Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-05-06T12:46:44Z No. of bitstreams: 1 2006_Joaquim Xavier da Silva.pdf: 1330147 bytes, checksum: 83e57b736c0b34631ffca17bf6b58d06 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-06T16:44:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Joaquim Xavier da Silva.pdf: 1330147 bytes, checksum: 83e57b736c0b34631ffca17bf6b58d06 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-06T16:44:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Joaquim Xavier da Silva.pdf: 1330147 bytes, checksum: 83e57b736c0b34631ffca17bf6b58d06 (MD5) Previous issue date: 2006-04 / A diminuição da expressão do receptor CD4 da superfície da célula infectada é um dos mais importantes eventos durante a infecção pelo vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV-1). Três proteínas virais, Nef, Env e Vpu, participam neste processo, sugerindo que a remoção do receptor viral possui um papel crítico no ciclo de vida destes retrovírus. Dentro deste contexto, estudos descritos por outros grupos e o nosso, mostraram claramente a relação entre a capacidade de diminuir a expressão do receptor viral e o aumento de infectividade e capacidade replicativa do HIV-1, o que sugere a participação deste fenômeno na patogênese e progressão à doença. Baseado nestes dados, este estudo propõe investigar a presença de possíveis mutações nas seqüências de alelos de vpu, presente em diferentes estágios clínicos da infecção. Por outro lado, aproveitando a abordagem de PCR utilizada, foram também analisadas as seqüências dos alelos do exon 1 do gene rev e do peptídeo sinal do gene env. Na análise dos alelos de vpu em amostras de DNA genômico de células de sangue periférico de 12 pacientes, nos estágios inicial e tardio da infecção, foram detectadas 37 mutações (P3S, -L, I4Q, V6L, I8P, I26F, L41I, L45I, I46R, E59D, - QEE, A74P, W75G, V6I, A7T, V60L, I4E, V6F, I15A, V20I, I26L, R36K, M66T, E50D, -V, I4V, V6S, A14V, S23T, I24L, I26G, R29S, M69L, I78V, D79V, I27G e D79A) nos alelos presentes no estágio inicial, sendo que oito mutações (P3S, -L, L45I, I46R, E59D, -QEE, I15A, M66T) apresentaram diferenças estatisticamente significativas (p<0,05). Após análise dos alelos do exon 1 de rev, foram detectadas seis mutações no estágio inicial da infecção (S5R, E11D, I13L, R14K, L18V e L21F) e uma (I19T) no estágio tardio, sendo que três das presentes no estágio inicial (I13L, R14K, L21F) apresentaram um valor de p<0,05, e a presente no estágio tardio um p>0,05. Finalmente, no peptídeo sinal da proteína Env, foi detectado seis mutações (IRKN, IRRNC, GIKKNC, IRMSC, IRKNC e TLL) no estágio inicial e uma (K16E) no estágio tardio, porém essas mutações, não apresentaram diferenças estatisticamente significativas (p>0,05). A localização das mutações detectadas, assim como, sua possível correlação com os estágios clínicos da infecção, sugerem que estas possam vir a desempenhar importante papel na função das proteínas analisadas e conseqüentemente no curso da infecção. Dessa forma, espera-se que as informações obtidas neste estudo nos permitam posteriormente junto com testes funcionais "in vitro", determinar a relevância fisiológica da proteína Vpu, como das outras regiões analisadas, na patogênese da AIDS. _________________________________________________________________________________________ Abstract / Down-modulation of CD4 receptor expression is one of the most important events during the HIV-1 infection. Three viral proteins, Nef, Env and Vpu participate in this process, suggesting that viral receptor removal from the cell surface exerts a critical role in the retroviral life cycle. In this context, results achieved by for our group and others clearly showed a relationship between the infected cells viral receptor down-modulation and the increased infectivity and viral replication of HIV-1. These data suggest participation of this phenomenon in the pathogenesis and progression to the syndrome. Based on these data, it was investigated the presence of possible mutations in the alleles sequences of vpu, present in different clinical stages of HIV-1 infection. On the other hand, and taking advantage of the PCR approach utilized it was also analysed the allelic sequences of exon 1 rev gene and of env gene signal peptide. The analysis of genomic DNA obtained from peripheral blood samples of 12 patients, in the early and late stage of infection, detected 37 mutations (P3S, -L, I4Q, V6L, I8P, I26F, L41I, L45I, I46R, E59D, - QEE, A74P, W75G, V6I, A7T, V60L, I4E, V6F, I15A, V20I, I26L, R36K, M66T, E50D, -V, I4V, V6S, A14V, S23T, I24L, I26G, R29S, M69L, I78V, D79V, I27G e D79A) in the vpu alleles present in the early stage of infection, of these, eight mutations (P3S, -L, L45I, I46R, E59D, -QEE, I15A, M66T) showed statistically differences significant (p<0,05). Analysis of alleles of exon 1 rev gene, showed six mutations were detected in the initial stage of infection (S5R, E11D, I13L, R14K, L18V e L21F). Of them three (I13L, R14K, L21F), were statistically significant (p<0.05), one mutation (I19T) in late stage was also statistically significant with p>0.05 value. Finally, in the env peptide signal, six mutations were detected (IRKN, IRRNC, GIKKNC, IRMSC, IRKNC e TLL) in the initial stage and one (K16E) in the late stage of infection. Nevertheless, these mutations did not show statistical differences (p>0.05). Mapping of detected mutations, as well as, the possible correlation with different clinical infection stages of AIDS, suggests that Vpu and Env peptide signal could play an important function in the disease evolution. Therefore, we hope these informations, related to mutations in different alleles, would allow us in the near future; allied with in vitro experiments, contribute to the elucidatation the physiological relevance of Vpu protein as also, the other analyzed regions, in the pathogenic mechanisms of AIDS.