Estudamos a homeostase energética no cérebro (córtex cerebral, estriado e hipocampo) e tecidos periféricos (coração e músculo esquelético) de camundongos selvagens (WT) e nocaute para a enzima glutaril-CoA desidrogenase (Gcdh-/-), modelo animal genético para estudo da acidemia glutárica tipo I (AG I), com 15 e 30 dias de vida. Esses animais também foram submetidos a uma sobrecarga de lisina através de uma injeção intraperitoneal (8 μmol/g) desse aminoácido ou de uma dieta rica em lisina (4,7 %) por 60 horas. Os parâmetros da homeostase energética analisados foram as atividades dos complexos I-III, II, II-III e IV da cadeia respiratória, das enzimas do ciclo do ácido cítrico (CAC) citrato sintase (CS), aconitase, isocitrato desidrogenase (IDH), α- cetoglutarato desidrogenase, sucinato desidrogenase e malato desidrogenase, da creatina quinase (CK) e da Na+, K+ - ATPase, bem como a liberação de lactato, os parâmetros respiratórios mitocondriais estados 3 e 4, razão de controle respiratório e o estado desacoplado, além do potencial de membrana mitocondrial na presença ou ausência de Ca2+. Estudos histológicos também foram conduzidos no córtex cerebral e estriado dos camundongos WT e Gcdh-/- de 30, 60 e 90 dias de vida submetidos por um pequeno (60 horas) ou longo (30 dias) período com dieta com alta concentração de lisina (4,7 %). Verificamos leves alterações nas atividades dos complexos da cadeia respiratória no cérebro, coração e músculo esquelético dos animais Gcdh-/- quando comparados aos WT com 15 e 30 dias de vida. Além disso, demonstramos uma diminuição significativa das atividades da CS e IDH em preparações mitocondriais de estriado de camundongos Gcdh-/- submetidos a uma sobrecarga de lisina associada a um pequeno aumento na liberação de lactato. No entanto, não encontramos alterações nos parâmetros respiratórios e no potencial de membrana em mitocôndrias de estriado dos camundongos Gcdh-/-quando comparados aos WT. Por outro lado, as atividades da Na+, K+-ATPase (cérebro) e CK (cérebro e músculo esquelético) foram significativamente menores em camundongos Gcdh-/- com 15 dias de vida quando submetidos a uma injeção intraperitoneal de lisina. Além disso, encontramos uma redução na atividade da Na+, K+-ATPase associada com uma diminuição da sua expressão em córtex cerebral, mas não em estriado e hipocampo, de camundongos Gcdh-/- com 30 dias de vida submetidos ou não a uma dieta rica em lisina. Finalmente, a análise histológica revelou a presença de vacúolos no córtex cerebral dos camundongos Gcdh-/- com 60 e 90 dias de vida, bem como no estriado dos animais Gcdh-/- com 90 dias de vida que foram alimentados com uma dieta rica em lisina por 30 dias. Concluindo, presumimos que uma redução das atividades da Na+, K+-ATPase e CK possa contribuir para o dano neurológico encontrado nos camundongos Gcdh-/- e possivelmente nos pacientes com AG I. / We studied energy homeostasis in the brain (cerebral cortex, striatum and hippocampus) and peripheral tissues (heart and skeletal muscle) from 15 and 30- day-old wild type (WT) and glutaryl-CoA dehydrogenase deficient (Gcdh-/-) mice, which is a genetic animal model to study glutaric academia type I (GA I). These animals were also submitted to lysine overload through an intraperitoneal injection (8 μmol/g) of this amino acid or supplementing the mice with a high lysine (4.7 %) diet for 60 hours. The energy homeostasis parameters evaluated were the activities of the respiratory chain complexes I-III, II, II-III and IV, of the citric acid cycle (CAC) enzymes citrate synthase (CS), aconitase, isocitrate dehydrogenase (IDH), α-ketoglutarate dehydrogenase, succinate dehydrogenase and malate dehydrogenase, creatine kinase (CK) and Na+, K+ - ATPase, as well as the lactate release, the mitochondrial respiratory parameters states 3 and 4, respiratory control ratio and uncoupled state, besides the mitochondrial membrane potential in the presence or absence of Ca2+. Histological studies were also conducted in the cerebral cortex and striatum from 30, 60 and 90-day-old WT and Gcdh-/- mice submitted for a short (60 hours) or long (30 days) period to a high lysine (4.7 %) diet. We verified mild alterations in the respiratory chain activity in the brain, heart and skeletal muscle from Gcdh-/- animals when compared to 15 and 30-day-old WT mice. Furthermore, we demonstrated a reduction in the activities of CS and IDH in striatum mitochondrial preparations from Gcdh-/- mice submitted to a lysine overload associated with a mild increase of lactate release. However, we did not find alterations in the respiratory parameters and membrane potential in striatum mitochondria from Gcdh-/- mice when compared to WT. On the other hand, the activities of Na+, K+-ATPase (brain) and CK (brain and skeletal muscle) were significantly reduced in 15-day-old Gcdh-/- mice when received an intraperitoneal injection of lysine. Moreover, a reduction in the Na+, K+-ATPase activity associated with a diminution of its expression was observed in the cerebral cortex, but not in striatum and hippocampus, from 30-day-old Gcdh-/- mice submitted or not to a high lysine diet. Finally, the histological analyses revealed the presence of vacuoles in the cerebral cortex from 60 and 90-day-old Gcdh-/- mice, as well as in the striatum from 90-day-old Gcdh-/- animals that were fed a high Lys chow for 30 days. In conclusion, we presume that a reduction in the activities of Na+, K+- ATPase and CK may contribute to the brain damage found in Gcdh-/- mice and possibly in GA I patients.

A deficiência da desidrogenase de acilas-CoA de cadeia média (MCAD) é um defeito da oxidação de ácidos graxos (DOAG) bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de acilcarnitinas de cadeia média (MCAC) em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Clinicamente os pacientes apresentam sintomas neurológicos como letargia e coma, geralmente desencadeados por episódios de descompensação metabólica. Outros distúrbios importantes entre os DOAG são as deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTPD) e da desidrogenase de 3-hidroxiacilas-CoA de cadeia longa (LCHADD) que são caracterizadas pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia longa e seus derivados 3- hidroxilados (LCHFA). Geralmente, os pacientes afetados apresentam disfunção cardíaca e hepática podendo também apresentar sinais de comprometimento neurológico. Até o momento, a hipoglicemia e a toxicidade dos ácidos graxos acumulados têm sido relacionados com a fisiopatologia dessas doenças, embora os mecanismos responsáveis pelo dano tecidual não são bem conhecidos. Assim, foram investigados os efeitos dos MCAC e LCHFA sobre importantes parâmetros da função redox e homeostase energética mitocondrial em cérebro e coração de ratos, bem como a produção de superóxido e morte celular em culturas de fibroblastos da pele de pacientes afetados por essas doenças. Primeiramente, observamos que as MCAC induzem dano oxidativo lipídico e proteico, além de reduzir as defesas antioxidantes não enzimáticas em cérebro de ratos, provavelmente através da indução de radicais hidroxil e peroxil. Além disso, evidenciamos aumento dos níveis de superóxido e de morte celular em fibroblastos de pacientes afetados pela MTPD em condições padrão de cultivo indicando uma exposição crônica a níveis mais elevados de superóxido e uma vulnerabilidade à morte celular. Fibroblastos de pacientes afetados pelas MTPD e MCADD também apresentaram aumento dos níveis de superóxido quando cultivadas em condições de estresse metabólico, contudo não houve aumento de morte celular. Finalmente, a morte celular foi mais pronunciada em fibroblastos afetados pela MTPD em comparação com pacientes afetados pela MCADD, além de apresentar uma forte correlação com a produção de superóxido, sugerindo que esses eventos são provavelmente associados. Por outro lado, observamos que LCHFA prejudicam a homeostase energética em mitocôndrias de coração devido a um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa evidenciado pelo aumento do estado 4 da respiração e diminuição da razão de controle respiratório, pela redução do potencial de membrana, do conteúdo de NAD(P)H e da produção de H2O2. O ácido 3- hidroxitetradecanóico (3 HTA) também induziu inchaço mitocondrial provavelmente como consequência da abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) uma vez que a ciclosporina A (CsA), um inibidor clássico da abertura do poro, impediu esse efeito em mitocôndrias cardíacas carregadas com Ca2+. LCHFA também dissipadaram o potencial de membrana, diminuíram o coneúdo de NAD(P)H e de ATP na presença ou ausência de Ca2+ em mitocondriais de córtex cerebral. Além disso, na presença de Ca2+, 3 HTA induziu inchamento mitocondrial e liberação de citocromo c, que ativa rotas apoptóticas. 3 HTA também afetou a homeostase de Ca2+ evidenciado por uma reduzida capacidade de retenção de Ca2+ pela mitocôndria e induziu a produção de H2O2 na presença de Ca2+. Essas alterações foram prevenidas pelo vermelho de rutênio (RR), um bloqueador da captação mitocondrial de Ca2+, e por CsA mais ADP, inibidores da abertura do mPTP, o que implica o seu envolvimento nesses efeitos. Em contraste, LCHFA não causaram dano oxidativo nem alteraram as defesas antioxidantes em coração de ratos jovens. Em conjunto, nós demonstramos que MCAC e LCHFA que se acumulam em pacientes afetados pelas deficiências da MCAD e MTP/LCHAD, respectivamente, são potencialmente tóxicos para as funções mitocondriais essenciais em cérebro e coração de ratos. Além disso, demonstramos que fibroblastos de pacientes com MTPD cultivados em condições padrão estão sob estresse oxidativo, que é acentuado quando os fibroblastos são submetidos a condições de estresse metabólico. Presume-se que esses mecanismos fisiopatológicos podem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelo dano tecidual característico desses pacientes. / The medium chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency is a fatty acid oxidation disorder (FAOD) biochemically characterized by accumulation of medium-chain acylcarnitines (MCAC) in tissues and biological fluids of affected individuals. The clinical presentation includes neurological symptoms as lethargy and coma, generally followed by episodes of metabolic decompensation. Other important FAOD are the mitochondrial trifunctional protein (MTPD) and the long-chain 3- hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHADD) deficiencies that are characterized by accumulation of long-chain fatty acids and their 3-hydroxylated (LCHFA) derivatives. Usually, affected patients present cardiac and hepatic dysfunction and may present signs of neurological impairment. So far, hypoglycemia and the toxicity of accumulating fatty acids have been related with the pathophysiology in these disorders, although the mechanisms responsible for tissue damage are poorly known. Thus, we investigated the effects of MCAC and LCHFA on important parameters of mitochondrial redox and energetic homeostasis in brain and heart of rats, as well as superoxide production and cell death in skin fibroblasts from patients affected by these diseases. First, we observed that MCAC induced lipid and protein oxidative damage, and reduced the antioxidant non-enzymatic defenses in rat brain, probably through induction of hydroxyl and peroxyl radicals. Furthermore, we evidenced increased superoxide levels and cell death in skin fibroblasts from MTP deficient patients under standard growing conditions indicating a chronic exposure to higher superoxide levels and a vulnerability to cell death. In addition, cells from MCADD and MTPD patients cultured under metabolic stress conditions presented increased levels of superoxide, although cell death was not increased. Finally, cell death was more pronounced in fibroblasts from MTP compared to MCAD deficient patients, and presented a strong correlation with superoxide production, suggesting that these events are probably associated. On the other hand, we observed that LCHFA provoked an impairment of heart mitochondrial energetic homeostasis, by behaving as uncouplers of oxidative phosphorylation, evidenced by increase of state 4 respiration and decrease of the respiratory control ratio, by reducing the membrane potential, the NAD(P)H content and H2O2 production. 3-Hydroxytetradecanoic acid (3 HTA) also induced mitochondrial swelling probably as a consequence of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening once cyclosporin A (CsA), a classical inhibitor, prevented this effect in heart mitochondria loaded with Ca2+. LCHFA also dissipated membrane potential, diminished NAD(P)H content and decreased ATP content in the presence or absence of Ca2+ in cerebral cortex mitochondrial preparations. Moreover, 3 HTA induced mitochondrial swelling and cytochrome c release in the presence of Ca2+, which activates apoptotic cascades. 3 HTA also affected Ca2+ homeostasis evidenced by a diminished mitochondrial Ca2+ retention capacity and induced hydrogen peroxide production in the presence of Ca2+. These alterations where prevented by ruthenium red (RR), a blocker of mitochondrial Ca2+ uptake, and by CsA plus ADP, inhibitors of the mPTP, implying its involvement in these effects. In contrast, LCHFA did not cause oxidative damage nor altered the antioxidant defenses in heart of young rats. Taken together, we demonstrated that MCAC and LCHFA found accumulated in patients affected by MCAD and MTP/LCHAD deficiencies, respectively, are potentially toxic to essential mitochondrial functions in rat brain and heart. We also found that fibroblasts from MTP deficient patients cultured under basal growing conditions are under oxidative stress that is accentuated when cultured metabolic stress conditions are used. It is presumed that these pathomechanisms may be responsible, at least in part, for the tissue damage characteristic of these patients.

Orientador: Lilia F. R. de Souza Li / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T11:10:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Macedo_LuciaCosentinode_M.pdf: 2481805 bytes, checksum: 85ab094926dbe8ad65a47ec2c1c6fcf5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A 1,25-dihidroxivitamina D é de fundamental importância na homeostase do cálcio. A vitamina D exerce suas ações através da interação com o seu receptor. O receptor da vitamina D (VDR) é membro da superfamília de receptores nucleares. O raquitismo é uma doença causada por mineralização deficiente na matriz óssea ou osteóide, afetando o desenvolvimento e a formação do osso na fase de crescimento. Mutações no receptor da vitamina D causam raquitismo dependente de vitamina D tipo II. Neste tipo de raquitismo ocorre hipocalcemia e as concentrações séricas de 1,25-dihidroxivitamina D3 são elevadas e, na maioria das vezes não há resposta ao tratamento com doses altas de 1,25-dihidroxivitamina D. Pacientes apresentam raquitismo grave de inicio precoce, nos primeiros meses de vida e a maior parte dos indivíduos apresenta pouco ou nenhum pêlo corporal (alopecia). O objetivo principal deste projeto foi a análise molecular do receptor de vitamina D (VDR) em quatro pacientes com raquitismo dependente de vitamina D tipo n que manifestaram raquitismo e alopecia. Amostras de DNA destes pacientes foram usadas para sequenciar o gene do VDR. Os cromatogramas gerados foram analisados em programas específicos, visando a busca de mutações. A análise mostrou 2 novas mutações pontuais que resultam em mudança de aminoácido (Q259E e G319V) e uma mutação que introduz um codon terminal (R73X). A cultura primária de fibroblasto proveniente de biópsia de pele dos pacientes foi usada para análise funcional do receptor. Extrato proteico nuclear mostrou redução de expressão de todos os receptores mutados. O receptor truncado contendo apenas parte do domínio de ligação com o DNA perdeu o epítopo de interação com o anticorpo usado, não sendo identificado no Western blot pelo anticorpo utilizado, impossibilitando a avaliação de sua expressão. Tratamento da cultura primária de fibroblasto com doses crescentes de l,25(OH)2 vitamina D demonstrou que os VDRs mutados foram incapazes de ser ativado e aumentar a expressão de 24-hidroxilase. Este trabalho identificou mutações em quatro pacientes com raquitismo dependente de vitamina D tipo II e estas mutações resultaram em comprometimento funcional do VDR / Abstract: The 1,25-dihydroxyvitamin D plays a fundamental role in the calcium homeostasis. The vitamin D exerts its actions through the interaction with its receptor. The vitamin D receptor (VDR) is a member of the superfamily of nuclear receptors. Rickets is a disease caused by deficient mineralization in the bone matrix or osteoids, affecting the development and formation of the bone during the growth stage. Mutations in the vitamin D receptor are associated to the vitamin D-dependent rickets type II. The biochemical characteristics is hypocalcemia and increase levels of 1,25-dihydroxyvitamin D3, and most of time there is no answer to the treatment with high doses of 1,25-dihydroxyvitamin D. Patients present rickets and or osteomalacia of varying severity beginning in the first months of life and most of the individuals presents little or any body hair (alopecia). The main objective of this project was the molecular analysis of the vitamin D receptor (VDR) in four patients with vitamin D-dependent rickets type II that manifested with rickets and alopecia. DNA samples of these patients were used to sequence the VDR gene. The generated chromatograms were analyzed in specific programs, aiming the search of mutations. The analysis showed two novel missense mutation that result in amino acid change (Q259E e G319V) and one nonsense mutations (R73X). Fibroblast primary culture derived from the patients' skin biopsy was carried out for functional analysis of the receptor. Nuclear protein extract showed reduction of expression of all mutant receptors. The truncated VDR receptor containing only part of the DNA binding domain lost the region containing the epitopo which the antibody was raised against and it was not identified by the Western blot analysis. Treatment of the fibroblast primary culture treatment with increasing doses of l,25(OH)2 vitamin D showed that the mutant VDR were unable to be activated and to increase the expression of the 24-hydroxylase. It was found mutations in the four patients with vitamin D-dependent rickets type II studied. Functional analysis confirmed that the mutations impaired the VDR activation / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Jose Antonio da Rocha Gontijo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciecias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T08:05:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lutaif_NelsonAfonso_D.pdf: 2278199 bytes, checksum: 2d4e7e7d11554b0032abc645e2972bac (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Introdução: Os rins, em humanos, são responsáveis por 10% de todo o oxigênio consumido, pelo corpo, em 24 horas. Este consumo pode ser representativo de uma grande contribuição da parte renal para a termogênese global dos indivíduos. A termogênese global é constituída pela termogênese facultativa, a qual está associada à ativação da UCP e captação celular de glicose, e a termogênese obrigatória, a qual está relacionada ao consumo de oxigênio mitocondrial. Assim nós assumimos que lesões renais podem levar a alterações na termogênese global e consequentemente distúrbios nas termogênese facultativa e obrigatória. Para investigar a contribuição renal na manutenção da temperatura interna, nós estudamos ratos Sprague Dowley com: redução da massa renal (Nx), denervação (Dx) e obstrução urinária (Ox), além de dois grupos controles: SHAM e non-operative (Non). Métodos: O estudo foi realizado colocando os grupos em estudo imersos em água isotérmica (próxima a temperatura interna) para bloquear a dissipação de calor enquanto a temperatura colonica era registrada durante 30 minutos. A termogênese obrigatória foi analizada através do controle respiratório e a relação ADP/O em mitocôndrias hepaticas. As atividades da UCP1 e os sinalizadores relacionados a capatação de glicose celular : IRS1, PI3K, AKT1 e ERK1,2, foram analisados pelo método de Westernblot. Resultados: O grupo Nx apresentou temperatura inicial significativamente inferior ao grupo Dx: 36,14 ± 0,8083°C x 37,51±0,9601°C, (P<0,05). Depois de 30 minutos, o grupo Dx (40,38 ± 1,04°C) apresentou temperaturas finais significativamente mais elevadas em comparação aos grupos: Sham (39,09±0,21°C), Nx (36,14±0,8083°C) e Ox (37,22±0,4338°C) com p<0,05. O grupo Dx apresentou curvas térmicas com uma maior inclinação (slope) (0,05836±0,07683) em relação aos grupos: Sham (0,04238±0,006312), Non (0,05182±0,005546) e Ox (0,04516±0,005107) com p<0,05. Também, a área sobre a curva em relação ao grupo Nx (57,05±17,82) foi superior aos valores obtidos nos grupos Ox (35,61±7,792), Sham (41,03±3,06) e Non (39,82±5,848) com p<0,001. Nenhuma diferença foi observada entre todos os grupos com relação ao controle respiratório e a relação ADP/O. Os grupos Dx e NX apresentaram aumento das atividades da UCP1 e AKT quando comparados com os demais grupos. Conclusão: Estes resultados sugerem que os rins podem ter influência na termorregulação, contribuindo com parte do calor necessário para a manutenção da temperatura corporal. Também concluiu-se que as fibras nervosas renais estão implicadas no controle homeostático do calor, trabalhando em associação com os tecidos da gordura marrom / Abstract: Introduction: Human kidneys are responsible for 10% of whole oxygen consumed in 24 hours as a result may have a great contribution in human global thermogenesis. Global thermogenesis which is related with mitochondrial oxygen consumption. We assumed that renal injuries necessarily promotes disturbances on global thermogenesis and consequently promote a re-adaptation on facultative and obligatory thermogenesis. To investigate the renal contribution on maintenance of internal temperature, we studied Sprague Dawley rats with: (Nx) mass reduction, (Dx) denervation and (Ox) urinary tract obstruction and two controls group: sham and (Non) no-operative. Methods: The study was performed after animals¿ immersions in warm water to avoid temperature dissipation and rectal temperature was recorded. Obligatory thermogenesis was evaluated through mitochondria respiratory chain and ADP/0 ratio in hepatocytes. The UCP1 and pathways associated with glucose captation (IRS1, PI3K, AKT1 and ERK1,2) protein expression in brow adipose tissue was studied by western blot method. Results: The Nx group presented significant initial lower temperature than Dx group: 36.14±0.8083°C x 37.15±0.9601 °C, with p<0.05. After thirty minutes, Dx group presented significant higher temperature (40.38 °C) than Sham (39.09±0.21°C), Nx (36.14±0.8083°C) and Ox (37.22±0.4338°C), groups with p<0.05. The Dx group showed significant higher thermal slope curve values (0.05836±0.07683) than Sham (0.04238±0.006312), Non (0.05182 ± 0.05546) and Ox (0.04516±0.005107) with p<0.05. Also, the area under curve presented Nx group with significant higher values (57.05 ± 17.82) than Ox (35.61±7.792), Sham (41.03 ± 3.06) and Non (39.82 ± 5.848) with p<0.001. No statistical difference was observed between all groups when the mitochondrial oxygen consumption and ADP/0 ratio were studied. The Dx and Nx groups showed increase in UCP1 and AKT1 activities. Conclusions: These results suggest that kidneys may play important function on body thermoregulation, contributing to thermal generation with own metabolic activities. We also concluded that renal nerves activity plays a role in thermic homeostase control, working associated with central nervous system and brown adipose tissue / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

Submitted by Celso Magalhaes (celsomagalhaes@ufrrj.br) on 2017-05-31T11:58:11Z No. of bitstreams: 1 2015 - Victor Menezes Tunholi Alves.pdf: 1068543 bytes, checksum: f36d6e4d78a70514a148e30e4249805b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-31T11:58:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015 - Victor Menezes Tunholi Alves.pdf: 1068543 bytes, checksum: f36d6e4d78a70514a148e30e4249805b (MD5) Previous issue date: 2015-10-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / Parasites belonging to the Echinostoma genus are characterized by having a complex biological cycle, with two intermediate hosts and a final habitat restricted to the intestinal lumen of the definitive hosts. These hosts include aquatic birds, mammals (including humans) and occasionally some reptile and fish species. Their first intermediate hosts are freshwater snails, into which the miracidia actively penetrate for development of the next three stages (sporocysts, rediae and cercariae). Freshwater crustaceans, amphibians, fish and snails act as the second intermediate hosts, enabling the formation of metacercariae, the infective larval stage to the definitive host. In this work, Biomphalaria glabrata specimens were experimentally infected with different doses (5 or 50) of E. paraensei miracidia. The snails were dissected one, two, three and four weeks after infection to collect the hemolymph, shells and tissues (gonad-digestive gland complex- GDG). In the hemolymph were quantified glucose concentrations and carboxylic acids (succinic, pyruvic, lactic and oxalic acids), as well as the activity of lactate dehydrogenase (LDH). The storage of tissues was measured glycogen content and oxygen consumption (O2). Changes were observed in glycemia of the snails, in both situations parasitism, with significant increase in glucose levels observed from the third week post infection when compared to the control group. Changes have also been described in relation to the activity of lactate dehydrogenase and are characterized by the increase of its activity in the later periods of infection. In parallel, there was a decrease in glycogen content in storage tissues, being such greater reduction in the digestive gland (larval development site) in comparison to the cephalopedal mass. In addition, the infection by both miracidiais doses resulted in increased levels of oxalic acid and lactic acid, as well as a decline in the content of pyruvic and succinic acids in B. glabrata. The prepatent infection by this equinostomatideo still significantly suppressed the phosphorylation state (state 3 respiration) and basal oxygen consumption (state 1 and 2) in B. glabrata, demonstrating that infection by E. paraensei decreases the capacity of the intermediate host in performing aerobic oxidative reactions. These results demonstrate the reduction in oxidative decarboxylation rate of the reactions that are part of the tricarboxylic acid cycle and acceleration of the process of anaerobic degradation of carbohydrates in the infected snails by lactic acid fermentation, it is essential to ensure the obtaining of energy and the success of the infection. Thus, the results observed in this study demonstrate that infection with five or 50 miracidia of E. paraensei caused significant metabolic changes in B. glabrata snails being exposed to the largest load miracidial showed the greatest damage, featuring a dose-dependent response / Parasitos pertencentes ao g?nero Echinostoma caracterizam por apresentar um ciclo biol?gico complexo, com dois hospedeiros intermedi?rios e s?tio final de infec??o restrito ao l?men intestinal de seus hospedeiros definitivos. Estes hospedeiros s?o representados principalmente por aves aqu?ticas e semi-aqu?ticas, mam?feros, incluindo o homem, e ocasionalmente algumas esp?cies de r?pteis e peixes. Possuem como primeiros hospedeiros intermedi?rios moluscos l?mnicos, onde os mirac?dios penetram ativamente e desenvolvem at? os est?gios de esporocistos, r?dias e cerc?rias. Por sua vez, crust?ceos, anf?bios, peixes e moluscos l?mnicos atuam como segundos hospedeiros intermedi?rios onde ocorre a forma??o de metacerc?rias, est?gios infectantes ao hospedeiro definitivo. Neste estudo, Biomphalaria glabrata foi experimentalmente infectada com diferentes doses miracidiais (5 ou 50) de E. paraensei. Os moluscos foram dissecados ap?s uma, duas, tr?s e quatro semanas de infec??o para a coleta da hemolinfa e tecidos (complexo g?nada-gl?ndula digestiva- GGD e massa cefalopediosa). Na hemolinfa foram quantificadas as concentra??es de glicose e de ?cidos carbox?licos (succ?nico, pir?vico, l?tico e ox?lico), bem como a atividade da lactato desidrogenase (LDH). Nos tecidos de estocagem foram mensurados os conte?dos de glicog?nio e consumo de oxig?nio (O2). Altera??es foram observadas na glicemia dos moluscos, em ambas as situa??es de parasitismo, com significativo aumento dos n?veis de glicose verificado a partir da terceira semana de infec??o quando comparado ao grupo controle. Mudan?as foram tamb?m descritas em rela??o ? atividade da lactato desidrogenase, sendo caracterizadas pelo aumento de sua atividade nos per?odos mais tardios da infec??o. Em paralelo, verificou-se um decr?scimo nos conte?dos de glicog?nio em tecidos de armazenamento, sendo tal redu??o maior na gl?ndula digestiva (s?tio de desenvolvimento larval), em compara??o ? massa cefalopediosa. A infec??o por ambas as doses miracidiais ainda resultou em um aumento dos n?veis de ?cidos ox?lico e l?tico, bem como em um decl?nio nos conte?dos de ?cidos pir?vico e succ?nico em B. glabrata. Significativa supress?o no estado fosforilativo (estado 3 respirat?rio) e no consumo basal de oxig?nio (estado 1 e 2) em B. glabrata infectada por E. paraensei foi demonstrada, indicando que a infec??o por este equinostomat?deo diminui a capacidade do hospedeiro intermedi?rio em realizar rea??es oxidativas aer?bias. Varia??es relevantes relacionadas ao estado mitocondrial desacoplado (estado 3u) de B. glabrata infectada por tal tremat?deo foram tamb?m descritas. Tais resultados demonstram redu??o na taxa de descarboxila??o oxidativa das rea??es que integram o ciclo do ?cido tricarbox?lico e acelera??o do processo de degrada??o anaer?bia de carboidratos nos moluscos infectados, atrav?s da fermenta??o l?tica, essencial para garantir a obten??o de energia e o sucesso da infec??o. Assim, os resultados observados neste estudo demonstram que a infec??o com cinco ou 50 mirac?dios de E. paraensei provocou consider?veis altera??es metab?licas em B. glabrata, sendo que os moluscos expostos a maior carga miracidial apresentaram os maiores danos, caracterizando uma resposta dosedependente.

