes a circadian temporal pattern. Both at the time of maximum as the low activity of nNOS, the aversive contextual conditioning resulted in fear conditioning to context and expression of nNOS-positive cells in the hippocampus was higher in pigeons conditioned than in controls. However, in the hippocampus of the group tested in the evening there was a greater number of nNOS-positive cells. This fact encourages questioning of whether there would be activation of compensatory mechanisms for the increased expression of nNOS protein, as this is required in situations of low availability / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Modulation of acute and chronic stress on NOS expression levels in the rat hippocampus. Márcia Leite dos Santos, São Cristovão-2014. Cerebral response to stress involves the activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. The hippocampus is associated with spatial learning, contextual memory and regulates this axis activation. Nitric oxide (NO) is considered an atypical neurotransmitter and participates in the process of memory consolidation and learning, although it is also associated with the neurotoxicity responsible for the activation of the neuronal death cascades. The aim of the present study was to evaluate the short- and long-term effects of stress on NO levels in the rat hippocampus, inducing stress by restraint. We verified that the hippocampal areas CA2 and dentate gyrus seem to be more susceptible to lesions by NO production. The dorsal region of these areas is the most expressive of NO, and possibly the one more damaged by long-term stress. We could observe that acute stress does not significantly alter the production of NO. It is likely that NO produced in the chronic stress protocol is maintained by the induced NO-synthase. Long-term stress is a determinant factor in NO production, which can be harmful to the hippocampus. / Modulação do estresse agudo e crônico sobre os níveis de expressão da NOS no hipocampo de ratos Wistar. Márcia Leite dos Santos, São Cristovão-2014. A reação cerebral ao estresse desenvolve-se ativando o eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal. O hipocampo está associado ao aprendizado espacial, memória contextual e atua regulando a atividade desse eixo. De modo que o óxido nítrico, considerado um neurotransmissor atípico, participa do processo de consolidação da memória e aprendizagem, porém tem intima relação com o processo de neurotoxicidade responsável pelo desencadeamento de cascatas de morte neuronal. O presente trabalho buscou investigar os efeitos do estresse a curto e longo prazo sobre os níveis de NO no hipocampo, utilizando o modelo experimental de contenção em ratos Wistar. Foi verificado que determinadas áreas hipocampais foram mais suscetíveis a lesões pela produção de NO, sendo elas a CA2 e o Giro Denteado. A região dorsal dessas áreas é mais expressiva junto a marcações diaforásicas e possivelmente também sofrem mais com os efeitos do estresse em longo prazo. Percebe-se que o estresse agudo não é capaz de produzir efeitos significativos sobre a produção do NO, no tocante a promover danos a homeostasia hipocampal. Provavelmente o NO produzido no estresse crônico seja mantido pela via da isoforma i-NOS. Sendo que o estresse em longo prazo é determinante para as taxas de produção de NO, deletérias ao sistema hipocampal.