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T23:42:04Z No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-04T18:29:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-04T18:29:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_KellyCristinaRodriguesSimi.pdf: 4029652 bytes, checksum: b826daae737141b32d0d9e55a96db197 (MD5) / A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é uma doença pandêmica que atinge diversos países no mundo todo. Atualmente, não existe uma vacina eficiente contra o vírus da imunodeficiência (HIV) devido a habilidade do vírus de escapar do sistema imune. Contudo, estudos recentes têm utilizado glicoproteínas do envelope do HIV como potencial alvo para o desenvolvimento de uma vacina capaz de inibir a entrada do vírus na célula hospedeira. Recentemente, nosso grupo selecionou fragmentos de anticorpos (Fabs) de uma biblioteca combinatória de anticorpos de pacientes com osteosarcoma direcionados para um peptídeo sintético de um epítopo neutralizante da gp41. No presente trabalho, foram clonados os Fabs anti-gp41-HIV em vetor de expressão de Pichia pastoris. Após a obtenção das clonagens dos Fabs nesse vetor as respectivas sequências foram confirmadas. A levedura Pichia pastoris tem sido largamente utilizada para a produção de proteínas recombinantes com sucesso. O nível de expressão obtido para os Fabs na levedura Pichia pastoris foi muito baixo. Esses Fabs demonstraram possuir um bom índice de adaptação de códon para a expressão em Pichia pastoris. Dessa forma, ajustes no protocolo de expressão deverão ser realizados. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) is a pandemic deficiency through out the continent. At the moment there is not an efficient vaccine against immunodeficiency virus (HIV) due the virus efficient escape of from the immune system. However, recent studies have used glycoprotein of HIV as a potential target to development a vaccine to inhibit the virus entry into host cells. Recently, our group selected antibody fragments (Fabs) from an antibody combinatorial library of osteosarcoma patients directed to a synthetic biotinilated peptide gp41 neutralizing epitope (576 to 619 amino acids residues). In this work, the Fabs anti-gp41-HIV into a Pichia pastoris were cloned into expression vector. Three Fabs were cloned into this vector with correct sequence. Pichia pastoris has been used extensively and successfully to express recombinant proteins. Unfortunately, the recombinant proteins were expressed in low levels. However, this Fabs showed to have a good codon adaptation index to be expressed in Pichia pastoris, thus adjustment in the protocol must be performed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-10-17T11:57:12Z No. of bitstreams: 1 2011_MikaelAraujoGuimaraesLemos.pdf: 25221855 bytes, checksum: f7f4a4d0e6a3d9806b4cc224ebdda964 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-10-17T13:22:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MikaelAraujoGuimaraesLemos.pdf: 25221855 bytes, checksum: f7f4a4d0e6a3d9806b4cc224ebdda964 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-17T13:22:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MikaelAraujoGuimaraesLemos.pdf: 25221855 bytes, checksum: f7f4a4d0e6a3d9806b4cc224ebdda964 (MD5) / A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV - Human immunodeficiencyVirus) caracteriza-se por uma imunossupressão progressiva e aumento da infectividade e replicação viral. Apesar dos exatos mecanismos moleculares envolvidos na patogênesedo HIV não terem sido completamente elucidados, diversos fatores genéticos do hospedeiro e do vírus foram descritos. Dentre os fatores virais, encontram-se alterações em domínios protéicos de regiões biologicamente ativas de várias proteínas virais. As proteínas acessórias Vif e Vpr participam de diversos mecanismos patogênicos. Dentro deste contexto este projeto teve como principal objetivo caracterizar o pool de seqüências dos genes vif e vpr presentes em amostras de DNA genômico de células de sangue periférico de oito pacientes, sendo três deles em dois estágios da infecção (inicial etardio). Foram obtidas 115 sequências, sendo 57 do gene vif e 58 do gene vpr. A salterações presentes nos diferentes domínios foram correlacionadas com as principais funções biológicas, com a progressão à doença (modelo de regressão linear simples) e com as estruturas terciárias das proteínas. Finalmente foram realizadas análises filognéticas de ambos os genes . Dentre as principais mudanças detectadas para os alelos de vif e vpr, podemos destacar : Em Vpr, L5P, S10P, R73G, R85P, R87K, V57A, G75K ,G75R, nos alelos presentes no estágio inicial e S94G, F72L, W54 por stop codon, presentes nos dois estágios de infecção. No caso de Vif as principais mudanças detectadas foram: W38L, W21 por stop codon, W38 por stop codon, nos alelos do estágio inicial e D101G e D101N em ambos os momentos. A análise da correlação entre as alterações presentes nos alelos de vpr e vif e os diferentes estágios clínicos da infecção pelo HIV-1, revelou que o score influencia a contagem de células CD4+. É possivel notar uma tendência no gráfico de regressão, onde quanto maior é o score, menor é o número de células CD4+. Há portanto uma forte correlação (r = -0,826 [Vpr] e r = -0,840 [Vif])entre as mudanças nas proteínas acessórias Vpr (score 1) e Vif (score 2) e a diminuição das células CD4+. As arvóres filogenéticas geradas com base nas sequências dos alelos de vif e vpr indicam uma tendência de agrupamento entre os alelos dos mesmos pacientes nos estágios iniciais de finais. Não houve significativa mudança estrutural nas sequências analisadas, quando comparadas com a estrutura terciária do consenso do subtipo B. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Human immunodeficiency virus (HIV) is caracterized by a progressive immunossupression and infectivity and viral replication increase. Although the exact molecular mechanisms involved in HIV pathogenesis have not been totally elucidated, several genetic factors of both host and vírus have been described. Among some viralf actors, there are alterations in protein domains of biologically active regions of several viral proteins. The accessory proteins Vif and Vpr participate of many pathogenic mechanisms. Taking this these ideas into consideration, this Project aimed at caracterizing the pool of sequences of vif and vpr genes present in genomic DNA samples of peripheral blood from eight patients, three of them from two different infection stages (early and late). Total of 115 sequences, 57 from vif gene and 58 from vpr gene were obtained. The alterations present at the different domains were correlated to the main biological functions, within the desease progression context (simple linear regression model), and with the protein’s terciary structure. Finally, filogenetic analysis were made for both genes. Among all detected mutations in vif and vpr aleles, we may highlight: in Vpr: L5P, S10P, R73G, R85P, R87K, V57A, G75K , G75R, ate the alleles present in the initiasl state and S94G, F72L, W54 for a stop cod on, present at both infection stages. In the Vif paradigm, the main detected changes were: W38L, W21 for a stop codon, in the early stage aleles and D101G e D101N in both moments. The correlation analysis of changes in vif and vpr aleles and the different clinical stages of HIV-1 infection showed that the influence score affect the CD4+ cells count. It is clearly possible to note a tendency in the regression graphic, being noticeable that when the score increases, CD4+ cells number decreases. Furthermore, there is a strong correlation between the changes in the accessory proteins Vpr (score 1) and Vif (score 2) and the diminish in the CD4+ cells count (r = -0,826 [Vpr] and r = -0,840 [Vif]). The filogenetic trees generated with regard to the sequence of the vif and vpr aleles indicate that there isa tendency in the gathering of the aleles of the same patients in the early and late stages. There hás not been noticed significant changes in the structure of the analysed sequences, when compared to the 3D consensus structure of the subtype B.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-10-13T20:26:55Z No. of bitstreams: 1 2011_MarcosViniciusPereiraGondim.pdf: 3114682 bytes, checksum: d7d4bbec765d574cd1538ad404d8cd94 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-10-17T14:16:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MarcosViniciusPereiraGondim.pdf: 3114682 bytes, checksum: d7d4bbec765d574cd1538ad404d8cd94 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-17T14:16:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MarcosViniciusPereiraGondim.pdf: 3114682 bytes, checksum: d7d4bbec765d574cd1538ad404d8cd94 (MD5) / A diminuição da expressão do receptor CD4 na superfície das células infectadas é um dos mais importantes eventos durante a infecção pelo HIV-1. Foi observada uma clara relação entre a degradação do receptor viral, o aumento da infectuosidade e a replicação viral, sugerindo a participação deste fenômeno na patogênese e progressão da infecção. Para vencer os efeitos negativos exercidos pela expressão da molécula CD4, o HIV possui três proteínas: Nef, Vpu e Env, sendo Nef a proteína mais relevante neste fenômeno. Nef agiria na superfície celular como um conector da cauda citoplasmática da molécula CD4, com membros do complexo adaptador heterotetramérico de clatrina, redirecionando a molécula CD4 para vesículas endocíticas. Uma bomba de prótons vacuolar (V-ATPase) e a proteína Epsn15 foram envolvidas no aumento da força de ligação entre Nef e a subunidade μ2 de AP-2. Com a finalidade de evitar a reciclagem de CD4 para a superfície celular, uma segunda conexão entre CD4 e a proteína β-COP é estabelecida por Nef, o que permite direcionar o receptor para degradação lisossômica. Adicionalmente, duas proteínas foram também envolvidas no mecanismo a tioesterase humana II (hTE-II) e a dinamina 2 (Dyn2). Experimentos para validar o papel dessas proteínas celulares e sua relevância fisiológica não foram conclusivos. Por esse motivo nos propomos neste trabalho a caracterizar as interações entre algumas das proteínas celulares e diferentes alelos da proteína Nef. Os níveis de interação entre as proteínas celulares hTEII, CD4, V1H, β-COP, AP1σ, AP2μ e AP2σ e diferentes alelos da proteína Nef do HIV-1 e de SIV (Nef.NA7, NL4.3 e Mac239, respectivamente), assim como mudança de localização intracelular foram avaliados pelas técnicas de transferência relativa de energia de fluorescência (FRET) e microscopia confocal. As proteínas hTEII, AP2μ e β-COP, embora tenham mostrado elevados níveis de interação com os alelos de Nef NL4.3, NA7 e Mac239, demonstraram importantes diferençaspor FRET e confirmados por microscopia confocal, sendo que algumas proteínas tiveram também sua localização intracelular alterada. Resultados similares foram observados quando analisadas as interações entre as proteínas celulares e o alelo Mac239 de SIV, detectando-se elevados níveis de interação entre este alelo e a proteína celular AP2μ, assim como uma mudança na localização da proteína celular. Já as proteínas V1H, AP1σ e AP2σ AP1 não evidenciaram níveis significativos de interação com os alelos de Nef por ambas as técnicas. As proteínas AP2μ e β-COP e o receptor CD4 mostraram uma significativa interação, mas não foi observado mudanças na localização das mesmas. Adicionalmente, foram construídos vetores lentivirais codificando RNAs de interferência (RNAis) contra as diferentes proteínas celulares e virais, com o intuito de avaliar o impacto fisiológico das mesmas na degradação de CD4 no contexto da infecção viral. A eficiência dos diferentes vetores no silenciamento gênico foi confirmada, entretanto, experimentos exploratórios para avaliar o impacto da inibição da expressão das proteínas celulares na degradação de CD4 mediada por Nef não foram conclusivos, precisando–se realizar experimentos adicionais com mudança nas condições experimentais. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The reduction of the receiver’s expression CD4 in the infected cells surfasse is one of the most importante events during the infectious process by HIV-1. It was observed a clear relationship among the viruses’ receiver degradation, the increase of infectious and virus’ replication, suggesting the participation of this phenomenon in infection pathogenesis and progress. To overcome the negative effects carried on by the molecular expression. CD4, HIV has three proteins: Nef, Vpu and Env, being Nef the most relevant protein in this phenomenon. Nef could act in cell surfasse as a link of the molecular cytoplasmic tail CD4 with the members of the complex adapter hetero tatrameter of clathrin, redirecting the CD4 molecule to the endocytic vesicles. A bomb of vacuole prótons (V- ATPase) and the protein Espn 15 were involved in the increase of bond strength between Nef and the subunit μ2 of AP-2. In order to avoid CD4 recycling to cell surfasse, another connection between CD4 and β-COP proteins is stabilished by Nef, which allows direct the receiver to the lysosomal degradation. Additionally, two proteins were also involved in this mechanism, human tioesterase II (hTEII) and the dynamin 2 (Dyn2). Experiments to validate the role of these cell proteins and its physiological relevance were not conclusive. For this reason we propose in this work characterize the interactions between some cell proteins and Nef’s protein diferente alleles. In both, the interactions and the location levels among some cell proteins as: hTEII, CD4, V1H,β- COP, AP1α, AP2μ and AP2α and diferente alleles of Nef protein of HIV-1 and SIV (Nef. NA7, NL4.3 and Mac 234, respectively), were evaluated by the techniques Relative transference of fluorescence energy (FRET) and Confocal microscopy. The proteins hTEII, Ap2μ and β- COP, although have shown high levels of interaction with Nef NL 4.3, NA7 and mac 239 alleles, demonstrated importante diferences among them. These levels of interaction were detected by FRET and confirmed by Confocal microscopy, of which some proteins also had their intracelular locations changed. Similar results were observed when interactions have happened between cell proteins and similar alleles Mac 239 of SIV, detecting high levels between this allele and the cell protein AP2μ, observing a change in the location of the protein, too. On the other hand, the proteins V1H, AP1α and AP2α, AP1 did not evidence significant levels of interaction with Ned alleles for both techniques. The analysis of interactions between cell proteins and CD4 receiver showed a significant interaction with AP2μ and β- COP proteins, but they did not induce changes in their location. Furthermore, there were lentiviral vectors encoding Interference RNAs (RNAis) against different cell proteins and viral. For the purposes of evaluate the physiological impact of CD4 degradation in viral infection context. The efficiency of different vectors in gene sileencing was confirmed, however, exploratory experiments to rate the impact of inibition in cell protein expression. in CD4 degradation, mediated by Nef, were not conclusive. It is necessary carry out additional experiments with change of experimental conditons.

As variações imunológicas causadas pelo vírus HIV possuem uma grande variação de possibilidades de debilitar as células que apresentam CD4 ou seus coreceptores CCR5 e CXCR4 ( Martinez et al. 1996, Bajetto et al 1997). As alterações celulares iniciam no Sistema Nervoso Central que é o primeiro órgão a ser infectado em contato com o HIV. Quando chega ao SNC o vírus inicia uma série de complexas interações entre as citocinas e ativa os alvos da infecção que são as células microgliais causando encefalopatia e neuropatia (Cohen et al. 1999). Algumas interações ocorrem através do eixo hipotalâmico/hipofisário. O vírus HIV age na hipófise anterior e interfere na liberação de hormônio do crescimento. A homologia observada entre os pentapeptídeos da gp120/HIV e o GHRH (Growth Hormone Release Hormone) demonstram claramente que a gp120/HIV pode interferir com os receptores de VIP/GHRH no hipotálamo e/ou na hipófise parasuprimir diretamente os eventos do GHRH no sistema de liberação do GH (Growth Hormone) (Mulroney et al. 1998). Este fator é sempre associado a qualquer outro sintoma da infecção causada pelo HIV. As alterações clinicas mais importantes desta associação é representada pelo atraso no desenvolvimento em crianças e por perda de massa magra nos adultos (Laue et al. 1990, Mc Kinney et al. 1993). As alterações apresentadas no controle endócrino regulam a liberação de hormônios anabólicos e catabólicos demonstrando a relação com o sistema imune. O exercício físico ativa a ativação do eixo Hipotalâmico/Hipofisário e gera aumento na secreção de Hormônio do Crescimento (Rowland 1993) estimulando efeitos como o aumento da síntese proteica com a promoção do ganho de massa muscular e estimula o crescimento dos ossos. Este processo é maior no exercício agudo do que no exercício crônico. O controle adequado da intensidade e da duração do exercício físico pode equilibrar os benefícios de um programa inicial de treinamento como complemento ao tratamento da doença. As crianças HIV- sofrem alterações induzidas pelo exercício no sistema imune incluindo aumento nos leucócitos, aumento na resposta proliferativa dos leucócitos e aumento na função das células NK e LAK. O interessante é que as crianças HIV+ demonstram menor habilidade para mobilizar neutrófilos e as células que ativam os linfócitos, principalmente NK que crianças HIV- (Pedersen; Hoffmann-Goetz; 2000).

