Objectifs : Les lymphocytes T régulateurs de par leur rôle primordial dans l'homéostasie de la réponse immune sont des cellules idéales pour une immunothérapie antigène-spécifique dans les maladies auto-immunes. Les lymphocytes T régulateurs de type 1 ou Tr1 sont caractérisées par une forte sécrétion d'IL-10, cytokine qui joue un rôle déterminant dans leur capacité à supprimer des réponses immunes pathologiques dans différents contextes. L'objectif de ma thèse est d'évaluer le potentiel thérapeutique de cellules Tr1 spécifiques du collagène de type II (col-Treg) dans deux modèles de polyarthrite rhumatoïde (PR) chez la souris. Méthode : Les clones Col-Treg ne possèdent pas de marqueurs membranaires spécifiques mais sont caractérisés par un profil cytokinique particulier (IL10highIL4negIFN-γint) et par leur capacité de suppression in vitro. Tout comme les Tregs naturels, ils expriment une quantité importante de GITR, de CD39 et de Granzyme B. Une simple injection de cellules Col-Treg réduit l'incidence et les symptômes cliniques de l'arthrite à la fois de manière préventive et curative, avec un impact significatif sur les anticorps anti-collagène de type II. En outre, l'injection de Tr1 antigène spécifique in vivo diminue de manière significative la prolifération des cellules T antigène spécifique. Conclusion : Nos résultats démontrent le potentiel thérapeutique des cellules Col-Treg dans deux modèles d'arthrite expérimentale prouvant que les cellules Col-Treg représente une nouvelle approche thérapeutique de choix pour le traitement des patients atteint de polyarthrite et réfractaires aux traitements actuels. / Objectives : Regulatory T (Treg) cells play a crucial role in preventing autoimmune diseases and are an ideal target for therapies to suppress inflammation in an antigen-specific manner. Type 1 Treg cells (Tr1) are defined by their capacity to produce high levels of IL10, which contributes to their ability to suppress pathological immune responses in several settings. The aim of my PhD was to evaluate the therapeutic potential of collagen type II-specific Tr1 (Col-Treg) cells in two models of rheumatoid arthritis (RA) in mice. Methods : Col-Treg clones were isolated and expanded from Collagen-specific TCR transgenic mice. Their cytokine secretion profile and phenotype characterization were studied. The therapeutic potential of Col-Treg cells was evaluated after adoptive transfer in collagen-antibodies- and collagen-induced arthritis models. The in vivo suppressive mechanism on effector T cell proliferation was also investigated. Results : Col-Treg clones are characterized by a cytokine profile (IL10highIL4negIFN-γint) and mediate contact-independent immune suppression. They also share with natural Tregs high expression of GITR, CD39 and Granzyme B. Single infusion of Col-Treg cells reduced incidence and clinical symptoms of arthritis both in preventive and curative settings, with a significant impact on collagen type II antibodies. Importantly, injection of antigen-specific type 1 Treg cells decreases significantly the proliferation of antigen-specific effector T cells in vivo. Conclusion : Our results demonstrate the therapeutic potential of Col-Treg cells in two models of RA, providing evidence that Col-Treg could be an efficient cell-based therapy for RA patients refractory to current treatments.

