Thesis (DR. P.H.)--University of Michigan.

Thesis (DR. P.H.)--University of Michigan.

Thesis (M.Med.Sc.)--University of Hong Kong, 1986. / Also available in print.

Typescript (photocopy). / Digitized by Kansas Correctional Industries

Thesis (doctoral)--Lund University, 1997. / Added t.p. with thesis statement inserted.

Thesis (doctoral)--Lund University, 1997. / Added t.p. with thesis statement inserted.

Orientador: Maria Silvia Viccari Gatti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T15:41:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wolf_VerenaHildegardGyarfas_D.pdf: 9944226 bytes, checksum: 09053dfca09f300be247c5d3d7342397 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A qualidade reprodutiva de fêmeas de suínos é determinada pelos índices de retorno ao cio, tamanho da leitegada, abortos, natimortalidade e mumificação fetal, entre outros itens. Parvovírus suínos (PVS) pela passagem transplacentária em porcas, podem levar à morte fetos em diferentes idades gestacionais, sendo associados aos índices elevados de mumificação fetal no início da gestação quando esses não são imunocompetentes. Em estágios mais tardios da gestação, fetos imunocompetentes podem sobreviver à infecção por PVS e esses vírus são isolados de fetos abortados e natimomortos. De granjas tecnificadas, com vacinação contra a parvovirose, foram coletadas amostras de 39 fetos com idade gestacional acima de 70 dias, com o objetivo de associar PVS a problemas reprodutivos de fêmeas. A imunocompetência dos fetos foi comprovada já que 93,4% deles foi positivo na inibição da hemaglutinação Por imunoperoxidase, a proteína estrutural VP2 de PVS foi detectada por anticorpo monoclonal no citoplasma de células isoladas e individualizadas de pulmão (macrófagos alveolares), em múltiplas células do músculo cardíaco e em células estromais de timo (retículo-epiteliais), tanto de fetos natimortos como abortados. Não houve diferença estatisticamente significante nesses achados entre fetos natimortos e abortados, mas tecidos do pulmão e do timo foram significativamente mais positivos que o coração. Por nested-PCR para o gene da proteína não estrutural NS-1 de PVS foram analisadas 108 amostras de tecidos de fetos natimortos, abortados e mumificados. O DNA viral foi detectado em 82,4% das amostras, sem diferença significativa para o tipo de feto, determinando que a parvovirose suína não deva ser caracterizada apenas como doença da mumificação fetal. A freqüência de identificação de PVS foi maior no pulmão (96,99%) e coração (93,33%) que no baço (54,91%), rim (69,56%) e timo (66,0%). Nos fetos com morte estimada entre 70 a 99 dias de gestação a detecção por nested-PCR foi maior (94,76%) que naqueles com 100 ou mais dias (55,57%). Houve diferença significativa na detecção de PVS em tecidos de fetos oriundos de porcas com menor (92,28%) e maior (65,43%) número de partos, o que sugere uma maior ocorrência da transmissão transplacentária em porcas mais jovens, submetidas a um menor número de vacinações. Mesmo em animais com anticorpos o DNA viral foi detectado, mostrando que a infecção ocorreu e se manteve independente da imunocompetência do feto. Ainda, nossos dados mostram que PVS estão associados tanto com a mumificação fetal, como com abortos e natimortalidade em suínos / Abstract: Swine female reproductive quality is mainly measured by return to estrus, litter size, abortion, stillbirth and mummies. Porcine parvovirus (PPV) transplacental infection is associated to fetal death at different gestacional age, and mostly with fetal mummification due to abscence of fetal immunecompetence in early pregnancy. In late gestational age, immunecompetent fetuses can survive the PPV infection and the virus may be isolated from stillbirth and aborted animals. From commercial vaccinated swine herds, thirty nine fetuses over 70 days of gestational age, so immunocompetent, were separated for analysis. The application of hemagglutination inhibition test confirm fetal immunecompetence in 93,4% of the samples. Viral antigen was detected in isolated individual cells of the lung (alveolar macrophage), in multiple miocardial cells and in stromal cells of the timus (epithelial-reticular), by immuneperoxidase staining using an anti-VP2 monoclonal antibody. These results were observed in stillbirth and aborted fetuses. There was no statistically significant difference for PPV infection in stillbirth and aborted fetuses, but lung and thymus were significantly more positive that the heart. The presence of virus in fetal tissues was analyzed by nested-PCR assay for the NS-1 gene of PPV in stillbirth, aborted fetuses and mummies. The viral DNA was detected in 