As mutações de resistência aos anti-retrovirais e a diversidade genética do HIV-1 são os principais obstáculos na luta contra a AIDS. O objetivo deste estudo foi descrever a diversidade genética do gene pol do HIV-1 bem como determinar o perfil de mutação de resistência às drogas em indivíduos infectados e sob falha terapêutica no estado do Rio Grande do Sul. Foram colhidas 183 amostras de plasma de pacientes infectados com HIV-1 durante o período de outubro de 2004 a setembro de 2005 para a realização do teste de resistência genotípica no Laboratório da Rede Nacional de Genotipagem do Rio Grande do Sul (Fundação Estadual de Produção e Pesquisa em Saúde). Para a genotipagem foi utilizado o sistema ViroseqTM (Celera Diagnostic-Abbott, EUA). A subtipagem e a avaliação das mutações de resistência para o HIV-1 foram baseadas no gene pol (região da protease e da transcriptase reversa). O subtipo B (53,2%) foi o mais prevalente nos pacientes HIV-1 acompanhados para avaliação de falha terapêutica no Rio Grande do Sul, seguido pelo subtipo C (31.6%) e subtipo F (6.5%). Dos genomas que formaram um grupo monofilético com o subtipo C, 32% tiveram um segmento curto do subtipo B na região da transcriptase reversa, formando um subgrupo com um padrão similar de recombinação e carreando uma nova assinatura de aminoácidos para a região da transcriptase reversa. Outros padrões de recombinação também foram observados (8.2%). Nenhum parâmetro laboratorial ou características sócio-demográficas foi associado a qualquer subtipo específico. Todos os pacientes infectados com vírus recombinantes foram provenientes da região metropolitana. O perfil genotípico das mutações de resistência associadas aos inibidores da transcriptase reversa mostrou uma alta freqüência da mutação M184V seguida das mutações associadas à timidina. A mutação K103N foi a mais prevalente para os inibidores da transcriptase reversa não nucleosídicos e o perfil de mutações associado aos inibidores da protease, mostrou as mutações L63P, M36I/V, e L10V/I como as mais prevalentes. Uma clara associação entre os subtipos e mutações de resistência e polimorfismos associados aos inibidores da protease e da transcriptase reversa foi observada. A manutenção do programa de genotipagem para pacientes infectados pelo HIV-1 é importante para o manejo da terapia anti-retroviral e para o monitoramento da peculiar epidemia molecular do HIV-1 nesta região do Brasil. / The anti-retroviral resistance mutations and viral genetic diversity are the main obstacles in the fight against AIDS. The objectives of the present study are to describe the genetic diversity of HIV-1 pol gene and to determine the drug resistance profile among infected individuals failing highly active antiretoviral therapy in the state of Rio Grande do Sul, Brasil. Plasma samples from 183 patients were collected during the years 2004 and 2005 to perform the viral resistance genotyping at RENAGENO Laboratory from Rio Grande do Sul (Fundação de Produção e Pesquisa em Saúde). Viral resistance genotyping was performed using ViroseqTM Genotyping System (Celera Diagnostic-Abbott, US). The subtyping and evaluation of the anti-retroviral resistance mutations were based on polymerase gene (pol) sequences (protease and reverse transcriptase- RT regions). The subtype B was the most prevalente (53.2%) in HIV-1 patients from Rio Grande do Sul failing HAART, followed by subtype C (31.6%) and subtype F (6.5%). Thirty-two percent of the genomes clustering in clade C have a small clade B segment at the reverse transcriptase, forming a sub-cluster within clade C with a similar CB recombinant structure and carrying new amino acid signatures. Other mosaic genomes were also observed (8,2%). No laboratory parameter or social-demographic issues was associated with any specific subtype. However the infected individuals whit pol recombinants viruses were founded only in metropolitan region. The genotyping profile associated to the reverse transcriptase inhibitors showed a high frequency of the M184V mutation followed by the timidine-associated mutations. The K103N mutation was the most prevalent for the non-nucleoside RT inhibitor and the resistance associated to protease inhibitor showed the minor L63P, M36I/V and L10V/I mutations as the most prevalent. A clear association between subtype and drug resistance mutations or molecular polymorphisms was observed in this study at protease and transcriptase genes. The maintenance of resistance genotyping programs for HIV-1 patients failing HAART is of great importance for the management of ARV therapies and to monitor the peculiar HIV-1 molecular epidemy in this region of Brazil.

