Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2002. / Härtill 4 uppsatser.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:20Z : No. of bitstreams: 1 Publico-160.pdf: 1425439 bytes, checksum: 3673b94c19926da28dd48fd0518c8c86 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A infecção pelo GBV-C é freqüente em indivíduos saudáveis e pode permanecer por longos períodos sem a manifestação de sinais e sintomas clínicos. O GBV-C é um flavivírus composto por uma única fita de RNA de polaridade positiva, intimamente relacionado ao HCV. Inicialmente, o GBV-C foi associado à casos de hepatite fulminante de etiologia desconhecida. Estudos posteriores, no entanto, falharam em associar o GBV-C a qualquer doença humana conhecida e o vírus foi negligenciado por um longo período até que estudos sugeriram um efeito benéfico da co-infecção em pacientes HIV soropositivos. Os estudos envolvendo a co-infecção HIV-GBV-C apresentam resultados controversos enquanto trabalhos avaliando a tripla infecção HIV-HCV-GBV-C ainda são raros. Com o intuito de avaliar o efeito do GBV-C sobre pacientes HIV e HIV-HCV co-infectados crônicos, incluímos uma coorte de 159 pacientes HIV soropositivos triados a partir do CCDI-UNIFESP. Os pacientes foram testados para a presença de anticorpos anti-E2 e RNA do GBV-C. Dos 107 pacientes HIV, negativos para o HCV, 41 (38,3 por cento) apresentaram marcadores de infecção pelo GBV-C, dos quais 17 (15,8 por cento) eram virêmicos e 24 (22,4 por cento) positivos para anticorpos anti-E2. Dos 52 pacientes HIV-HCV co-infectados, 24 (46,1 por cento) apresentaram marcadores de infecção pelo GBV-C, dos quais 14 (26,9 por cento) apresentaram viremia e 10 (19,2 por cento) foram positivos para anticorpos anti-E2 do GBV-C. Foram coletados dados epidemiológicos e avaliados marcadores virológicos, imunológicos e de função hepática, além da produção de IFN-γ e IL-2 em células T CD4, T CD8 e Tγδ e da avaliação do marcador de ativação celular CD38 em células T CD4 e T CD8. Não foram observadas diferenças estatísticas nos níveis de CV do HIV e nem na contagem de linfócitos T CD4 e T CD8, de acordo com o perfil de infecção. A resposta imune, avaliada pela produção de citocinas IFN-γ e IL-2 e da expressão do marcador de ativação celular CD38 não diferiu entre os grupos avaliados. A análise univariada demonstrou aumento dos níveis de ALT, AST e GGT no grupo de pacientes HIV-HCV co-infectados e no grupo triplo infectado HIV-HCV- GBV-C. A análise multivariada revelou a influência do GBV-C sobre o aumento da ALT nos pacientes com tripla infecção. Os nossos dados demonstram que o GBV-C não exerce influência positiva sobre a infecção pelo HIV e pode causar sobrecarga hepática, como demonstrado pela elevação da ALT, em pacientes com tripla infecção. Dessa forma, esta interação deve ser vista com cautela até que se exclua completamente a possibilidade de patogenicidade do GBV-C nessa situação. / GBV-C co-infection is frequent in humans and could last for years without clinical symptoms. GBV-C is a flavivirus composed by a single positive RNA strain, closely related to HCV. Initially in its discovery GBV-C was associated with non-A-B hepatitis. However, subsequent studies failed to associate GBV-C with any known human disease and the virus became neglected until a series of studies associated the virus with prolonged survival in HIV infected recipients. Studies evaluating the co-infection presents conflicting results whereas triple HIV-HCV-GBV-C infection remains to be clarified. With the aim to evaluate the effect of GBV-C upon HIV and HIV-HCV co-infected patients, we included a cohort of 159 HIV-seropositive patients from CCDI-UNIFESP. The patients were tested for the presence of anti-E2 antibodies and GBV-C RNA. Of the 107 HIV seropositive patients negative to HCV infection, 41 (38,3%) were positive to GBV-C infection markers, of whom 17 (15,8%) were GBV-C viremic and 24 (22,4%) were positive to anti-E2 antibodies. Of the 52 HIV-HCV co-infected patients, 24 (46,1%) were positive to GBV-C infection markers, of whom 14 (26,9%) were viremic and 10 (19,2%) presented anti-E2 antibodies. Epidemiological data were collected; virological and immunological markers and also hepatic function were evaluated. Besides, IFN- and IL-2 production on CD4, T CD8 and T cells and CD38 activation marker on T CD4 and T CD8 cells were also evaluated. No significant differences on HIV viral load nor on T CD4 and T CD8 cell counts were observed, according to the infection profile. Immune response, evaluated by the IFN- and IL-2 production and by the CD38 expression did not differ among the groups studied. Univariate analysis demonstrated higher ALT, AST and GGT levels in the HIV-HCV co-infetced and HIVHCV- GBV-C triple infected patients. The multivariate analysis demonstrated that the GBV-C influences ALT levels on triple infected patients. Our results demonstrate that GBV-C does not exerts beneficial effects upon chronically HIV infected patients, unlike, it can cause hepatic overload, as demonstrated by the higher ALT levels in the HIV-HCV-GBV-C triple infected patients. In the light of these results, is reasonable to prudently consider this interaction until the possible pathological role of GBV-C on this situation is completely excluded. / FAPESP: 05/57611-5 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-10-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:28Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00284.pdf: 1210351 