Objetivo:Caracterizar o padrão de homeostase (proliferação celular e apoptose) de tecido endometrial eutópico e ectópico de coelhas submetidas à indução de lesões de endometriose por modelo experimental já conhecido, quatro e oito semanas após o procedimento de implantação endometrial. Material e Métodos:Estudo experimental animal sendo utilizado 20 coelhas adultas Nova Zelândia, fêmeas e virgens, submetidas à laparotomia para indução da lesão de endometriose, através da ressecção de um corno uterino e fixação no peritônio pélvico de fragmento de 5mm. As coelhas foram divididas em dois grupos de 10 animais, sendo os animais do grupo 1, sacrificados após 4 semanas da indução da lesão endometrial ectópica e os do grupo 2 após 8 semanas. A lesão foi excisada para análise histológica juntamentecom o corno uterino contralateral, comprovando a presença de tecido endometrial glandular e estromal. Reações de imunohistoquímica foram realizadas, no tecido endometrial eutópico e ectópico, para proliferação celular através do PCNA e para apoptose através do fas, na glândula e estroma, sendo obtido o índice de proliferação celular (IPC) e de apoptose (IA) através do número de células marcadas por 1000 contadas, e o índice dehomeostase tecidual através do coeficiente entre o IPC e IA. Resultados:Observou-se maior índice de proliferação no tecido ectópico, tanto glandular como estromal, quando comparado com o endométrio eutópico, com 4 e 8 semanas após a indução da lesão. Contudo, quando as lesões ectópicas foram comparadas entre si, com 4 e 8 semanas, não foi observada diferença significativa. Quando comparamos o índice de apoptose, observamos que não houve diferença entre o tecido ectópico e o eutópico, tanto glandular como estromal nas lesões induzidas e analisadas com 4 semanas, porém no tecido glandular das lesões analisadas com 8 semanas houve diferença significativa entre a lesão ectópica e o tecido endometrialeutópico 0,0819 ± 0,0213 e 0,0995 ± 0,01336, respectivamente (p=0,04). A homeostase tecidual foi calculada e observou-se uma tendência destes tecidos a proliferação, sempre com índicesde homeostase tecidual (IPC/IA) acima de 1. Conclusão:As lesões ectópicas parecem ter uma proliferação celular maior que o endométrio eutópico levando a uma tendência ao crescimento tecidual descontrolado nas lesões de endometriose induzidas. / Objective: To characterize the pattern of tissue homeostasis (cell proliferation and apoptosis) of eutopic and ectopic endometrium in rabbitsfour and eight weeks after endometrium implantation for induction of endometriotic lesions by experimental standardized method. Material and methods: Animal experimental study with 20 female, virgins and adult New Zeland rabbits, submitted to laparotomy for endometriosis induction by resection of one uterine horn, isolation of the correspondent endometrium and fixation of a 5mm tissue segment to the pelvic peritoneum. The animals were divided in two groups of 10, group 1 was sacrificed after 4 weeks of endometriosis induction and group 2 eight weeks after the procedure. The lesion was excised for later histological analysis together with the opposite uterine horn, just to verify the presence of endometrial gland and stroma. Immunohistochemistry reactions were performed in order to study cell proliferation (by PCNA technique) and apoptosis (by fastechnique) in the eutopic and ectopic endometrium, and a Cell Proliferation Index (CPI) and an Apoptotic Index (AI) werecalculated based on these findings, considering the number of marked cellsper 1000 counted cells. The Homeostatic Tissue Index (HTI) was considered to be the relation between CPI and AI (CPI/AI). Gland and stroma were analyzed separately. Results: There was an increase in the CPI of the ectopic tissue, considering gland and stroma, after four and eight weeks of endometriosis induction when comparing to the eutopic one. However, when comparing the ectopic lesions, there was no difference between four and eight weeks of induction. Analyzing the only the AI, there was no difference between the eutopic and the ectopic endometrium with four weeks,nevertheless there was a significant difference in the glandular tissue of the lesions with eight weeks when comparing eutopic and ectopic tissues (0.0819 ± 0.0213 e 0.0995 ± 0.01336, respectively (p=0,04)). Based on HTI there was a tendency to cell proliferation on these tissues, always with and HTI (CPI/AI) higher than 1. Conclusions: Ectopic lesions seem to have a higher cell proliferation than the eutopic endometrium, tending to present an uncontrolled tissue growth in the endometriotic inducted lesions.

Diversos trabalhos vêm demonstrando que a suplementação com naringina é capaz de promover a neuroproteção em modelos de doenças neurodegenerativas induzidos em animais, principalmente através da regulação da homeostase redox e função mitocondrial. Embora a naringina possa ser considerada como uma possível abordagem terapêutica nesses modelos, ainda se desconhecem os efeitos que essa suplementação pode ter quando realizada durante a gestação no desenvolvimento fetal. Dessa forma, nós buscamos avaliar o efeito da suplementação com naringina durante a gestação sobre a homeostase redox e a função mitocondrial no encéfalo de filhotes fêmeas, além de investigar parâmetros de desenvolvimento pós-natal e memória nos filhotes machos nascidos de ratas que foram suplementadas. Assim, ratas Wistar prenhas foram divididas em dois grupos: (1) controle e (2) naringina, que foi administrada na dose de 100 mg/kg/dia por via oral durante toda a prenhez. Após o nascimento, as filhotes fêmeas foram eutanasiados nos dias pós-natais 1, 7 e 21, e córtex pré-frontal, hipocampo, corpo estriado e cerebelo foram coletados para análises bioquímicas. Os filhotes machos tiveram seu desenvolvimento pós-natal avaliado durante as duas primeiras semanas depois do nascimento, entre os dias pós-natais 2 e 15, além de serem submetidos a testes comportamentais no dia pós-natal 21. Nossos resultados demonstraram que a suplementação com naringina durante a gestação alterou a homeostase redox e a função mitocondrial no encéfalo das fêmeas de uma forma específica em cada estrutura e que essas alterações também foram dependentes da idade avaliada, já que a maior intensidade de efeitos foi observada nos dias pós-natais 1 e 7, e reduziram-se progressivamente até o dia pós-natal 21, exceto no cerebelo, que manteve um número elevado de alterações até essa idade, demonstrando ser mais susceptível aos efeitos do consumo materno de naringina durante a gestação. Os filhotes machos não apresentaram alterações significativas tanto em seu desenvolvimento durante as duas primeiras semanas após o nascimento quanto no desempenho nos testes comportamentais para avaliação da função mnemônica no dia pós-natal 21. Dessa forma, concluímos que a suplementação com naringina durante a gestação pode ser prejudicial ao desenvolvimento do sistema nervoso central em relação à homeostase redox e à função mitocondrial, especialmente no cerebelo, visto que essa suplementação foi capaz de desencadear diversas alterações bioquímicas. Se nossos dados puderem ser extrapolados para a clínica, sugerimos atenção ao consumo e suplementação com polifenóis durante o período gestacional, considerando os possíveis efeitos deletérios sobre o cérebro em desenvolvimento. / Several studies have been