Diferentes mecanismos envolvidos no controle da infecção pelo HIV-1 dependem, além de fatores virais, da variabilidade genética do hospedeiro. Assim, foi observado que os receptores tipo Toll (TLRs) endossomais, tais como TLR7, 8 e 9, estão envolvidos no reconhecimento de ácidos nucleicos derivados de vírus, como o HIV-1. Sendo que TLR7/8 reconhecem RNA simples fita (ssRNA) e TLR9 reconhece DNA dupla ou simples fita (ssDNA/dsDNA). Observou-se que o ssRNA derivado de HIV-1 é reconhecido pelos TLR7/8, os quais estimulam células dendríticas (DCs) e macrófagos à produção de interferons (IFNs) e citocinas pró-inflamatórias. Também foi observado que a proteína gp120 do HIV inibe a ativação das DCs plasmocitóides (pDCs), que expressam TLR9, consequentemente inibindo produção de IFN-α. Variantes nos genes TLR7/8/9 já foram associadas com a infecção ao HIV-1 e outras doenças inflamatórias, autoimunes e infecciosas. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência dos polimorfismos genéticos potencialmente funcionais: rs179008 no TLR7, rs3764880 no TLR8, rs5743836 e rs352140 no TLR9 em 366 pacientes adultos HIV+ e 415 indivíduos adultos saudáveis provenientes do sul do Brasil. O polimorfismo rs5743836 do TLR9 foi genotipado através da técnica de PCR alelo específico BIPASA enquanto que os demais polimorfismos por PCR-RFLP. As frequências genotípicas e haplotípicas foram comparadas usando o teste de Qui-quadrado e as frequências alélicas usando o teste Exato de Fisher. As comparações foram realizadas subdividindo os indivíduos de acordo com a origem étnica e o sexo. Quando comparamos indivíduos HIV+ eurodescendentes com o grupo controle, observamos diferenças nas frequências alélicas e genotípicas para o polimorfismo rs5743836 no TLR9 (P=0,011 e P=0,028, respectivamente), sendo que a frequência do genótipo CC foi maior nos pacientes quando comparado com os controles (residual P=0,040) conferindo susceptibilidade à infecção (OR=1,53; 95% IC: 1,05-2,23; P=0,030, modelo dominante). Na comparação dos indivíduos HIV+ afrodescendentes com o grupo controle, houve uma menor frequência do genótipo TC nos pacientes (residual P=0,006), sendo que esse genótipo foi associado com proteção à infecção (OR=0,60; 95% IC: 0,36-0,99; P=0,049, modelo dominante). Na análise de haplótipos dos polimorfismos rs5743836 e rs352140 do TLR9, as frequências haplotípicas estimadas não foram diferentes na comparação entre pacientes e controles. Em relação aos polimorfismos do TLR7 e TLR8 também não observamos diferenças nas frequências alélicas e genotípicas quando comparamos pacientes e controles. Nossos resultados demonstram o papel fundamental do polimorfismo rs5743836 na infecção do HIV e a importância do background genético entre os grupos étnicos que influenciam na susceptibilidade frente ao vírus. / Different mechanisms are involved in the control of HIV infection, as viral factors and genetic variability on the host. Thus, intracellular Toll-like receptors (TLRs), such as TLR7/8/9, are involved in the recognition of nucleic acids derived from viruses. TLR7/8 recognizes simple RNA strand (ssRNA) and TLR9 recognizes simple or double DNA strand (ss/dsDNA). It was showed that the ssRNA derived from HIV is recognized by TLR7/8 and stimulates DCs and macrophages to secrete IFN-α and proinflammatory cytokines. Also, a direct interaction of HIV gp120 with pDCs inhibits TLR9-mediated responses, including pDC activation and IFN-α secretion. TLR7/8/9 polymorphisms have been associated with HIV infection and other inflammatory autoimmune and infectious diseases. The aim of this study was to evaluate the influence of the rs179008 TLR7, rs3764880 TLR8 and rs5743836/rs352140 TLR9 polymorphisms, potentially functional, in 366 HIV+ adults patients and 415 healthy adults subjects from the Southern Brazil. The rs5743836 polymorphism was genotyped by allele specific PCR-BIPASA while the other variants by PCR-RFLP. Genotypic and haplotypic frequencies were compared using the Chi-square test and allele frequencies using the Fisher's exact test. The comparisons were made by subdividing the sample according to ethnicity and gender. In European-derived individuals, differences in genotypic and allelic frequencies was observed for the rs5743836 as compared patients with controls (P=0.028 and P=0.011, respectively). Also, a higher frequency for the CC genotype in patients as compared with controls (residual P=0.040), this genotype conferring susceptibility to HIV-1 infection (OR=1,53; 95% CI: 1,05-2,23; P=0,030, dominant model). In African-derived individuals, was observed that the rs5743836 TC genotype frequency was lower in patients as compared to controls (residual P=0,006) being associated with protection against to HIV infection (OR=0,60; 95% CI: 0,36-0,99; P=0,049). No differences in allelic and genotypic frequencies were observed for the TLR7/8 polymorphisms or haplotypic frequencies of TLR9 variants, comparing patients and controls. Our results suggest that the rs5743836 TLR9 polymorphism has an important role in HIV-1 infection since it was associated with susceptibility in Euro-derived and Afro-derived individuals. Keywords: TLRs, HIV-1, ethnicity, polymorphisms.

Submitted by Andre Moraes Queiroz (andre.moraesqueiroz@ufpe.br) on 2015-04-14T14:12:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Antonio Coelho.pdf: 871850 bytes, checksum: 65f954df216fcb2b29d2b8b7f7072e49 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T14:12:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Antonio Coelho.pdf: 871850 bytes, checksum: 65f954df216fcb2b29d2b8b7f7072e49 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / FACEPE; CNPq / A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) pode promover a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Os antirretrovirais reduziram as mortes relacionadas a AIDS. Os antirretrovirais são absorvidos e metabolizados em diversas células. Existe variabilidade na resposta a esses medicamentos. Portanto, polimorfismos genéticos em vias farmacocinéticas podem afetar o resultado terapêutico. O objetivo do presente estudo foi avaliar se diferentes perfis genéticos estão relacionados com a falha virológica de antirretrovirais de primeira linha, definida como presença de carga viral detectável no sangue apesar de um ano de terapia. Foram recrutados 187 pacientes em tratamento na região metropolitana de Recife – PE para um estudo de caso controle (160 sucessos e 27 falhas). Foram analisadas variáveis clínicas e epidemiológicas, como sexo, idade e massa corporal, medicamentos prescritos, carga viral e contagem de células T CD4+. Sete polimorfismos em cinco genes (ABCB1, ABCC1, CYP2B6, SLC22A1 e SLCO3A1) foram genotipados. Não foram observadas associações entre os polimorfismos dos genes CYP2B6, SLC22A1 e SLCO3A1 com a falha virológica. Análises por regressão logística indicaram que polimorfismos nos genes ABCB1 (rs1045642) e ABCC1 (rs212091) estiveram significativamente associados com a ocorrência de falha de esquemas contendo inibidores de protease (OR=5,01, p=0,045 e OR=6,50, p=0,02, respectivamente). Os resultados poderão contribuir para o entendimento da variabilidade na resposta ao tratamento anti-HIV e ajudar a identificar pacientes em risco de falha, auxiliando na orientação da escolha do primeiro esquema terapêutico.

