Cancer remains the second most common cause of death worldwide affecting around 10 million patients every year. Among the therapeutic options, chemotherapeutic drugs are widely used but often associated with side effects. In addition, toxicity against immune cells may hamper anti-tumor immune responses. Some chemotherapeutic drugs, however, preserve immune functions and some can even stimulate anti-tumor immune responses through the induction of immunogenic cell death (ICD) rather than apoptosis. ICD stimulates the immune system by several mechanisms including the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs) from dying cells. In this review, we will discuss the consequences of inducing two recently characterized forms of ICD, i.e., pyroptosis and necroptosis, in the tumor microenvironment (TME) and the perspectives they may offer to increase the immunogenicity of the so-called cold tumors and to stimulate effective anti-tumor immune responses.

Les infections à Salmonella Enteritidis chez les humains sont associées à la consommation d’œufs ou d’ovoproduits contaminés. La vaccination est un outil utilisé pour diminuer les risques d’infection à SE chez la volaille, mais avec des résultats variables. Au Canada deux bactérines, MBL SE4C et Layermune, sont couramment utilisées pour lutter contre SE. Cependant, leur efficacité n’a pas été complètement déterminée chez les poules pondeuses plus âgées. Par ailleurs, la capacité de ces vaccins à prévenir la transmission verticale et horizontale n’a pas encore été étudiée. L’objectif principal de cette étude était d’évaluer l’effet des deux bactérines sur la réponse immunitaire chez les poules pondeuses, de vérifier la protection conférée par ces vaccins contre l’infection expérimentale à SE, et d’identifier des protéines immunogènes afin de développer un vaccin sous-unitaire. Les oiseaux ont été vaccinés avec deux protocoles d’immunisation en cours d’élevage (soit à 12 et 18, ou à 16 semaines d’âge). Le groupe contrôle a été injecté avec la solution saline. Les oiseaux ont été inoculés per os avec 2 x 109 CFU de la souche SE lysotype 4 à 55 ou à 65 semaines d’âge. Les anticorps (IgG et IgA) ont été mesurés à différents temps avec un ELISA maison en utilisant l’antigène entier de SE. La phagocytose, flambée oxydative, les populations des splénocytes B et T ont été analysées en utilisant la cytométrie en flux. Les signes cliniques, l’excrétion fécale, la contamination des jaunes d’œufs et l’invasion des salmonelles dans les organes ont été étudiés pour évaluer l’efficacité de protection. La transmission horizontale a aussi été étudiée en évaluant l’infection à SE chez les oiseaux mis en contact avec les oiseaux inoculés. Les protéines immunogènes ont été identifiées par SDS-PAGE et Western blot à l’aide d’antisérums prélevés suite à la vaccination et/ou à l’infection expérimentale/naturelle, puis caractérisées par la spectrométrie de masse. Le protocole de vaccination avec deux immunisations a généré un niveau élevé de séroconversion à partir de 3 jusqu’à 32-34 semaines post-vaccination par rapport à celui avec une seule immunisation (p < 0.02), mais il n’y avait plus de différence entre les groupes à 54 et 64 semaines d’âge. Il n’y a pas eu de corrélation entre les niveaux d’IgG et les taux d’isolement des salmonelles dans les organes et des jaunes d’œuf. La production des IgA n’a été observée que chez les oiseaux vaccinés avec 2 injections de MBL SE4C (p ≤ 0.04). Après l’infection expérimentale, la production des IgA a été significativement plus élevée aux jours 1 et 7 p.i dans l’oviducte des oiseaux vaccinés (sauf pour le groupe vacciné avec 2 injections de Layermune) par comparaison avec le groupe contrôle (p ≤ 0.03). Seule la bactérine MBL SE4C a eu un effet protecteur contre la contamination des jaunes d’œuf chez les oiseaux infectés. Ce vaccin réduit partiellement en utilisant deux immunisations, le taux d’excrétion fécale des salmonelles chez les oiseaux inoculés et les oiseaux horizontalement infectés (p ≤ 0.02). Cinq des protéines identifiées par la spectrométrie de masse sont considérées comme des protéines potentiellement candidates pour une étude plus approfondie de leur immonogénicité: Lipoamide dehydrogenase, Enolase (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase), Elongation factor Tu (EF-Tu), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) et DNA protection during starvation protein. En général, les bactérines ont induit une immunité humorale (IgG et IgA) chez les poules pondeuses. Cette réponse immunitaire a protégé partiellement les oiseaux quant à l’élimination des salmonelles, la contamination des jaunes d’œuf, ainsi que la transmission horizontale. Dans cette étude, la bactérine MBL SE4C (avec deux immunisations) s’est montrée plus efficace pour protéger les oiseaux que la bactérine Layermune. Nos résultats apportent des informations objectives et complémentaires sur le potentiel de deux bactérines pour lutter contre SE chez les poules pondeuses. Étant donné la protection partielle obtenue en utilisant ces vaccins, l’identification des antigènes immunogènes a permis de sélectionner des protéines spécifiques pour l’élaboration éventuelle d’un vaccin plus efficace contre SE chez les volailles. / Contaminated eggs and egg products have been associated with outbreaks of human Salmonella Enteritidis (SE) infections. Killed bacteria (bacterins) have been used to control Salmonella infections in poultry but variation in the conferred protection has been observed. In Canada the bacterins MBL SE4C and Layermune are currently used to control SE. However, their efficacy in protecting older layers has not been fully determined. Furthermore, the capacity of these bacterins to prevent vertical and horizontal transmissions has not yet been investigated. The main objectives of this study were to evaluate the effect of two available commercial bacterins on the immune response of laying hens, to verify the protection conferred by these vaccines against SE challenge and to identify immunogenic proteins to develop an oral subunit vaccine. Laying hens were vaccinated with two immunization schedules prior to the lay cycle (either at 12 and 18, or 16 weeks of age). The control group was injected with a saline solution. Laying hens were later inoculated per os with 2 x 109 CFU of SE PT4 strain either at 55 or 65 weeks of age. Serum IgG and mucosal IgA antibodies were measured with an in-house SE whole cell antigen ELISA. The phagocytosis, oxidative burst, splenic T and B cells populations were analyzed using flow cytometry. Clinical signs, fecal shedding, egg yolks contamination and organ invasion by SE were assessed to evaluate vaccine protection. Potential horizontal transmission from inoculated laying hens to non-inoculated laying hens, housed in the same isolator unit, was also evaluated. Immunogenic proteins were identified by SDS-PAGE and Western blot with sampled antisera during vaccination and/or infection of poultry with SE and then subjected to mass spectrometry. The vaccination protocol with two immunizations showed a higher seroconversion level than the single vaccination at 3 until 32-34 weeks post vaccination (p < 0.02) but no difference before challenge (54 and 64 old weeks). There was no relationship between high IgG level and SE isolation rates in organs and egg yolks. Only the MBL SE4C vaccine elicited IgA antibody production at 3 weeks post vaccination in both immunization protocols (p ≤ 0.04). Significant higher mucosal IgA levels were observed at day 1 and 7 post challenge in oviduct of vaccinated birds (except for the twice vaccinated Layermune group) compared to the control group (p ≤ 0.03). Humoral efficacy to protect from SE contamination of egg yolk was only observed in MBL SE4C vaccinated group and only this bacterin administered twice reduced SE shedding rate in inoculated birds and their exposed cagemates (p ≤ 0.02). A set of 5 proteins were considered as putative protein candidates to further detailed study on their immunogenicity: Lipoamide dehydrogenase; Enolase (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase); Elongation factor Tu (EF-Tu); Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and DNA protection during starvation protein. Overall, the commercial bacterins induced humoral immunity (IgG and IgA antibodies) in laying hens. This immune response partially protected for SE clearance, egg yolks contamination as well as horizontal transmission. In this study, MBL SE4C bacterin appeared to be more efficient in comparison to Layermune for protection of hens with a vaccination protocol comprising two immunizations. Our results provide additional and objective information on the potential of these vaccines for the control of SE in laying hens. Considering the partial protection achieved with the use of these bacterins, the identification of immunogenic antigens could help in the selection of specific proteins to elaborate a more efficient vaccine against SE in poultry.

Immunogenic cell death (ICD) is characterized by presence of specific molecules including surface exposed calreticulin (CRT) and the heat shock proteins HSP70 and HSP90. Release of ATP and high- mobility group box protein 1 (HMGB1) belongs to other typical characteristics. For induction of ICD in lung cancer cells high-hydrostatic pressure (HHP) was used. Treatment by HHP induces expression of immunogenic markers CRT, HSP70 and HSP90 on the cell surface. HHP also induces secretion of ATP to the extracellular milieu. Dendritic cells (DC) pulsed with HHP-treated tumor cells showed fenotypic maturation characterized by upregulation of maturation molecule CD83, costimulation molecules CD80 and CD86, chemokine receptor CCR7 and MHC class II molecule HLA-DR. Pulsed DCs have also higher rate of phagocytosis of HHP-treated tumor cells and they induce lower numbers of regulatory T cells compared to immature DCs. Moreover, activation of caspases (-8, -9, -3) and other proteins (phosphorylation of eIF2α) which are crucial in ER-stress mediated apoptotic pathway, was observed after HHP treatment. Using wide range of methods it was confirmed that HHP treatment is able to induce ICD in lung cancer cell lines, fenotypic and functional characteristics were described and the decreased induction of regulatory T-lymphocytes...

Le développement d’un cancer chez un individu immunocompétent témoigne del’inefficacité de ses défenses immunitaires naturelles à entraver la progression tumorale. Larestauration ou l’induction de réponses immunitaires anti-tumorales efficaces sont des enjeuxmajeurs des stratégies thérapeutiques actuelles. En plus des immunothérapies classiques,visant à activer le système immunitaire des patients contre leurs tumeurs, les thérapiesconventionnelles, telles que les chimiothérapies et la radiothérapie, peuvent avoir des effetsimmunostimulants, en parallèle de leur effet directement cytotoxique sur les cellulestumorales. Parmi celles-ci, les anthracyclines, l’oxaliplatine et la radiothérapie sontnotamment capables d’induire une mort cellulaire immunogène. L’efficacité thérapeutique deces traitements dépend de l’activation de lymphocytes T (LT) CD8 anti-tumoraux,producteurs d’interféron-gamma (IFN-γ). En utilisant des modèles murins de tumeurstransplantées, nous montrons que le traitement des cellules tumorales par des droguesimmunogènes induit la libération d’adénosine triphosphate (ATP) dans le milieu extracellulaire.Ce signal de danger endogène se lie à son récepteur P2RX7 sur les cellulesdendritiques et permet la formation de l’inflammasome NLRP3/ASC/pro-caspase 1,conduisant à l’activation protéolytique de la caspase 1, qui active la pro-interleukine-1β (pro-IL-1β) en interleukine-1β (IL-1β). L’IL-1β peut directement agir sur les LT CD8 pourfaciliter leur polarisation vers un phénotype de lymphocytes T cytotoxiques de type 1 (Tc1).De plus, le traitement de tumeurs établies par des drogues immunogènes induit uneproduction d’IL-17A (IL-17) dans le lit tumoral, au cours de la première semaine suivant letraitement. Les LT gamma delta (LTγδ) sont les principaux producteurs de cette cytokinedans nos modèles. Ces cellules s’accumulent transitoirement dans la tumeur dès le troisièmejour suivant le traitement et leur taux est parfaitement corrélé à celui des LT CD8 producteursd’IFN-γ tumoraux. Comme l’IFN-γ, l’IL-17 et les LTγδ sont nécessaires à l’efficacitéthérapeutique des drogues immunogènes. L’IL-1β produite par les cellules dendritiquesexposées à des corps apoptotiques immunogènes stimule directement la production d’IL-17par les LTγδ. Ces travaux ont contribué à identifier l’ATP extra-cellulaire comme undéterminant moléculaire de l’immunogénicité des cellules tumorales exposées à certainesthérapies anti-cancéreuses conventionnelles. De plus, nous montrons que les traitementscytotoxiques classiques peuvent moduler l’environnement immunitaire dans le lit tumoral, etcontribuer à remplacer une inflammation chronique et immunosuppressive en uneinflammation aigüe et immunogène. L’étude des interactions entre le système immunitaire etles thérapies anti-cancéreuses conventionnelles est nécessaire pour utiliser ces traitements demanière plus rationnelle, en les combinant par exemple à des immunothérapies plusclassiques. / In most cases, cancer occurs in immunocompetent individuals, revealing the potential failure of the immune system to impair tumor development. Trying to restore or to induce an efficient anti-tumoral immune response is part of the main challenges of cancer treatment. In addition to the classical immunotherapeutic compounds, conventionnal cytotoxic treatments can also have some immunostimulatory effects. Among these treatments, the chemotherapeutic agents oxaliplatin and anthracyclins, as well as irradiation, can induce an immunogenic cell death, contributing to the activation of IFNγ-producing CD8 T cells. We show that upon treatment with immunogenic drugs, tumor cells are able to release ATP in the extracellular medium. This ATP can act on dendritic cells through its receptor P2RX7, which is able to activate the inflammasome NLRP3 and the subsequent production of IL-1β. Using models of transplantable tumors in mice we could show that the production of IL-1β induced by immunogenic treatments was mandatory for their efficacy. In addition to being directly involved in Tc1 cells polarization, IL-1β could promote the production of IL-17A by gamma delta T cells which were accumulating in the tumor bed following chemotherapy. We could show that these IL-17 producing gamma delta T cells were involved in treatment efficacy. This work has revealed that extracellular ATP was a crucial endogenous danger signal involved in anti-cancer chemotherapy efficacy. Furthermore, we have shown that conventionnal cytotoxic compounds could transform the smoldering pro-tumoral inflammation into an acute and immunogenic anti-tumoral one. This work may have some clinical implications, especially in the setting of therapeutic protocols involving the combination of conventionnal cytotoxic therapies with selected immunoadjuvants for the treatment of cancer.

L’efficacité de la chimiothérapie contre la croissance tumourale repose sur l'induction d'une mort des cellules tumourales dite immunogène. Les cellules tumourales mourantes agissent alors comme un vaccin thérapeutique en stimulant une réponse immunitaire anti-tumourale capable de contrôler, voire d'éliminer, les cellules cancéreuses résiduel. Les trois marqueurs principales de la mort cellulaire immunogène (MCI), sont (i) l'exposition pré-apoptotique de la calréticuline (CRT) à la surface des cellules, (ii) la sécrétion de l'ATP pendant l'apoptose qui dépend du processus d'autophagie, et (iii) le relargage post-apoptotique de la protéine non-histone de fixation à la chromatine HMGB1 (High Mobility Group B1). CRT, ATP et HMGB1 se lient respectivement à CD91, au récepteur purinergique P2RX7 (Purinergic Receptor P2X, ligand-gated ion channel 7) et au récepteur TLR4 (Toll-like Receptor 4) situés à la surface des cellules dendritiques. En retour, ces interactions initient respectivement la phagocytose des cellules mourantes, la production de l'interleukine-1β et la cross-présentation des antigènes tumouraux aux lymphocytes T.Notre laboratoire a précédemment démontré que la chimiothérapie adjuvante présente une efficacité réduite chez des patients atteints de cancers colorectaux et du sein portant un polymorphisme d'un seul nucléotide ou SNP (Single-Nucleotide Polymorphism) compromettent la fonction des gènes P2RX7 et TLR4, notamment rs3751143 (496Glu>Ala) pour le gène P2RX7 et rs4986790 (299Asp>Gly) pour le gène TLR4.Compte tenu des ces résultats que mettent en évidence la relation étroite entre l’efficacité de la chimiothérapie anticancéreuse et un système immunitaire opérationnel, nous avons décidé d'étudier l'effet de ces SNPs, soit sur la survie globale soit sur la survie sans événement, chez des patients atteints de cancer pulmonaire non à petites cellules ou NSCLC (Non-Small Cell Lung Carcinoma) et de cancers de la tête et du cou ou HNSCC (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma). De plus, nous avons porté notre attention sur un autre SNP affectant le gène ATG16L1 (Autophagy-related 16-Like 1), notamment rs2241880 (300Thr>Ala) qui compromet l’activité d’un gène fondamental dans le processus d’autophagie.Dans les cancers NSCLC, les allèles mutants "perte de fonction" des gènes ATG16L1, P2RX7 et TLR4 n'affectent pas la survie globale, indépendamment du type de chimiothérapie administrée. Au contraire, les patientes atteintes de HNSCC, portant au moins un allèle "perte de fonction" d’ATG16L1 et TLR4, présentent un taux de survie sans récidive inferieure par rapport aux patients qui présentent un genotype sauvage. Ce travail décrit pour la première fois un biomarqueur prognostique pour ce type de cancer.De plus, nous avons pu définir, par génotypage à haut débit, une signature de SNPs prédictive de la réponse à la chimiothérapie neoadjuvantes à base d'anthracyclines et des taxanes chez les patients atteints de cancer du sein. En particulier, la combinaison des deux paramètres clinicopathologiques classiques (âge lors du diagnostic et récepteur aux œstrogènes) avec les génotypes rs1076669 du gène ECE1 (Endothelin Converting Enzyme 1; 341Thr>Ile) et rs2277413 du gène PZP (Pregnancy-Zone Protein; 813Val>Ala) a permis de définir trois grandes catégories des patients et leur probabilité respective d'atteindre la réponse complète pathologique après traitement.L'identification de nouveaux biomarqueurs associés à une absence/diminution de réponse à la chimiothérapie apparaît critique pour choisir des alternatives thérapeutiques appropriées et éviter les effets secondaires indésirables chez les non-répondeurs. / Successful chemotherapeutics can induce a type of tumour cell death that is immunogenic, implying that patient’s dying cancer cells function as a therapeutic vaccine and elicit an anti-tumour immune response that controls the residual disease. The three main hallmarks of immunogenic cell death (ICD) are the pre-apoptotic exposure of calreticulin (CRT) on the cell surface, the autophagy-dependent secretion of ATP during the blebbing phase of apoptosis and the post-apoptotic release of the chromatin-binding non-histone protein high mobility group B1 (HMGB1). CRT, ATP and HMGB1 interact with CD91, purinergic receptor P2X, ligand-gated ion channel, 7 (P2RX7) and Toll-like receptor 4 (TLR4), respectively, on the surface of dendritic cells (DCs), thus promoting the engulfment of dying cells, the production of IL-1β and the cross-presentation of tumour-associated antigens to T cells, respectively.Our laboratory has demonstrated that adjuvant chemotherapy exhibits a reduced efficacy in breast and colorectal cancer patients bearing single-nucleotide polymorphisms (SNPs) that compromise the function of P2RX7 or TLR4, such as rs3751143 in P2RX7 (Glu496Ala) and rs4986790 in TLR4 (Asp299Gly).Driven by these results, underpinning the intimate relationship between the success of anti-cancer chemotherapy and an operational immune system, we decided to investigate the effect of these SNPs on disease outcome among non-small cell lung carcinoma (NSCLC) and head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients. Additionally, we focused our attention on a SNP in autophagy related 16-like 1 (ATG16L1), namely rs2241880 (Thr300Ala), which compromises the activity of one pivotal autophagic gene. In NSCLC patients, loss-of-function ATG16L1, P2RX7 and TLR4 alleles do not affect overall survival, irrespective of the administration and type of chemotherapy. Conversely, HNSCC patients bearing at least one loss-of-function ATG16L1 or TLR4 allele exhibit a reduced disease-free survival when compared to their wild-type counterparts. This is the first report highlighting a putative prognostic biomarker for this malignancy. Furthermore, taking advantage of a high throughput genotyping study, we delineated a SNP-based signature that predicts the response of breast cancer patients to anthracycline- and taxane-based neoadjuvant chemotherapy. Particularly, the combination of two classical clinicophatological parameters (age at diagnosis and estrogen receptor) and genotype at the ECE1 (rs1076669 Thr341Ile) and PZP (rs2277413 Val813Ala) loci allowed us to define three broad categories with a correspondent probability of achieving pathological complete response. The identification of new biomarkers associated with a reduced/absent response to chemotherapy appears critical for selecting appropriate therapeutic alternatives, and avoiding undesired side effects among non-responders.

Le métabolisme des lipides joue un rôle prépondérant dans le cancer. Ce métabolisme a pour effet, particulièrement grâce à la production de phospholipides (PLs), de supporter le niveau accru de prolifération mais aussi de réguler finement des mécanismes intra-cellulaires et extra-cellulaires qui promeuvent le maintien et la progression des cellules cancéreuses. Parmi tous ces acteurs, les gouttelettes lipidiques (GLs), connues pour leur fonction de réservoir, commencent à dévoiler leurs côtés sombres. Notre premier projet nous a permis de mettre en avant l’accumulation de GLs par des cellules de cancer colorectal (CCR) chimiorésistantes. La formation de GLs est régie par l’expression de l’enzyme lysophosphatidylcholine acyltransférase 2 (LPCAT2), permettant la production de phosphatidylcholine. Elle a pour effet de protéger le réticulum endoplasmique (RE) de l’induction d’un stress prévenant l’activation d’une mort cellulaire immunogène. Ces modulations lipidiques peuvent également se retrouver dans le plasma, où elles font l’objet de l’identification de biomarqueurs. Dans ce contexte, nous avons montré dans un second projet, que certains PLs pouvaient diagnostiquer la présence d’un carcinome hépatocellulaire (CHC) sur un foie cirrhotique. Ces deux aspects soulignent l’importance du métabolisme des PLs dans les cancers digestifs. / Among all altered cancer metabolic pathways, lipid metabolism has a preponderant role in cancer development. This metabolism, especially through the production of phospholipids, supports high level of proliferation and carefully regulates intra-cellular and extra-cellular mechanisms promoting maintenance and progression of cancer cells. Among all metabolic players, lipid droplets (LD), known for their storage function, begin to reveal dark sides. Our first project led us to highlight LD involvement in the chemoresistance of colorectal cancer (CRC) cells. This resistance carries out thanks to LD accumulation during chemotherapy treatment. Their accumulation is regulated by the expression of lysophosphatidylcholine acyltransferase 2 (LPCAT2), leading to the production of phosphatidylcholine. It causes the protection of the endoplasmic reticulum (ER) stress induction preventing the activation of immunogenic cell death. These lipid modulations can also be found in plasma where they can be identified as biomarkers. In this context, we have shown that some phospholipids could prognosticate hepatocellular carcinoma (HCC) upon cirrhotic liver. These two aspects highlight the significance of phospholipid metabolism in digestive cancers.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese sabrina.pdf: 5211450 bytes, checksum: 0bc9c15d9e2f434943a2738627937629 (MD5) Previous issue date: 2009-03-31 / Paracoccidioides brasiliensis causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis presenting clinical manifestations ranging from mild to severe forms. A P. brasiliensis cDNA expression library was produced and screened with pooled sera from PCM patients adsorbed against antigens derived from in vitro-grown P. brasiliensis yeast cells. Sequencing DNA inserts from clones reactive with PCM patients sera indicated 35 open reading frames presenting homology to genes involved in metabolic pathways, transport, among other predicted functions. The complete cDNAs encoding aromatic L-amino acid decarboxylase (Pbddc), lumazine synthase (Pbls) and a homologue of the high affinity copper transporter (Pbctr3) were obtained. Recombinant proteins PbDDC and PbLS were obtained; a peptide was synthesized for PbCTR3. The proteins and the synthetic peptide were recognized by sera of patients with confirmed PCM and not by sera of healthy patients. Using the vivo-induced antigen technology (IVIAT) we identified immunogenic proteins expressed at high levels during infection. Quantitative real - time RT-PCR demonstrated high transcript levels of Pbddc, Pbls and Pbctr3 in yeast cells infecting macrophages. Transcripts in yeast cells derived from spleen and liver of infected mice were also measured by qRT-PCR. Our results suggest a putative role for the immunogenic proteins in the infectious process of P. brasiliensis. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica, prevalente nos países da América Latina. Uma biblioteca de cDNA de expressão de Paracoccidioides brasiliensis foi construída e rastreada com soros de pacientes acometidos por paracoccidioidomicose (PCM). Foram identificados 35 clones de cDNAs que codificam proteínas relacionadas com metabolismo celular, transporte, energia, transcrição, endereçamento de proteínas, transdução de sinal e componentes celulares. Os cDNAs codificantes da L- aminoacido aromatico - descarboxilase (Pbddc), da lumazina sintase (Pbls) e do transportador de cobre de alta afinidade foram obtidos. As proteínas recombinantes PbDDC e PbLS e o peptídio sintético PbCTR3 foram reconhecidos por soros de pacientes com PCM e não reagiram com soros controle. A técnica de IVIAT (tecnologia de antígenos induzidos in vivo) propiciou a identificação de proteínas imunogênicas mais expressas durante o processo infecçioso. RT-PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR) demostrou altos níveis de transcritos de Pbddc, Pbls e Pbctr3 em células leveduriformes infectando macrófagos. O transcritos de células leveduriformes de P. brasiliensis recuperadas de fígado e baço de camundongos foram medidos por qRT-PCR. Estes resultados sugerem o provável papel das proteínas imunogênicas no processo infeccioso de P. brasiliensis.

Les infections à Salmonella Enteritidis chez les humains sont associées à la consommation d’œufs ou d’ovoproduits contaminés. La vaccination est un outil utilisé pour diminuer les risques d’infection à SE chez la volaille, mais avec des résultats variables. Au Canada deux bactérines, MBL SE4C et Layermune, sont couramment utilisées pour lutter contre SE. Cependant, leur efficacité n’a pas été complètement déterminée chez les poules pondeuses plus âgées. Par ailleurs, la capacité de ces vaccins à prévenir la transmission verticale et horizontale n’a pas encore été étudiée. L’objectif principal de cette étude était d’évaluer l’effet des deux bactérines sur la réponse immunitaire chez les poules pondeuses, de vérifier la protection conférée par ces vaccins contre l’infection expérimentale à SE, et d’identifier des protéines immunogènes afin de développer un vaccin sous-unitaire. Les oiseaux ont été vaccinés avec deux protocoles d’immunisation en cours d’élevage (soit à 12 et 18, ou à 16 semaines d’âge). Le groupe contrôle a été injecté avec la solution saline. Les oiseaux ont été inoculés per os avec 2 x 109 CFU de la souche SE lysotype 4 à 55 ou à 65 semaines d’âge. Les anticorps (IgG et IgA) ont été mesurés à différents temps avec un ELISA maison en utilisant l’antigène entier de SE. La phagocytose, flambée oxydative, les populations des splénocytes B et T ont été analysées en utilisant la cytométrie en flux. Les signes cliniques, l’excrétion fécale, la contamination des jaunes d’œufs et l’invasion des salmonelles dans les organes ont été étudiés pour évaluer l’efficacité de protection. La transmission horizontale a aussi été étudiée en évaluant l’infection à SE chez les oiseaux mis en contact avec les oiseaux inoculés. Les protéines immunogènes ont été identifiées par SDS-PAGE et Western blot à l’aide d’antisérums prélevés suite à la vaccination et/ou à l’infection expérimentale/naturelle, puis caractérisées par la spectrométrie de masse. Le protocole de vaccination avec deux immunisations a généré un niveau élevé de séroconversion à partir de 3 jusqu’à 32-34 semaines post-vaccination par rapport à celui avec une seule immunisation (p < 0.02), mais il n’y avait plus de différence entre les groupes à 54 et 64 semaines d’âge. Il n’y a pas eu de corrélation entre les niveaux d’IgG et les taux d’isolement des salmonelles dans les organes et des jaunes d’œuf. La production des IgA n’a été observée que chez les oiseaux vaccinés avec 2 injections de MBL SE4C (p ≤ 0.04). Après l’infection expérimentale, la production des IgA a été significativement plus élevée aux jours 1 et 7 p.i dans l’oviducte des oiseaux vaccinés (sauf pour le groupe vacciné avec 2 injections de Layermune) par comparaison avec le groupe contrôle (p ≤ 0.03). Seule la bactérine MBL SE4C a eu un effet protecteur contre la contamination des jaunes d’œuf chez les oiseaux infectés. Ce vaccin réduit partiellement en utilisant deux immunisations, le taux d’excrétion fécale des salmonelles chez les oiseaux inoculés et les oiseaux horizontalement infectés (p ≤ 0.02). Cinq des protéines identifiées par la spectrométrie de masse sont considérées comme des protéines potentiellement candidates pour une étude plus approfondie de leur immonogénicité: Lipoamide dehydrogenase, Enolase (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase), Elongation factor Tu (EF-Tu), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) et DNA protection during starvation protein. En général, les bactérines ont induit une immunité humorale (IgG et IgA) chez les poules pondeuses. Cette réponse immunitaire a protégé partiellement les oiseaux quant à l’élimination des salmonelles, la contamination des jaunes d’œuf, ainsi que la transmission horizontale. Dans cette étude, la bactérine MBL SE4C (avec deux immunisations) s’est montrée plus efficace pour protéger les oiseaux que la bactérine Layermune. Nos résultats apportent des informations objectives et complémentaires sur le potentiel de deux bactérines pour lutter contre SE chez les poules pondeuses. Étant donné la protection partielle obtenue en utilisant ces vaccins, l’identification des antigènes immunogènes a permis de sélectionner des protéines spécifiques pour l’élaboration éventuelle d’un vaccin plus efficace contre SE chez les volailles. / Contaminated eggs and egg products have been associated with outbreaks of human Salmonella Enteritidis (SE) infections. Killed bacteria (bacterins) have been used to control Salmonella infections in poultry but variation in the conferred protection has been observed. In Canada the bacterins MBL SE4C and Layermune are currently used to control SE. However, their efficacy in protecting older layers has not been fully determined. Furthermore, the capacity of these bacterins to prevent vertical and horizontal transmissions has not yet been investigated. The main objectives of this study were to evaluate the effect of two available commercial bacterins on the immune response of laying hens, to verify the protection conferred by these vaccines against SE challenge and to identify immunogenic proteins to develop an oral subunit vaccine. Laying hens were vaccinated with two immunization schedules prior to the lay cycle (either at 12 and 18, or 16 weeks of age). The control group was injected with a saline solution. Laying hens were later inoculated per os with 2 x 109 CFU of SE PT4 strain either at 55 or 65 weeks of age. Serum IgG and mucosal IgA antibodies were measured with an in-house SE whole cell antigen ELISA. The phagocytosis, oxidative burst, splenic T and B cells populations were analyzed using flow cytometry. Clinical signs, fecal shedding, egg yolks contamination and organ invasion by SE were assessed to evaluate vaccine protection. Potential horizontal transmission from inoculated laying hens to non-inoculated laying hens, housed in the same isolator unit, was also evaluated. Immunogenic proteins were identified by SDS-PAGE and Western blot with sampled antisera during vaccination and/or infection of poultry with SE and then subjected to mass spectrometry. The vaccination protocol with two immunizations showed a higher seroconversion level than the single vaccination at 3 until 32-34 weeks post vaccination (p < 0.02) but no difference before challenge (54 and 64 old weeks). There was no relationship between high IgG level and SE isolation rates in organs and egg yolks. Only the MBL SE4C vaccine elicited IgA antibody production at 3 weeks post vaccination in both immunization protocols (p ≤ 0.04). Significant higher mucosal IgA levels were observed at day 1 and 7 post challenge in oviduct of vaccinated birds (except for the twice vaccinated Layermune group) compared to the control group (p ≤ 0.03). Humoral efficacy to protect from SE contamination of egg yolk was only observed in MBL SE4C vaccinated group and only this bacterin administered twice reduced SE shedding rate in inoculated birds and their exposed cagemates (p ≤ 0.02). A set of 5 proteins were considered as putative protein candidates to further detailed study on their immunogenicity: Lipoamide dehydrogenase; Enolase (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase); Elongation factor Tu (EF-Tu); Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and DNA protection during starvation protein. Overall, the commercial bacterins induced humoral immunity (IgG and IgA antibodies) in laying hens. This immune response partially protected for SE clearance, egg yolks contamination as well as horizontal transmission. In this study, MBL SE4C bacterin appeared to be more efficient in comparison to Layermune for protection of hens with a vaccination protocol comprising two immunizations. Our results provide additional and objective information on the potential of these vaccines for the control of SE in laying hens. Considering the partial protection achieved with the use of these bacterins, the identification of immunogenic antigens could help in the selection of specific proteins to elaborate a more efficient vaccine against SE in poultry.

The treatment of human immunodeficiency virus (HIV-1) infection faces the challenge of drug resistance. The high mutation rate of HIV-1 allows it to develop resistance against all available drugs. New mechanisms of intervention that do not succumb to failure through resistance are thus being explored. Mutagens that increase the viral mutation rate are a promising class of drugs. They can drive HIV-1 past a critical mutation rate, called the error threshold, and induce a catastrophic loss of genetic information. The treatment duration for a mutagen to drive HIV-1 beyond this error threshold is not yet estimated. We devise a detailed stochastic simulation of HIV-1 infection to estimate this duration. The simulations predict that the required duration is inversely proportional to the difference between the mutation rate induced by a mutagen and the error threshold. This scaling is robust to changes in simulation parameters. Using this scaling, we estimate the required duration of treatment with mutagens to be many years. Unfortunately, all available drugs, including mutagens, fail to clear the infection because HIV-1 establishes a reservoir of latently infected cells harbouring silent HIV-1 integrated genomes. A new \shock and kill" strategy that aims to activate latent cells and render them susceptible to immune killing or viral cytopathicity and thus to eradicate the HIV-1 latent reservoir has been suggested. Several latency reversal agents (LRAs) have been developed. Individual LRAs fail to show any decline in the HIV-1 latent reservoir in clinical trials. Combinations of LRAs have been tested in a few in-vitro and ex-vivo experiments. It has been found that in combination LRAs act synergistically. Finding the drug concentrations that yield the maximum synergy may be helpful in achieving a sterilizing cure. Here, we develop an intracellular model to estimate these drug concentrations. We choose drugs from two different classes of LRAs and show that our model captures quantitatively recent in-vitro experiments of their activity individually and in combination. With this model, we estimate the concentrations of the drugs required to obtain the maximum synergy. Strong CD8+ T cell responses against viruses have been associated with low levels of viremia. Elite controllers of HIV-1, who are known to have low or undetectable viremia, mount a cross-reactive CD8+ T cell response against the pathogen which controls viral mutation-driven escape from immune activity. These cross-reactive responses are against specific epitopes of HIV-1. Our goal was to examine whether such epitopes could be identified systematically so that a cross-reactive immune response could be induced by using these epitopes as immunogens. Immune recognition of an epitope involves two parts: presentation of the epitope, or peptide, by the major histocompatibility complex (MHC) molecules in the host and high a finity binding of the peptide-MHC complex with a T cell receptor (TCR). Immune escape could occur at either of these steps. Here, we examined the first step. We devise the following procedure to identify peptides that sustain HLA binding despite mutations. First, from the full length HIV-1 (HCV) proteome, we identify viral peptides that bind tightly with MHC molecules using the software NetMHCpan2.8. Next, we pick the peptides and their complementary MHC molecules that yield tight binding and mutate the peptides bit by bit to examine whether binding was compromised. We identify several viral peptide-MHC pairs that display tight binding despite all possible single mutations of the peptides both with HIV-1 and HCV. These peptides present candidates which can be tested for their TCR binding and cross-reactive immunogenic potential.

De nombreuses données suggèrent que le succès thérapeutique de certaines chimiothérapies conventionnelles, radiothérapies, ainsi que des thérapies ciblées est dû à leur capacité a induire la mort cellulaire immunogène (ICD), ce qui stimule la libération ou l'exposition des motifs moléculaires associés à un dommage (DAMPs) conduisant à leur reconnaissance par le système immunitaire, rétablissant ainsi l'immunosurveillance. En utilisant un criblage non polarisé, le crizotinib a été identifié en tant qu'inhibiteur de tyrosine-kinase ayant la capacité de stimuler la libération de caractéristiques distinctives de l’ICD. Des expériences faites par la suite ont montréque le crizotinib induit l'exposition de la calreticulin, la sécrétion d'ATP et la libération d’HMGB1, ainsi que le stress du réticulum endoplasmique dans les lignées cellulaires cancéreuses murines et humaines, notamment en combinaison avec les agents non immunogènes tel que le cisplatine. L’ICD causée par la combinaison du crizotinib avec la chimiothérapie a aussi été observée dans les cellules du cancer bronchique non à petites cellules (NSCLC), cellules ne possédant pas de mutations activatrices d’ALK ou ROS1 ; cela suggère un mode d'action hors-cible. Des études comparatives ont montré que seule la conformation utilisée en clinique, l’isoforme (R)-crizotinib, a la capacité de stimuler l’ICD ; le (S)-énantiomère ne possède pas ces caractéristiques. Combinées au cisplatine, les cellules fibrosarcome MCA205 et les cellules cancéreuses du poumon TC-1 traitées avec le crizotinib ont vacciné efficacement les souris immunocompétentes syngéniques contre la croissance des cellules vivantes de même type. Le crizotinib a amélioré l'efficacité de la chimiothérapie dans trois modèles de cancer du poumon orthotopiques : transplantable, induit par des carcinogènes et induites par les oncogènes. De façon remarquable, l’effet du crizotinib est aboli si un des signaux de l’ICD est bloqué. L'efficacité anticancéreuse dans chaque modèle s’est révélé être lié à l'infiltration de lymphocytes T, montrant l’implication d’une réaction immunitaire. Cela a été confirmé par des expériences chez des souris immunodéficientes (nu/nu, déficientes en thymodépendantes lymphocytes T) et dans des souris immunocompétentes dans lesquelles l’interféron gamma a été neutralisé à l’aide d’un anticorps ; l’effet du crizotinib était aboli dans les deux modèles. La combinaison du crizotinib avec le cisplatine a entraîné un accroissement de l'expression de PD-1, PDL-1 et CTLA-4 dans la tumeur, s’accompagnant par conséquent d'une sensibilisation importante des NSCLC à l'immunothérapie avec des anticorps anti-PD-1 et CTLA-4. Ainsi, la combinaison du crizotinib avec la chimiothérapie conventionnelle et les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire peuvent être actifs contre le NSCLC. Les données présentées dans cette thèse pourraient faciliter la conception d’essais cliniques afin d’établir de nouvelles stratégies combinatoires pour le traitement des NSCLC. / Accumulating evidence suggests that certain conventional chemotherapies, radiotherapies, as well as targeted therapies mediate their long-term therapeutic success by inducing immunogenic cell death (ICD), which stimulate the release or exposure of danger-associated molecular patterns from or on cancer cells, causing their recognition by the immune system, thus reinstating immunosurveillance. An unbiased screen identified crizotinib as a tyrosine kinase inhibitor that is potent in provoking hallmarks of ICD. In subsequent low-throughput validation experiments, crizotinib promoted Calreticulin exposure, ATP secretion, HMGB1 release, as well as ER stress in both human and murine cancer cells, especially if it is combined with normally non-ICD inducing chemotherapeutics such as cisplatin. ICD induced by the combination of chemotherapy and crizotinib was also observed in non-small cell lung carcinoma (NSCLC) cells lacking activating mutations of the crizotinib targets ALK and ROS1, suggesting an off-target-mediated mode of action. Comparative studies indicated that exclusively the clinically used (R) isoform of crizotinib was efficient in inducing cell death and stimulating ICD hallmarks whereas the (S) enantiomer lacked those characteristics. When combined with cisplatin, crizotinib-killed fibrosarcoma MCA205 cells as well as lung cancer TC-1 cells efficiently vaccinated syngeneic immunocompetent mice against a re-challenge with live cancer cells of the same types. Crizotinib improved the efficacy of chemotherapy with non-ICD inducers (such as cisplatin and mitomycin C) on three distinct (transplantable, carcinogen- or oncogene induced) orthotopic NSCLC models, none of which relied on the activation of ALK or ROS1. Of note these anticancer effects were completely lost if any of the ICD signals was blocked. These anticancer efficacies in different models were linked to an increased T lymphocyte infiltration as a sign of an immune response and were lost if such tumors grew on immunodeficient (nu/nu) mice that are athymic and hence lack thymus-dependent T lymphocytes, or on immunocompetent mice with a neutralization of interferon-. The combination of cisplatin and crizotinib led to an increase in the expression of CTLA-4, PD-1 and PD-L1 in tumors, coupled to a strong sensitization of NSCLC to immunotherapy with antibodies blocking CTLA-4 and PD-1. Hence, a combination of crizotinib, conventional chemotherapy and immune checkpoint blockade may be active against NSCLC, and these data might facilitate the design of clinical trials to evaluated novel combination regiments for the treatment of NSCLC.