demonstrating that naringin supplementation promotes neuroprotection when used in animal models of neurodegenerative diseases, especially by regulating redox homeostasis and mitochondrial function. However, despite naringin use as a potential therapeutic approach in those models, there is no data concerning the effects of naringin supplementation during pregnancy on fetal development. Thereby, we sought to evaluate the effects of maternal naringin supplementation during pregnancy on redox homeostasis and mitochondrial function in female pups’ brain, as well as on postnatal development and memory of male pups. Thus, pregnant Wistar rats were divided into two groups: (1) control and (2) naringin, which was supplemented by oral gavage in a dose of 100 mg/kg/day during entire pregnancy. After birth, female pups were euthanized on postnatal days 1, 7 and 21, and prefrontal cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum were dissected for biochemical essays. Male pups were used to asses postnatal development during the first two weeks after birth, between postnatal days 2 and 15, and were submitted to behavioral test on postnatal day 21. Our results demonstrated that naringin supplementation during pregnancy altered redox homeostasis and mitochondrial function in brain of female pups in a structure specific manner, and that these alterations were also time-dependent, since most alterations were found on postnatal days 1 and 7, and progressively declined until postnatal day 21, except the cerebellum, which demonstrated an increased number of alterations until the last age, suggesting a higher susceptibility of this brain structure to the programming effects triggered by maternal naringin supplementation during gestation. Moreover, male pups did not demonstrate any significant alteration during postnatal development on the first two weeks after birth or on behavioral tests on postnatal day 21. Thereby, maternal naringin supplementation during pregnancy might be detrimental to the central nervous system development when considering redox homeostasis and mitochondrial function, especially on cerebellum, since naringin supplementation triggered several biochemical alterations. Whether our data could be considered for clinical purposes, we suggest attention to polyphenol consumption and supplementation during pregnancy, considering the high impact on brain metabolism during development.

Introdução: No Transtorno de Ansiedade Generalizada [TAG] observa-se prevalência de sintomas de ansiedade, perturbações do sono, irritabilidade, nervosismo persistente, tremores, tensão muscular, palpitações, tonturas e desconforto epigástrico, causando mal-estar e afetando negativamente a homeostase. Os mamíferos, inclusive os humanos, se acalmam ao receber cuidados maternos no início da vida, graças à ação regulatória conjunta do comportamento de apego e da liberação do neuropeptídeo ocitocina [OT]. Possivelmente por atenuar estados excitatórios, essa situação favorece o adormecer. Em seres humanos, a maternagem favorece, ainda, a criação de um forte e duradouro laço amoroso e estado de bem-estar e calma na díade mãe-bebê. Objetivos: Investigar possíveis relações entre OT, apego, e aspectos psicofisiológicos e homeostáticos de sono/insônia em pessoas com TAG. Desenho: Pesquisa translacional em neurociências, com N=27 participantes adultos do sexo masculino, diagnosticados com TAG, randomizados em grupo experimental [GE] e placebo [GP]. Hipótese: Após a intervenção, (administração de OT IN ou soro fisiológico) o GE deve apresentar, em relação ao GP, um estado de calma e bem-estar caracterizado pela diminuição nos níveis de cortisol salivar, no nível de ansiedade, e numa melhora dos afetos positivos e negativos [regulação ocitocinérgica], o que, por sua vez, deve favorecer o processo de adormecimento. Material e métodos: Entrevistas inicial e final; dados sociodemográficos; escalas sobre apego, ansiedade, afetos positivos e negativos, diário do sono. Após a randomização, GE e GP receberam respectivamente, de modo duplo-cego, spray com OT intranasal e soro fisiológico, duas vezes ao dia por quatro semanas, com avaliação de cortisol salivar, ansiedade e afetos antes e após a intervenção. Resultados: Os resultados finais, quando comparados com a linha de base, mostraram que o GE apresentou uma diminuição nos níveis de cortisol salivar e melhora na ansiedade e nos afetos, em relação ao GP. Ambos os grupos apresentaram redução na média de horas de sono, mas, qualitativamente, o GE teve desfecho melhor que o GP. Ambos os grupos apresentaram perfil de apego semelhante, com maiores índices de Superproteção do que de Cuidado, tanto materno quanto paterno, e prevalência do vínculo de tipo Controle Afetivo. Conclusões: Os resultados mostraram que as intervenções experimental e placebo estiveram associadas a índices mais altos de afetos positivos, e mais baixos de afetos negativos, ansiedade, e cortisol salivar nos dois grupos; no entanto, no GE esses resultados foram mais acentuados, e estiveram qualitativamente associados a melhora no humor, nas relações sociais e na qualidade do sono. Com relação ao apego, os resultados indicaram que os participantes receberam mais controle e superproteção do que cuidados amorosos de seu meio familiar / Introduction: In Generalized Anxiety Disorder [GAD] there is a prevalence of simptoms of anxiety, insomnia, irritability, persistent nervousness, trembling, muscle tension, palpitations, dizziness and epigastric discomfort, causing malaise and an imbalance in homeostasis. In humans and other mammals, babies and pups calm down upon receiving maternal care, as a result of the regulatory action of attachment behavior associated to the release of neuropeptide oxytocin [OT]. Falling asleep is probably eased as a consequence of attenuation of excitatory states. This associated action also favors the creation of a strong, long-lasting love bond, as well as states of well-being and calm in the mother-baby dyad. Objectives: To investigate eventual relations between OT, attachment and psychophysiological and homeostatic aspects of sleep-insomnia in patients with GAD. Hypothesis: After intervention (administration of IN OT or saline), GE should present, in relation to GP, a state of calm and well-being, characterized by a decrease in salivary cortisol levels, in anxiety, and improvement in positive and negative affects [oxytocinergic regulation], favoring, as a consequence, the process of falling asleep. Design: Translational Research in Neurosciences, with N = 27 male adults diagnosed with GAD, randomized in experimental [EG] and placebo group [PG]. Materials & Methods: Initial and final interviews; sociodemographic data, scales of attachment, anxiety and positive & negative affects; and sleep diary. After randomization, EG and PG were administered, in a double-blind way, respectively, intranasal OT spray and saline spray, twice a day, for four weeks, with assessment of salivary cortisol, anxiety and affects, before and after intervention. Results: When compared with baseline, final results showed a decrease in salivary cortisol levels, an improvement in anxiety as well as in affects in GE in relation to GP. Both groups presented a decrease in average sleep hours; however, GE had a qualitative improvement in sleep quality. Both groups presented a similar attachment profile, with higher levels of Overprotection when compared with Care, both maternal and paternal, and prevalence of the Affective Control-type bond. Conclusions: Results indicate that experimental and placebo interventions were associated with higher rates of positive affects, and lower rates of negative affects, anxiety, and salivary cortisol in both groups, however, in the EG these results were more accentuated, as well as qualitatively associated with improvement in mood, social relations, and sleep quality. As for attachment, results suggest that the participants probably received more control and overprotection than loving care from their parental environment