Orientador: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T04:52:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Canova_Fernando.pdf: 32640695 bytes, checksum: 6c06f9d94ba0675ea059bb7d42685788 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Uma grande parte do conhecimento sobre as bases e mecanismos neurais dos processos de aprendizagem, memória e amnésia fundamenta-se na investigação dos correlatos neurais do comportamento de animais não humanos em situações aversivas. Vários estudos têm resultados sugestivos de que o condicionamento clássico aversivo é afetado pelo sistema de temporização circadiana. As análises do condicionamento clássico aversivo e da resposta condicionada de congelamento (FRZ) são úteis para as análises do comportamento e dos processos mecanismos neurais subjacentes. Estudos prévios mostraram a indução da expressão de Zenk no hipocampo de pombos pelo treino em condicionamento clássico aversivo e pelo teste no contexto aversivo. O presente estudo investigou as variações dia - noite na aquisição e na evocação do condicionamento clássico aversivo e na expressão da proteína Zenk no hipocampo. O Experimento I avaliou o condicionamento ao contexto em pombos divididos em grupos condicionados (EC), controle (CC) e manipulação (CM) e o Experimento II investigou o condicionamento aversivo ao som previamente associado ao choque utilizando de animais que receberam som-choque pareados (EP), som-choque não pareados (NP) ou som(GS). Nos dois experimentos foi utilizado o fotoperíodo com pulsos de luz (15 min) às 6h (ZT00) e às 18h (ZT12), sendo as sessões realizadas nos horários ZT02 e ZT14. Os resultados do Experimento I indicaram diferença significativa na ocorrência de congelamento entre os grupos (p<0,05), mas não entre os horários (p>0,05). Comparações entre bloco final do treino e bloco inicial do teste mostraram queda significativa na ocorrência de congelamento no bloco inicial do teste no grupo EC ZT02 (p<0,05, mas não no EC ZT14 (p>0,05). A análise de células Zenk positivas no hipocampo mostrou aumento significativo na região HpV em relação a HpD do grupo EC ZT02 em comparação aos demais grupos (p<0,05), demonstrando uma diferença significativa de horário. Houve aumento significativo na marcação de núcleos Zenk-positivos em HpVM do grupo EC ZT02 em comparação aos demais grupos (p<0,05) e em relação a HpVL (p<0,05). No Experimento II houve maior ocorrência de exploração cautelosa nos grupos EP e NP (p>0,05) em comparação aos grupos GS (p<0,05) e diferença significativa na ocorrência de congelamento entre os grupos EP e GS (p<0,05), mas não entre os horários (p>0,05). A marcação de núcleos Zenk-positivos em HpV foi maior do que em HpD nos animais que receberam som e choque pareados ou não-pareados (p<0,05). Não houve diferenças significativas na marcação de Zenk em HpVL e HpVM nos diferentes grupos e nos dois horários (p>0,05). Os dois experimentos indicaram a expressão de diferentes padrões comportamentais frente ao contexto aversivo condicionado e ao som aversivo condicionado. As variações na expressão de Zenk são indicativas de ativação diferencial de HpD, HpVM e HpVL durante a evocação da memória do contexto e do som. A existência de variações dia - noite na ocorrência de condicionamento ao contexto e na expressão de Zenk no hipocampo sugere uma modulação do sistema temporizador circadiano sobre esses processos. Palavras-Chave: Condicionamento clássico aversivo; Hipocampo; Proteína Zenk; Fotoperiodo esqueleto / Abstract: Part of the knowledge about the mechanisms and neural basis of learning, memory and amnesia is based on the investigation of neural correlates of the behavior of non human animals in aversive situations. Moreover, many studies suggest that these behavioral processes are affected by the circadian timing system. The procedures of classical aversive conditioning and analysis of the conditioned freezing response are useful for the study of behavior and the underlying neural mechanisms. Previous studies showed the induction of Zenk expression in the hippocampus of pigeons after training in classical aversive conditioning. This study investigated day - night variations in the acquisition and retrieval of aversive classical conditioning and in the expression