82.4% of the samples, with no significant difference in the type of fetus, determining that the porcine parvovirosis should not be characterized only as a disease of fetal mummification. Using nested-PCR assay, the frequency of identification of PPV was higher in the lung (96,99%) and hearth (93,33%) than in the spleen (54,91%), thymus (66,0%) and kidney (69,5%). Fetuses which death estimated age more than 100 days old were less positive to PPV and a significant difference in PVS detection was detected in tissues from fetuses from sows with lower (92.28%) and highest (65.43%) number of parturitions. This suggests for a higher susceptibility of transmission in younger sows, submitted to a fewer vaccinations. PPV DNA were detection was independent of antibody presence in fetuses. Fetus immunecompetence did not prevent the infection by PPV and these viruses are associated with abortion, stillbirth and mummies / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T12:40:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KosckyPaier_CarlosRoberto_M.pdf: 3760581 bytes, checksum: 99331529324819b59a4360d60efd9b9a (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A quinase de 70 kDa da proteína ribossomal S6, isoforma 1 (S6K1), é uma fosfoproteína implicada na regulação de genes relacionados ao controle da tradução em mamíferos e possui uma forma nuclear (a1) e uma citoplasmática (a2). A fosforilação do seu principal alvo, a proteína RPS6, tem sido comumente associada ao recrutamento seletivo dos 5'-TOP (5' tract of oligopyrimidine) mRNAs pela maquinaria de tradução, embora haja estudos contrariando esta hipótese. Devido às funções de seus demais alvos, S6K1 tem sido implicada na sobrevivência celular e em diversos outros processos, como crescimento, câncer e resistência à insulina. S6K1 é ativada por um mecanismo que envolve fosforilação seqüencial através da ativação das vias mTORC1 (complexo 1 do alvo da rapamicina em mamíferos) e PI3K (fosfoinositol-3 quinase). Como uma quinase da família AGC, S6K1 deve ser fosforilada por mTORC1 no resíduo Thr389 do domínio hidrofóbico e, em seguida, por PDPK1 (proteína quinase 1 dependente de fosfoinositol) no resíduo Thr229 da alça T do domínio catalítico. Estes eventos ocorrem somente após a fosforilação em diversos sítios do domínio auto-inibitório carboxiterminal, por mTORC1. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um ensaio modelo para análise da função da S6K1 in vitro e utilizá-lo como ferramenta na elucidação do papel de proteínas adaptadoras da via de mTOR em interações com a S6K1. Para isso foi necessário produzir as proteínas recombinantes para ensaios de interação e para realização de um ensaio de atividade para a S6K1. Foram testados vários sistemas de expressão para Escherichia coli para produção das construções GST-S6K1a1-His6, GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT (forma a2 de S6K1 com a substituição T389E e o carboxiterminal truncado), GST-PDPK1 e GST-CDPDPK1 (domínio catalítico de PDPK1 fusionado a GST). A expressão das formas truncadas de S6K1 e PDPK1 foi mais eficiente em E. coli. Embora o rendimento tenha ficado muito aquém do esperado, foi suficiente para os ensaios de interação in vitro. Também foi feita a expressão em E. coli da região C-terminal da proteína RPS6, que é o substrato da S6K1, em fusão com a proteína D do fago ?. Posteriormente, foram montados sistemas de expressão das construções His6-S6K1a2T389E?CT e His6-CDPDPK1 em células de inseto, a partir de vetor de baculovírus. Constatou-se que essas construções são expressas na forma de fosfoproteínas em células de inseto. Ensaios de GST pull-down com GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT contra as duas isoformas da subunidade catalítica da PP2AC, His6-PP2ACa(maior) e His6-PP2ACa(menor), revelaram que His6-PP2ACa(maior) não interage com GST-S6K1a2-His6, embora interaja fortemente com GST-S6K1a2T389E?CT. Já a construção His6-PP2ACa(menor) interage fracamente com as construções GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT. Tomados em conjunto, os resultados sugerem que a presença do C-terminal não fosforilado de S6K1a2 impede a interação com PP2ACa(maior). PP2ACa(menor) comporta-se de forma completamente diferente da isoforma maior, pois a interação entre PP2ACa(menor) e S6K1a2 parece ser independente do carboxiterminal da quinase, visto que as quantidades de S6K1a2T389E?CT e de S6K1a2 inteira que interagem com PP2ACa(menor) são semelhantes. Esses resultados necessitam ainda serem confirmados in vivo. Outros experimentos de GST pull-down confirmaram que as construções de S6K1 não interagem com a4, embora interajam com TIPRL1. Se confirmado