bytes, checksum: 9468c9b00f4f6d4853d0e556a03096c4 (MD5) / Introdução: a falha ao HAART torna importante o desenvolvimento de novos fármacos que alvejam diferentes passos do ciclo de vida do HIV-1. O Enfuvirtide (T20) é um peptídeo sintético que mimetiza a região HR2 da gp41 do HIV-1, impedindo sua fusão e entrada na célula hospedeira. A presença de mutações de resistência primária ao T20 pode levar a falta de resposta virológica sustentada (RVS) em indivíduos em falha terapêutica ao HAART. Objetivos: genotipar a gp41 do HIV-1 de indivíduos considerados respondedores e não respondedores ao T20; verificar se a presença de mutações de resistência primária poderia interferir na RVS; correlacionar o status RVS com aspectos virais, imunológicos e tropismo. Metodologia: DNA genômico do baseline (antes do tratamento), 6 e 12 meses após o tratamento com T20, foi purificado utilizando QIAamp DNA Mini kit (Qiagen®, Valencia, Califórnia, USA). Todos pacientes receberam terapia otimizada mais T20 no inicio. 506 pb referentes as regiões HR1 e HR2 da gp41 foram amplificados por PCR “nested”. A PCR “nested” da região V3 para estudo do tropismo viral amplificou 654 pb. A PCR foi purificada utilizando Montage® PCR Centrifugal Filter Devises (Millipore®). As PCRs purificadas das regiões V3 e gp41 foram sequenciadas no ABI Prism 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Ca, USA) com o kit comercial BigDye® Terminator Cycle Sequencing versão 3.1 (Applied Biossystems, Foster City. Califórnia, USA). Iniciadores da segunda etapa da PCR “nested” foram utilizados para sequenciar. Resultados: sete indivíduos apresentavam um perfil de resposta ao T20 por 12 meses, 4 por pelo menos 6 meses e dois não responderam entre 6 e 12 meses. A média de idade foi de 44,92 ± 5,39, sendo 46,16% do sexo feminino e 53,84% do masculino. Dos 13 pacientes analisados, 12 pertencem ao subtipo B e 1 ao F1. Oito pacientes apresentaram o correceptor R5 e cinco o X4. Não foram encontradas mutações nas posições 36 a 45 da HR1 em 12 meses. Tivemos a N42S, que é responsável pela diminuição da susceptibilidade ao T20. De um total de 59 aminoácidos analisados na HR1, observamos 18,64% de trocas e na região HR2, 38,88%. Na HR1 no período de 8 meses ou mais em relação ao baseline, não encontramos modificações nas posições 36 a 45. De um total de 59 aminoácidos analisados, observamos 15,25% de trocas e na HR2, 36,11%. Verificamos a E137K sem a presença da N43D, que causou resistência. Verificamos a S138T como mutação de primaria com persistência de 12 meses sem a N43D e a falta de resposta ao tratamento. Na contagem de T CD4+, não encontramos diferença estatística entre as médias dos diferentes grupos (ANOVA – p=0,1). As cargas virais após 6 meses foram indetectáveis (<50 copias/mL) em 69,23% dos pacientes. Houve queda de carga viral do baseline para 6 meses (p=0.034), assim como para 6 meses e 8 meses ou mais. O uso do medicamento teve interferência significativa quando comparados o baseline e 6 meses (p=0.004) e entre o baseline e 12 meses (p=0.022), mas entre 6 e 12 meses a interferência não foi significativa, mostrando que após 6 meses ela permanece sustentada. Entre as variáveis, indivíduos respondedores e genótipo R5 houve alto valor de similaridade (76.98). Ocorreu agrupamento entre as duas amostras dos respondedores com genótipo X4 com as mutações 306, 311 e 320, que o caracterizam. Discussão: em relação ao tropismo, 38,47% dos pacientes que estudamos apresentaram correceptor X4 após alguns anos de infecção e múltiplos esquemas HAART. Este resultado mostra concordância com a literatura, que descreve uma taxa média de 50%. A N42S, observada em nosso estudo é relacionada com diminuição da susceptibilidade da droga. Apesar disso, somente um dos pacientes não respondeu ao tratamento, não obtendo ganho imunológico. Conclusão: o tropismo dos vírus HIV-1 na maioria dos indivíduos que responderam ao T20 está fortemente associado com o R5, que não causa progressão rápida. A presença da S138T foi suficiente para a falta de resposta ao T20, sem associação com a N43D. Mostramos evidente RVS e recuperação imunológica com o T20, mas que não foi suficiente para retirar estes indivíduos do risco de doenças oportunistas. Nosso estudo evidenciou a importância de iniciar o resgate quando a contagem de linfócitos T CD4+ está acima de 200 células/mm3. / Introduction: the failure to HAART becomes important to development of new drugs that target different steps of the life cycle of HIV-1. The Enfuvirtide (T20) is a synthetic peptide that mimics the HR2 region of gp41 of HIV-1, preventing its fusion and entry into the host cell. The presence of primary resistance mutations to T20 can lead to lack of sustained virologic response (SVR) in people in the HAART failure. Objectives: to genotype the gp41 of HIV-1 subjects considered responders and nonresponders to T20; verify the presence of primary resistance mutations could influence the SVR, SVR status correlate with aspects of viral, immunological and tropism. Methodology: genomic DNA from baseline (before treatment), 6 and 12 months after treatment with T20, was purified using QIAamp DNA Mini kit (Qiagen ®, Valencia, California, USA). All patients received optimal therapy more T20 at the beginning. 