De nombreuses données expérimentales et cliniques ont montré l'importance des cellules Natural Killer (NK) dans l'immunosurveillance antitumorale. Les stratégies thérapeutiques basées sur les cellules NK pourraient donc être une alternative de choix dans le traitement de certains types de cancers. Nous avons focalisé notre étude sur deux types de cancer incurables malgré les récents progrès thérapeutiques : la leucémie lymphoïde chronique B (LLC-B) et le cancer de la prostate. Le but de notre étude est une meilleure compréhension des mécanismes mis en place par les cellules B leucémiques et les cellules tumorales prostatiques pour échapper à la réponse antitumorale des cellules NK. La connaissance de ces mécanismes d'échappement est un pré-requis indispensable à l'utilisation des cellules NK dans les thérapies antitumorales. Concernant la LLC-B, nos résultats suggèrent que les cellules NK de patients, fonctionnellement compétentes, ne peuvent pas initier une réaction immunitaire appropriée envers les cellules B leucémiques due au manque de reconnaissance de ces dernières. Concernant le cancer de la prostate, nos données préliminaires montrent que les cellules NK circulantes de patients sont également fonctionnellement compétentes, quelque soit le stade de la maladie, malgré la diminution significative de l'expression du récepteur NKp30. Ainsi, le degré d’immunogénicité des cellules B leucémiques et celui des cellules tumorales prostatiques devra être autant pris en compte que la fonctionnalité des cellules NK dans les stratégies visant à optimiser l'activité antitumorale de ces dernières. / Many experimental and clinical data have enlightened the importance of Natural Killer (NK) cells in tumor immunosurveillance. Therapeutic strategies based on NK cells could be an alternative in the treatment of certain cancers. We focused our study on two types of incurable cancers despite recent advances in treatment: B chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) and prostate cancer. The aim of our study is a better understanding of the mechanisms set up by leukemic B cells and prostate cancer cells to escape from NK antitumor response. The knowledge of these escape mechanisms is an essential prerequisite to the use of NK cells in antitumor therapies. Regarding B-CLL, our results suggest that NK cells, although functionally competent, can not initiate an appropriate immune response against leukemic B cells due to a lack of recognition of the latter. Concerning the prostate cancer, our preliminary data show that circulating NK cells are functionally competent, whatever the stage of disease, despite the significant decrease in expression of the receptor NKp30. Thus, the degree of immunogenicity of leukemic B cells and of the prostate cancer cells must be taken into account as well as the functionality of NK cells in strategies aiming at improving NK antitumor activity.

L'infection chronique par le virus de l'hépatite B (VHB) touche 400 millions de personnes dans le monde et conduit à 1 million de décès par an des suites de complications hépatiques. Les traitements actuels permettent de freiner la progression de la maladie mais ne guérissent les patients que dans de très rares cas (3-5%). Le besoin médical pour de nouvelles thérapies est fort et les approches de type immunothérapie semblent aujourd'hui prometteuses dans cette pathologie où des corrélats immunitaires de résolution sont établis. Le but de cette thèse a été l'étude approfondie de candidats d'immunothérapie basés sur un vecteur adénovirus de sérotype 5 humain non réplicatif codant pour plusieurs antigènes du VHB. Des études in vitro et dans un modèle murin, ont montré la capacité : 1/ des antigènes du VHB codés par certains candidats a formé des VLP (microscopie électronique) 2/ des candidats à induire un recrutement de cellules immunitaires sur le site d'injection après administration par voie sous-cutanée. Des études in vivo utilisant un candidat prototype ont visé à caractériser les réponses immunitaires induites et à étudier l'impact de schémas d'immunisation atypiques, tels que ceux qui pourraient être utilisés en clinique. Elles ont montré la capacité du prototype, qu'il soit injecté une ou de multiples fois, à induire des réponses T CD8+ spécifiques du VHB, fortes, multispécifiques et maintenues dans le temps dans des modèles murins naïfs ou tolérants pour le VHB. Les administrations multiples n'ont pas conduit à une augmentation de la proportion de cellules T spécifiques du VHB exprimant des molécules d'inhibition, de type PD1 / Chronic infection with hepatitis B virus (HBV) affects 400 million people worldwide and leads to 1 million