in vivo, esse resultado compõe um novo quadro na regulação coordenada entre mTOR1 e PP2A, do qual TIPRL1 parece participar. As construções genéticas e os sistemas de expressão gerados neste trabalho possibilitaram a obtenção dos reagentes necessários para analisar o mecanismo de regulação da quinase S6K1, mediado por proteínas regulatórias. Permitem também desenvolver uma série de experimentos, como busca de inibidores específicos para a S6K1, que dependem da reconstituição de ensaios de atividade in vitro com a S6K1 ativada. Contudo, o ensaio de atividade realizado não apresentou resultados satisfatórios e precisa ser desenvolvido. / Abstract: The 70kDa ribosomal S6 protein kinase 1 (S6K1) is a phosphoprotein involved in the regulation of genes related to translational control in mammals. S6K1 shows distinct nuclear (a1) and cytoplasmic (a2) forms. Phosphorylation of the S6K1 best characterized target, the protein of the small ribosomal subunit (RPS6), has been generally associated to the selective recruitment of the 5'-TOP mRNAs (5' tract of oligopyrimidine) by the translational machinery, although there is still some controversy on this issue. Due to the function of its targets, S6K1 has been implicated in several cellular processes including cell growth, cancer and insulin resistance. S6K1 is activated by a mechanism of sequential phosphorylation following activation of the mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) and PI3K (phosphoinositide-3-kinase) pathways. As a kinase of the AGC family, S6K1 activation requires mTORC1 phosphorylation of residue Thr389 of the hydrophobic domain followed by PDPK1 (phosphoinositide dependent protein kinase 1) phosphorylation of residue Thr229 at the T loop of the catalytic domain. These take place only after phosphorylation by mTORC1 of several residues of the autoinhibitory C-terminal domain. The objective of this work was to develop an assay to analyze the function of S6K1 in vitro and use it as a tool in the discovering of the functions of regulators proteins of the mTOR cascade in interactions with S6K1. For these purposes, expression systems were constructed to produce the various recombinant proteins to be used in the interaction and activity assays. Several genetic constructions were tested in Escherichia coli for the production of GST-S6K1a1-His6, GST-S6K1a2-His6 and GST-S6K1a2T389E?CT (a2 form of S6K1 with the T389E substitution and truncated carboxiterminus), GST-PDPK1 and GST-CDPDPK1 (GST fusion protein of the catalytic domain of PDPK1). The truncated forms were expressed more efficiently in E. coli. Although the yield in E. coli was lower than expected, it was sufficient to perform interaction assays. The C-terminal domain of RPS6, a substrate for S6K1, was successfully expressed in E. coli as a fusion protein with the phage ? protein D. Subsequently, expression systems for production of His6-S6K1a2T389E?CT and His6-CDPDPK1 in insect cells were constructed using baculovirus vectors. It was found that these constructs are expressed in the form of phosphoproteins in insect cells. GST pull-down assays using GST-S6K1a2-His6 e GST-S6K1a2T389E?CT to test interaction with the PP2AC isoforms His6-PP2ACa(major) and His6-PP2ACa(minor) revealed that His6-PP2ACa(major) does not interact with GST-S6K1a2-His6, although it interacts strongly with GST-S6K1a2T389E?CT. On the other hand, His6-PP2ACa(minor) interacts weakly with both GST- S6K1a2-His6 and GST-S6K1a2T389E?CT. This finding suggests that the unphosphorylated C-terminal of S6K1a2 inhibits interaction with PP2ACa(major). His6-PP2ACa(minor) behaves differently form His6-PP2ACa(major). Its interaction with S6K1a2 seems to be independent of the C-terminal since the amounts of S6K1a2T389E?CT and S6K1a2 that interact with His6-PP2ACa(minor) are similar. Future work in vivo is required to confirm these results. GST pull-down assays confirmed that a4 does not interact with the constructions of S6K1, while TIPRL1 interacts with them. If confirmed in vivo, these results provides a new perspective for the coordinated regulation between mTOR1 and PP2A, which apparently involves also TIPRL1. The genetic constructions and expression systems established in this work allow the production of the reagents required to study the mechanism of S6K1 regulation mediated by adaptor proteins. They will also allow the development of experiments such as screening for specific S6K1 inhibitors, which depend on reconstitution of S6K1 activity assays using activated S6K1. Nevertheless, the activity assay performed did not yield satisfactory outcomes and must be improved. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular