Dans l’approche expérimentale de l’immunothérapie des tumeurs solides, les modèles murins sont utilisés pour des raisons de rapidité et de reproductibilité. Le plus souvent, les modèles tumoraux murins sont ectopiques ce qui constitue un modèle artificiel qui ne reflète qu’une partie de la réalité biologique de tumeurs provenant de diverses origines.Mon projet de thèse a consisté à mettre au point de nouveaux modèles pré-cliniques murins permettant de mieux mimer les situations pathologiques des tumeurs solides chez l’homme. Pour cela, je me suis notamment intéressée à un modèle orthotopique de cancer du rein (implantation de cellules RenCa ou RenCa-MUC1 dans la capsule rénale) et à un modèle spontané de cancer du sein (souris MMTV-PyMT). Ces modèles ont ensuite permis l’évaluation de trois différentes approches d’immunothérapie à savoir la thérapie virale oncolytique, la vectorisation d’antigènes tumoraux au moyen d’un vecteur viral ainsi que la thérapie via un anticorps monoclonal. / In experimental approaches to immunotherapy of cancer, mouse tumor models are used for reasons of speed and reproducibility. Ectopic mouse tumor models are the most often used, but they constitute artificial models that reflect only a part of the biological reality of tumors from various origins.The aim of my thesis project was to develop new mouse preclinical tumor models to better mimic the pathological situations of solid tumors in humans. First, I developed an orthotopic model of kidney cancer (subcapsular kidney implantation of a renal carcinoma cell line which either expressed or did not express the human xeno-antigen, MUC1). In addition to this, I also studied a spontaneous model of breast cancer (MMTV-PyMT).These models enabled us to evaluate the efficacy of three different immunotherapy approaches namely oncolytic virus strategy, tumor antigen vectorization by using a viral vector, and monoclonal antibody.

Les nanomatériaux combinant des fonctions de ciblage, d'imagerie, de thérapie et de détection font l'objet de nombreuses recherches dans le domaine de la santé. Les travaux présentés dans cette thèse concernent la multi‐fonctionnalisation de nanoparticules (NPs) par un procédé de synthèse supportée. Le support solide développé dans cette étude est constitué d'un matériau poreux en verre sur lequel sont greffées de manière temporaire des nanoparticules de silice. La fonctionnalisation de la surface des nanoparticules a été réalisée de façon automatisée par une chimie de synthèse dite aux phosphoramidites. Dans un premier temps, cette technique a permis d'obtenir des densités de greffage de l'ordre de 5000 à 7000 oligonucléotides par nanoparticule, ce qui représente une fonctionnalisation 10 à 20 fois supérieure à celles obtenues par des méthodes de greffage en solution. Les brins d'ADN synthétisés sur les NPs ont montré une bonne accessibilité pour l'hybridation avec un brin d'ADN complémentaire, ouvrant la voie à des applications thérapeutiques ou à l'intégration de ces objets dans des systèmes de détection. La deuxième partie de ces travaux est consacrée à la vectorisation d'une protéine thérapeutique, le G‐CSF (facteur de croissance de colonies de granulocytes), par des nanoparticules présentant également des propriétés d'imagerie. Ces nanovecteurs thérapeutiques ont montré des propriétés de stimulation cellulaire in vitro et de ciblage de la rate, organe réservoir de neutrophiles, in vivo. Enfin il a été démontré que la modification de NPs sur support ouvre des perspectives intéressantes pour la préparation d'assemblages complexes de nanoparticules (dimères et NPs dissymétriques) / Nanomaterials combining targeting, imaging, therapy and sensing properties are of growing interest for biomedical applications. The work reported in this thesis concerns nanoparticle (NP) multifunctionalization by solid phase synthesis. The solid support developed in this study is composed of a porous glass material on which silica NPs are temporarily grafted. Nanoparticle surface functionalization was performed by automated synthesis using phosphoramidite chemistry. Firstly, high surface loadings from 5000 to 7000 oligonucleotides per NP were achieved, representing a functionalization 10 to 20‐fold greater than those obtained by coupling methods in solution. DNA strands synthesized on NPs showed a good accessibility for hybridization with a complementary DNA strand, paving the way for therapeutic applications or integration of these objects in detection systems. The second part of this work was devoted to the vectorization of a therapeutic protein, GCSF (Granulocyte‐Colony Stimulating Factor) by nanoparticles that also exhibited imaging properties. These therapeutic nanocarriers showed cell stimulating properties in vitro and spleen targeting, which is a reservoir of neutrophils, in vivo. Finally, it was demonstrated that the solid phase modification of NPs opens interesting perspectives for the production of complex nanoparticle assemblies (dimers and asymmetric NPs)

Abstract : CD8 + T cells can be programmed in their naïve state with pro-inflammatory cytokines such as IL-15 and IL-21. IL-15 induces the proliferation of CD8 + T cells and allows the generation of memory cells. IL-21 programs CD8 + T cells to become more cytotoxic while retaining a memory type phenotype. In the laboratory, we studied the effect of these two cytokines in different contexts by using the mouse model MHC-I-restricted Pmel-1 transgenic TCR specific to the melanoma-derived gp10025-33 antigen, which is also expressed by normal melanocytes. First, we elucidated the effect of IL-15 on CD8 + T cells in the Pmel-1 transgenic model lacking the protein Suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). SOCS1 is a critical regulator of T cell homeostasis. We have found that these mice have CD8 + T-cells expressing surface proteins characteristic of memory T cells (CD44, Ly6C, CD122 and CD62L). However, these cells decrease the expression of the TCR and increase that of CD5, indicative of TCR activation in vivo. When stimulated in vitro, these cells displayed a highly cytotoxic phenotype but very low proliferation. Adoptive cell transfer studies in Rag1 - / - mice showed that these cells can undergo homeostatic proliferation under lymphopenic conditions. This proliferation was characterized by severe inflammatory lesions in the skin, extremities and eyes. This study demonstrates the importance of IL-15 and SOCS1 in the regulation of self-reactive cells that can be activated under lymphopenic conditions and can cause autoimmune diseases. Second, we studied the synergistic effect of IL-15 and IL-21 in native CD8+ T cells for cancer immunotherapy. We used the mouse melanoma model B16-F10 (B16) which expresses very weakly MHC-I molecules. In parallel, we studied the effect of NOD-like receptor CARD domain containing 5 (NLRC5) overexpression, the trans-activator of MHC-I genes, in B16 cells in order to increase their immunogenicity and restore anti-tumor immunity. We generated stable lines of B16 cells expressing NLRC5 (B16-5); the co-stimulatory molecule of T cells, CD80 (B16-CD80), or both (B16-5 / 80). The over-expressing NLRC5 cells positively regulated the MHC-I and LMP2, LMP7 and TAP1 genes. B16-5 cells efficiently presented gp10025-33 to CD8+ Pmel-1 T cells and induced their proliferation. This proliferation was very robust when Pmel-1 naive cells were pre-stimulated with IL-15 and IL-21 prior to activation. In the presence of CD80, B16-5 cells stimulate Pmel-1 cells even without the addition of gp100, indicating that NLRC5 facilitates the treatment and presentation of endogenous tumor antigens. During subcutaneous implantation, B16-5 cells showed a significant reduction in tumor growth in C57BL/6 hosts but not in immunodeficient hosts, indicating that tumor cells expressing NLRC5 generated an anti-tumor immunity. This response is dependent on CD8 + T cells since in mice depleted of these cells, B16-5 cells formed large subcutaneous and pulmonary tumors. Finally, immunization with irradiated B16-5 cells allowed anti-tumor protection during challenge of parental B16 cells. Collectively, our results indicate that NLRC5 could be exploited to restore tumor immunogenicity and to stimulate protective antitumor immunity. / Les cellules T CD8+ peuvent être programmées à leur état naïf avec des cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-15 et l’IL-21. IL-15 induit la prolifération de cellules T CD8+ et permet la génération de cellules T CD8+ mémoire. IL-21 programme les cellules T CD8+ à devenir plus cytotoxiques tout en conservant un phénotype de type mémoire. Dans le laboratoire, nous avons étudié l’effet de ces deux cytokines dans différent contextes en utilisant le modèle de souris transgénique Pmel-1 qui possède des récepteurs de cellules T (TCR) spécifiques envers le peptide gp10025-33, exprimé par des cellules de mélanome et aussi par des mélanocytes. Premièrement, nous avons élucidé l’effet de l’IL-15 sur les cellules T CD8+ dans le modèle transgénique Pmel-1 déficient dans la protéine Suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1). SOCS1 est un régulateur critique de l’homéostasie de lymphocytes T. Nous avons trouvé que ces souris ont de cellules T CD8+ exprimant des protéines de surface caractéristique de cellules T mémoire (CD44, Ly6C, CD122 et CD62L). Cependant, ces cellules diminuent l’expression du TCR et augmentent celle de CD5, ce qui témoigne d’une activation du TCR in vivo. Lorsque stimulées in vitro, ces cellules montrent un phénotype hautement cytotoxique mais une prolifération très faible. Lorsque nous avons fait des études de transfert cellulaire adoptive dans de souris Rag1-/-, ces cellules ont proliféré de façon importante causant des lésions inflammatoires sévères dans la peau, les extrémités et les yeux. Cette étude démontre l’importance de l’IL-15 et de SOCS1 dans la régulation de cellules auto-réactives qui peuvent être activées sous des conditions lymphopéniques et qui peuvent causer de maladies auto-immunitaires. Deuxièmement, nous avons étudié l’effet synergique d’IL-15 et d’IL-21 dans les cellules T CD8+ naïves pour l’immunothérapie du cancer. Nous avons utilisé le modèle B16-F10 (B16) de mélanome de souris qui exprime très faiblement des molécules de CMH-I. En parallèle, nous avons étudié l’effet de la surexpression de NOD-like receptor CARD domain containing 5 (NLRC5), le trans-activateur de gènes de CMH-I dans les cellules B16, dans le but d’augmenter leur immunogénicité et de restaurer l’immunité anti-tumorale. Nous avons généré des lignées stables de cellules B16 exprimant NLRC5 (B16-5); la molécule co-stimulatrice de cellules T, CD80 (B16-CD80), ou les deux (B16-5 / 80). Les cellules sur-exprimant NLRC5 ont régulé positivement de manière constitutive les gènes MHC-I et LMP2, LMP7 et TAP1. Les cellules B16-5 ont efficacement présenté gp10025-33 aux cellules T CD8+ Pmel-1 et ont induit leur prolifération. Cette prolifération a été très robuste lorsque les cellules naïves Pmel-1 étaient pré-stimulées avec IL-15 et IL-21 avant leur activation. En présence de CD80, les cellules B16-5 stimulent les cellules Pmel-1 même sans l'addition de gp100, ce qui indique que NLRC5 facilite l’apprêtement et la présentation des antigènes tumoraux endogènes. Lors de l'implantation sous-cutanée, les cellules B16-5 ont montré une réduction significative de la croissance tumorale chez des hôtes C57BL/6, mais pas chez des hôtes immuno-déficients, ce qui indique que les cellules tumorales exprimant NLRC5 ont provoqué une immunité anti-tumorale. Cette réponse est dépendante de cellules T CD8+ puisque chez les souris déplétées de ces dernières, les cellules B16-5 ont formé de grandes tumeurs sous-cutanées et pulmonaires. Enfin, l'immunisation avec des cellules B16-5 irradiées a permis une protection anti-tumorale lors de la réimplantation des cellules B16 parentales. Collectivement, nos résultats indiquent que NLRC5 pourrait être exploité pour restaurer l'immunogénicité tumorale et pour stimuler l’immunité anti-tumorale protectrice.

La surveillance immunologique des tumeurs repose sur la capacité des cellules effectrices du système immunitaire à détecter et à éliminer les cellules cancéreuses. Nonobstant ce constat, la régression complète et spontanée de cancers établis n’est observée que dans de très rares cas. L’échec de la résolution des cancers par le système immunitaire pourrait résulter de la conjonction de plusieurs facteurs : i) une réponse immune inadéquate liée au manque d’immunogénicité des tumeurs, ii) l’incompétence du système immunitaire consécutif à des immunodéficiences acquises ou induites et iii) la sélection de variants tumoraux résistants capables de déjouer la surveillance opérée par le système immunitaire ou de subvertir ses effets. Ainsi, le développement de stratégies visant à potentialiser les réponses antitumorales de l’hôte revêt un enjeu crucial en cancérologie.Au laboratoire, notre travail de recherche a pour objectif de mieux caractériser les liens entre réponse immunitaire et cancer. Mon travail de thèse vise précisément à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation des lymphocytes T CD4 et à déterminer le rôle de ces cellules dans l’immunité antitumorale. Au cours de ma thèse, nous nous sommes particulièrement attachés à explorer les mécanismes moléculaires qui sous tendent la différenciation des populations lymphocytaires Th17, Th9 et TFh pour mieux appréhender et moduler leurs fonctions effectrices afin d’optimiser les réponses antitumorales. Ces travaux s’inscrivent dans une démarche d’application potentielle en immunothérapie anticancéreuse, un domaine de recherches qui connaît actuellement des avancées spectaculaires.Nous avons tout d’abord étudié l’influence de l’acide docosahexaénoïque (DHA), un acide gras à longue chaîne de la série n 3, sur la différenciation des cellules Th17. Nous avons mis en évidence le mécanisme moléculaire responsable de l’inhibition directe de la polarisation cellulaire Th17 par le DHA. L’activation de PPARγ par le DHA induit l’expression de SOCS3 qui agit comme un répresseur intrinsèque de la différenciation Th17. Dans deux modèles de cancers murins, nous avons également montré que l’activité anticancéreuse du DHA était dépendante de sa capacité à inhiber la sécrétion d’IL 17 par les cellules T CD4 in vivo. Nous avons ainsi caractérisé l’un des mécanismes impliqués dans l’effet anticancéreux du DHA.Dans un deuxième travail, nous avons caractérisé les effets de l’interleukine 1β sur le programme moléculaire des cellules Th9. Nous avons montré que les cellules Th9 différenciées en présence d’IL-1β possédaient de puissantes propriétés anticancéreuses dépendantes de l’IL-21 reposant sur l’activation du facteur de transcription IRF1. Au niveau moléculaire, nous avons démontré que l’IL-1β induisait la phosphorylation de STAT1 elle même responsable de l’activation d’IRF1 qui est alors capable d’interagir sur les promoteurs de l’Il9 et de l’Il21 pour induire l’expression de ces gènes dans les cellules Th9.Le dernier projet porte sur la régulation transcriptionnelle du facteur de transcription IRF1 sur la réponse T folliculaire auxiliaire et cherche à en évaluer les retombées potentielles en immunothérapie anticancéreuse. Notre étude met en évidence l’activation précoce d’IRF1 dans la différenciation TFh et suggère que ce facteur de transcription semble initier le développement de ces cellules. Des approches de transfert adoptif révèlent que les TFh semblent posséder des propriétés anticancéreuses capables de limiter efficacement la croissance des tumeurs dans des modèles murins. Enfin, après caractérisation phénotypique nous montrons que les cellules TFh sont présentes dans des tumeurs mammaires chez l’Homme et validons la présence d’IRF1 dans ces lymphocytes. / Immune surveillance of tumors is based on the ability of effector cells of the immune system to detect and eliminate the cancer cells. Notwithstanding, the complete and spontaneous regression of established cancers was observed only in very few cases. The failure of cancer resolution by the immune system could result from the combination of several factors: i) inadequate immune response related to a low tumor immunogenicity, ii) incompetent immune system consecutively to induced or acquired immunodeficiencies and iii) the selection of resistant tumor variants able to thwart immune surveillance or subverting immune responses. Developing novel cancer immunotherapy strategies leading to potentiation of the host antitumor responses is thus a key challenge in oncology.We aim to better characterize the relationships between immune response and cancer. My work is precisely to understand the molecular mechanisms involved in CD4 T cell differentiation and to determine the role of these cells in antitumor immunity. I am particularly committed to explore the molecular mechanisms underlying the Th17, Th9 and TFh cell differentiations. The goal is to better understand and adjust their effector functions to optimize antitumor responses. This work is part of a potential application in cancer immunotherapy approach, an area that is experiencing dramatic advances and is likely to grow in the years ahead.We first studied the influence of the n 3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid (DHA) on Th17 cell differentiation. We unraveled the molecular mechanism responsible for the direct inhibition of Th17 cell polarization by DHA, explaining one way of DHA to exert its anticancer activity. TH17 cells induced in vitro displayed increased SOCS3 expression and diminished capacity to produce interleukin 17 following activation of PPARγ by DHA. In two different mouse cancer models, DHA prevented tumor outgrowth and angiogenesis in an IL 17 dependent manner. Altogether, our results uncover a novel molecular pathway by which PPARγ induced SOCS3 expression prevents IL 17 mediated cancer growth.Then, we characterized the effects of interleukin 1β (IL-1β) on Th9 cells molecular program. We found that the transcription factor IRF1 enhanced the effector functions of Th9 cells and dictated their anticancer properties. Under Th9 skewing conditions, IL-1β induced phosphorylation of the transcription factor STAT1 and subsequent expression of IRF1, which bound to Il9 and Il21 gene promoters and enhanced their secretion by Th9 cells. In addition, IL-1β induced Th9 cells exerted potent anticancer functions in an IRF1 and IL 21 dependent manner. Thus, our findings identify IRF1 as a target for controlling the function of Th9 cells.We are currently investigating the transcriptional regulation of IRF1 on follicular helper CD4 T (TFh) cell program. We address the question whether TFh cells could be beneficial in cancer immunotherapy. Our study highlights the early activation of IRF1 during the TFh cell polarization and suggests that IRF1 appears to initiate the development of these cells. Adoptive transfer approaches show that TFh lymphocytes seem to habor anticancer properties by limiting efficiently tumor outgrowth in mouse models of cancer. Finally, phenotypic characterization of TFh cells points out that they infiltrate human breast tumors and express IRF1.

L’immunothérapie basée sur le transfert de lymphocytes T (LT) spécifiques de la tumeur est une approche prometteuse contre le cancer. Pour activer et amplifier de tels LT, principale étape limitante de cette approche, des cellules présentatrices d’antigène artificielles (CPAA) ont été développées au laboratoire. Ces CPAA ont été construites à partir de fibroblastes murins NIH/3T3 transduits à l’aide de vecteurs gammarétroviraux afin d’exprimer les principaux éléments nécessaires à l’activation de LT humains. Ces CPAA nous permettent d’obtenir des LT mémoires souches (TSCM : CD95+CD45RA+CD62L+CCR7+), LT très peu différenciés récemment identifiés chez l’homme. Ces TSCM ont été décrits comme étant du plus grand intérêt pour l’immunothérapie en raison de leur capacité d’auto-renouvellement et de leur faculté à se différencier en LT effecteursefficaces. Pour optimiser l’amplification de TSCM spécifiques, nous avons notamment étudié les effets sur les LT de l’expression de différentes molécules de costimulation par nos CPAA (CD80, CD70 et 4-1BBL). Les protéines MART-1 et MELOE-1, surexprimées dans les mélanomes, ont été utilisées comme antigènes modèles pour ces travaux. Les CPAA CD80+CD70+ et CD80+CD70+4-1BBL+ sont les plus prometteuses pour maintenir le phénotype des TSCM. Une étude exhaustive des CPAA CD80+CD70+ a montré que nous pouvions obtenir un plus grand nombre de TSCM fonctionnels spécifiques de MART-1 et de MELOE-1 de manière reproductible avec ces CPAA. Dans une seconde étude, nous avons pu montrer que les CPAA CD80+CD70+4-1BBL+ permettaient d’obtenir le plus grand nombre de LT spécifiques fonctionnels et très peu différenciés après purification et restimulation de LT spécifiques stimulés une première fois par les CPAA CD80+CD70+. Ces travaux devraient nous permettre, après le développement d’un modèle murin, de proposer de nouvelles stratégies d’immunothérapie basées sur l’obtention grâce à nos CPAA optimisées de LT spécifiques anti-tumoraux capables d’assurer une protection à long terme aux patients. / Immunotherapy based on the transfer of tumor-specific T lymphocytes (TLs) is a promising approach against cancer. To activate and amplify such TLs, main limiting step of this approach, artificial antigen presenting cells (AAPCs) have been developed in the laboratory. These AAPCs have been constructed from NIH/3T3 murine fibroblasts transduced with gammaretroviral vectors to express the principal elements required to activate human TLs. With these AAPCs, we can obtain anti-tumor stem cell memory TLs (TSCM: CD95+CD45RA+CD62L+CCR7+), which are very limitedly differentiated TLs recently identified in humans. These TLs have been recently described as cells of great interest for immunotherapy because of their self-renewal capacity and their ability to differentiate into effective effector TLs. To improve the amplification of specific TSCM, we notably studied the effects on TLs of the expression of different co-stimulatory molecules by our AAPCs (CD80, CD70 and 4-1BBL). MART-1 and MELOE-1, proteins that are overexpressed in melanoma, were used as model antigens in this work. CD80+CD70+ and CD80+CD70+4-1BBL+ AAPCs appear to be the most promising ones for maintaining a TSCM phenotype. An exhaustive study of CD80+CD70+ AAPCs showed that we could reproducibly get greater numbers of MART-1- and MELOE-1-specific functional TSCM with these AAPCs. In another study, we have shown that CD80+CD70+4-1BBL+ AAPCs enabled us to get the greatest number of functional and very limitedly differentiated specific TLs after purification and restimulation of specific TLs stimulated first with CD80+CD70+ AAPCs. This work should allow us, after the development of a murine model, to propose new immunotherapy strategies based on the possibility of obtaining with our optimized AAPCs anti-tumor specific TLs capable of ensuring patient long term protection.

Les lymphocytes T (LT) CD4+ auxiliaires soutiennent l‘action des LT CD8+ cytotoxiques (LTC) au cours des réponses immunitaires anti-tumorales. Des protocoles d‘immunothérapie cellulaire adoptive (ICA) basés sur l‘injection d‘effecteurs T CD4+ ont donc été développés pour traiter les cancers, et ils ont montré une efficacité thérapeutique. Cependant, la difficulté de disposer de cellules présentatrices d‘antigène (CPA) autologues permettant de générer un nombre suffisant de LT CD4+ spécifiques fonctionnels in vitro dans un court délai représente un obstacle majeur au développement de telles approches. Pour contourner cette difficulté, notre groupe a précédemment développé des cellules présentatrices d‘antigène artificielles (CPAA) dérivant de fibroblastes murins NIH/3T3 et exprimant les molécules nécessaires pour activer des LT CD4+ humains : une molécule HLA (Human Leucocyte Antigen) de classe II (ici HLA-DR1), la molécule de costimulation CD80 et les molécules d‘adhérence CD54 et CD58. Dans ce travail, nous avons cherché à optimiser nos CPAA DR1+ (CPAADR1) en permettant une expression endogène et constitutive de l‘antigène d‘intérêt (ici l‘hémagglutinine, HA), sous forme de peptide ou de protéine, au niveau des compartiments cellulaires impliqués dans la présentation des antigènes par les molécules HLA-II. Nous avons montré que les CPAADR1 « endogènes » exprimant le peptide HA au niveau du réticulum endoplasmique (RE) ou la protéine HA à la membrane plasmique, possédaient les meilleures capacités de présentation de l‘antigène. En stimulation primaire, ces deux lignées de CPAADR1 activaient des LT CD4+ spécifiques de HA, mais avec une capacité moindre que des CPA autologues. En revanche, en restimulation, les CPAADR1 exprimant le peptide HA dans le RE étaient même plus efficaces pour amplifier des LT CD4+ spécifiques fonctionnels que des CPAADR1 ou des CPA autologues chargées avec le peptide d‘intérêt. Les LT obtenus étaient des cellules Th1 mémoires exprimant du granzyme B et produisant de l‘IFN-γ et du TNF-α. C‘est la première fois à notre connaissance qu‘un antigène exprimé de façon endogène dans une lignée cellulaire peut-être présenté de façon efficace sur une molécule HLA de classe II. Nos CPAA « endogènes » constituent donc un nouvel outil unique pour générer de façon reproductible et standardisable des réponses T CD4+ spécifiques, et pourraient déboucher sur le développement de nouvelles approches d‘ICA / CD4+ helper T lymphocytes (TLs) sustain CD8+ cytotoxic TL (CTL) activity during anti-tumor immune responses. Adoptive cell immunotherapy (ACI) protocols based on the injection of CD4+ T-effectors have therefore been developed to treat cancers, and they have proven therapeutic efficacy. However, the difficulty of obtaining autologous antigen presenting cells (APCs) for generating a sufficient number of functional specific CD4+ TLs in a short time in vitro is a major obstacle to the development of such approaches. To bypass this difficulty, our group has previously developed artificial antigen presenting cells (AAPCs) derived from NIH/3T3 murine fibroblasts expressing molecules necessary to activate human CD4+ TLs: an HLA (Human Leucocyte Antigen) class II molecule (in this study HLA-DR1), CD80 costimulatory molecule, and CD54 and CD58 adhesion molecules. In this work, we sought to optimize our DR1+ AAPCs (AAPCDR1) by allowing an endogenous and constitutive expression of the antigen of interest (in this study hemagglutinin, HA), as a peptide or a whole protein, in different cell compartments involved in antigen presentation by HLA-II molecules. We have shown that ―endogenous‖ AAPCDR1 expressing HA peptide in the endoplasmic reticulum (ER) or HA protein at the plasma membrane had the best antigen presentation abilities. In a first stimulation, both AAPCDR1cell lines activated HA-specific CD4+ TLs, but to a lower extent than autologous APCs. However, in a second stimulation, AAPCDR1 expressing HA peptide in the ER were even more effective for amplifying functional specific CD4+ TLs than AAPCDR1 or autologous APCs loaded with the peptide of interest. Obtained TLs were memory Th1 cells expressing granzyme B and producing IFN-γ and TNF-α. This is the first time to our knowledge that an antigen expressed endogenously in a cell line can be efficiently presented on an HLA class II molecule. Our ―endogenous‖ AAPCs represent therefore a new and unique tool for reproducible and standardizable generation of specific CD4+ T responses, and could lead to the development of new ACI approaches.