506 bp referring to the HR1 and HR2 regions of gp41 were amplified by PCR nested. PCR nested the V3 region to study viral tropism amplified 654 bp. The PCR was purified using Montage ® PCR Centrifugal Filter Devises (Millipore ®). The PCRs of purified V3 and gp41 regions were sequenced in ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, CA, USA) with commercial kit BigDye ® Terminator Cycle Sequencing version 3.1 (Applied Biossystems, Foster City. California, USA). Initiators of the second stage of PCR nested were used for sequencing. Results: seven patients had a higher response to T20 for 12 months, 4 for at least 6 months and two did not respond between 6 and 12 months. The average age was 44.92 ± 5.39, and 46.16% female and 53.84% male. Of the 13 patients analyzed, 12 belong to subtype B and 1 to F1. Eight patients had the coreceptor R5 and five the X4. There were no mutations at positions 36 to 45 of HR1 in 12 months. We acquired the N42S, which is responsible for decreased susceptibility to T20. From a total of 59 amino acids analyzed in HR1, we observed 18.64% of change and in HR2 region, 38.88%. In HR1 within 8 months or more compared to the baseline, we found no changes in positions 36 to 45. From a total of 59 amino acids analyzed, we observed 15.25% of change and in HR2, 36.11%. We checked the E137K without the presence of N43D, which caused resistance. We checked the S138T mutation as the primary persistence of 12 months without the N43D and the lack of response to treatment. On the count of CD4 + T cells, we found no statistical difference between the means of different groups (ANOVA - p = 0.1). The viral loads after 6 months were undetectable (<50 copies / mL) in 69.23% of patients. There was a decrease in viral load baseline to 6 months (p = 0.034) and for 6 months and 8 months or more. The use of the drug had significant interference when compared to baseline and 6 months (p = 0.004) and between baseline and 12 months (p = 0.022), but between 6 and 12 months the interference was not significant, showing that after 6 months it remains sustainable. Among the variables, responders and R5 genotype, there were high value of similarity (76.98). There was a grouping between the two samples of responders with X4 genotype with mutations 306, 311 and 320 which characterize it. Discussion: regarding tropism, 38.47% of the patients studied had correceptor X4 after a few years of infection and multiple HAART regimens. This result shows agreement with the literature, which describes an average rate of 50%. The N42S, observed in our study is associated with decreased drug susceptibility. However, only one patient did not respond to treatment, without increase of his immune. Conclusion: the tropism of HIV-1 in the majority of people who responded to the T20 is strongly associated with the R5, which causes rapid progression. The presence of S138T was sufficient for the lack of response to T20, but no association with N43D. It was clearly shown SVR and immune recovery with the T20, but that was not enough to remove these people from the risk of contracting opportunistic diseases. Our study showed the importance of starting the rescue when the count of CD4 + T cells are above 200 cells/mm3. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A principal via de infecção pelo HIV-1 em crianças é a transmissão materno-infantil (TMI). Estimativas para taxas de TMI do HIV-1 são de 3% entre gestantes sob terapia antirretroviral e de 25 a 30% para as não tratadas. Apesar da exposição viral durante a gestação, a maioria dos recém-nascidos não são verticalmente infectados, o que sugere a existência de barreiras protetoras à TMI do HIV-1. Diversos fatores podem estar associados com a TMI do HIV-1. Polimorfismos genéticos são descritos em associação com a infecção pelo HIV-1, incluindo os dos antígenos leucocitários humanos (HLA). A molécula HLA-G tem sido implicada nas interações imunológicas materno-fetais e é expressa em células da placenta, especificamente nos citotrofoblastos extravilosos, que formam a camada responsável pela interface entre os tecidos fetais e maternos. Este estudo avaliou os polimorfismos de inserção e deleção de 14pb do HLA-G na TMI do HIV-1. Participaram do estudo, 86 duplas de mães e filhos, sendo 58 duplas de mãe-filho em que a TMI do HIV-1 não ocorreu e 28 duplas em que a TMI ocorreu. Os resultados mostraram maior frequência de genótipo deleção/deleção em mães pertencentes ao grupo TMI positiva, sem utilização de antirretrovirais (p=0,05). Foi observada associação significante entre conhecimento prévio da soropositividade, realização de pré-natal, utilização de antirretrovirais na gestação e não amamentação com a prevenção da TMI (p<0,05). Nesse contexto, a enfermagem pode contribuir com ações que envolvem o pré-natal, parto e puerpério, por meio de aconselhamento quanto à realização do teste anti- HIV-1 no pré-natal, utilização adequada de antirretrovirais e promoção de práticas ideais de alimentação infantil. Adicionalmente, o estudo contribui para a ampliação de conhecimentos da enfermagem sobre a temática do HLA-G na TMI, e destaca a importância de que a enfermagem, fundamentada em ciências biológicas, esteja envolvida na produção de conhecimentos e tecnologias, o que reflete na melhoria da prestação do cuidado ao paciente. / The main way of HIV-1 infection in children is mother-child transmission (MTCT). TMI rates estimates for HIV-1 are 3% in pregnant women in antiretroviral therapy and 25 to 30% for untreated ones. Despite the viral exposure during pregnancy, most newborns are not vertically infected, suggesting the existence of protective barriers to TMI of HIV-1. Several factors may be associated with