Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Final Luana Karen.pdf: 1636172 bytes, checksum: c9eb81400c0c198ae103082ad8f70318 (MD5) Previous issue date: 2007-11-16 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is characterized by a wide genetic diversity. Two types of HIV are recognized at present: HIV-1 and HIV-2. The HIV-1, responsible for most of the cases of AIDS in the world, is divided in three groups denominated M (Major), O (Outlier) and N (Non-M/Non-O), and until this moment nine subtypes of the group M (A-D, F-H, J-K) were already identified. Beyond of those subtypes, the HIV-1 also have been classified in circulating recombinant forms (CRFs) and unique recombinant forms (URFs). In Brazil, a pattern complex of distribution of those subtypes has been described in their different geographical areas. In search of elucidating the predominant subtypes of HIV-1 in the city of Manaus, this study had as objective to analyze blood samples of subjects that presented results positive or indeterminate for HIV, in the systematic selection of blood donors of the Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (HEMOAM). In the moment of the collect, the donors registered their authorization by the signature of the free consent and knowledge term and they answered a questionnaire used for epidemic data investigation. DNA proviral extracted of the samples with indeterminate/positive resulted in Western Blot was submitted a Polimerase Chain Reaction in two stages (Nested PCR) for the confirmation of the HIV-I infection. The amplified products (regions gag, pol and env) of the 31 samples reactivate for PCR were automatically sequencing and analyzed phylogenetically by the Phylip program. All of the indeterminate samples for the confirmatory test presented negative amplification pattern. Of the reactivates samples for HIV in the confirmatory test and PCR, it was observed male predominance (77,4%) and in the donors of first time (67,7%). Among the repetition donors, 60% presented seroconvertion in up to 20 months. Of the total of samples, was identified the predominance of the subtype B (87,1%), following by the subtype C (6,5%), F (3,2%) and recombinant BF (3,2%). The amino acids sequences of 19 isolated were analyzed for the genetic variability characterization of the region of the loop V3. Among the isolated of the subtype B, the tetrapeptide more prevalente was GPGR (68,4%), following by the Brazilian variant B" GWGR (15,8%). The Subtype C occurrence in the North Region still was not reported in the literature. The analyses of similarity of the isolated of the subtype C in this study demonstrated larger similarity of these with other isolated ones brazilian, in relation to isolated in other parts of the world. Our results can contribute to a better understanding of the characteristics of the lineages of the HIV-1 circulating in Brazil, information that can be used in benefit of the diagnosis, treatment, control of the disease and preparation of vaccines. / O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é caracterizado por uma ampla diversidade genética. Dois tipos de HIV são reconhecidos atualmente: HIV-1 e HIV-2. O HIV-1, responsável pela maioria dos casos de aids no mundo, é dividido em três grupos denominados M (Major), O (Outlier) e N (Non-M/Non-O). Para o grupo M, nove subtipos foram identificados até o momento: A-D, F-H, J, K. Além desses subtipos, o HIV-1 também tem sido classificado em formas recombinantes circulantes (CRFs) e formas recombinantes únicas (URFs). No Brasil, um complexo padrão de distribuição desses subtipos tem sido descrito em suas diferentes regiões geográficas. Buscando esclarecer a distribuição dos subtipos de HIV-1 predominantes na cidade de Manaus, este estudo teve como objetivo analisar amostras de sangue de indivíduos candidatos a doadores de sangue que apresentaram resultados positivo ou indeterminado para HIV-1, na triagem sistemática para doação de sangue da Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (HEMOAM). Na ocasião da coleta, os doadores registraram a sua autorização através da assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido e responderam a um questionário utilizado para investigação de dados epidemiológicos. O DNA proviral extraído das amostras com resultados indeterminado/positivo no Wersten Blot foi submetido a uma Reação em Cadeia da Polimerase em duas etapas (Nested PCR) para a confirmação da infecção pelo HIV-1. Os produtos amplificados (regiões gag, pol e env) das 31 amostras reativas por PCR foram seqüenciados e analisados por métodos filogenéticos usando o programa Phylip. Todas as amostras indeterminadas para o teste confirmatório apresentaram padrão de amplificação negativo. Das amostras reativas para HIV-I no teste confirmatório e PCR, observou-se predominância do