Made available in DSpace on 2018-03-07T17:02:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) silvana_portes_ioc_dout_2017.pdf: 8610199 bytes, checksum: 0cccd6bb223121b0a0613dee1f34758f (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os vírus gastrentéricos são associados à casos esporádicos e surtos de doença diarreica (DD). A DD é uma complicação frequente em crianças imunocompetentes e imunocomprometidas. O objetivo principal deste estudo, foi avaliar a frequência de detecção dos vírus gastroentéricos (rotavírus [RVA], norovírus [NoV], astrovírus [HAstV] e adenovírus [HAdV]) ou emergentes (bocavírus [HBoV] e aichivírus [AiV-1]), em crianças hospitalizadas com DD, infectadas ou não infectadas pelo HIV-1, no estado do Rio de Janeiro. Neste contexto, as taxas de detecção destes vírus nessas crianças, foram descritas e comparadas e, a infecção recorrente de HAdV em crianças soropositivas para HIV-1, foi avaliada. Além disso, foi possível investigar a etiologia viral de um surto de DD ocorrido no Rio de Janeiro, em 2013. O RVA foi detectado por ensaio imunoenzimático (EIE) e por eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), sendo caracterizado por semi-nested multiplex RT-PCR. Os NoV, HAdV,HAstV, HBoV e AiV-1 foram detectados e caracterizados através da PCR ou RT-PCR e sequenciamento. A carga viral dos RVA, NoV, HAstV, HAdV e HBoV foram determinadas nas fezes das crianças estudadas. Nossos resultados, mostraram que o AiV-1, NoV, HBoV e HAdV foram significativamente mais frequentes entre as crianças HIV-1 soropositivas, enquanto RVA e HAstV foram significativamente menos frequentes entre essas crianças. A circulação do AiV-1 genótipos A e B foi demonstrada nas crianças estudadas. Foram observadas coinfecções nas crianças estudadas, sendo mais frequentes nas crianças com AIDS A mediana da carga viral de HAstV nas fezes das crianças estudadas, foi significativamente maior entre as crianças HIV-1 positivas em comparação com crianças HIV-1 negativas, enquanto que para RVA, NoV, HBoV e HAdV, não hove significância nas medianas das cargas virais nas fezes destas crianças. NoV e o HBoV foram significativamente mais frequentes entre crianças com contagem de linfócitos TCD4+<200 células/mm3. Os dados apontam o NoV, AiV-1 e HAdV como patógenos oportunistas, infectando crianças com AIDS e DD. A diversidade genética foi demonstrada, sendo possível apresentar as variantes circulantes para os vírus estudados. A infecção recorrente por HAdV foi detectada entre as crianças HIV-1 soropositivas, com HAdV-F40, -F41 e D associados a diarreia crônica e persistente. O HAdV foi o único vírus detectado no surto de 2013, no Rio de Janeiro, sendo o HAdV-A12 associado ao surto. Os resultados obtidos neste estudo, monstram que os vírus gastroentéricos e emergentes devem ser considerados como causas importantes de DD em crianças HIV-1 soropositivas. Além disso, este estudo enfatiza a importância de investigar os vírus gastroentéricos e emergentes em casos de DD, especialmente em surtos, visando a vigilância desses vírus em DD em países onde a vacinação com RVA é rotineiramente realizada / Gastroenteric viruses are associated with sporadic cases and outbreaks of diarrheal disease (DD). DD is a frequent complication in immunocompetent and immunocompromised children. The main objective of this study was to evaluate the frequency of detection of gastroenteric (rotavirus [RVA], norovirus [NoV], astrovirus [HAstV] and adenovirus [HAdV]) or emergent (bocavirus [HBoV] and aichivirus [AiV-1]) viruses in children hospitalized with DD, infected or not infected by HIV-1, in the state of Rio de Janeiro. In this context, detection rates of these viruses in these children were described and compared, and recurrent HAdV infection in children HIV-1 seropositive was evaluated. In addition, it was possible to investigate the viral etiology of a DD outbreak occurred in Rio de Janeiro in 2013. The RVA was detected by immunoenzymatic assay (EIE) and by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), characterized by semi-nested multiplex RT-PCR. NoV, HAdV, HAstV, HBoV and AiV-1 were detected and characterized by PCR or RT-PCR and sequencing. The viral load of RVA, NoV, HAstV, HAdV and HBoV were determined in the feces of the studied children. Our results showed that AiV-1, NoV, HBoV and HAdV were significantly more frequent among children HIV-1 seropositive, whereas RVA and HAstV were significantly less frequent among these children. The circulation of the AiV-1 genotypes A and B was demonstrated in the studied children. Coinfections were observed in the studied children, being more frequent in children with AIDS The median HAstV viral load in the feces of the children studied was significantly higher among children HIV-1 seropositive compared to children HIV-1 seronegative, while for RVA, NoV, HBoV and HAdV, there is no significance in the medians of the viral loads in the feces of these children. NoV and HBoV were significantly more frequent among children with TCD4 + cells <200 cells / mm3. The data point to the NoV, AiV-1 and HAdV as opportunistic pathogen infecting children with AIDS and DD. The genetic diversity was demonstrated, being possible to present the circulating variants for the virus studied. Recurrent HAdV infection was detected among children HIV-1 seropositive with HAdV-F40, -F41 and D associated with chronic and persistent diarrhea. HAdV was the only virus detected in the 2013 outbreak in Rio de Janeiro, with HAdV-A12 associated with the outbreak. The results obtained in this study, show that the gastroenteric and emergent viruses should be considered as important causes of DD in children HIV-1 seropositive. In addition, this study emphasizes the importance of investigating the gastroenteric and emergent viruses in cases of DD, especially in outbreaks, aiming the surveillance of these viruses in DD in countries where vaccination with RVA is routinely performed