MTCT of HIV-1. Genetic polymorphisms are described in association with HIV-1, including the human leukocyte antigens (HLA). The molecule HLA-G has been implicated in maternal-fetal immune interactions and is expressed in placenta cells, particularly in extravillous cytotrophoblasts, forming the layer responsible for the interface between fetal and maternal tissues. This study evaluated the HLA-G 14pb insertion and deletion polymorphisms in MTCT of HIV-1. Participated in the study 86 mother-child pair, 58 mother-child pairs in which the MTCT did not occur and 28 doubles in which the MTCT occurred. The results showed a higher frequency of genotype deletion/deletion in mothers in which MTCT occurred belonging to the group without using antiretroviral (p=0.05). Significant association was observed between prior knowledge of seropositivity, conducting prenatal, use of antiretroviral during pregnancy and not breastfeeding to the prevention of MTCT (p <0.05). In this context, nursing can contribute to actions involving prenatal, birth and postpartum, conducting counseling for the conduct of HIV testing during prenatal care, proper use of antiretroviral and promotion of optimal infant feeding practices. Additionally, the study contributes to the expansion of nursing knowledge about the topic of HLA-G in MTCT, and highlights the importance of nursing, grounded in basic sciences, is involved in the production of knowledge and technology, which reflects improvement in the provision of patient\'s care.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-04-01Bitstream added on 2014-06-13T20:29:51Z : No. of bitstreams: 1 triglia_dg_me_botfm.pdf: 753832 bytes, checksum: 1548d01f8015f2a3aa0616b8f844936a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Ministério da Saúde / Secretaria do Estado da Saúde de São Paulo / O HIV-1 é um retrovirus que possui grande variabilidade genética, principalmente no gene que codifica o envelope viral (env). A diversidade de seqüências encontrada na terceira alça variável (alça V3) da gp120 é relacionada a várias características biológicas virais, tais como: habilidade do vírus a induzir sincício, antigenicidade e tropismo viral. O arco da alça V3 é formado por uma seqüência de aminoácidos relativamente conservada (GPGR) nos vírus do subtipo B. No Brasil, encontramos a variante B , que possui a seqüência GWGR formando a região do arco e tem sido associada a uma progressão mais lenta da infecção. O fenótipo viral Não Indutor de Sincício (NSI) predomina nas fases assintomáticas, enquanto que o fenótipo Indutor de Sincício (SI) emerge em indivíduos infectados precedendo um declínio acentuado de células T CD4, sendo associado à progressão para aids. A mudança do fenótipo NSI para SI é resultante da substituição de determinados aminoácidos na alça V3. Mutações que alterem a seqüência de aminoácidos da alça V3, incluindo a região do arco podem ser utilizadas como marcadores genéticos para inferir sobre a evolução da infecção. DNA viral foi isolado a partir de leucócitos e utilizado como fonte para amplificação por PCR e seqüenciamento automático da região da alça V3. Um script desenvolvido pelo setor de Bioinformática foi utilizado para identificar os fenótipos SI/NSI e a seqüência de aminoácidos do arco da alça V3 (GPGR/GWGR) em 1279 pacientes estudados no Estado de São Paulo como parte do projeto VGDN. Esse estudo mostrou que 34,8% dos pacientes possuíam os aminoácidos GPGR formando a região do arco enquanto que 22,8% possuíam GWGR. Além disso, análises estatísticas utilizando o Teste de Goodman apontaram uma prevalência significativa de GWGR em pacientes assintomáticos com fenótipo NSI... / Genomic diversity in HIV-1 is a well-characterized feature and although this heterogeneity is distributed throughout the genome, most of the polymorphisms are located in the envelope gene (env). Sequence variability at the env gene third variable region (V3 loop) of HIV-1 is highly correlated with several viral biological features, such as the ability to induce syncytia, antigenicity and viral tropism. The tip of V3 loop consists of a relative conserved amino acid sequence (GPGR) in subtype B and the presence of GWGR motif in this region has been found in Brazilian strains (B' variant). Non-syncytium-inducing (NSI) phenotype variants predominate in the asymptomatic phase and Sincytium-inducing (SI) phenotype variants emerge in infected patients preceding a CD4 cell decline and correlate with progression to clinical manifestations. The switch from an NSI to an SI phenotype was correlated with one or more basic amino acids substitutions in the V3 loop. Genetic mutations modifying the V3 sequence has been associated with alterations in cytopathic abilities and antigenicity. The patterns of the HIV-1 sequences variability can be used as genetic marker to infer about the infection evolution. Viral DNA isolated from leucocytes was used as a source for PCR amplification and automatic sequencing of the V3 loop gene. Home-made PERL scripts were used to identify NSI/SI phenotypes and GPGR/GWGR motif in 1279 patients studied in São Paulo State, Brazil, as part of VGDN Project (www.lemb.icb.usp.br). This study showed that 34.8% of the patients have had GPGR variants and 22.8% GWGR. In addiction, statistical analysis using Goodman's Test showed GWGR prevailed in asymptomatic patients with NSI strains... (Complete abstract click electronic access below)

Vif (Viral Infectivity Factor) est une protéine auxiliaire qui augmente le «fitness» viral dans l’hôte infecté. Vif est essentielle à la formation de particules virales infectieuses dans les cellules dites «non-permissives», alors que des virus ΔVif se répliquent efficacement dans des lignées cellulaires T dites « permissives ». Les cellules non-permissives expriment les facteurs de restriction APOBEC3G (APOlipoprotein B mRNA-Editing enzyme Catalytic polypeptide 3G ou A3G) et A3F, deux cytidine désaminases dont l’action hypermutatrice est létale pour le virus. Vif réduit de façon considérable le taux d’expression des protéines A3G/3F par deux mécanismes principaux : (1) en recrutant une E3 ubiquitine ligase, Vif induit la dégradation d’A3G par le protéasome et (2) en se fixant sur l’ARNm, Vif régulant négativement la traduction d’A3G par un mécanisme dépendent de la région 5'-UTR. L'objectif de mon projet a été de déterminer le rôle et le mécanisme de la régulation traductionnelle du facteur de restriction A3G par la protéine Vif du VIH-1 ex vivo. En parallèle, nous nous sommes intéressés à déterminer les domaines de la protéine Vif impliqués dans l’activité chaperonne d'ARN. Par l’analyse des « westerns blots » issus de co-transfections de différents vecteurs d’expression d’A3G en présence ou absence de Vif et d’un dominant négative de la Cullin 5, nous avons démontré ex vivo que Vif requiert les tiges boucles 2 et 3 de la région 5’UTR (de façon simultanée) pour inhiber la traduction d’A3G. La régulation traductionnelle d’A3G par Vif cause 50% de la réduction total d’A3G en présence de Vif. Ensuite, nous avons observé qu’une une petite uORF (Upstream Open Reading Frame), contenue entre ces deux tiges-boucles est nécessaire pour l’inhibition d’A3G par Vif. Les uORFs, présents dans 50 % des gènes eucaryotes, interviennent principalement dans des mécanismes de régulation traductionnelle. Ainsi, nous avons observé in vitro et ex vivo que l’uORF régule négativement la traduction de l’ORF majeure d’A3G. Par l’analyse de l’expression de différents mutants de l’uORF, nous avons démontré ex vivo que 60% des complexes d’initiation de la traduction synthétisent A3G par « leaky scanning » et 40 % sont recrutés dans la traduction de l’uORF, en inhibant ainsi l’expression d’A3G. A partir de ces résultats nous proposons un modèle de l’inhibition d’A3G par Vif. Dans ce modèle, Vif pourrais inhiber l’étape de terminaison de la traduction de l’uORF en causant un « stalling » des ribosomes en empêchant ainsi à des nouveaux complexes d’initiation d’attendre l’ORF majeur. Nous avons aussi déterminé l’impact de la régulation traductionnelle d’A3G par Vif sur l’incorporation d’A3G dans les particules virales et sur l’infectivité virale. Nous avons alors observé que l’inhibition traductionnel d’A3G par Vif réduit l’incorporation d’A3G dans les particules virales avec un profil de diminution d’A3G similaire à celui observé dans les cellules. En utilisant des cellules indicatrices TZM-bl, nous avons ensuite observé que l’inhibition traductionnelle d’A3G par Vif augmente l’infectivité virale de 50%. Finalement, nous avons déterminé les domaines de la protéine Vif impliqués dans l’activité chaperonnes d'ARN. En utilisant des essaies de dimérisation des fragments d’ARN du VIH-1, nous avons pu mettre en évidence que le domaine C-terminal de la protéine Vif était impliqué dans cette activité. Ces résultats nous ont permis de mieux comprendre ce phénomène de restriction cellulaire et pourraient être importants dans le développement de nouvelles stratégies d’inhibition de la réplication virale qui ciblerait spécifiquement l’interaction de Vif avec l’ARNm d’A3G. / The HIV-1 viral infectivity factor (Vif) is a small basic protein essential for viral fitness and pathogenicity. Vif allows productive infection of non-permissive cells (including most natural HIV-1 targets) by counteracting cellular cytosine deaminases APOBEC3G (A3G) and A3F by different mechanisms and thus preventing its incorporation into viral particles. The Vif-induced degradation of A3G through the proteasome pathway has been extensively studied, but little is known about the translational repression of A3G mRNA by Vif. After cellular co-transfection of A3G mRNA constructs mutated in their untranslated regions (UTRs) in presence or absence of Vif, and in conditions where the proteasome-induced degradation of A3G was inhibited, we show that the 5’-UTR of A3G mRNA is crucial for the translational inhibition by Vif. The core binding factor, CBF-, required to stabilize the Vif/A3G complex is dispensable for this specific repression. According to our previous secondary structural model of the 5’-UTR, the two distal stem-loop structures are sufficient for a complete translational inhibition of A3G. We show that residue K26 of Vif is critical for A3G neutralization, both for its proteasome-induced degradation and translation inhibition of itsmRNA. Interestingly, we observe a strict correlation between the cellular reduction of A3G through translation inhibition and the quantity of A3G incorporated into viral particles. Both mechanisms account for about 50% decrease of A3G in cell. Thus, we showed for the first time that A3G mRNA translational inhibition by Vif is a 5’-UTR mRNA-dependent mechanism, and that any of these two mechanisms, degradation or translation, is sufficient to restore viral infectivity. Regulating the translation of A3G could thus be considered as a new target to restore a functional expression of A3G and viral restriction.

