Les bactéries entéropathogènes du genre Salmonella et Shigella sont transmises par les aliments ou l’eau et sont responsables de nombreuses infections entériques chez les animaux et les humains. Ces maladies infectieuses restent une cause importante de morbidité et de mortalité dans les pays en voie de développement. L’existence de multiples sérotypes de Salmonella et de Shigella ainsi que l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques, nécessite le développement de vaccins efficaces et large spectre. Ces bactéries utilisent un système d’injection de leurs protéines effectrices, appelé injectisome ou encore Système de Sécrétion de Type III (SST3), nécessaire à leur pathogénicité. Alors que les protéines effectrices injectées au moyen de cet injectisome sont variées et dépendent essentiellement du type cellulaire cible et donc de la spécificité du pathogène, certaines des protéines structurales composant l’injectisome sont relativement bien conservées parmi les différentes bactéries pathogènes, notamment les protéines de l’aiguille : PrgI et MxiH, et celles de la coiffe de l’aiguille : SipD et IpaD, respectivement de Salmonella et Shigella. Ces protéines, fortement impliquées dans la virulence des bactéries, semblent donc être des cibles de choix pour lutter contre des infections opportunistes impliquant ces bactéries pathogènes.Le premier objectif de cette thèse était d’évaluer l’immunogénicité et l’effet protecteur des protéines structurales de l’injectisome citées précédemment contre les infections à Salmonella et Shigella. Les protéines recombinantes préparées et produites au laboratoire ont été utilisées de façon séparée ou en combinaison pour immuniser des souris par différentes routes. Ensuite, les réponses immunitaires des souris ainsi immunisées ont été analysées par des tests immunométriques. Enfin, le potentiel immunogène et vaccinant de ces protéines structurales a été évalué en infectant les souris immunisées avec 100 DL50 de Salmonella par voie orale ou de Shigella par voie intranasale. Le meilleur résultat a été obtenu en utilisant la voie intra-gastrique pour les immunisations avec environ 70% de protection. Cette stratégie a permis également d’évaluer la pertinence de cette approche vaccinale dans un modèle murin de protection croisée (entre 25 et 60%). Le deuxième objectif de cette thèse était d’évaluer le pouvoir protecteur d’anticorps monoclonaux murins reconnaissant les régions conservées des protéines SipD et IpaD. Les anticorps obtenus ont été caractérisés et leur pouvoir neutralisant a été évalué in vivo dans un modèle murin d’infection avec Salmonella ou Shigella (jusqu’à 60% de protection).L’ensemble de ces travaux montre que l’utilisation de certaines protéines structurales conservées de l’injectisome de bactéries entéropathogènes présente un intérêt vaccinal et immunothérapeutique pour aider au traitement de certaines salmonelloses et shigelloses. / Salmonella and Shigella species are food and water borne pathogens that are responsible for enteric infections in both humans and animals. These infectious diseases are still the major cause of morbidity and mortality in the emerging countries. The existence of multiple Salmonella and Shigella serotypes as well as the emergence of antibio- resistant strains, require the development of protective and broad-spectrum vaccines. All these bacteria utilize a system for injection of their effectors, called injectisome or Type III Secretion System (T3SS), necessary for their pathogenicity. While effector proteins are varied and depend essentially on the cellular target and thus on the specificity of the pathogen, the structural proteins that form the injectisome are common to all virulent Salmonella and Shigella spp., particularly the needle proteins PrgI and MxiH and the needle-tip proteins SipD and IpaD of Salmonella and Shigella respectively. These proteins, strongly involved in the virulence of the bacteria, appear to be ideal candidate antigens for a subunit-based, broad spectrum vaccine.The first aim of my PhD was to evaluate the immunogenicity and protective efficacy of structural proteins of the above-mentioned injectisome against Salmonella and Shigella infections. The recombinant proteins were prepared and produced in the laboratory and were used alone or in combination to immunize mice using different routes. The immune responses of immunized mice were then analyzed by immunometric assays. Finally, the protective efficacy was evaluated in a mouse model of intestinal (Salmonella) or pulmonary (Shigella) challenge. The best result was obtained by orogastric immunization with 70% of protection. This strategy also allowed to estimate the relevance of this approach in a mouse model of crossed protection (from 25 to 60%). The second objective of my PhD was to evaluate the protective efficacy of murine monoclonal antibodies recognizing conserved regions of SipD and IpaD proteins. The obtained antibodies were characterized and their therapeutic effect was evaluated in vivo with a Salmonella and Shigella infection murine model (up to 60% of protection).To conclude, this work showed that some conserved structural proteins composing the injectisome of enteropathogenic bacteria is of interest for treatment of enteric diseases caused by Salmonella and Shigella.

Les modèles animaux actuellement disponibles pour l’étude des leucémies humaines ne sont pas adaptés pour le développement optimal de nouvelles thérapies ciblées. Au cours de ce projet, qui s’inscrit dans une double perspective fondamentale et industrielle, nous avons cherché à générer un modèle versatile de leucémogénèse humaine chez la souris humanisée BRGS (BALB/c Rag2-/- IL-2Rγc-/- SIRPα.NOD). Les animaux sont greffés avec des progéniteurs hématopoïétiques transduits par des vecteurs lentiviraux surexprimant les oncogènes MYC et BCL2 et placés sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire (EF1α ou SFFV). Le suivi longitudinal des animaux sur une période de 5 mois montre que seule la construction SFFV/Myc-T2A-Bcl2 entraîne la transformation des progéniteurs hématopoïétiques. Entre 12 à 14 semaines post-greffe, >90% des animaux développent des lympho-proliférations de type pro-B (CD19+CD10+CD9+CD20-cytIgM-) infiltrant principalement la rate et la moelle osseuse, et circulant en abondance dans le sang. Le caractère transmissible des tumeurs est validé par des greffes secondaires de tumeurs spléniques. Les cultures in vitro de progéniteurs hématopoïétiques suggèrent que l’émergence des blastes est liée à la réactivation d’un programme B latent dans les précurseurs T, dont le développement est bloqué. Nous avons développé en parallèle un modèle de tumeur autologue. L’ensemble de ces résultats valide le modèle de leucémogénèse humaine développé chez la souris humanisée BRGS et ouvre des perspectives pour la caractérisation fonctionnelle des mécanismes de leucémogénèse, et la validation préclinique de nouvelles stratégies anti-tumorales. / Existing animal models for the study of human leukemia are not accurate for the proper development of innovative, targeted therapies. The aim of this project, which contains both a fundamental and an industrial perspective, therefore was to develop a new, versatile model of human leukemogenesis in the BRGS (BALB/c Rag2-/- IL-2Rγc-/- SIRPα.NOD) humanized mouse. Animals are grafted with hematopoietic progenitors transduced with lentivirals vectors to allow overexpression of MYC and BCL2 proteins under the control of an ubiquitous promotor (EF1α or SFFV). Longitudinal monitoring of the animals over five months shows that only the SFFV/Myc-T2A-Bcl2 construction induces the transformation of humans hematopoietics progenitors. Between 12 and 14 weeks post-transplantation, more than 90% of the animals develop pro-B lympho-proliferations (CD19+CD10+CD9+CD20-cytIgM-), with tumor cells being mainly found in the spleen, the bone marrow and in blood. Tumor transferability is achievable through secondary transplantation in immunodeficient mouse recipients. In vitro culture of bone marrow T cell progenitors suggest that the blasts arise from these cells after reactivation of a latent B cell program with blockade of their T cell development. In parallel, we have also developed an autologous tumor model. Altogether, these results validate the human leukemogenesis model constructed here in humanized BRGS mice and provide attractive prospects regarding the functional characterization of leukemogenesis and a preclinical validation of new anti-tumor strategies.