L’implication du microbiote intestinal dans le développement du cancer colorectal (CCR) et dans la réponse aux traitements anti-cancéreux est de plus en plus évidente. Plusieurs études indépendantes ont montré que la muqueuse intestinale de patients atteints de CCR est anormalement colonisée par des souches d’Escherichia coli pouvant présenter des propriétés invasives et ayant acquis des facteurs de virulence. Plus de la moitié de ces souches sont porteuses de l’îlot pks responsable de la synthèse d’une génotoxine : la colibactine, qui peut interférer directement avec l’ADN ou avec le cycle cellulaire des cellules de l’hôte, et générer des mutations. Plusieurs études indépendantes sur différents modèles animaux de CCR ou sur lignées cellulaires ont décrit d’autres mécanismes d’action de ces bactéries qui pourraient jouer un rôle dans la carcinogenèse colique : interactions avec le système immunitaire et l’inflammation et induction de la sénescence cellulaire qui s’accompagne de la libération de facteurs de croissance ayant un effet pro-tumoral sur les cellules épithéliales. Cependant, faute de lien entre ces études physiopathologiques parcellaires, l’étude de l’association des bactéries E. coli avec le CCR doit être poursuivie. Le but de ces travaux de thèse était de préciser l’effet d’une infection chronique par E. coli colibactine-positive, notamment sur le micro-environnement immunitaire colique et son implication sur la carcinogenèse colique, et sur l’efficacité anti-tumorale d’une stratégie d’immunothérapie ciblant le checkpoint immunologique PD-1. Afin d’étudier les interactions microbiote-système immunitaire-hôte, nous avons choisi de travailler sur le modèle APCMin/+, modèle murin de référence du CCR. Dans un premier temps, nous avons développé et validé une nouvelle méthode pour quantifier les cellules immunitaires dans le côlon de ce modèle. Cette méthode, basée sur des marquages immunofluorescents et une analyse numérique d’image dotée d’un apprentissage automatique (dit « machine learning »), nous a permis de distinguer, quantifier et localiser ces cellules dans trois compartiments d’intérêt d’une section colique entière : la muqueuse, les follicules lymphoïdes et les tumeurs. Après validation, cette méthode d’imagerie nous a permis d’obtenir une analyse précise de l’environnement immunitaire colique dans le modèle de souris APCMin/+ chroniquement infectées par une souche E. coli colibactine positive isolée d’une muqueuse de patients CCR. Nous avons montré in vivo que cette bactérie induit un environnement pro-carcinogène dépendant de la présence de la colibactine, avec une augmentation de populations pro-inflammatoires telles que les neutrophiles et d’enzyme pro-inflammatoire (myéloperoxydase), accompagnée de la diminution de cytokines antiinflammatoires. Ce contexte procarcinogène est renforcé par la diminution des Lymphocytes T (LT) anti-tumoraux dans la muqueuse et la tumeur. Cet effet a également été observé chez les patients atteints de CCR porteurs de souches E. coli colibactine-positives avec une baisse de la population des LT CD3+. Enfin, nous avons démontré qu’une infection par E. coli colibactine-positives induit une résistance à une immunothérapie anti-tumorale ciblant le checkpoint immunologique PD-1. Ces résultats suggèrent que la diminution des LT induite par l’infection chronique du tube digestif par des E. coli colibactine-positives pourrait être liée à cette résistance au traitement. Ainsi, les travaux effectués lors de cette thèse permettent de confirmer le rôle clé de certaines bactéries du microbiote intestinal et du dialogue complexe de celui-ci avec le système immunitaire, dans la carcinogenèse colique et la réponse aux traitements anti-cancéreux. (...) / Multiple evidences show the role of microbiota in colorectal cancer (CRC) development and anti-tumor drug responses. Various independent studies demonstrated that Escherichia coli strains with specific invasive properties and virulence factors abnormally colonize CRC patient mucosa. More than half of these strains harboring the pks pathogenic island coding for the synthesis of a genotoxin named colibactin. This genotoxin can impair directly DNA synthesis or cellular cycle and provokes genomic instability. Many different studies highlighted others bacteria-associated mechanisms leading to colorectal carcinogenesis as crosstalk between immune responses, inflammatory events, and/or cell senescence induction. However, the mechanisms by which CRC-associated E. coli promote colorectal carcinogenesis are diverse and some-what specific to the animal models and the microbial status of the animals (germ-free or Specific Pathogen Free). However, modulation of immune response and inflammation seems to play a central role in these mechanisms.The aim of this work was to evaluate the impact of chronic infection by colibactin-positive E. coli in a CRC reference model, the APCMin/+ mice colon focusing on inflammation and immune cells. First, we developed and validated an innovative method to quantify immune cells in APCMin/+ mice, based on immunostainings and digital image analysis. Thanks to the machine learning approach, we succeeded to precisely discriminate, quantify and localize these cells in three regions of interest: mucosa, lymphoid follicle and tumor. After the complete validation of this new method, we accurately examined the impact of a chronic infection with a colibactin-positive E. coli strain isolated from a CRC patient, on the APCMin/+ colon immune microenvironment. Particularly, we demonstrated the induction of a pro-carcinogenic environment by these bacteria in vivo, in a colibactin dependent manner, with both an increase of the pro-inflammatory neutrophil enzyme (myeloperoxydase) and cells, and a decrease of anti-inflammatory cytokines. This carcinogenesis-associated context is emphasized by the decrease of anti-tumor T cells in colon mucosa and tumor. This phenomenon is equally observed in CRC patients, with a decrease of T cells in patient tumors, which are harboring the colibactin-positive E. coli. Finally, we demonstrated for the first time that colibactin-positive E. coli infection induce resistance to an anti-tumor immunotherapy treatment based on PD-1 immune checkpoint blockade. Our results suggest that the decrease of T cells induce by colibactin-positive E. coli chronic infection could lead to the impairment of an immunotherapy response. To conclude, this thesis work confirms the crosstalk between some specific bacteria from intestine microbiota and the immune system in carcinogenesis and anti-tumor drug efficacy. In longer term, these results suggest that the colibactin-positive E. coli presence could be used as a poor prognosis biomarker in CRC and particularly to predict response to anti-PD-1 immunotherapy.

Malgré les avancées thérapeutiques récentes, le pronostic des patients porteurs de métastases osseuses (MO) reste faible, ce qui incite à chercher des nouvelles stratégies thérapeutiques. Les chimiokines sont des acteurs majeurs de la réponse immune, et apparaissent comme des cibles potentielles de l’immunothérapie anti-cancéreuse. Nous avons recherché à définir si la chimiokine CX3CL1 pouvait représenter un axe thérapeutique efficace dans le contexte des MO. Pour cela nous avons développé des modèles murins de MO de cancer du rein et du poumon. Dans le modèle de MO de cancer du poumon, notre travail a démontré que l'expression de CX3CL1 inhibe la croissance tumorale. L’analyse transcriptomique des tumeurs a montré que CX3CL1 diminue (i) l’ostéloyse via un effet sur la triade OPG/RANKL/RANK (ii) l'expression de certains checkpoints, en faveur d’une réponse immune antitumorale. En revanche, dans le modèle de MO de cancer du rein, l’expression de CX3CL1 stimule le développement tumoral et l'ostéolyse via une action sur la triade OPG/RANKL/RANK et inhibe la réponse immune antitumorale via une augmentation de l'expression de certains checkpoints immunitaires. Les bisphosphonates (BPs) sont des agents utilisés pour le traitement des MO. Afin de réduire leurs effets indésirables, nous avons utilisé des ciments de phosphate de calcium (CPC), pour délivrer localement dans l’os des BPs (alendronate, ALN). Notre travail a mis en évidence que (i) ces ciments chargés en ALN relarguent en continue les BPs, (ii) le relarguage d’ALN est efficace pour induire des effets cytotoxiques et pro-apoptotiques vis à vis des cellules de cancer du sein / Despite recent therapeutic improvments, the prognosis for a patient with bone metastases (BM) remains poor, this situation prompting the research of new therapeutic strategies. Chemokines are central players in the immune response, and appear as potential targets in anti-cancer immunotherapies. We are interested to determine whether the CX3CL1 chemokine exerted pro or anti-tumor actions within the bone metastatic context. To address this issue, we developed mouse models of lung or renal cancer BM. In lung cancer BM model, our work demonstrated that CX3CL1 expression led to tumor growth inhibition. Tumors transcriptomic analysis revealed that CX3CL1: (i) impacted bone metabolism by modulating the OPG/RANKL/RANK triad (ii) decreased the expression of certain immune checkpoints, this up-regulating the anti-tumor immune response. By contrast, in renal cancer BM model, CX3CL1 expression stimulated bone tumor development and transcriptomic analysis showed that CX3CL1 (i) promoted osteolysis through an action on the OPG/RANKL/RANK triad (ii) -induced tumor development correlated with an increased expression of certain immune checkpoints, this down-regulating the anti-tumor immune response. Bisphosphonates (BPs) are targeted agents used for BM treatment. In order to reduce their side effects, we used resorbable calcium phosphate cements (CPC), which are frequently used as bone void fillers, as platform for a local delivery of BPs (alendronate, ALN). As a whole, our in vitro data demonstrated that: (i) ALN-CPC cements continuous released ALN; (ii) this ALN release was effective in inducing cytotoxic and pro-apoptotic effects in breast cancer cells

La lymphohistiocytose hémophagocytaire (HLH) est une maladie hyper-inflammatoire rare, mais potentiellement mortelle affectant surtout les jeunes enfants. Il existe deux formes de HLH : primaire et secondaire. La HLH primaire est causée par une mutation des gènes impliqués dans la voie cytotoxique médiée par les granules, alors que la HLH secondaire se développe en raison d’une condition préexistante, telle qu’un cancer, une infection chronique ou une transplantation. La HLH est caractérisée par le développement d’inflammation extrême, une production excessive de cytokines inflammatoires ainsi qu’une infiltration tissulaire massive par des lymphocytes T et des macrophages activés. À ce jour, le traitement de la HLH consiste d’abord à réduire l’inflammation à l’aide d’agents de chimiothérapie hautement toxiques et de corticostéroïdes, puis à procéder à une transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) chez les patients atteints de HLH primaire, le seul traitement disponible permettant la rémission de ces patients. Toutefois, les thérapies actuelles ne parviennent pas toujours à réduire l’inflammation extrême chez plusieurs patients atteints de HLH, si bien que le taux de mortalité avant la transplantation de CSH est toujours d’environ 20% à 25%. C’est pourquoi le développement de nouveaux traitements anti-inflammatoires, plus efficaces, représenterait une avancée majeure dans le traitement de la HLH. Des études dans des modèles murins avaient déjà démontré que l’utilisation d’anticorps bloquants ciblant l’IFNg (anti-IFNg) ou de ruxolitinib, un inhibiteur de JAK1/2 (« janus activated kinases 1/2 »), pouvait améliorer efficacement, quoique partiellement, les manifestations de la HLH. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’utilisation d’une thérapie combinée ciblant des cytokines JAK-dépendantes et indépendantes serait plus efficace qu’une monothérapie pour diminuer les symptômes de la HLH. À l’aide d’un modèle murin déficient pour le gène de la perforine (PKO), nous avons comparé les effets de l’inhibition de l’IL-6 et de l’IL-18, deux cytokines fortement sécrétées dans la HLH, en combinaison avec soit de l’anti-IFNg ou du ruxolitinib. Nous avons aussi vérifié l’efficacité d’une thérapie combinée d’anti-IFNg et de ruxolitinib sur les manifestations de la HLH. Nos travaux ont montré que l’anti-IL-6R et l’anti-IL-18, lorsque combinés avec de l’anti-IFNg ou du ruxolitinib, amélioraient légèrement, mais pas de manière significative, les symptômes de la HLH. Par contre, l’utilisation d’une thérapie combinant du ruxolitinib avec de l’anti-IFNg générait un important effet de synergie sur la résolution des symptômes. Notre étude démontre que l’anti-IFNg et le ruxolitinib, même s’ils sont efficaces par eux-mêmes, devraient être utilisés en combinaison afin de prévenir la progression de