Um dos maiores problemas encontrados em terapias anti-retrovirais contra AIDS é a emergência de variantes virais que exibem resistência aos fármacos disponíveis e subtiposvirais naturalmente mais suscetíveis ao desenvolvimento de falha terapêutica. Neste trabalho nós resolvemos as estruturas cristalográficas de quatro proteases de HIV-1 complexadas com o inibidor universal C2 simétrico TL-3. As proteases utilizadas foram extraídas de pacientes com AIDS, uma do subtipo B selvagem (Bwt), uma do subtipo F selvagem (Fwt), e um mutante de cada um dos subtipos (Bmut e Fmut), esses dois últimos de pacientes apresentando falha terapêutica. As proteínas foram produzidas por expressão heteróloga em bactérias Escherichia coli, purificadas à partir das proteínas dos corpos de inclusão, e reenoveladas. Os dados coletados foram processados à uma resolução de 2.1 A para o complexo Bwt:TL-3, 1.75 A para Bmut:TL-3, 2.1 A para Fwt:TL-3 e 2.8 A para Fmut:TL-3. Esses dados foram inicialmente processados em P6122 e, posteriormente, reprocessados em P6i. As estruturas foram resolvidas por substituição molecular utilizando a estrutura de uma protease de HIV-1 publicada como modelo. A análise dessas quatro estruturas mostrou que o inibidor TL-3 liga-se de maneira muito próxima em todas elas. Nas proteases Bmut e Fmut a mutação V82A causa um reempacotamento do bolsão SI\', que se reflete num rearranjo da cadeia lateral do inibidor em Pl\'. Nossas análises indicaram, ainda, que algumas substituições polimórficas entre os subtipos B e F podem levar à maior estabilização de regiões naturalmente flexíveis nas proteases do subtipo F, originando uma enzima intrinsicamente menos ativa e resistente à alguns inibidores. Nas proteases Fwt e Fmut, a substituição polimorfica M36I causa um deslocamento do loop entre os resíduos 35-41, que levaria à perda de flexibilidade dos fiaps e do loop 76-83 no sítio ativo. Nossas comparações indicaram também que a substituição L89M nos subtipos não B pode ser equivalente à mutação de resistência L90M em subtipos B. Por fim, esses dados estruturais nos permitiram sugerir modificações na estrutura do inibidor TL-3 que poderiam levar à um aumento da sua potência. Nesta tese também apresentamos os dados de resolução e análise estruturais da L-asparaginase de Escherichia coli, resolvida à uma resolução de 1.95 A no grupo espacial C2. Baseados em dados estruturais e cinéticos propusemos um mecanísmo de reação geral para as amidohidrolases, que incluem as L-asparaginases, através da formação de duas tríades catalíticas Thr-Tyr-Glu e Thr-Lys-Asp, envolvendo as duas treoninas no sítio ativo. Nossas análises do volume da cavidade catalítica de três amidohidrolases também indicam que o aumento da atividade L-glutaminase em algumas enzimas é diretamente proporcional ao aumento do volume dessa cavidade. / One of the major problems faced in antiviral therapy against AIDS is the emergence of viral variants that exhibit drug resistance, as well as viral subtypes naturally more liable to development of therapeutic failure. In this work we solved the crystal structure of four HIV-1 proteases complexed with the universal C2 symmetry-based inhibitor TL-3. These proteases where obtained from patients with AIDS: one of the subtype B wild type (Bwt), one of the subtype F wild type (Fwt), and a mutant of each subtype (Bmut and Fmut), these last two out of patients showing therapeutic failure. The proteins were produced by Escherichia coli bacteria heterologous expression, purified out of the inclusion bodies, and refolded. The collected diffraction data were processed to 2.1 A resolution for the Bwt:TL-3 complex, 1.75 A for Bmut:TL-3, 2.1 A for Fwt:TL-3 and 2.8 A for Fmut:TL-3. These data were initially processed in the P6122 space group and latter reprocessed in P6i. The four structures were solved by molecular replacement using a published HIV-1 protease structure as a model. The structural analysis shown that the TL-3 inhibitor binds in a similar fashion in the active site of all four structures. On the proteases Bmut and Fmut the mutation V82A causes a repacking of the SI\' pocket which rerranges the inhibitor\'s side chain at P1\' subsite. Our analysis further indicate that some polymorphic substitutions between subtypes B and F could lead to a stabilization of naturally flexible regions on subtype F proteases, creating a intrinsically less active resistant enzyme. On the proteases Fwt and Fmut the polymorphic substitution M36I leads to the displacement of the loop between residues 35-41, which would cause a flexibility loss of the flaps and of the loop 76-83 in the active site. Our comparisons further indicate that the polymorphic substitution L89M on non-B subtypes could be equivalent to the L90M resistance mutation on subtype B proteases. Lastly, based on these structural data we were able to suggest a few structural modifications on the TL-3 inhibitor that could furnish a more potent inhibitor. On this thesis we also present the data of structural solution and analysis of the Escherichia coli L-asparaginase solved at 1.95 A resolution in C2 space group. Based on structural and kinetical data we proposed a general reaction mechanism for amidohidrolases, which include L-asparaginases, involving the formation of two catalytic triads Thr-Tyr-Glu and Thr-Lys-Asp, which acounts for the two threonines in the active site. Our cavity volume analysis of three amidohidrolases also indicate that the increasing in the L-glutaminase activity in some enzimes is directly proportional to the increase in the cavity volume.