De récents progrès dans la compréhension de la régulation de l'interaction moléculaire entre les lymphocytes T CD8 (LT CD8) et les cellules tumorales ont donné lieu à de nouvelles immunothérapies contre le cancer. En effet, les anticorps monoclonaux anti-CTLA-4 et anti-PD-1 (mAb), ciblant des récepteurs inhibiteurs à la surface des LT CD8, ont démontré des bénéfices de survie dans de nombreux cancers. Malheureusement, seule une partie des patients répond à ces traitements. Il est donc crucial de caractériser l'influence d'autres facteurs moléculaires régulant la migration et les activités fonctionnelles des LT CD8 afin d'améliorer les traitements actuels du cancer. Un candidat potentiel impliqué dans cette immunosuppression est le récepteur Neuropiline-1 (Nrp-1), qui a été initialement identifié dans le système nerveux. Nous avons identifié une large population de LT CD8 infiltrant le mélanome murin (lignée tumorale B16 greffée à des souris C57BL/6), qui exprime des niveaux élevés de Nrp-1. La présence de cette population augmente pendant la croissance tumorale, mais reste indétectable dans les organes lymphoïdes (rate et ganglion lymphatique drainant la tumeur). De plus, les LT CD8 infiltrant la tumeur exprimant Nrp-1 montre des caractéristiques d’épuisement. En parallèle, l’inhibition de la Nrp-1 avec un anticorps neutralisant augmente la capacité des LT CD8 à migrer, et à tuer les cellules tumorales autologues ex vivo. D’autre part, l’inhibition de la Nrp-1 in vivo agit en synergie avec la neutralisation du récepteur PD-1 pour le contrôle de la croissance tumorale et l’amélioration des fonctions effectrices des LT CD8. Nos résultats montrent donc comment le microenvironnement tumoral induit l'expression de la Nrp-1 sur les LT CD8 et comment ce récepteur neuronal peut participer à la régulation des fonctions effectrices des LT CD8 antitumoraux, avec de potentielles implications comme biomarqueur/cible pour une immunothérapie. / Recent advances in understanding the regulation of molecular interaction between CD8 T cell and tumor cells gave rise to novel cancer immunotherapies. Indeed, monoclonal antibodies against CTLA-4 and PD-1 (mAb), targeting inhibitory receptors on the surface of CD8 T cells, have demonstrated survival benefits in many cancers. Unfortunately, only a fraction of patients responds to these treatments. Therefore, it is crucial to characterize the influence of additional molecular factors regulating the migration and the functional activities of CD8 T cells, in order to improve current cancer treatments. A potential candidate involved in this immunosuppression function is the Neuropilin-1 (Nrp-1), which was originally identified in the nervous system. We identified a large subset of CD8 T cells infiltrating B16 melanoma (mouse model), which expresses high levels of Nrp-1. The frequency of Nrp-1+ CD8 T cells increased during tumor growth, but was undetectable in lymphoid organs (spleen and tumor-draining lymph node). Moreover, Nrp-1+ CD8 tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) displayed features of T cell exhaustion. Importantly, blocking of Nrp-1 with a neutralizing mAb, increases the capacity of CD8 T cells to migrate and to kill autologous tumor cells. In addition, the blockade of Nrp-1 in vivo acts synergistically with the neutralization of the inhibitory receptor PD-1 to control tumor growth and restore TIL function. Our findings show how the tumor microenvironment induces Nrp-1 expression on CD8 T cells and how this neuronal receptor may participate in regulating antitumor CD8 T cell response, with potential implications as a biomarker/target for immunotherapeutic intervention.

De récents résultats d’études cliniques ont démontré l’efficacité de l’immunothérapie chez des patients atteints de cancer. Ce type de thérapie consiste à traiter les cellules cancéreuses en stimulant les défenses immunitaires du patient. Le but de ce projet de thèse est de mettre au point un biomarqueur d’efficacité de cette thérapie, afin d’une part de mieux comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu, et d’autre part d’avoir un indicateur précoce et non-invasif de réponse du patient à l’immunothérapie. Pour ce faire, deux techniques d’imagerie (IRM et TEP) ont été utilisées comme outils de suivi in vivo de la biodistribution de différentes populations de cellules immunitaires. La première étape de ce travail a été d’établir différents protocoles de marquage des cellules immunitaires. Pour l’approche TEP, les cellules immunitaires ont été marquées avec du Zirconium 89 ; quant à l’IRM, deux techniques de marquage ont été étudiées : la première utilise des nanoparticules de fer, l’autre des micelles chargées en Fluor 19. Après validation de leur non-toxicité, la sensibilité de chaque marquage a été évaluée in vitro dans un premier temps, puis in vivo dans un deuxième temps, permettant ainsi d’étudier la biodistribution des cellules immunitaires après différents types d’injections. Le marquage au Zirconium 89 a ensuite été testé sur différents modèles animaux d’immunothérapies (par exemple PD1/PDL1). Enfin, les marquages directs ne permettant pas un suivi optimal des cellules à long terme, une approche de marquage cellulaire utilisant des gènes rapporteurs a été envisagée. Il s’agissait de modifier le génome des cellules immunitaires afin qu’elles puissent exprimer une enzyme (par exemple la thymidine kinase virale HSV1-TK) ou un transporteur (tel que le transporteur d’iode NIS) permettant l’internalisation d’un traceur radioactif in vivo, et de pouvoir ainsi réaliser un marquage indirect des cellules. / Recent clinical trial results have demonstrated the efficacy of immunotherapy in cancer patients. This type of therapy involves treating cancer cells by stimulating the patient's immune defenses. The aim of this thesis project is to develop a biomarker of efficacy for this therapy, in order to better understand the biological mechanisms involved, and to have an early and non-invasive indicator of the patient’s response to immunotherapy. To do this, two imaging techniques (MRI and PET) were used as in vivo monitoring tools for the biodistribution of different populations of immune cells. The first step of this work was to establish different protocols for labeling immune cells. For the PET approach, the immune cells were labeled with Zirconium 89; and for MRI, two labeling techniques were studied: the first uses iron nanoparticles, and the other uses micelles loaded with Fluorine 19. After validation of their non-toxicity, the sensitivity of each labeling was evaluated in vitro, then in vivo in a second step, thus making it possible to study the biodistribution of the immune cells after different types of injections. The labeling with Zirconium 89 was then tested on different animal models of immunotherapies (PD1/PDL1 for example). Finally, since direct markings do not allow optimal cellular monitoring in the long term, a cell labeling approach using reporter genes has been considered. It involved modifying the genome of the immune cells so that they could express an enzyme (for example the viral thymidine kinase HSV1-TK) or a transporter (such as the NIS iodine transporter) allowing the internalization of a radioactive tracer in vivo, and thus be able to carry out indirect labeling of the cells.

Au cours des dernières années, l’immunothérapie a révolutionné le paysage en oncologie. L’anti-CTLA-4 a montré son efficacité sur la survie globale des patients atteints de mélanome métastatique. Cependant, ce traitement présente des limites à son utilisation telles que l'efficacité clinique obtenu chez seulement 20% des patients et la survenue fréquente de colites pouvant être sévères. La recherche de biomarqueurs prédictifs de réponse clinique et/ou de développement de toxicité devient maintenant un enjeu majeur pour sélectionner les patients pouvant avoir un bénéfice à l’utilisation de ces traitements. En partant de l’observation que les colites induites par l’anti-CTLA-4 présentent des similitudes avec les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, nous avons émis l’hypothèse de l’existence d’un microbiote intestinal associé à une dysrégulation du système immunitaire pouvant prédire la réponse clinique et/ou la survenue d’une colite induite par l’anti-CTLA-4. Nous avons montré dans une cohorte de patients atteints de mélanome métastatique et traités par ipilimumab, qu'un microbiote intestinal enrichi en Faecalibacterium et autres Firmicutes est associé à une meilleure survie globale et sans progression ainsi qu'un risque accru de développer une colite. Les patients avec une flore enrichie en Firmicutes présentent également après traitement par ipilimumab, une activation lymphocytaire plus efficace. Par la suite, nous nous sommes intéressés aux métabolites issus du microbiote fécal et leur implication dans la réponse à l'anti-CTLA-4. Le butyrate est le principal métabolite produit par les Firmicutes. Nous avons observé chez la souris, une inhibition de l'efficacité anti-tumorale de l'anti-CTLA-4 lorsqu'elles étaient supplémentées en butyrate. In vivo, nous avons