sexo masculino (77,4%) e de doadores de primeira vez (67,7%). Entre os doadores de repetição, 60 % apresentaram soroconversão em até 20 meses. Do total de amostras, identificou-se a predominância do subtipo B (87,1%), seguida do subtipo C (6,5%), F (3,2%) e recombinante BF (3,2%). As seqüências de aminoácidos de 19 isolados foram analisadas para a caracterização da variabilidade genética da região da alça V3. Dentre os isolados do subtipo B, o tetrapeptídeo mais prevalente foi o GPGR (68,4%), seguido pelo variante brasileiro B GWGR (15,8%). A ocorrência do Subtipo C na região Norte, ainda não foi relatada na literatura. As análises de similaridade dos isolados do subtipo C nesse estudo demonstraram maior semelhança destes com outros isolados brasileiros, em relação a isolados de outras partes do mundo. Nossos resultados contribuem para uma melhor compreensão das características dos isolados do HIV-1 circulantes no Brasil, informações que poderão ser utilizados em benefício do diagnóstico, tratamento, controle da doença e preparação de vacinas.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2014-10-08T21:49:25Z No. of bitstreams: 2 Dissertação de Mestrado Mônica Reis19_07.d oc.pdf: 1532492 bytes, checksum: b88a88ff0daba799bc2fd5e3082c7928 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-10-09T11:13:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação de Mestrado Mônica Reis19_07.d oc.pdf: 1532492 bytes, checksum: b88a88ff0daba799bc2fd5e3082c7928 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-09T11:13:03Z (GMT). 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The env gene gp41 fragment of 766 bp (FP, HR1, HR2, TM regions) was amplified by “nested”-PCR from cDNA and sequenced among 110 patients (Big Dye Terminator Sequencing v. 3.1, Applied Biosystems, EUA; ABI Prism 3130). HIV-1 subtypes were assigned by REGA tool and by phylogenetic analyses (Neighbor-Joining, Kimura 2-P). T-20 resistance mutations were analyzed according to the IAS/USA, Stanford online HIV Drug Resistance Database and other sources. The median age of pregnant women (n=110) was 26 years (16-42 years), 16% were AIDS cases. The frequency of natural resistance (N42D, L44M and R46M) to T-20 was 5.4% (6/110). All resistance mutations were identified in HIV-1 subtype B isolates within the HR1 region of the gp41 fragment. The prevalence of compensatory mutations in HR2 region of gp41 was 20.9% (23/110): S138A (n=11), E137K (n=10) e N126K (n=2). All 110 isolates presented several polymorphisms. The following polymorphisms were observed in FP of gp41: M24I/L/V, I7M/V, and I4A/F/L/M. In 42.7% (47/110) of isolates many indels within the gp41 FP fragment were observed. Polymorphisms identified in HR1 were: K77E/L/Q/R/V, I69V, L54M, R46K/Q, N42S and Q32L/N. Polymorphisms in HR2 gp41 region were: S157D/N, E151A/K/Q, E148D, I135L, S133D/E/N/Q/R/T, H132F/Y, L130E/I/T, S129D/G/N/Q, N125A/D/E/S, R122K, N121E/D and E119Q. Moderate rate of natural resistance for T-20 and higher prevalence of polymorphisms in env gp41 region were described. Moreover higher prevalence of HIV-1 “non- B subtypes” C and F1 was observed. These molecular data may contribute to better therapeutic and MTCT preventive strategies for pregnant women infected with HIV-1. / Nas gestantes infectadas pelo HIV-1, a presença de mutações associadas à resistência aos antirretrovirais (ARV) representa um desafio para a prevenção da transmissão materno-infantil do HIV-1 e para futuras opções de tratamento materno. Este estudo teve como objetivo avaliar a presença de mutações na gp41 associadas à resistência natural ao inibidor de fusão T-20, polimorfismos e subtipos do HIV-1 em gestantes nunca tratadas com T-20 e com diferentes níveis de exposição a outros ARVs. Um total de 153 gestantes infectadas pelo HIV-1 (virgens de tratamento ARV, em profilaxia para TV ou em tratamento com ARV) foi recrutado entre junho/2008-junho/2010. O fragmento de 766 pb da gp41 do gene env (porções PF, HR1, HR2 e TM) foi amplificado por “nested”-PCR a partir de cDNA e sequenciado em 110 pacientes (Big Dye Terminator Sequencing v. 3.1, Applied Biosystems, EUA; ABI Prism 3130). Os subtipos do HIV-1 foram identificados pelos softwares REGA HIV-1 e por inferência filogenética (Neighbor-Joining, Kimura 2-P). Mutações associadas à resistência natural ao T-20 foram analisadas por comparação com o banco de dados da IAS-USA, Stanford HIV Drug Resistance Database e outras fontes. A mediana de idade das gestantes (n=110) foi de 26 anos (variação 16-42 anos), 16% eram casos sintomáticos. Mutações associadas à resistência natural para T-20 (N42D, L44M, R46M) foram encontradas em 5,4% (6/110). Todas as mutações associadas à resistência foram descritas nos isolados do subtipo B no fragmento HR1 da gp41. A prevalência de mutações compensatórias foi de 20,9% (23/110): S138A (n=11), E137K (n=10) e N126K (n=2). Todos os 110 isolados apresentaram vários polimorfismos. Os polimorfismos encontrados no fragmento PF da gp41 foram: M24I/L/V, I7M/V e I4A/F/L/M. Em 42,7% (47/110) dos isolados apresentaram várias inserções e deleções dentro do fragmento FP da gp41. Os polimorfismos na região HR1 foram: K77E/L/Q/R/V, I69V, L54M, R46K/Q, N42S e Q32L/N. Polimorfismos na região HR2 da gp41 foram: S157D/N, E151A/K/Q, E148D, I135L, S133D/E/N/Q/R/T, H132F/Y, L130E/I/T, S129D/G/N/Q, N125A/D/E/S, R122K, N121E/D e E119Q. Moderada prevalência de resistência natural ao T-20 e elevada frequência de polimorfismos na região da gp41 foram descritas. Além disso, uma alta prevalência de “subtipos não-B” C e F1 de HIV-1 foram observados. Estes dados moleculares podem contribuir para estratégias terapêuticas e profiláticas mais eficazes para gestantes infectadas pelo HIV-1.

A principal via de infecção pelo HIV-1 em crianças é a transmissão materno-infantil (TMI). Estimativas para taxas de TMI do HIV-1 são de 3% entre gestantes sob terapia antirretroviral e de 25 a 30% para as não tratadas. Apesar da exposição viral durante a gestação, a maioria dos recém-nascidos não são verticalmente infectados, o que sugere a existência de barreiras protetoras à TMI do HIV-1. Diversos fatores podem estar associados com a TMI do HIV-1. Polimorfismos genéticos são descritos em associação com a infecção pelo HIV-1, incluindo os dos antígenos leucocitários humanos (HLA). A molécula HLA-G tem sido implicada nas interações imunológicas materno-fetais e é expressa em células da placenta, especificamente nos citotrofoblastos extravilosos, que formam a camada responsável pela interface entre os tecidos fetais e maternos. Este estudo avaliou os polimorfismos de inserção e deleção de 14pb do HLA-G na TMI do HIV-1. Participaram do estudo, 86 duplas de mães e filhos, sendo 58 duplas de mãe-filho em que a TMI do HIV-1 não ocorreu e 28 duplas em que a TMI ocorreu. Os resultados mostraram maior frequência de genótipo deleção/deleção em mães pertencentes ao grupo TMI positiva, sem utilização de antirretrovirais (p=0,05). Foi observada associação significante entre conhecimento prévio da soropositividade, realização de pré-natal, utilização de antirretrovirais na gestação e não amamentação com a prevenção da TMI (p<0,05). Nesse contexto, a enfermagem pode contribuir com ações que envolvem o pré-natal, parto e puerpério, por meio de aconselhamento quanto à realização do teste anti- HIV-1 no pré-natal, utilização adequada de antirretrovirais e promoção de práticas ideais de alimentação infantil. Adicionalmente, o estudo contribui para a ampliação de conhecimentos da enfermagem sobre a temática do HLA-G na TMI, e destaca a importância de que a enfermagem, fundamentada em ciências biológicas, esteja envolvida na produção de conhecimentos e tecnologias, o que reflete na melhoria da prestação do cuidado ao paciente. / The main way of HIV-1 infection in children is mother-child transmission (MTCT). TMI rates estimates for HIV-1 are 3% in pregnant women in antiretroviral therapy and 25 to 30% for untreated ones. Despite the viral exposure during pregnancy, most newborns are not vertically infected, suggesting the existence of protective barriers to TMI of HIV-1. Several factors may be associated with MTCT of HIV-1. Genetic polymorphisms are described in association with HIV-1, including the human leukocyte antigens (HLA). The molecule HLA-G has been implicated in maternal-fetal immune interactions and is expressed in placenta cells, particularly in extravillous cytotrophoblasts, forming the layer responsible for the interface between fetal and maternal tissues. This study evaluated the HLA-G 14pb insertion and deletion polymorphisms in MTCT of HIV-1. Participated in the study 86 mother-child pair, 58 mother-child pairs in which the MTCT did not occur and 28 doubles in which the MTCT occurred. The results showed a higher frequency of genotype deletion/deletion in mothers in which MTCT occurred belonging to the group without using antiretroviral (p=0.05). Significant association was observed between prior knowledge of seropositivity, conducting prenatal, use of antiretroviral during pregnancy and not breastfeeding to the prevention of MTCT (p <0.05). In this context, nursing can contribute to actions involving prenatal, birth and postpartum, conducting counseling for the conduct of HIV testing during prenatal care, proper use of antiretroviral and promotion of optimal infant feeding practices. Additionally, the study contributes to the expansion of nursing knowledge about the topic of HLA-G in MTCT, and highlights the importance of nursing, grounded in basic sciences, is involved in the production of knowledge and technology, which reflects improvement in the provision of patient\'s care.

A compilação mais recente dos dados mundiais indica que anualmente 466.000 novos casos de câncer cervical são detectados em todo mundo. A infecção pelos tipos oncogênicos do papilomavírus humano (HPV), constitui importante fator de risco para o desenvolvimento do câncer do colo uterino. Em mulheres portadoras do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), tem sido demonstrado o aumento na prevalência e persistência da infecção por HPV oncogênicos, justificando o aumento da susceptibilidade destas mulheres para o desenvolvimento das lesões cervicais, lesões precursoras do câncer do colo uterino. Citocinas são importantes na defesa contra a infecção pelo HPV e o nível de sua produção é geneticamente determinado. A predominância de citocinas do padrão do tipo Th1, como o TNF-alfa, está associada com a regressão das lesões cervicais. Neste estudo foram analisados os fatores comportamentais, imunológicos e virais, possivelmente, associados ao desenvolvimento das lesões cervicais em 66 mulheres mexicanas, portadoras ou não da infecção pelo HIV-1, apresentando lesões cervicais. Assim, aspectos sócio-demográficos e hábitos sexuais, a identificação e a tipificação do HPV, e a detecção do polimorfismo da região promotora do TNF foram analisados. Ao avaliar os aspectos sócio-comportamentais, a maioria das mulheres estava casada legalmente ou em união consensual no momento da entrevista, com nível educacional fundamental e nível sócio-econômico baixo. Associado a isso, a maior porcentagem dos maridos eram migrantes dos Estados Unidos da América (EUA), em busca de emprego e melhores condições financeiras. O grupo de pacientes com HIV-1 que referiram utilizar a camisinha só algumas vezes ou nunca e que relataram possuir entre 2-3 parceiros sexuais foi maior do que o grupo de mulheres sem o HIV- 1. Adicionalmente, os parceiros sexuais de mulheres com o HIV-1 mantinham outras parcerias sexuais, sendo estas heterossexuais e/ou homossexuais. Todas as pacientes arroladas no presente estudo apresentavam infecção ativa por HPV e lesões cervicais de baixo grau. Os HPV oncogênicos, como os do tipo 16/18 e 35, foram significantemente mais freqüentes entre as HIV positivas em comparação às não portadoras dessa infecção. Relativo às comparações do polimorfismo do TNF, a freqüência do genótipo TNF-308 não mostrou diferenças significantes entre os grupos de pacientes. O gene da região promotora do TNF na posição -238 também foi avaliado e observamos que o alelo TNF-238G, associado à alta produção dessa citocina, apresentou significativo aumento de sua freqüência entre as pacientes com o HIV-1 em relação às pacientes sem o HIV-1. Estes resultados sugerem que as condições sócio-culturais e hábitos sexuais estão envolvidos com a vulnerabilidade para a aquisição do HIV e HPV em mulheres mexicanas. Embora as portadoras do HIV apresentem infecção ativa por HPV oncogênicos, a presença do alelo -238G, relacionado com a alta produção do TNFalfa, pode estar associado com a não progressão das lesões cervicais. Entretanto, esta interpretação deve ser realizada com cautela, pois algumas mulheres que apresentavam resultados de lesões cervicais de baixo grau morreram de câncer cérvico uterino. Este fato revela a fragilidade das análises e avaliações ginecológicas nos serviços de saúde referidos neste estudo e sugere que a alternativa de utilizar técnicas de biologia molecular para a identificação e tipificação dos tipos oncogênicos do HPV seja uma estratégia importante para os programas de prevenção do câncer do colo do útero. / The most recent compilation of global data indicates that, every year, 466,000 new cases of cervical cancer are detected around the world. Infection by oncogenic types of the human papillomavirus (HPV) constitutes an important risk factor for the development of colon cancer. In women with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), an increased prevalence and persistence of infection by oncogenic HPV has been demonstrated, justifying these women\'s increased susceptibility to the development of cervical lesions, which precede colon cancer. Cytokines are important in the defense against infection by HPV and its production level is genetically determined. The predominance of th1 cytokines, such as TNF-alfa, is associated with the regression of cervical lesions. This study analyzed behavioral, immunological and viral factors that may be associated with the development of cervical lesions in 66 Mexican women, infected by HIV-1 or not