Ácido ajulêmico (AJA) é um análogo sintético do ácido THC-11-óico, um metabólito do composto tetrahidrocanabinol (THC), principal ingrediente ativo da maconha, uma droga derivada da planta cannabis sativa. A principal característica do composto AJA é que este apresenta potentes efeitos analgésico e antiinflamatório, sem a ação psicotrópica do THC. AJA não é ulcerogênico em doses terapêuticas e encontra-se atualmente na fase I de testes clínicos, apesar de seu mecanismo de ação não ser completamente entendido. Vários estudos têm reportado que AJA se liga de maneira direta a isoforma da família PPAR de receptores nucleares, induzindo sua atividade transcricional em modelos humanos e em ratos, quando administrado em concentrações farmacológicas. Atualmente AJA se encontra em fase I de testes clínicos, sob aprovação do FDA (Food and Drug Adminstration, E.U.A.). Neste trabalho, é determinada e analisada a estrutura cristalográfica do complexo PPAR -LBD:AJA, mostrando que de fato este receptor pode ser o (ou um) mediador da ação terapêutica de AJA in vivo. Na segunda parte da tese é apresentada da estrutura cristalográfica com complexo entre o domínio catalítico da integrase de HIV e parte do coativador transcricional p75 (também conhecido como LEDGF), mostrando as bases estruturais do reconhecimento molecular no hospedeiro por enzimas retrovirais, passo esse crucial para a replicação viral. Tal importância tem sido explorada no desenvolvimento de fármacos anti-retrovirais, que possam inibir o passo de integração do cDNA viral no genoma humano, atacando o sítio ativo da enzima Devido a características da interface observada no modelo cristolográfico, sugerimos tal região pode vir a ser um novo alvo no desenho de pequenas moléculas que interfiram no reconhecimento molecular / Ajulemic acid (AJA) is a synthetic analog of the tetrahydrocannabinol (THC) metabolite THC-11-oic acid. THC is a major active ingredient of the drug marijuana derived from the plant cannabis sativa. It has been shown that AJA has potent analgesic and anti-inflammatory activity without the psychotropic action of THC. At therapeutic doses AJA is not ulcerogenic, making it a promising anti-inflarnatory drug. Furthermore, AJA is currently under phase I of clinical tests by Indevus Phmaceuticals (USA). However, the mechanism of AJA action remains unknown. It has been shown by biochemical assays that AJA binds directly and specifically to the peroxisome proliferators-activated receptor (PPAR) indicating that this may be a potential target for drug-development in the treatment of pain and inflammation. In this work we describe the crystal structure of the ligand binding region of this receptor in complex with ajulêmico acid, showing that in fact they may be partners in vivo, also providing structure-based answers for current questions, for example, the specificity for the isoform . The binding mode of AJA gives clues about modifications on its structure that might lead to development of more specific and potent molecules. In the second half, it is presented the crystal structure of macromolecular complex between the catalytic core domain of HIV-1 Integrase and the integrase-binding domain of LEDGF (also known as p75). Inspection of the crystallographic model suggests the presence of a specific interface, sharing a high number of tight contacts, apparent lentiviral tropism of LEDGF. Also, our results, along with in vitro assays previously reported, encourage efforts to exploit vim-host protein interactions for the development of novel antiretroviral drugs

O Papilomavírus Humano é uma das infecções sexualmente transmissíveis mais comuns no mundo. A história natural da infecção oral pelo HPV não é bem esclarecida e seus fatores de risco não são bem explorados. Pessoas imunocomprometidas, como pacientes infectados pelo HIV, apresentam maior risco para a infecção pelo HPV.Objetivo: determinar a prevalência do HPV no fluído oral de homens infectados pelo HIV e sua relação com os fatores de risco. Casuística: Um total de 283 amostras de lavado oral foram analisadas. Todas as amostras passaram por processos de lavagem, extração de DNA, amplificação do DNA por PCR convencional (MY09/11), eletroforese em gel de agarose e as amostras positivas para HPV DNA foram submetidas à genotipagem do HPV por meio de hibridização. Resultados: A genotipagem do HPV identificou a presença dos tipos 06, 16, 44, 51, 56, 58, 62, 66, 67, 69, 72, 83 e 84. O tipo mais prevalente no grupo de alto risco foi HPV-66 e no grupo de baixo risco HPV-6 e 83. Em relação aos fatores de risco, o tabagismo foi o único fator considerado significativo [OR (CI) = 10,04 (1,98 - 50,92), p>0,01] para a infecção do HPV oral em homens infectados pelo HIV em São Paulo, Brasil Discussão: A prevalência do HPV oral é altamente variável em decorrência de fatores como método de coleta e análises das amostras. Apesar de dados sobre a infecção pelo HPV em homens serem escassos, estudos mostram que grande parte dos homens brasileiros são infectados pelo vírus. O fator de risco principal é a exposição sexual de risco, porém, outros fatores são considerados como possíveis para aquisição do HPV como o tabagismo, consumo excessivo de álcool e a infecção pelo HIV. Conclusão:. A prevalência do HPV oral nos indivíduos estudados foi de 3,5%, e dentre os tipos encontrados, a maioria não são encontrados na vacina do HPV comercialmente disponível. / Human Papillomavirus is one of the most common sexually transmitted infection worlwide. The natural history of oral HPV infection is unclear and its risk factors have not been explored. Immunocompromised people, as exemplified by HIV patients, are at high risk for