montré que le butyrate inhibe la surexpression sur les cellules dendritiques, des molécules CD80 et CD86 (molécules B7) induite par l'anti-CTLA-4. Cette immaturité des cellules dendritiques entraine un défaut d'activation des lymphocytes T spécifiques d'antigènes dépendant de l'axe CD28/B7 réduisant ainsi l'efficacité anti-tumorale. Chez l'Homme, nous avons valider cette hypothèse en montrant qu'une concentration sérique élevée en butyrate est associée à une diminution de la survie globale et sans progression comparativement aux patients avec un faible niveau de butyrate sérique.Ces travaux mettent en évidence le lien entre la composition du microbiote et les réponses immunologiques au blocage du CTLA-4. Ils apportent une explication sur un lien indirect via le butyrate entre la composition du microbiote intestinal et la réponse anti-tumorale aux immunothérapies. / In the last years, immunotherapy has revolutionized the landscape in oncology. The efficacy of anti-CTLA-4 has been demonstrated by improving overall survival of patients with metastatic melanoma. However, this treatment has limitations to its use such as the clinical efficacy obtained in only 20% of patients and the high incidence of severe colitis. Predictive biomarkers of clinical response and / or toxicity development are mandatory for a better selection of patients who will benefit from this treatment. Based on the observation that anti-CTLA-4-induced colitis has similarities with inflammatory bowel disease, we hypothesized that the gut microbiota associated with dysregulation of the immune system may predict the clinical response and / or occurrence of anti-CTLA-4-induced colitis.In a cohort of patients with metastatic melanoma treated with ipilimumab, we have shown that a gut microbiota enriched with Faecalibacterium and other Firmicutes is associated with a better of overall and progression-free survival as well as an increased risk of developing colitis. Firmicutes-driven microbiota is also associated with an improvement in lymphocyte T activation after ipilimumab treatment. Subsequently, we were interested in microbial metabolites and their involvement in the clinical response to anti-CTLA-4. Butyrate is the main metabolite produced by the Firmicutes. In mice, we observed an inhibition of anti-tumor effect of anti-CTLA-4 in butyrate-supplemented mice. In vivo, we have shown that butyrate inhibits the overexpression on dendritic cells, of CD80 and CD86 molecules (B7molecules) induced by anti-CTLA-4. This immaturity of the dendritic cells leads to a poor signaling of CD28 / B7 axis and activation of antigen-specific T-cells, thereby reducing anti-tumor efficacy. In humans, we validated this hypothesis by showing that a high serum concentration of butyrate is associated with decreased overall and progression-free survival compared to patients with low serum butyrate levels.This studie highlights the link between the composition of gut microbiota and the immunological responses to CTLA-4 blockade. They provide an explanation of an indirect link via butyrate, between the composition of the gut microbiota and the anti-tumor response to immunotherapies.

Le projet de thèse à pour but de produire et caractériser un nouvel allergène de pollen d'ambroisie. Le projet est décliné en cinq axes: production d'une forme recombinante mature et en conformation native, caractérisation structurale, étude de la fonction enzymatique, étude de l'allergenicité et l'immunogénicité et évaluation du potentiel thérapeutique. / The goal of the thesis project is to product and caracterize a novel ragweed pollen allergen.The project have five axes: production of recombinant mature and native form,structurale caracterization, study of enzymatique function, study of allergenicity and immunogenicity and evaluation of therapeutic potential.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / Les parodontites sont des infections polymicrobiennes aux étiologies et pathogénies variées qui se traduisent par des destructions plus ou moins sévères des tissus parodontaux. Parmi plus de 500 espèces microbiennes dénombrées dans la plaque sousgingivale, un complexe bactérien nommé complexe rouge, composé de Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola et Tannerella forsythia, a été fortement associé aux lésions parodontales avancées. L'évolution des parodontites- dépend à la fois de la virulence des bactéries parodontopathogènes et de l'intensité de la réponse immunologique de l'hôte. Certains patients atteints de parodontite chronique répondent d'une façon