of Zenk protein in the hippocampus of pigeons. The Experiment I evaluated the conditioning to the context in pigeons attributed to conditioned (COND), control (CC) or naive groups (N). The Experiment II investigated the aversive conditioning to the tone in groups of pigeons that received toneshock pairing (PS), unpaired tone and shock (NPS) or tone alone (TS). In both experiments a photoperiod was used with pulses of light (15 min) at 6h (ZT00) and 18h (ZT12) and the sessions were conducted at ZT02 and ZT14. The results of the Experiment I indicated between group differences in the occurrence of freezing (p<0.05). A significant decrease in freezing was observed in the initial block of the test as compared to the final block of the training session of the COND ZT02 (p<0.05), but not in the COND ZT14 group (p>0.05). The analysis of the Zenk-positive nuclei in the hippocampus showed a significant increase in the HpV of the COND ZT02 group compared with the other groups (p<0.05), indicating a significant time difference when compared to COND ZT14 (p<0.05). Higher density of Zenk-positive nuclei was found in HpVM of COND ZT02 group compared to HpVL (p<0.001) and to HpVM of other groups (p<0.05). Experiment II data showed higher occurrence of exploratory risk assessment in PS and NPS groups (p>0.05) as compared to TS (P<0.5). The occurrence of freezing in the PS groups was different from TS groups (p<0,05), but not from NPS groups (p>0.05). No significant time of the day variation of freezing was detected (p> 0.05). Zenk- positive nuclei densities were higher in HpV than in HpD in the animals trained with paired or unpaired tone and shock stimulation (p <0.05). These PS and NPS groups showed no significant differences in the density of labeling of Zenk-positive nuclei in HpVL as compared to HpVM (p>0.05). Data from both experiments showed different behavioral patterns during the exposure to the conditioned aversive context and to the conditioned aversive tone. The variations in Zenk expression indicate differential activation of the HpD, HpVL and HpVM regions during retrieval of aversive memory of the context and of the tone. The day-night variation in the conditioned freezing to the context as well as in Zenk expression in the hippocampus suggests a modulation of these processes by the circadian timing system. Keywords: Classical aversive conditioning; Hippocampus; Zenk protein. Skeleton photoperiod / Universidade Estadual de Campi / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T20:16:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Denadai_MagdaAline_M.pdf: 823511 bytes, checksum: 1887972f9e5047fecbd7195247b586a8 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O óxido nítrico (NO), um neurotransmissor não convencional, tem papel importante em processos neurobiológicos de comportamento e de memória. Sua síntese é mediada por três isoformas de sintase do óxido nítrico (NOS): a neuronal (nNOS), a endotelial (eNOS) e induzível (iNOS). Este trabalho analisou o efeito do 7-nitroindazole (7-NI), um inibidor seletivo da nNOS, no condicionamento clássico aversivo em pombos. Foram usados 4 grupos: tratados com 7-NI (grupo 7-nitroindazole; G7-NI, n=5), tratados com óleo de amendoim (grupo veículo; GV, n=5), controle/sem tratamento (grupo controle; GC, n=5) e grupo não tratado/não condicionado (grupo manipulação; GM, n=5). A administração i.p. de 7-NI (25 mg/kg), ou do óleo de amendoim foi feita imediatamente após o treinamento. O G7-NI, o GV e o GC receberam três associações som-choque (5°, 10° e 15º minutos) numa sessão de 20 min. O teste a o contexto foi realizado 24 horas depois. As sessões foram gravadas para posterior transcrição e análise comportamental. A ocorrência da resposta de congelamento durante o treino não diferiu entre os grupos (p>0,05), mas durante o teste foi menor para o G7-NI em comparação ao treino (p<0.01) e aos demais grupos no teste (p<0.001). A atividade da NOS dependente de Ca++ no hipocampo foi menor no G7-NI do que nos outros grupos (p<0,01). Análise por Western blot indicou aumento na expressão de nNOS no G7-NI (p<0,05). A administração sistêmica de 7-NI teve um efeito amnésico sobre a memória contextual aversiva, indicando que a atividade da NOS dependente de Ca++ é importante para os processos de condicionamento clássico aversivo em pombos. / Abstract: Nitric oxide (NO) is an unsual neurotransmitter that plays an important role in neurobiological functions underlying behavior and memory. NO synthesis and release can be mediated by three isoforms of NO synthases (NOS): neuronal (nNOS), endothelial (eNOS) and inducible (iNOS). This study examined the effect of 7-nitroindazole (7-NI), a selective nNOS inhibitor, on contextual fear conditioning in pigeons. Four groups of pigeons were used: treated with 7-NI (7-NI; n=5), treated with peanut oil (Vehicle; n=5), non treated controls (Control; n=5) and non treated and no-trained controls (Non-trained; n=5). Treatment consisted in 7-NI (25 mg/kg; i.p.) or vehicle (peanut oil) administration, immediately after training. All the animals were trained in one 20 min session during which three tone-shock pairings (5th, 10th and 15th minutes) were presented. The test to the context was conducted 24h later. Behavioral categories were analyzed through the transcription of video-tapes of the sessions. The groups 7-NI, Vehicle and Control showed no significant differences in freezing during the conditioning session (p>0.05). During the test to the context the group 7-NI expressed significantly lower freezing as compared to Vehicle and Control (p<0.05). The 7-NI pigeons showed lower hippocampal activity of Ca++ dependent-NOS than Vehicle and Control groups (p<0.01). Western blot analysis indicated significant increase in nNOS expression (p<0.05). The systemic administration of 7-NI induced amnestic effects on contextual fear memory that evidence that Ca++-dependent NOS activity is required for fear conditioning in pigeons. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Neste trabalho, estudos comportamentais, farmacolÃgicos e neuroquÃmicos em Ãreas cerebrais foram realizados em animais adultos (2 meses de idade) que apresentaram convulsÃo e estado epilÃptico (EP), atravÃs da administraÃÃo de pilocarpina 400mg/kg, s.c., P400, com a finalidade de investigar os mecanismos envolvidos durante a fase aguda (1 e 24h) do processo convulsivo. Os estudos comportamentais em animais mostraram que a administraÃÃo de P400 produziu sinais colinÃrgicos perifÃricos (SCP) e movimentos estereotipados (ME) em todos os animais em ambos os perÃodos de observaÃÃo. Os animais observados por 1h apresentaram parÃmetros comportamentais semelhantes ao grupo de 24h, somente o Ãndice de desenvolvimento de convulsÃes, EP, foi um pouco menor, e nÃo houve nenhuma morte. Os estudos farmacolÃgicos com antagonista colinÃrgico bloqueou todos os parÃmetros comportamentais observados. Das drogas gabaÃrgicas, os antagonistas dopaminÃrgico e glutamatÃrgico apresentaram melhor resultado, aumentado a latÃncia da primeira convulsÃo (LC), a latÃncia do EP (LEP) e reduzindo o nÃmero de mortes. Os antagonistas dopaminÃrgico D2, o opÃide, os antidepressivos e o agonista dopaminÃrgico reduziram a LC, LEP e aumentou o nÃmero de mortes, enquanto o antipsicÃtico testado aumentou a LC, a LEP e reduziu as mortes. O lÃtio potencializou os efietos da pilocarpina aumentado o nÃmero de mortes e reduzindo a LC e a LEP. Os estudos neuroquÃmicos revelaram que a atividade da acetilcolinesterase no hipocampo, cÃrtex frontal (CF) e corpo estriado dos animais sofreu uma reduÃÃo significativa apenas na primeira hora da fase aguda, enquanto que no perÃodo de 24h de observaÃÃo a atividade enzimÃtica praticamente se normalizou. O nÃvel de lipÃdio peroxidaÃÃo e o conteÃdo de nitrito e nitrato aumentaram, enquanto que, a concentraÃÃo de GSH diminui nos dois perÃodos do estudo nas Ãreas investigadas. A atividade da SOD aumentou durante 1h em todas a Ãreas. Por sua vez, no perÃodo de 24h aumentou apenas no CF. Na atividade da catalase em ambos os perÃodos e nas Ãreas estudadas verificou-se um aumento significativo. Estudos sobre a densidade mÃxima (Bmax) dos receptores colinÃrgicos muscarÃnicos (M1 e M2) e dopaminÃrgicos (D1 e D2) nas Ãreas analisadas durante 1 e 24h de observaÃÃo foram diminuÃdos e nÃo alterados, respectivamente. Em relaÃÃo aos receptores serotonÃrgicos (5-HT2) nÃo foi verificado alteraÃÃo no Bmax apÃs 1 e 24h de observaÃÃo, nas trÃs Ãreas estudadas. Nas trÃs Ãreas estudadas observou-se um aumento e uma diminuiÃÃo no Bmax dos receptores glutamatÃrgicos e GABAÃrgicos, respectivamente. O P400 alterou de forma diversificada a constante de dissociaÃÃo (Kd) dos receptores M1, M2, D1, D2, 5-HT2, GABAÃrgicos e glutamatÃrgicos nos animais que apresentaram convulsÃo, EP e que foram sacrificados 1 e 24 h depois do tratamento. Na determinaÃÃo de monoaminas e seus metabÃlitos com HPLC, o P400 alterou a concentraÃÃo de DA, DOPAC e HVA, bem como da NA e da 5-HT e seu metabÃlito o 5-HIAA nas diferentes regiÃes do cÃrebro apÃs 1 e 24 h de observaÃÃo. Nos experimentos de determinaÃÃo do conteÃdo dos aminoÃcidos com HPLC, o P400 alterou a concentraÃÃo de (glutamato) GLU estriatal, (glutamina) GLN hipocampal, (aspartato) ASP cortical e nÃo modificou o conteÃdo de tirosina com 1h nas trÃs Ãreas estudadas. JÃ com 24 horas de observaÃÃo nÃo houve alteraÃÃo em nenhuma das Ãreas nos aminoÃcidos GLU, GLN e ASP, mas o conteÃdo de tirosina aumentou de forma significativa nas Ãreas investigadas. / The present study was aimed at investigating behavioural and neurochemical alterations in brain areas of adults rat (2-month-old) which presented seizures and status epilepticus (SE) after treatment with a single dose of pilocarpine (400mg/kg, s.c., P400) in order to clarify the mechanisms of the acute phase in the convulsive process (1 and 24h). Behavioural studies have demonstrated that the P400 administration produced peripheral cholinergic signs and stereotyped movements in all of the animals in both periods of observation. The behavioural parameters assessed between 1 and 24 h were similar, but the seizure and SE development index was slightly lower in the 1h group and in the same group no case of fatality was observed. The pharmacological studies with antagonist cholinergic did not present any of the behavioural alterations. The drugs gabaergic, the antagonist dopaminergic D1, antipsychotic used and glutamatergic antagonist presented increased in the latency to first seizure (LS), latency of the SE (LSE) and decreasing the number of the death. The antagonists dopaminergic D2, the opioide, the antidepressants, and the dopaminergic agonist decreased the LS and a LSE and increased the number of the death. The lithium increased the effects of the pilocapine as well as the number of the death and decreased the LS and LSE. Neurochemical assessments revealed that acetylcholinesterase activity in hippocampus, frontal cortex and striatum decreased significantly only the first hour of the acute phase, meanwhile after 24h, the enzymatic activity remained unaltered. Lipid peroxidation level and nitrite e nitrate content were augmented whereas the GSH concentration was decreased in the areas investigated in both periods of observation. The SOD activity was increased during the first hour in the three areas. In turn, in the 24h period it was augmented in the frontal cortex alone. The catalase activity was significantly increased in both periods and in all areas. Works concerning maximum density (Bmax) of muscarinc cholinergic (M1 e M2) and dopaminergic (D1 e D2) receptors in the areas studied during 1h and 24h of observation were decreased and unaltered, respectively. Regarding the serotonergic receptors (5-HT2) was not verified alteration in the Bmax after 1 and 24h of observation in the three areas studied. In the areas studied the Bmax from glutamatergic and GABAergic receptors were increased and decreased, respectively. P400 altered the M1, M2, D1, D2, 5-HT2, GABAergic e glutamatergic receptors dissociation constant values (Kd) in distinct ways after 1 e 24h from the treatment. In the monoamine and their metabolites with HPLC determination P400 changes the DA, DOPAC and HVA as well as NA and 5-HT and its metabolite 5-HIIAA concentrations in the different cerebral areas after 1 and 24h of observation. In the experimental determinations of the amino acids contents, the P400 altered the content of (glutamate) GLU striatal, (glutamine) GLN hippocampal and the (aspartate) ASP cortical and no modified the concentration od tyrosine in the areas observed. However the TYR contents after 24 h of observation increas in striatum, hippocampus and frontal cortex, but GLU, GLN e ASP reamained unaltered in this period of the observation .

Déficits cognitivos e alterações cerebrais estruturais são comumente encontrados em idosos deprimidos. Este estudo teve como objetivos comparar o volume de regiões de interesse, hipocampo e giro para-hipocampal, de idosos com transtornos depressivos e sem transtornos depressivos utilizando a técnica de morfometria baseada no voxel, investigando se há correlação entre o volume dessas regiões e os escores dos testes cognitivos. Neste estudo, as diferenças clínicas, demográficas e de volume de substância cerebral total foram avaliadas por meio de exames de ressonância magnética estrutural em 48 idosos com transtornos depressivos e 31 controles. Os dados contínuos dos grupos de indivíduos foram comparados pelo teste t de Student ou pelo teste de Mann-Whitney, e a análise das freqüências de categorias foi feita utilizando-se o teste exato de Fisher ou o teste do qui quadrado com correção de continuidade. A comparação dos escores nos testes cognitivos dos dois grupos foi feita por meio da análise de covariância, pois os grupos eram diferentes quanto à escolaridade. A correlação entre o volume de cada estrutura e os escores nos testes cognitivos, para cada grupo estudado, foi feita utilizando-se o programa \"Statistical Parametric Mapping\" e o coeficiente de correlação de Pearson. Pacientes e controles eram similares quanto ao volume cerebral total e quanto às regiões de interesse, mas os pacientes apresentaram desempenho inferior em testes de avaliação da memória, das funções executivas e da velocidade de processamento. No grupo de idosos com transtornos depressivos, foi verificada correlação entre teste de memória episódica verbal e volume do hipocampo esquerdo (p = 0,023) e giro para-hipocampal direito (p = 0,044) e esquerdo (p = 0,007). Nesse grupo, também foi verificada correlação entre giro para-hipocampal esquerdo, teste de memória episódica visual (p = 0,039) e evocação tardia em teste de aprendizagem visuo-verbal (p = 0,040). No grupo de idosos sem transtornos depressivos, foi observada correlação entre desempenho no teste Mini-exame do Estado Mental e hipocampo direito (p = 0,010), e total de evocação em teste de aprendizagem visuo-verbal e giro para-hipocampal direito (p = 0,10) e esquerdo (p = 0,015). Este estudo contou com algumas limitações, como: grupos heterogêneos quanto à escolaridade; pacientes deprimidos, em sua maioria, com sintomas leves e moderados; falta de dados referentes ao tempo total de doença dos pacientes com história de episódios depressivos prévios ou quadros de depressão crônica; e o fato de a maioria dos idosos do grupo controle já ter participado de grupos para a terceira idade. Os resultados corroboraram que idosos deprimidos apresentam alterações de memória, e que essas alterações se correlacionam com alterações estruturais, dado que pode auxiliar a compreensão da fisiopatologia da depressão em idosos. / Cognitive deficits and structural brain alterations are usually found in depressed elderly. The objective of this study was to compare the volume of the regions of interest, hippocampus and parahippocampal gyrus, of elderly with and without depressive disorders using the voxel-based morphometry technique, investigating whether there is a correlation between the volume of these regions and the scores on these cognitive tests. In this study, the clinical and demographic differences, as well as the difference in the volume of the total brain matter were assessed using structural magnetic resonance imaging in 48 elderly people with depressive disorders and 31 controls. The continuous data of the groups of subjects were compared using the Student\'s t test or the Mann-Whitney test; and the analysis of category frequency was performed using the Fisher\'s Exact Test or the Chi-square test with Continuity Correction. The comparison of the scores on the cognitive tests of both groups was carried out using the Analysis of Covariance, since the groups were different in terms of level of education. The correlation between the volume of each structure and the scores on the cognitive tests for each group studied was made using the Statistical Parametric Mapping program and Pearson\'s Correlation Coefficient. Patients and controls were similar regarding the total brain volume and also with respect to the regions of interest; however, the patients presented lower performance on the tests that assessed memory, executive functions and processing speed. In the group of elderly subjects with depressive disorder, there was a correlation between the verbal episodic memory test and the volume of the left hippocampus (p = 0.023); right (p = 0.044) and left (p = 0.007) parahippocampal gyrus. In this group, there was also a correlation between the left parahippocampal gyrus, the visual episodic memory (p = 0.039) and the delayed naming in the visual-verbal learning test (p = 0.040). In the group of elderly without depressive disorders, there was a correlation between the performance on the Mini Mental State Examination and the right hippocampus (p = 0.010), and the total naming on the visual-verbal learning test and the right (p = 0.10) and left (p = 0.015) parahippocampal gyrus. This study had some limitations such as groups with different levels of education, most depressed patients had mild to moderate symptoms, lack of data regarding the total length of the disease in patients with previous history of depressive episodes or chronic depression, and most elderly of the control group had participated in elderly support groups. The results demonstrate that the elderly with depressive disorders have memory deficits and that these deficits are correlated to structural brain alterations. Such finding might help to understand the pathophysiology of depression in the elderly.

O presente estudo comparou o efeito do tratamento crônico com lítio em doses subterapêuticas (0,02mM e 0,2mM) e dose terapêutica (2mM) em cultura primária de neurônios corticais e hipocampais. As amostras foram analisadas e comparadas com o grupo controle (sem tratamento) tanto para os neurônios corticais, como para os neurônios hipocampais. O objetivo do estudo foi: 1) avaliar, nessas culturas celulares, a atividade de diferentes quinases (PKA, CaMKII, AKT e GSK3beta), diferentes sítio de fosforilação da Tau (Ser, 199, 205, 214, 396, C-terminal e seis isoformas), a partir da inibição da PLA2 pelo lítio; 2) Investigar as vias de sinalização envolvidas na modulação do estado de fosforilação da proteína tau a partir da inibição da PLA2 em culturas primárias de neurônios; 3) avaliar, simultaneamente, a expressão de fatores neurotróficos (BDNF) e citocinas (GM-CSF, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL6, IL-10, IL-12, IFN-y e TNF-alfa) mediante o tratamento de neurônios primários com lítio e 4) avaliar expressão gênica por microarray das culturas tratadas com diferentes doses, subterapêuticas e terapêutica, de cloreto de lítio. Nossos resultados sugerem uma dissociação de efeitos em neurônios corticais dos observados em neurônios hipocampais. O lítio aumentou a atividade enzimática da iPLA2 e da cPLA2, tanto em neurônios corticais como em neurônios hipocampais. A atividade da GSK3beta foi inibida pelo tratamento crônico com lítio em neurônios hipocampais e apresentou efeito contrário em neurônios corticais. Observamos comportamentos diferentes das diferentes proteínas analisadas em culturas de neurônios corticais e hipocampais, e não tivemos significância estatística para as alterações na proteína tau. O tratamento nas doses subterapêuticas aumentou a secreção de citocinas pró-inflamatórias tanto em neurônios corticais quanto em neurônios hipocampais / The present study compared the effect of lithium chronic treatment with subtherapeutic doses (0.02mM and 0.2mM) and therapeutic dose (2mM) in primary cortical and hippocampal neurons cell culture. This samples were analyzed and compared with the control group (no treatment). The study\'s goal was: 1) to evaluate in these Cell Culture a different activity kinases (PKA, CaMKII, AKT and GSK3beta), different phosphorylation site of the Tau (199, 205, 214, 396, C-terminal and Six isoforms) and PLA2 inhibition; 2) To investigate how signaling pathways involved in modulation of tau phosphorylation from the inhibition of PLA2 in primary cultures of neurons; 3) analyze an expression of neurotrophic factors (BDNF) and cytokines (GM-CSF, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IFNy TNFalfa 4) to evaluate gene expression via microarray with different doses of lithium treatment. Our results suggest a dissociation effects on cortical and hippocampal neurons cell culture. Lithium increased the enzyme activity of iPLA2 and cPLA2, in both cortical and hippocampal neurons. The GSK3beta the activity was inhibited by chronic treatment with lithium in hippocampal neurons and presented contrary effect on cortical neurons. We observe not statistics significance on tau protein. The treatment at subtherapeutic and therapeutic doses increased the secretion of pro and anti-inflammatory cytokines both in cortical and hippocampal neurons

Estrutura central do hipocampo, o corno de Ammon pode ser subdividido em pelo menos três áreas: CA1, CA2 e CA3. Enquanto CA1 e CA3 foram extensamente estudados, dado o envolvimento do hipocampo em processos cognitivos como a memória e patológicos como a epilepsia, CA2 tem sido largamente ignorado na literatura. Entretanto, este campo possui características específicas, tanto neuroanatômicas como bioquímicas e fisiológicas, sendo resistente à indução de plasticidade e recebendo aferência específica do núcleo supramamilar do hipotálamo, envolvido na circuitaria geradora/mantenedora do ritmo teta, oscilações centrais ao funcionamento do hipocampo. O objetivo deste estudo foi, portanto, caracterizar no animal em livre movimentação os padrões de atividade eletrofisiológica nas três áreas do corno de Ammon bilateralmente. Os resultados demonstraram que CA2 possui, em média, intervalos entre disparos mais prolongados que CA1 e CA3 durante o sono de ondas lentas e o sono REM. Nestas fases do ciclo a coerência entre CA1-CA2 foi mais elevada que entre CA1-CA3 e CA2-CA3 nos três ratos avaliados, em três faixas de freqüência: teta (6 a 12 Hz), gama lento (30 a 50 Hz) e gama rápido (90 a 110 Hz) ipsilateralmente. A coerência entre campos contralaterais é predominante no teta, sendo quase zero nas demais freqüências. Estes resultados corroboram trabalhos recentes que apontam CA2 como área distinta e sugerem que esta pequena região do corno de Ammon possa exercer papéis importantes na modulação da atividade das demais estruturas hipocampais e parahipocampais em processos de memória e em patologias como a epilepsia / The Ammons horn, central structure of the hippocampus, can be subdivided in at least three regions: CA1, CA2 and CA3. While CA1 and CA3 have been extensively studied given the hippocampus involvement in cognitive processes such as memory and pathological ones such as epilepsy, CA2 remains largely ignored. However, this sector contains specific neuroanatomical, biochemical e physiological characteristics, being resistant to induction of plasticity and receiving a specific afference from the supramammillary nucleus in the hypothalamus, involved in the generation/maintenance of the theta rhythm, central oscillations to hippocampal functioning. Therefore, the objective of this study was to characterize electrophysiological patterns of interaction in the three areas of the Ammons horn bilaterally. Results revealed that CA2 has a mean interspike interval larger than CA1 and CA3 during slow wave and REM sleep. During these stages of the sleep-wake cycle, coherence between CA1-CA2 was higher than CA1-CA3 and CA2-CA3 in the three animals evaluated, in three frequency bands: theta (6 to 12 Hz), slow gamma (30 to 50 Hz) and fast gamma (90 to 110 Hz) ipsilaterally. Coherence between contralateral fields was predominant in the theta band and almost zero in other frequencies. These results add to some previous published data showing that CA2 is distinct from the other subfields and that this small region of the Ammons horn may exert important roles in modulating activity in the other hippocampal fields and parahippocampal regions during memory and pathologies such as epilepsy