HPV-infection. Objectives: To determine the prevalence of HPV in the oral tract of HIV-1-positive male subjects and its association with risk factors. Case series: A total of 283 oral wash samples were analyzed. All samples were processed by washing processes, DNA extraction, DNA amplification by conventional PCR (MY 09/11), agarose gel electrophoresis and HPV DNA positive samples were submitted to HPV genotyping by hybridization. Results: HPV genotyping revealed of types 06, 16, 44, 51, 56, 58, 62, 66, 67, 72, 83 and 84; major high risk HPV type identified was HPV-66 and low risk types were HPV-6 and 83. Regarding risk factors, smoking was the only risk factor considered significant [OR (CI) = 10,04 (1,98 - 50,92), p>0,01] for the oral HPVinfection in HIV-1-infected subjects in São Paulo, Brazil. Discussion: The prevalence of oral HPV is highly variable due to factors such as method of collection and analysis. Although data on HPV infection in men are scarce, studies show that most Brazilian men are infected by the virus. The main risk factors are unprotected sexual intercourse, but other factors for this infection have been described elsewhere including smoking, alcohol consumption and HIV-positive serostatus. Conclusion: the prevalence of oral HPV in the individuals studied was 3.5% and among the types analyzed, most are not found in HPV vaccine commercially available.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-09-21T12:07:22Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Jeyzon Valeriano-Dissertacao-2016.pdf: 2220289 bytes, checksum: ac06db6f610b526f0d583eff5e7b11d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-21T12:07:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Jeyzon Valeriano-Dissertacao-2016.pdf: 2220289 bytes, checksum: ac06db6f610b526f0d583eff5e7b11d0 (MD5) Previous issue date: 2016-03-09 / CAPES / CNPq / FACEPE / A Terapia Antirretroviral Altamente Ativa (HAART) foi uma revolução que mudou drasticamente a evolução da infecção pelo HIV, transformando uma doença fatal em uma doença crônica. Efavirenz é um antirretroviral muito eficaz, mundialmente prescrito, presente no tratamento de primeira linha HAART, mas que apresenta uma alta frequência de efeitos neuropsiquiátricos que afetam a adesão ao tratamento, prejudicam a saúde e a qualidade de vida dos pacientes. Neste sentido, este estudo visa identificar polimorfismos genéticos associados à ocorrência de efeitos neuropsiquiátricos relatados no tratamento com Efavirenz em doses padrão. Através da análise retrospectiva dos prontuários dos 162 pacientes HIV positivos que utilizavam Efavirenz, 82 (50,6%) apresentaram efeitos adversos neuropsiquiátricos relacionados, dentre os quais: tonturas, cefaleia, insônia e depressão se mostraram os mais frequentes. Foi demonstrado que o uso da Zidovudina combinado ao Efavirenz, ao invés de Tenofovir (HR: 2,7; p-valor: 0,04), e o sexo feminino (HR: 3,5; p-valor: 0,05) aumentam o risco de tonturas e depressão, respectivamente, ao longo do tempo. Dez sete genes (CYP2B6, ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCC10, NR1I 2p oeli mNoRr1fiIs3m) ofosr eamm analisados. Apenas o polimorfismo no gene ABCC10 (rs2125739), alelo C, foi associado à ocorrência de efeitos adversos neuropsiquiátricos no tratamento com Efavirenz (OR: 2,6; p-valor: 0,03). Análises por regressão logística ajustada para variáveis demográficas, clínicas e genéticas, esta última relacionada ao aumento nas concentrações plasmáticas do Efavirenz, mostraram que os genótipos CT ou CC no rs2125739 estavam ainda mais associados com um risco elevado (OR: 5,1; p-valor: 0,007). Os resultados poderão contribuir para minimizar os riscos de eofceotrivrêidnacdiae ,d eid eefnetiitfoicsa nndeou roppasciqieuniátetrsi cossu sncae ptetírvaepiisa ceo mau Exiflaiavnirdeon z,n am aensteconldhoa sudaa HAART combinada. / Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART) was a revolution that changed the HIV dynamic infection, turning a fatal disease into a chronic one. Efavirenz is a very efficient globally prescribed antiretroviral, present in first line of HAART treatment, but which presents a high frequency of neuropsychiatric adverse effects that affect treatment adherence, damaging the patients’ health and their quality of life. Thus, this study aims to identify genetic polymorphism associated with the occurrence of neuropsychiatric adverse effects in HIV-positive patients submitted to Efavirenz therapy in standard oral doses. Through retrospective analysis of medical records of 162 of these patients, 82 (50,6%) had neuropsychiatric adverse effects related, such as: dizziness, headache, depression and insomnia. Survival analysis demonstrated that the combined use of Efavirenz with Zidovudine instead of Tenofovir increases the dizziness risk (HR: 2.7; p value: 0.04), as well as female sex increases the depression risk (HR: 3.5; p-value: 0.05), both polymorphisms in seven genes (CYP2B6, ABCB1, ABCC1, AB CoCve2r, tAimBeC. CT1e0n, NR1I2 and NR1I3) were genotyped. Only a polymorphism on ABCC10 gene (rs2125739) was associated (C allele) with the neuropsychiatric adverse effects occurrence in treatment with Efavirenz (OR 2.6; p value: 0.03). Logistic regression analysis, adjusted to demographic, clinical and genetic variables related to increased plasma concentrations of Efavirenz, showed that the CT or CC genotypes at rs2125739 were even more significantly associated to a higher risk of neuropsychiatric effects (OR 5.1; p -value: 0.007). The results may help to minimize the neuropsychiatric effects risk in therapy with Efavirenz maintaining its effectiveness by identifying susceptible patients and assisting in the choice of combin ed HAART.