inadéquate au traitement classique de cette maladie consistant à éliminer la plaque bactérienne sous-gingivale. Par conséquent, des solutions thérapeutiques complémentaires visant à moduler la réponse de l'hôte ou à atténuer la virulence des bactéries parodontopathogènes pourraient être utiles pour traiter ces patients. Le but de cette étude était d'investiguer la capacité des bactéries parodontopathogènes à favoriser la réponse immunodestructrice de l'hôte ainsi que d'évaluer l'effet des constituants de la canneberge sur les mécanismes pathogéniques des parodontites. La capacité de P. gingivalis à moduler la production de médiateurs inflammatoires a été mise en évidence dans un modèle de co-culture de cellules épithéliales et de macrophages et dans un modèle ex vivo de sang complet. Nous avons aussi rapporté que les bactéries du complexe rouge agissaient de concert pour induire la production de cytokines, de prostaglandine E2 (PGE2) et de métalloprotéinase matricielle 9 (MMP-9). L'ensemble de ces résultats met en évidence le potentiel des bactéries parodontopathogènes à favoriser la réponse immunodestructrice de l'hôte. De plus, des effets synergiques entre l'hémoglobine et le lipopolysaccharide (LPS) de bactéries parodontopathogènes sur la réponse inflammatoire des macrophages ont été mis en évidence. Par ailleurs, la capacité d'une fraction de canneberge de haut poids moléculaire à diminuer la production de médiateurs inflammatoires (cytokines, chimiokines et PGE2), de MMP-3 et de MMP-9 par des macrophages et des fibroblastes gingivaux stimulés avec le LPS de bactéries parodontopathogènes a été démontrée. De plus, cette fraction de canneberge s'est avérée capable d'inhiber l'activité de la MMP-3, de la MMP-9 et de l'élastase. Enfin, cette fraction a également démontré une capacité à inhiber la formation du biofilm et l'adhérence de P. gingivalis aux protéines humaines ainsi que les activités protéolytiques des bactéries du complexe rouge. L'ensemble de ces résultats suggère que les polyphénols de la canneberge pourraient contribuer à atténuer la réponse immunodestructrice de l'hôte et la virulence des bactéries parodontopathogènes, offrant ainsi des perspectives prometteuses pour le développement d'un traitement complémentaire pour les parodontites. / Periodontitis are polymicrobial infections leading to destruction of the tooth supporting tissue. Among 500 bacterial species enumerated in the subgingival plaque, members of the red complex, which includes Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola, are strongly related to more advanced periodontal lesions. Two major factors are involved in the pathogenesis of periodontitis, bacteria themselves and the host immune response to these periodontopathogens. Some patients with periodontitis do not respond correctly to conventional therapy consisting in the removal of the subgingival plaque. Consequently, adjunctive therapeutic solutions based on the attenuation of periodontopathogens virulence or of host response may be useful for periodontitis treatment. The aim of this study was to investigate the capacity of periodontopathogens to favor the host immunodestructive response and to evaluate the potential beneficial effects of cranberry constituents on the pathogenic mechanisms of periodontitis. The capacity of P. gingivalis to modulate inflammatory mediator production was characterized in a macrophage/epithelial cell co-culture model as well as in a whole blood model. We have also reported that bacteria of the red complex act in concert to induce the production of cytokines, prostaglandin E2 (PGE2) and matrix metalloproteinases 9 (MMP-9). Moreover, synergistic effects between hemoglobin and lipopolysaccharides (LPS) from periodontopathogens on the macrophage inflammatory response were demonstrated. In addition, the capacity of a high molecular weight cranberry fraction to reduce the production of inflammatory mediators (cytokines, chemokines and PGE2) and MMPs (MMP-3 and MMP-9) by macrophages and fibroblasts stimulated with periodontopathogen LPS was shown. This fraction also inhibited the activity of MMP-3, MMP-9 and elastase. Finally, this cranberry fraction showed the capacity to inhibit adhesion and biofilm formation of P. gingivalis as well as proteolytic activities of bacteria of the red complex. These results suggest that cranberry polyphenols may contribute to limit the host immunodestructive response and periodontopathogen virulence, offering thus promising perspectives for the development of an adjunctive treatment for periodontitis.