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-02-24T20:04:38Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Regyane Ferreira Guimarães Dias - 2015.pdf: 6640888 bytes, checksum: 32d26ee8f08840eec10eaca06583b3b8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-02T11:00:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Regyane Ferreira Guimarães Dias - 2015.pdf: 6640888 bytes, checksum: 32d26ee8f08840eec10eaca06583b3b8 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-02T11:00:27Z (GMT). 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This study goal to trace the clinical and epidemiological profile of HIV/AIDS patients attended at Jataí city between 2005-2015 and, among patients under ART at the year 2015, the resistance mutations and the HIV-1 subtypes were determined. From 539 HIV/AIDS patients attended at Jataí, most were male, with infection prevalence among the age group of 30-34 and 40-49 years. Among female patients, the infection occurred mainly among 19-24 and 40-49 years. The sexual unprotected exposure category to HIV-1 prevailed, being the heterosexual preference predominant. The majority of patients were symptomatic at the diagnosis, being the weight loss the predominant complaint. The pneumocystosis and toxoplasmosis were the most frequent opportunistic infections related to AIDS. The AIDS was the cause of death in most cases. Regarding patients on ART, there was significant difference between the CD4+ T cell counts median and the viral load median (on admission) and at final (current lab result). The genotyping test for the subtypes identification and ARV resistance mutations was performed among 26 samples of ART patients, wherein 21 samples were amplified. The HIV-1 subtype B prevailed (19/21) and 2/21 classified as F1 subtype. The secondary resistance prevalence was 52.4%. Most isolates with resistance (7/11) had mutations at more than one ARV class and four isolates had mutations for a single class. The most frequent mutation was M184V, followed by K103N and thymidine associated mutations (TAMs-D67N, M41L, L210W and T215Y). The data presented in this study contributes to the HIV-1 diversity mapping and ARV resistance surveillance among patients from the Southwest region of Goiás state and will certainly be useful for local epidemiological surveillance specific actions. / O atual cenário da epidemia da infecção pelo HIV no Brasil inclui a “interiorização”, “heterossexualização” e aumento da emergência de cepas resistentes aos esquemas de terapia antirretroviral (TARV). O município de Jataí é responsável pelo diagnóstico e tratamento dos pacientes portadores de HIV/aids de municípios da regional Sudoeste II de Goiás e já esteve entre as cidades com a maior taxa de detecção de casos de aids do estado. O perfil epidemiológico dos pacientes infectados pelo HIV de municípios de pequeno e médio porte é ainda pouco conhecido, assim como a prevalência de resistência aos ARVs. Este estudo teve como objetivo traçar o perfil clínico e epidemiológico dos pacientes HIV+/aids atendidos em Jataí entre os anos de 2005 a 2015 e, entre os pacientes em TARV no ano de 2015, identificar mutações de resistência aos ARVs e os subtipos do HIV-1. De 539 pacientes HIV+/aids atendidos em Jataí, a maioria era do sexo masculino, com predomínio da infecção na faixa etária de 30 a 34 e 40 a 49 anos. Entre pacientes do sexo feminino, a infecção ocorreu predominantemente entre 19 a 24 e 40 a 49 anos. A categoria da exposição ao HIV-1 sexual sem proteção prevaleceu, sendo dominante a preferência heterossexual. A maioria dos pacientes era sintomático ao diagnóstico, sendo a perda ponderal a queixa predominante. A pneumocistose e a neurotoxoplasmose foram as infecções oportunistas relacionadas à aids mais frequentes e a aids foi a causa básica do óbito na maioria dos casos. Entre os pacientes em TARV houve diferença significante entre as medianas das contagens de células T CD4+ e entre as medianas da quantificação da carga viral inicial (na admissão) e final (atual). O teste de genotipagem para a identificação dos subtipos e resistência aos ARVs foi realizado em 26 amostras de pacientes em TARV, sendo 21 amostras amplificadas. O subtipo B prevaleceu (19/21) e 2/21 foram classificadas como subtipo F1. A prevalência de resistência secundária foi de 52,4%. A maioria dos isolados com resistência (7/11) apresentou mutações a mais de uma classe de ARVs e 4 isolados para uma única classe. A mutação mais frequente foi a M184V, seguida da K103N e de mutações associadas à timidina (TAMs-D67N, M41L, L210W e T215Y). Os dados apresentados neste estudo contribuem para o mapeamento da diversidade do HIV-1 e da vigilância da resistência aos ARVs em pacientes do Sudoeste goiano e, certamente serão úteis para o planejamento de ações específicas de vigilância epidemiológica local.