la HLH. Cette étude est particulièrement pertinente puisque l’anti-IFNg a récemment été approuvé par la FDA pour le traitement de la HLH tandis que le ruxolitinib est présentement à l’étude chez l’humain. / Hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) is a rare, life-threatening hyper-inflammatory disease affecting mainly young children. There are two types of HLH : primary and secondary. Primary HLH is caused by defects in genes of the perforin-granzyme cytotoxic pathway, whereas secondary HLH develops following a pre-existing underlying condition, such as a cancer, a chronic infection or a transplantation. HLH is characterized by extreme inflammation, a very high secretion of inflammatory cytokines and a massive tissue infiltration by activated T cells and macrophages. Currently, treatment for HLH consists of reducing the inflammation with a course of highly toxic chemotherapy agents and corticosteroids, followed by hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) for patients with primary HLH, which is the only available curative treatment for these patients. However, current therapies often fail to properly manage the extreme inflammation of HLH in many patients, so that the pre-HSCT fatality still stands around 20% to 25%. Thus, the development of new, more potent anti-inflammatory treatments would be a major advance in the treatment of HLH. It had already been shown in relevant mouse models that blocking antibodies targeting IFNg (anti-IFNg) or ruxolitinib, a Janus activated kinase 1/2 (JAK1/2) inhibitor, could efficiently, but partially, improve the pathological manifestations of HLH. Thus, we hypothesized that combined therapies targeting both JAK-dependent and independent cytokines would be more effective than either one alone to reduce the symptoms of this pathology. Using a perforin knock-out (PKO) mouse model, we compared the effects of targeting IL-6 and IL-18, which are highly expressed cytokines during HLH, in combination with either anti-IFNg or ruxolitinib. We also tested the efficacy of a therapy combining anti-IFNg with ruxolitinib on the manifestations of HLH. We found that anti-IL-6R and anti-IL-18, when used in combination with either anti-IFNg or ruxolitinib, showed small, but not significant improvements on the pathological manifestations of HLH. However, combination therapy using ruxolitinib and anti-IFNg showed a major synergistic effect on the resolution of the symptoms of HLH. Our findings support that anti-IFNg and ruxolitinib, although effective independently, should be used in combination to suppress HLH progression. This is particularly relevant since the former was recently approved for treating HLH while the latter is in clinical trials.

Malgré le succès de l’utilisation des lymphocytes T modifiées par des récepteur antigéniques chimériques (CAR) contre les leucémies, celles-ci présentent des limites comme leur risque de CRS et leur inefficacité dans les tumeurs solides. Plusieurs autres immunothérapies cellulaires ont été proposées pour pallier à ces inconvénients. Les cellules natural killer (NK) ont plusieurs propriétés qui en font une alternative avantageuse aux cellules T dans les immunothérapies. Cependant, les cellules NK restent difficiles à modifier avec les outils actuels et leur efficacité reste limitée par les mécanismes immunosuppresseurs des tumeurs. Nous avons réussi à augmenter l’efficacité de transduction avec une nouvelle glycoprotéine, le BaEVRless. Nous avons aussi démontré que cette enveloppe ne provoque pas de modification du phénotype ou de l’activité intrinsèque des cellules NK. Dans un modèle de leucémie, nous avons déterminé que l’utilisation du BaEVRless permet la production de cellules CAR-NK fonctionnelles. Les cellules NK peuvent aussi être transduites efficacement par des constructions lentivirales portant les séquences codant pour deux constructions CAR simultanément. Nous avons aussi démontré que l’édition génomique des NK par la technologie Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats (CRISPR) est possible en utilisant une livraison non-virale. Avec cette méthode, nous avons pu réduire l’expression de NKG2A. Les cellules NK avec une expresssion réduite de NKG2A étaient résistantes à l’inhibition par HLA-E, exprimé sur des lignées de cancer du sein et du colon. Cet effet a été confirmé in vivo dans un modèle préclinique xenogénique. Ces résultats montrent deux stratégies qui pourraient permettre d’améliorer les immunothérapies à base de cellules NK. / Despite the overwhelming success of chimeric antigen receptor (CAR)-modified T lymphocytes against leukemias, some limitations have been observed, such as the risk of developing CRS and the lack of efficiency in solid tumor settings. Many other cell-based immunotherapies have been explored to circumvent those caveats. Natural killer (NK) cells present many advantageous properties that could make them a very promising alternative to T cells in immunotherapies. However, NK cells have some caveats, mainly they are hard to modify using conventional tools and they are sensitive to many inhibitory signals expressed by cancer cells. We managed to greatly improve the efficiency of transduction using a novel viral glycoprotein, BaEVRless. In the process, we determined that this novel enveloppe glycoprotein did not modify the phenotype or intrinsic activity of the transduced NK cells. In a leukemia model, we also showed that the BaEVRless can be used to generate functionnal CAR-NK cells. Moreover, the NK cells can be transduced with larger lentiviral constructions bearing two simultaneous CAR-coding sequences. We also demonstrated that Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats (CRISPR) modification of NK cells using a non-viral approach was possible. Using this approach, we generated NK cells with lower NKG2A expression, that were resistant to the inhibitory effects of HLA-E. This affect was seen in a breast cancer model and a colon cancer model. The in vitro results were confirmed in an in vivo preclinical xenogeneic model. Together, those results represent two improvements applicable to NK cell-based immunotherapies.