and presenting cervical lesions. Sociodemographic aspects and sexual aspects, HPV identification and typification and the detection of polymorphism in the region that promotes TNF were analyzed. With respect to socio-behavioral aspects, most women were legally married or lived in consensual union at the time of the interview, with basic education and low socioeconomic level. Moreover, most husbands were migrants from the United States (USA) who were looking for a job and better financial conditions. The group of HIV-1 patients who mentioned using a condom sometimes or never had having 2-3 partners was larger than the group of women without HIV-1. In addition, the sexual partners of women with HIV-1 had other hetero and/or homosexual partners. All patients included in this research presented active infection by HPV and low-grade cervical lesions. Oncogenic HPV, such as types 16/18 and 35, were significantly more frequent among HIV-positive than among HIV-negative patients. As to the comparisons of TNF polymorphism, the frequency of the TNF-308 genotype did not show significant differences between the patient group. The gene of the TNF promoting region in position -238 was also assessed. It was found that the TNF 238G allele, associated with high production levels of the cytokine, presented a significant increase in frequency among patient with in comparison with those without HIV-1. These results suggest that sociocultural conditions and sexual habits are involved in Mexican women\'s vulnerability to infection by HIV and HPV. Although the HIV patients present active infection by oncogenic HPV, the presence of the -238G allele, related with the high production of TNF-alpha, can be associated with the non progression of the cervical lesions. However, this must be interpreted with caution, as some women with low-grade cervical lesion results died of colon cancer. This fact reveals the fragility of gynecological analyses and assessments at the health services mentioned in this research and suggest the alternative of using molecular biology techniques for the identification and typification of HPV as an important strategy for colon cancer prevention programs.

A epidemia de HIV-1 está mudando em São Paulo, com uma crescente preocupação no número de jovens de homens que fazem sexo com homens (HSH). A epidemia é dominada pelos subtipos B, F1, porém tem aumentado a prevalência do subtipo C. O objetivo do estudo foi identificar e caracterizar as redes de transmissão em São Paulo, comparando entre os subtipos epidêmicos, fatores de risco e exposição à terapia antirretroviral. Nós compilamos dados clínicos, epidemiológicos e as sequencias virais dos indivíduos acompanhados no Instituto Adolfo Lutz de Jan 2004 a fev de 2015. Após o controle de qualidade, 2.260 sequencias parciais do gene pol foram subtipadas previamente como B, C e F1 e então incluídas no estudo. 2.107 sequencias únicas controle foram selecionadas pelo blast contra as nossas sequencias no banco de dados de Los Alamos e banco de dados de Portugal. Todas as sequencias foram investigadas para a identificação de mutação de resistência (TDRM). Árvores filogenéticas foram construídas em RaxML para cada subtipo. Nós usamos Cluster Picker para analise da dinâmica de transmissão de acordo com os parâmetros de distância genética e bootstrap. Análises estatísticas foram utilizadas para identificar possíveis correlações dos clusters. 414 (18,3%) da nossa população foi incluída em cluster (2-12 indivíduos). A taxa de cluster não diferiu entre B e F1, no entanto as sequencias do subtipo C se agruparam duas vezes mais (p<0.001). Mais clusters foram identificados entre a população HSH quando comparada a de heterossexuais independente do subtipo (p<0.001). A taxa de TDRM foi maior em cluster que fora de cluster nos subtipos B e F1 (p<0.001 e p=0.009), respectivamente. Apesar do alto número de clusters no subtipo C verificamos baixa prevalência de TDRM. Os indivíduos que estavam em clusters eram 5 anos mais jovens que os de fora de cluster nos subtipos B e C (p<0.001 e 0.02, respectivamente). Nossos resultados indicam que, independente do subtipo, a epidemia de HIV-1 em São Paulo é auto-sustentada pelos pacientes HSH virgens de tratamento. O subtipo C apresentou maior proporção de clusters. No entanto, mais análises são necessárias para clarificar se isto implica em alta taxa de transmissão do subtipo em São Paulo. / The HIV-1 epidemic in Sao Paulo is changing, with a worrying increase in the number of new infections in young men and in the Men who have Sex with Men (MSM). The epidemic is dominated by subtypes B and F1, but theres been a recent increase in the prevalence of subtype C. The aim of this study was to identify and characterize HIV-1 transmission networks in Sao Paulo, comparing across subtype epidemics, risk factors, and HAART exposure therapy. We gathered epidemiological, clinical and viral sequence data from HIV-1 infected individuals followed in Adolfo Lutz Institute/SP-BR from Jan 2004 through Feb 2015. After quality control, 2,260 sequences of the partial pol gene were subtyped as previously reported as B, C and F1 were included on this study. 2,107 unique background control sequences were selected by blasting our sequences against Los Alamos database and the Portuguese HIV-1 database. The dataset was screened for Drug Resistance Mutations to identify transmitted drug resistance mutations (TDRM). Maximum-Likelihood phylogenetic trees were built in RaxML for each subtype separately. We used Cluster Picker to analyze transmission dynamics according the thresholds: genetic distance (0.06) and bootstrap over 90%. Statistical analyzes were performed to identify possible correlates of clustering. Categorical variables were compared using Chi-square or Fishers exact test and quantitative variables were analyzed using Mann-Whitney test (SPSS). 414 (18,3%) of our population were included in clusters (range: 2-12 individuals). The rate of clustering did not differ between subtypes B and F, however more subtype C sequences (40%) significantly clustered together (p<0.001). Furthermore, more clusters were significantly found in the MSM group when compared to heterosexuals for all subtypes, (p<0.001). Also, drug naïve patients were more likely to be in clusters when compared to treated patients in all subtypes (p <0.001). TDRM were more prevalent in clustering than in non-clustering in subtypes B (p <0.001) and F1 (p =0.009), and more related to MSM group. Despite the higher number of clusters, subtype C presented a lower prevalence of TDRM, although without significant difference between cluster and non-cluster. Clustering individuals were also 5 years younger than non-clustering individuals for subtypes B and C (p<0.001 and 0.02, respectively). Our results indicate that, regardless of subtype, the HIV-1 epidemic in Sao Paulo is self-sustained by treatment-naive MSM patients, who transmit the infection before starting treatment. Subtype C presents a higher proportion of patients that cluster together. However, further analyses are necessary to clarify whether this implies a higher transmission rate of this subtype in Sao Paulo.

A infecção por HIV-1 leva a uma séria imunodeficiência causada principalmente pela depleção de linfócitos T auxiliadores, a principal célula-alvo do vírus. Além dos linfócitos T CD4, o HIV-1 também pode interagir e infectar macrófagos e células dendríticas (DCs). As DCs são resistentes à infecção pelo HIV-1, mas podem internalizar vírions em compartimentos e transferi-los para linfócitos T CD4&#43, em um processo chamado trans-infecção. Para promover sua infecção, o HIV-1 subverte o citoesqueleto da actina da célula hospedeira em várias etapas de seu ciclo. Em DCs o citoesqueleto também é essencial para internalização do HIV-1 e formação dos compartimentos. Miosinas são proteínas motoras que interagem com filamentos de actina e estão envolvidas em diversos processos celulares, incluindo migração, transporte de moléculas, endocitose e reciclagem de componentes de lipid rafts. Apesar de existirem mais de 40 tipos de miosinas em humanos, apenas a miosina 2a foi estudada no contexto da trans-infecção. Por isso, nosso objetivo nesse trabalho foi estudar o papel das miosinas 1c e 1e na maturação de células dendríticas derivadas de monócitos (MDDCs) e na internalização de HIV-1 por estas células. Confirmamos por Real Time PCR a expressão de 10 miosinas em MDDCs de doadores saudáveis, depois verificamos que há regulação negativa da expressão do gene da miosina (myo1c) em MDDCs de pacientes HIV&#43. Analisamos a ativação das células em resposta ao lipopolissacarídeo (LPS) por meio da expressão de CD86 e HLA-DR em MDDCs silenciadas para myo1c e 1e. Não houve diferença na expressão dos marcadores de ativação em células silenciadas para miosina 1e (myo1e) em relação ao controle. No entanto, na maioria dos doadores testados, o silenciamento da myo1c interferiu com o aumento de expressão desses marcadores, indicando que a myo1c possa ter um papel na ativação celular por LPS. Ademais, a localização subcelular do HIV-1 em MDDCs silenciadas para myo1c e ativadas com LPS ficou mais próxima ao fenótipo de células imaturas. Contudo, não houve diferença na quantidade HIV-1 internalizado por MDDCs silenciadas para as miosinas 1c e 1e ou tratadas com um inibidor específico de miosinas do tipo 1. Estes resultados sugerem que a myo1c pode estar envolvida na ativação de células dendríticas e consequentemente alterar o mecanismo de internalização do HIV-1 por MDDCs. / Infection by human immunodeficiency virus (HIV) leads to severe immunodeficiency caused by depletion of T helper cells, the main targets of the virus. Besides T CD4&#43 cells, HIV-1 can infect and interact with other immune cells, including dendritic cells and macrophages. Dendritic cells are resistant to HIV infection, however, they can bind and internalize HIV in compartments and then transfer the virus to CD4&#43 T cells in a process called trans-infection. To promote infection, HIV-1 subverts actin cytoskeleton of host cell at several points of its cycle. In DCs, cytoskeleton is also essential to HIV-1 internalization and compartment assembly. Myosins are motor proteins that can interact with actin and take part in several cellular processes, including migration, molecular trafficking, endocytosis and lipid raft recycling. Even though there are about 40 myosin types, only myosin 2a has been investigated in trans-infection. Thus, our aim was to evaluate the role of myosins 1c and 1e in monocyte derived dendritic cell (MDDC) activation and HIV-1 internalization. We have validated the expression of 10 myosins in MDDCs by real-time PCR, and observed a down regulation of myosin 1c gene in HIV&#43 patients. We have evaluated cell activation in response to lipopolysaccharide (LPS) through CD86 and HLA-DR expression in myosin 1c and 1e knocked down MDDCs. There was no change in expression of activation markers in myosin 1e knocked down MDDCs compared with control cells. However, in most donors, myosin 1c knock down impaired the increase of activation markers following LPS treatment, suggesting that myosin 1c may play a role in cell activation by LPS. In addition, subcellular location of HIV-1 in MDDCs knocked down for myosin 1c and activated with LPS, was similar to immature cell phenotype. Nevertheless, we have not observed changes in the amount of HIV-1 internalized by myosin 1c or 1e knocked down MDDCs or in MDDCs treated with myosin I inhibitor. These data suggest that myosin 1c may play a role in MDDC activation and therefore alter the mechanism of HIV-1 internalization by MDDCs.

A imunidade inata na interface materno-fetal é um dos mecanismos de proteção essenciais na resposta antiviral, sobretudo, na infecção por HIV-1. Neste trabalho, avaliamos a influência da infecção materna por HIV-1 na expressão de fatores antivirais, nas moléculas do complexo inflamassoma e de retrovírus endógenos (HERV), em células mononucleares (CMN) maternas, células do cordão umbilical (recém-natos, RN), colostro e no tecido placentário. Os resultados mostraram que no vilo das placentas de mães infectadas há um aumento na expressão de mRNA dos fatores antivirais, como IFN tipo I e III, DAMPs damage-associated molecular patterns e HERVs. Entretanto, na análise proteica, essas diferenças não se confirmam, indicando que o sistema imune inato é capaz de reconhecer o vírus, ou ainda, o dano causado pela infecção, mas controla a produção exacerbada da proteína. Sob estímulo de agonista de TLRs Toll-like receptor, em CMNs a expressão de HERVs não se altera entre RNs. Além disto, avaliando os níveis de &#223-quimiocinas, CCL5 e CCL3, e de IFN-&#967 nos sobrenadantes das culturas de CMNs, a ativação por LPS foi capaz de diminuir a produção de CCL3 e CCL5 nas CMNs de mães infectadas por HIV em relação às mães controles, contudo o CL097 promoveu níveis similares às mães do grupo controle. Nos RNs, enquanto os níveis de CCL5 são inferiores aos de adultos, os níveis de CCL3 são semelhantes. Já o ligante TLR7/8 foi capaz de restaurar a secreção de IFN-&#945 no grupo infectado por HIV-1. Além disso, no vilo das placentas das mães infectadas por HIV, há intensa modificação na expressão de mRNA dos fatores analisados, sejam antivirais, como IFN tipo I (IFN-&#945), tipo III (IFN-&#955), fatores relacionados ao dano celular (DAMPs e seus receptores). Entre os DAMPs, um aumento da expressão de S100A9 e HMGB1 e seus receptores RAGE, TLR4 e TLR9 foi observado nos vilos de placentas de mães infectadas por HIV-1, contudo, os níveis séricos de HMGB1 estão diminuídos em mães infectadas e RN expostos. Quanto aos níveis séricos de citocinas, foram observados níveis reduzidos de HMGB1, IL-6 e IL-1&#223 nos RNs expostos, o que evidencia um controle do estado inflamatório na exposição ao HIV-1. Também observamos presença de níveis séricos de HERV-W, livre ou em exossomas, em ambos os grupos analisados. Já no colostro, não encontramos diferenças nas análises de fatores inflamatórios e HERVs indicando que, nesse compartimento, a infecção não altera os padrões de expressão desses alvos. A vigência do estado antiviral e a supressão do ambiente inflamatório podem equilibrar a resposta imune placentária, promovendo a homeostase para o desenvolvimento do feto e de proteção à infecção por HIV-1 nos neonatos. / Innate immunity at the maternal-fetal interface is one of the main protection mechanisms in the antiviral response, especially in HIV-1 infection. In this work, we present the influence of maternal HIV-1 infection on the expression of antiviral factors, inflammasome molecular complex and human endogenous retroviruses (HERV), in maternal mononuclear cells (MNCs), umbilical cord cells (newborns, NB), colostrum and placental tissue. The results show that in infected mothers cells has an increase in mRNA expression of antiviral factors, such as IFN type I and III, DAMPs (damage-associated molecular patterns) and HERVs. However, in protein analysis, these differences are not confirmed, indicating that the immune system is able to detect the virus, or even the damage caused by the infection, but controls the exacerbated protein production. Under stimulation of the TLR (Toll-like receptor) agonist, CMNs do not change among the RNs. In addition, by evaluating the levels of &#223-chemokines, CCL5 and CCL3, and of IFN-&#945 in the supernatants of CMNs cultures, LPS activation was able to decrease the production of CCL3 and CCL5 in CMNs of HIV-infected mothers compared to control mothers, nevertheless CL097 promoted similar levels between HIV-infected mothers and control group. In RNs, while CCL5 levels are lower than in adults, CCL3 levels are similar. TLR7/8 agonist was able to restore IFN- secretion in the HIV-infected group. In contrast, the TLR7/8 agonist was able to restore IFN- secretion in HIV-infected group. In addition, in placental villi, there is intense modification in the mRNA expression of the analyzed factors, whether they are antiviral, such as IFN type I (IFN-&#945), type III (IFN-&#955), related to cell damage (DAMPs and their receptors). Among DAMPs, increased expression of S100A9 and HMGB1 and their receptors RAGE, TLR4 and TLR9 was observed in placental villi of HIV-infected mothers, however, serum HMGB1 levels are decreased in infected-mothers and exposed-newborns. About the cytokines serum levels, reduced levels of HMGB1, IL-6 and IL-1&#223 were observed in the exposed-NBs, which evidences an inflammatory status control in HIV-1 exposure. We also observed the presence of free HERV-W or exosomes levels in serum in both groups analyzed. In colostrum, we did not find differences in inflammatory factors and HERVs analysis indicating that, in this compartment, the infection does not alter the expression patterns of these targets. The effectiveness of antiviral status and suppression of the inflammatory environment can balance the placental immune response, promoting homeostasis for fetal development and protection of HIV-1 infection in neonates.

The HIV-1 envelope glycoprotein, Env, facilitates the translocation of the viral capsid across the cellular membrane. Env is a trimer of hetero-dimers composed of a gp120 subunit and gp41 transmembrane protein. The gp120 subunit binds the primary receptor, CD4, leading to conformational changes of Env that then promote binding to the coreceptor, principally CCR5 or CXCR4. As the sole protein on the surface of the virion, Env is under continuous pressure from the host's antibody response. Two classes of antibodies target the highly conserved receptor-binding sites of gp120: CD4-binding site (CD4bs) and CD4-induced (CD4i) antibodies.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2007. / Härtill 5 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--University of Alabama at Birmingham, 2007. / Title from first page of PDF file (viewed Feb. 15, 2008). Lys,3 is superscript in the title. Includes bibliographical references.