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os estresses salino e osmÃtico sÃo responsÃveis por perdas significativas na produÃÃo agrÃcola, particularmente nas regiÃes semiÃridas. Nessas condiÃÃes, a raiz à o ÃrgÃo da planta que sofre os primeiros efeitos e à responsÃvel pela percepÃÃo e sinalizaÃÃo bioquÃmica dos estresses. Em folhas, as peroxidases do ascorbato do citosol sÃo as principais isoformas envolvidas com a proteÃÃo antioxidativa contra o excesso de H2O2 e sÃo tambÃm relacionadas na sinalizaÃÃo em condiÃÃes de estresses. Entretanto, esses mecanismos de aÃÃo em raÃzes sÃo pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi testar a hipÃtese de que as APXs citosÃlicas sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa de raÃzes de arroz expostas Ãs condiÃÃes de estresse salino e osmÃtico. Para isso, plantas transgÃnicas silenciadas nas duas isoformas de APXs citosÃlicas (APX1/2) e plantas nÃo transformadas (45 dias de idade) foram expostas a duas condiÃÃes de estresse: (1) NaCl e manitol em concentraÃÃes iso-osmÃticas (-0,62 MPa) durante oito dias e (2) manitol 268 mM (-0,62 MPa) por dois dias. Em plantas silenciadas, a quantidade de transcritos (RNAs) de OsAPX1 e OsAPX2 foi reduzida em 90% enquanto que a abundÃncia das duas proteÃnas mensurada por western blotting nÃo foi detectÃvel. A atividade total de APX foi diminuÃda em 66% em comparaÃÃo com as NTs na condiÃÃo controle, evidenciando que o silenciamento foi efetivo nas raÃzes. Como consequÃncia da deficiÃncia das APX1/2, o nÃvel de H2O2 foi aumentado em 51% comparado com as NTs. Ambos os estresses afetaram de modo similar o crescimento da raiz e parte aÃrea das APX1/2, em comparaÃÃo com as plantas nÃo transformadas (NT). Os valores de danos de membrana nas raÃzes foram aumentados na mesma intensidade nos dois genÃtipos e nos dois tipos de estresses, indicando que as APX1/2 apresentaram mesma sensibilidade aos estresses estudados. Nas plantas NT, as quantidades de transcritos de OsAPX1 e OsAPX2 foram aumentadas discretamente por NaCl e manitol enquanto que a atividade de APX foi aumentada somente pelo NaCl. As plantas APX1/2 mostraram a mesma tendÃncia das NTs quanto a expressÃo e atividade de APX. O aumento na quantidade relativa dos transcritos das outras isoformas de APX, principalmente de OsAPX3, OsAPX5 e OsAPX8, em ambos os genÃtipos sob estresse salino, foi correlacionado com o aumento da atividade da APX. AlÃm disso, outras peroxidases (GPX e GPOD) apresentaram a mesma tendÃncia de aumento de atividade apenas sob estresse salino. Diferentemente, manitol induziu um aumento proeminente na atividade de catalase nas plantas NT enquanto que nas APX1/2 essa enzima jà apresentava atividade aumentada antes do estresse e permaneceu no mesmo nÃvel. As concentraÃÃes de H2O2 foram aumentadas intensamente por manitol e reduzidas na presenÃa de NaCl. O nÃvel de TBARS (indicador de peroxidaÃÃo lipÃdica) foi mantido inalterado na presenÃa dos dois estresses e nos dois tipos de plantas. Os resultados deste estudo, quando analisados em conjunto, mostram que raÃzes de arroz expostas aos estresses salino e osmÃtico exibiram respostas complexas em termos de metabolismo redox. Aparentemente, as duas APXs citosÃlicas nÃo sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa, uma vez que as plantas mutantes apresentaram uma performance fisiolÃgica semelhante as plantas NT. As respostas aos dois fatores de estresse, NaCl e manitol, foram contrastantes nos dois genÃtipos, sugerindo que diferentes mecanismos de proteÃÃo antioxidante foram acionados para cada tipo de estresse. / Os estresses salino e osmÃtico sÃo responsÃveis por perdas significativas na produÃÃo agrÃcola, particularmente nas regiÃes semiÃridas. Nessas condiÃÃes, a raiz à o ÃrgÃo da planta que sofre os primeiros efeitos e à responsÃvel pela percepÃÃo e sinalizaÃÃo bioquÃmica dos estresses. Em folhas, as peroxidases do ascorbato do citosol sÃo as principais isoformas envolvidas com a proteÃÃo antioxidativa contra o excesso de H2O2 e sÃo tambÃm relacionadas na sinalizaÃÃo em condiÃÃes de estresses. Entretanto, esses mecanismos de aÃÃo em raÃzes sÃo pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi testar a hipÃtese de que as APXs citosÃlicas sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa de raÃzes de arroz expostas Ãs condiÃÃes de estresse salino e osmÃtico. Para isso, plantas transgÃnicas silenciadas nas duas isoformas de APXs citosÃlicas (APX1/2) e plantas nÃo transformadas (45 dias de idade) foram expostas a duas condiÃÃes de estresse: (1) NaCl e manitol em concentraÃÃes iso-osmÃticas (-0,62 MPa) durante oito dias e (2) manitol 268 mM (-0,62 MPa) por dois dias. Em plantas silenciadas, a quantidade de transcritos (RNAs) de OsAPX1 e OsAPX2 foi reduzida em 90% enquanto que a abundÃncia das duas proteÃnas mensurada por western blotting nÃo foi detectÃvel. A atividade total de APX foi diminuÃda em 66% em comparaÃÃo com as NTs na condiÃÃo controle, evidenciando que o silenciamento foi efetivo nas raÃzes. Como consequÃncia da deficiÃncia das APX1/2, o nÃvel de H2O2 foi aumentado em 51% comparado com as NTs. Ambos os estresses afetaram de modo similar o crescimento da raiz e parte aÃrea das APX1/2, em comparaÃÃo com as plantas nÃo transformadas (NT). Os valores de danos de membrana nas raÃzes foram aumentados na mesma intensidade nos dois genÃtipos e nos dois tipos de estresses, indicando que as APX1/2 apresentaram mesma sensibilidade aos estresses estudados. Nas plantas NT, as quantidades de transcritos de OsAPX1 e OsAPX2 foram aumentadas discretamente por NaCl e manitol enquanto que a atividade de APX foi aumentada somente pelo NaCl. As plantas APX1/2 mostraram a mesma tendÃncia das NTs quanto a expressÃo e atividade de APX. O aumento na quantidade relativa dos transcritos das outras isoformas de APX, principalmente de OsAPX3, OsAPX5 e OsAPX8, em ambos os genÃtipos sob estresse salino, foi correlacionado com o aumento da atividade da APX. AlÃm disso, outras peroxidases (GPX e GPOD) apresentaram a mesma tendÃncia de aumento de atividade apenas sob estresse salino. Diferentemente, manitol induziu um aumento proeminente na atividade de catalase nas plantas NT enquanto que nas APX1/2 essa enzima jà apresentava atividade aumentada antes do estresse e permaneceu no mesmo nÃvel. As concentraÃÃes de H2O2 foram aumentadas intensamente por manitol e reduzidas na presenÃa de NaCl. O nÃvel de TBARS (indicador de peroxidaÃÃo lipÃdica) foi mantido inalterado na presenÃa dos dois estresses e nos dois tipos de plantas. Os resultados deste estudo, quando analisados em conjunto, mostram que raÃzes de arroz expostas aos estresses salino e osmÃtico exibiram respostas complexas em termos de metabolismo