Le cancer superficiel de la vessie (CSV) présente un taux élevé de récidive (60%). De ces récidives 10 à 15% progresseront vers un cancer infiltrant beaucoup plus dangereux. La résection transurétrale (RTU) des tumeurs superficielles est souvent suivie d’immunothérapie intravésicale par le BCG (Bacille-Calmette-Guérin) afin de prévenir la récidive et la progression ; cependant ce traitement échoue dans 40% des cas. De plus, la sévérité des effets secondaires empêche plusieurs patients de tolérer un traitement complet. La prédiction de la réponse au BCG et le développement de traitements alternatifs s’avèrent donc nécessaires. Nous avons d’abord évalué la signification clinique de la présence de cellules dendritiques matures infiltrant la tumeur (CDIT) et de macrophages associés aux tumeurs (MAT) dans des CSV à bas risque, traités seulement par RTU. La présence de CDIT a permis d’identifier des patients à risque élevé de progression. Chez des patients à haut risque de récidive et de progression traités au BCG, nous avons observé que ceux qui ont un haut niveau d'infiltration par des CDIT ou des MAT ne répondaient pas efficacement au BCG. Dans un deuxième volet, j’ai exploré la possibilité d’utiliser d’autres agents théarapeutiques pouvant se combiner au BCG ou le remplacer pour stimuler la réponse antitumorale. Pour un tel rôle j’ai choisi les agonistes des Toll-like receptors (TLR). Les TLR, principalement exprimés par les cellules du système immunitaire et quelques cellules épithéliales, jouent un rôle important dans l’immunité innée en reconnaissant des motifs moléculaires conservés de pathogènes. J’ai d’abord montré que les TLR sont exprimés et fonctionnels dans des cellules urothéliales normales et tumorales. Par la suite, j’ai démontré que le poly(I :C), agoniste du TLR3, a un effet cytotoxique et antiprolifératif direct sur des lignées de cancer de vessie. Dans les cellules MGH-U3, il induit également la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et induit fortement l’expression des molécules du CMH de classe I alors que le BCG a très peu d’effet sur l’immunogénicité de ces cellules. Un essai d’inhibition de croissance tumorale utilisant le modèle de cancer de vessie murin MBT-2 a montré que l’utilisation combinée du BCG et du poly(I :C) inhibe très significativement la croissance tumorale alors que chacun des produits utilisés seuls n’avait pas d’effet significatif. Notre étude suggère que le poly(I :C) dû à ses effets anti-néoplasiques pourrait améliorer l’efficacité thérapeutique du BCG dans l’immunothérapie du CSV. / Non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC) is characterized by a high rate of recurrence (60%). Ten to fiftheen % of the recurrences will progress toward muscle-invasive tumors, which are more dangerous. Transurethral resection (TUR) of non-muscle invasive tumors is frequently followed by intravesical immunotherapy using BCG (bacillus Calmette-Guérin) to prevent recurrence and progression but this treatment fails in 40% of cases. Moreover, the severity of the side effects prevents many patients to comply with the whole treatment. Tools to predict the response to BCG and the development of alternative treatments are therefore required. We first evaluated the clinical significance of the presence of tumor infiltrating mature dendritic cells (TIDCs) and of tumor-associated macrophages (TAMs) in low-risk NMIBCs treated only by TUR. The presence of TIDCs allowed the identification of patients that were at high risk of progression. In patients with NMIBCs at high risk of recurrence and progression treated with BCG, we observed that those with a high level of MAT or TIDC infiltration did not respond efficiently to BCG. In the second part of my work, I have explored the possibility to use other immunomodulatory agents to replace or complement BCG immunotherapy. I therefore selected toll-like receptors (TLRs) agonists for this purpose. TLRs, which are mainly expressed in immune cells but also epithelial cells, play an important role in the innate immunity by recognizing molecular patterns that are conserved between pathogens. I have first showed that TLRs are expressed and functional in normal and tumor urothelial cells. Then, I showed that poly(I:C), a TLR3 agonsist, has direct cytotoxic and antiproliferative effects on bladder cancer cell lines. In MGH-U3 cells, it induces the secretion of proinflammatory cytokines and expression of major histocompatibility class I molecules whereas BCG has little effect on the immunogenicity of these cells. A growth inhibition assay using the MBT-2 murine bladder cancer model showed that the combination of poly(I:C) and BCG inhibited very significantly the growth of bladder cancer cells whereas each product alone had no significant effect. Our study suggests that poly(I:C), due to its anti-tumoral effects, could improve the therapeutic efficacy of BCG for the immunotherapy of NMIBCs.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / La présence de lymphocytes T infiltrant (TILs) a été démontrée dans plusieurs types de cancer. Par contre, la fonctionnalité des TILs est affectée par de nombreux facteurs qui font du milieu tumoral un environnement inhibiteur pour ceux-ci. Notre hypothèse de travail était qu'il est possible de prendre avantage des TILs encore activés afin d'élaborer une stratégie anti-tumorale. Nous avons mis au point un système qui permet d'isoler spécifiquement les TILs activés. Pour ce faire, nous avons construit un vecteur contenant le gène codant pour la partie extracellulaire et transmembranaire du CD 19 (ACD19), que nous avons mis sous le contrôle du promoteur minimal de l'interleukine 2. Nous avons démontré que le ACD19 est exprimé de façon stable à la surface cellulaire, que le vecteur est inductible suite à l'activation des lymphocytes T et qu'il est possible d'isoler spécifiquement les cellules exprimant le ACD19. Finalement, nous avons caractérisé un modèle tumoral animal et déterminé les conditions nécessaires pour tester notre hypothèse in vivo.

Le neuroblastome (NB) est la tumeur extra-crânienne la plus fréquente du jeune enfant. Malgré une thérapie multimodale très agressive, 40% des patients atteints de NB à haut risque rechutent. Le traitement de ces patients consiste à éliminer la tumeur par chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie, à reconstituer la moelle osseuse par une greffe de cellules souches autologues et enfin à éliminer la maladie résiduelle (MRD) par une immunothérapie visant l’antigène GD2 exprimé par les neuroblastes. Notre étude préclinique a examiné l’efficacité de deux stratégies de traitements qui visent à potentialiser les thérapies actuelles et réduire leur toxicité. La première consiste à réduire la masse tumorale par la radiothérapie ciblée combinée à des radiosensibilisants. La deuxième approche est basée sur l’activation des cellules natural killer (NK) pour potentialiser l’effet de l’immunothérapie anti-GD2 et éliminer la MRD. L’autophagie est un processus catabolique qui élimine les protéines et organelles endommagées par différents stress incluant les irradiations. Par conséquent, inhiber l’autophagie pourrait sensibiliser les neuroblastes aux irradiations. Or, nous avons montré qu’étant très radiosensibles, les neuroblastes ne sont pas davantage éliminés par les irradiations quand ils sont traités avec un inhibiteur de l’autophagie. De plus, l’absence d’un inhibiteur efficace de l’autophagie à usage thérapeutique ne permet pas actuellement d’adopter cette approche. Notre étude a également permis de révéler une nouvelle approche de stimulation des cellules NK par les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) activées par un ligand du récepteur Toll-like, capable d’éradiquer la MRD et prévenir les rechutes de NB. Nos résultats ont permis, d’une part, d’élucider les mécanismes impliqués dans la lyse des cellules NK activées par les pDC contre les neuroblastes et, d’une autre part, de démontrer que l’axe pDC-NK chez le patient est fonctionnel, augmente l’efficacité de l’anti-GD2 et élimine efficacement les neuroblastes. Ainsi, l’immunothérapie par les cellules NK est une stratégie très prometteuse pour traiter le NB. Cette étude préclinique servira de base à l’élaboration d’un essai clinique pour traiter les enfants atteints de NB au CHU Sainte Justine. / Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid tumor in childhood. Despite aggressive multimodal therapy, 40% of patients with high-risk NB relapse. The current therapy comprises an induction treatment with chemotherapy and surgery, a consolidation treatment including radiotherapy and high-dose chemotherapy followed by bone marrow rescue with autologous hematopoietic stem cell transplantation and finally anti-GD2 immunotherapy targeting the disialoganglioside (GD2) antigen expressed by neuroblasts to treat minimal residual disease (MRD). Our preclinical study proposes two treatment strategies to potentiate current therapies and reduced toxicities. The first aim to reduce tumor mass by targeted radiotherapy combined with radiosensitizers. The second approach is based on the activation of natural killer (NK) cells to potentiate the effect of anti-GD2 therapy and eliminate MRD. Autophagy is a catabolic process that recycle damaged proteins and organelles, induced under various conditions of cellular stress including irradiation. Therefore, inhibiting autophagy could sensitize neuroblasts to irradiation. However, our study showed that neuroblasts were highly sensitive to irradiation and autophagy inhibitor failed to increase neuroblasts sensitization to irradiation. In addition, the absence of a potent autophagy inhibitor for therapeutic use does not allow this approach to be adopted. Our preclinical study demonstrated a novel approach based on NK cell stimulation with Toll-like activated plasmacytoid dendritic cells (pDC) that enhances the efficacy of anti-GD2 immunotherapy and prevent NB relapse. We elucidated the mechanisms involved in pDC-activated NK cells killing of neuroblasts. We further demonstrated that neuroblasts were efficiently killed by patient’s NK cells after stimulation by activated pDC. This is further increased by the addition of anti-GD2 antibody. Altogether, our study demonstrates that NK cell-based immunotherapy has a real potential to enhance anti-GD2 immunotherapy effect and prevent NB relapse. This preclinical study will serve as a basis for the development of a clinical trial to treat children with NB at CHU Sainte Justine.