redox. Aparentemente, as duas APXs citosÃlicas nÃo sÃo essenciais para a proteÃÃo antioxidativa, uma vez que as plantas mutantes apresentaram uma performance fisiolÃgica semelhante as plantas NT. As respostas aos dois fatores de estresse, NaCl e manitol, foram contrastantes nos dois genÃtipos, sugerindo que diferentes mecanismos de proteÃÃo antioxidante foram acionados para cada tipo de estresse. / Salt and osmotic stresses are responsible for significant losses in agriculture, particularly in semiarid regions. In such conditions, roots are the first plant organ in contact with the stress and are responsible for perception and signaling. In leaves, cytosolic ascorbate peroxidases (APX) are the main isoforms involved with antioxidative defence against H2O2 excess and signaling under stressful conditions. Nevertheless, such metabolic mechanisms in roots are still unknown. The aim of this study was to test the hypothesis that cytosolic APX isoforms are essential to antioxidant protection in rice roots exposed to salt and osmotic stresses. To test this hypothesis, rice mutants double silenced for cytosolic APXs (APX1/2) and non-transformed plants, both with 45 day-old, were submitted to two stressful treatments: (1) NaCl and mannitol in iso-osmotic concentrations (-0.62MPa) for eight days and (2) mannitol 268 mM (-0.62MPa) for two days. In mutant plants, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts (RNAs) were reduced by 90% whereas both protein abundance measured by Western blotting were not detectable. Under control conditions, total APX activity was reduced by 66% in comparison with NT plants, showing that the silencing was effective in roots. In APX1/2 roots, H2O2 level was increased by 51% as a consequence of APX1/2 silencing. Both stresses affected similarly root and shoot growing compared with NT. Membrane damage was increased at the same level in both genotypes and in both stresses, showing that APX1/2 were as sensible as NT plants. In NT roots, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts was slightly increased by NaCl and mannitol whereas only NaCl increased APX activity. Under salt stress, both genotypes increased other APX isoforms, especially OsAPX3, OsAPX5 and OsAPX8. These increases were correlated with the increased APX activity. In addition, other peroxidases (GPX and GPOD) displayed the same trend as APX, increasing their activity in response to NaCl. On the other hand, mannitol induced a prominent increase in catalase activity in NT plants, while in APX1/2 plants CAT activity did not changed. The H2O2 content was increased in both genotypes exposed to mannitol treatments, and was reduced for NaCl. TBARS level was not altered in the presence of both stresses for both genotypes. This study shows that rice plants exposed to salt or osmotic stresses display complex responses regarding to redox metabolism. Apparently, both cytosolic APXs are not essential to antioxidative protection, since mutant plants presented similar physiological performance to NT plants. The responses to both stresses, NaCl and mannitol, were contrasting for both genotypes, suggesting that different mechanisms of antioxidative protection were triggered for each different stress condition. / Salt and osmotic stresses are responsible for significant losses in agriculture, particularly in semiarid regions. In such conditions, roots are the first plant organ in contact with the stress and are responsible for perception and signaling. In leaves, cytosolic ascorbate peroxidases (APX) are the main isoforms involved with antioxidative defence against H2O2 excess and signaling under stressful conditions. Nevertheless, such metabolic mechanisms in roots are still unknown. The aim of this study was to test the hypothesis that cytosolic APX isoforms are essential to antioxidant protection in rice roots exposed to salt and osmotic stresses. To test this hypothesis, rice mutants double silenced for cytosolic APXs (APX1/2) and non-transformed plants, both with 45 day-old, were submitted to two stressful treatments: (1) NaCl and mannitol in iso-osmotic concentrations (-0.62MPa) for eight days and (2) mannitol 268 mM (-0.62MPa) for two days. In mutant plants, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts (RNAs) were reduced by 90% whereas both protein abundance measured by Western blotting were not detectable. Under control conditions, total APX activity was reduced by 66% in comparison with NT plants, showing that the silencing was effective in roots. In APX1/2 roots, H2O2 level was increased by 51% as a consequence of APX1/2 silencing. Both stresses affected similarly root and shoot growing compared with NT. Membrane damage was increased at the same level in both genotypes and in both stresses, showing that APX1/2 were as sensible as NT plants. In NT roots, OsAPX1 and OsAPX2 transcript amounts was slightly increased by NaCl and mannitol whereas only NaCl increased APX activity. Under salt stress, both genotypes increased other APX isoforms, especially OsAPX3, OsAPX5 and OsAPX8. These increases were correlated with the increased APX activity. In addition, other peroxidases (GPX and GPOD) displayed the same trend as APX, increasing their activity in response to NaCl. On the other hand, mannitol induced a prominent increase in catalase activity in NT plants, while in APX1/2 plants CAT activity did not changed. The H2O2 content was increased in both genotypes exposed to mannitol treatments, and was reduced for NaCl. TBARS level was not altered in the presence of both stresses for both genotypes. This study shows that rice plants exposed to salt or osmotic stresses display complex responses regarding to redox metabolism. Apparently, both cytosolic APXs are not essential to antioxidative protection, since mutant plants presented similar physiological performance to NT plants. The responses to both stresses, NaCl and mannitol, were contrasting for both genotypes, suggesting that different mechanisms of antioxidative protection were triggered for each different stress condition.

3 Abstract Yeast Saccharomyces cerevisiae belongs to important models for alkali-metal-cation homeostasis research. As other cells, certain intracellular content of K+ is necessary for S. cerevisiae, but Na+ or other alkali metal cations (Li+ , Rb+ ) are toxic for yeast cells. Uniporters Trk1 and Trk2 are responsible for K+ accumulation, while efflux of Na+ , Li+ , Rb+ and K+ is ensured by Ena ATPases, Na+ (K+ )/H+ antiporter Nha1 and K+ specific channel Tok1. Several regulators of K+ (Na+ ) transporters are already known, but reciprocal regulation between transporters and overall picture of the maintenance of alkali-metal-cation homeostasis is still unclear. In this work, K+ circulation (simultaneous uptake and export of K+ ) was shown to be important in alkali-metal-cation homeostasis maintenance. K+ circulation is maintained using reciprocal regulation and interactions between K+ exporters and importers. Though obtained results showed that the alkali-metal-cation homeostasis and associated physiological parameters (e.g. membrane potential, cell size, salt sensitivity) are strain specific, Nha1p was verified to be important for cell survival in ever-changing natural environment. Furthermore, two novel positive regulators of Nha1p activity were found, 14-3-3 proteins and Cka1 kinase. 14-3-3 proteins...