of deaths per year as a result of liver complications. Current treatments can slow the progression of the disease but cure patients in very rare cases (3-5%). The medical need for new therapies is obvious, strong and immunotherapy approaches appear promising in this disease, where immune correlates of resolution are established. The aim of this thesis was a comprehensive study of immunotherapeutic candidates, based on a non-replicating human adenovirus serotype 5 vector, encoding several antigens of HBV. Studies in vitro and in a mouse model, showed the ability of: 1 / HBV antigens encoded by some candidates to form VLPs (electron microscopy) 2 / candidates to induce recruitment of immune cells at the injection site after subcutaneous administration. In vivo studies using a prototype candidate aimed at characterizing the induced immune responses and to study the impact of atypical immunization schedules, which could be clinically used. They demonstrated the ability of the prototype, injected once or multiple times, to induce strong, multispecific and sustained over time HBV specific CD8 + T cells, in naive or tolerant to HBV mouse models. Multiple administrations do not increase the proportion of HBV specific T cells expressing inhibitory molecules, such as PD1

L’oncologie actuelle est encore confrontée à la résistance et à la progression rapide des cancers. Les mécanismes de résistance intrinsèque développés par les cellules tumorales peuvent compromettre l’efficacité des chimiothérapies et des immunothérapies. Il est maintenant admis que l’état de la réponse immunitaire de l’hôte détermine en partie l’issue thérapeutique des patients. L’objectif de notre équipe de recherche est donc de caractériser cette réponse et d’étudier l’impact des thérapies conventionnelles sur celle-ci dans le but d’identifier les mécanismes liés à un échappement futur de la tumeur. Dans ce contexte, nous avons montré qu’une chimiothérapie (5-FU, oxaliplatine, anti-VEGF (« Vascular Endothelium Growth Factor » : FOLFOX-bevacizumab) provoque chez certains patients une chute des gMDSC (cellules myéloïdes immunosuppressives granulocytaires) périphériques qui est associée à une meilleure réponse thérapeutique. Comme chez la souris, cet effet sur les gMDSC provoque néanmoins une élévation des Th17, une population pro-angiogénique, qui limite l’efficacité de la chimiothérapie. La suite de notre travail a eu pour objectif de tester l’effet « anti-Th17 » de l’activation de l’histone désacétylase SIRT1. SIRT1 est une enzyme capable de perturber l’acétylation de STAT3, un facteur essentiel à la différenciation des Th17. Nous avons montré que l’utilisation d’agonistes pharmacologiques de SIRT1 (resvératrol, SRT1720, metformine) inhibe la polarisation des Th17 par la désacétylation de STAT3 et que cet effet permet de limiter la croissance tumorale dans un modèle de cancer colique et de mélanome chez la souris (B16F10, CT26). Nous avons validé ce concept chez l’homme, ce qui suggère qu’il est possible de cibler les Th17 par cette stratégie en complément de la chimiothérapie. Le dernier volet de ce travail est consacré à la comparaison du profil immunologique périphérique de volontaires sains à celui d’une cohorte prospective de cancers bronchiques non à petites cellules. Cette étude nous a permis de mettre en lumière les altérations immunitaires induites par la tumeur et de lier ces altérations à la réponse au nivolumab (anti-PD-1). Un premier modèle prédictif de réponse a pu être généré grâce aux données d’un panel d’analyse des cellules myéloïdes. Ce modèle révèle une fois encore que les cellules gMDSC ont un rôle prédictif défavorable, alors que les populations présentatrices d’antigènes (cellules dendritiques et monocytes) exprimant PD-L1 ont un bon rôle prédictif. Les données présentées dans cette partie sont préliminaires et devront être confirmées avec la cohorte de validation qui est en cours d’inclusion. L’ensemble de ce travail a permis de montrer qu’il est essentiel de cibler spécifiquement les cellules myéloïdes immunosuppressives et les Th17 pour favoriser l’efficacité des chimiothérapies et de l’immunothérapie dans le cancer. / Actual oncology is still facing resistance and rapid progression of cancer. Intrinsic resistance mechanisms developed by tumor cells determine chemotherapy and immunotherapy efficacy. It is now recognized that the host immune response status is in part implicated in the therapeutic outcome of patients. The aim of our research team is to characterize this response and to study the impact of therapies in order to identify the mechanisms associated with future exhaust of the tumor. In this context, we have shown that chemotherapy (5-FU, oxaliplatin, anti-VEGF: FOLFOX-bevacizumab) in some patients causes a drop in devices gMDSC (granulocytic myeloid derived suppressive cells) that is associated with better therapeutic response. Nevertheless, as in mice, this effect on gMDSC causes an elevation of Th17, a pro-angiogenic population, which limits the effectiveness of chemotherapy. The result of our work was aimed to test the effect "anti-Th17" activating SIRT1 deacetylase histone. SIRT1 is an enzyme capable of disrupting the acetylation of STAT3, a key factor in the differentiation of Th17. We have shown that by using pharmacological agonists SIRT1 (resveratrol, SRT1720, metformin) inhibits Th17 polarization by deacetylation of STAT3 and that this effect can limit tumor growth in colorectal and melanoma murine models (B16F10, CT26). We validated this concept in humans, suggesting that it is possible to target Th17 cells by this strategy in addition to chemotherapy. The final component of this work is devoted to the comparison of peripheral immunological profile of healthy volunteers to a prospective cohort of non-small cell lung cancer. This study has allowed us to highlight the immune alterations induced by the tumor and to link these changes in response to nivolumab (anti-PD-1). A first response predictive model could be generated using data from a panel analysis of myeloid cells. This model proves once again that gMDSC have a negative predictive role, while antigen presenting (dendritic cells and monocytes) expressing PD-L1 has a good predictive role. Data presented in this section are preliminary and must be confirmed with the validation cohort that is currently included. All of this work has shown that it is essential to specifically target immunosuppressive myeloid cells and Th17 to promote the efficacy of chemotherapy and immunotherapy in cancer.

L’allergie ou l’hypersensibilité de type I est une réponse inappropriée du système immunitaire à une substance étrangère à l’organisme, nommée « allergène ». L’immunothérapie allergénique (ITA) est actuellement le seul traitement sur le marché qui permet de traiter l’étiologie de la maladie allergique par opposition aux traitements symptomatiques qui diminuent temporairement les manifestations allergiques. Son action consiste à réduire la sensibilité de l’organisme vis-à-vis de l’allergène en modulant progressivement la réponse immunitaire dirigée contre ce dernier. L’objectif de cette thèse était de définir des biomarqueurs d’efficacité clinique utilisables dans le cadre des traitements de l’ITA. La stratégie de recherche est basée sur une hypothèse qui consiste à suggérer que les cellules dendritiques (DCs) sont impliquées dans le succès de l’immunothérapie. En particulier, nous supposons que le traitement induit une baisse des DCs de type 2 (DC2), qui induisent des lymphocytes T auxiliaires de type 2 (TH2), et une augmentation des DCs régulatrices (DCreg), qui induisent des lymphocytes T régulateurs. La première partie de cette thèse a consisté à mettre au point des conditions de culture induisant des DC2. Pour cela, un criblage de molécules biologiques et pharmacologiques a été entrepris sur les DCs dérivées des monocytes afin d’induire in vitro des DC2 et a conduit à la mise au point d’un mélange de plusieurs molécules, dont certaines sont impliquées dans les mécanismes de l’allergie. Le phénotype des DC2 obtenu a été étudié ainsi que la polarisation des lymphocytes T induite après co-cultures en comparaison avec des DCs de type 1 (DC1) et des DCreg.La deuxième partie de cette thèse a consisté à analyser, à l’échelle moléculaire, les différents types de DCs induites (DC1, DC2 et DCreg). Pour cela, deux techniques ont été utilisées, une analyse transcriptomique par puces à ADN et une analyse protéomique par spectrométrie de masse sans marquage, pour comparer le transcriptome et le protéome des DCs induites. Le différentiel d’expression des marqueurs les plus pertinents a été validé au niveau transcriptionnel et protéique.Dans la troisième partie de cette thèse, le suivi des marqueurs dans des cellules du sang de patients allergiques traités ou non par ITA lors d’une étude clinique randomisée, contrôlée, en double aveugle, a permis de définir six nouveaux candidats biomarqueurs d’efficacité de l’immunothérapie, dont trois spécifiques des DC2 et trois autres spécifiques des DCreg. Ces marqueurs pourront être suivis lors des traitements d’ITA pour distinguer les patients répondeurs des non-répondeurs. / Allergy or type I hypersensitivity is an inappropriate response of the immune system to a foreign substance in the body, called "allergen". Allergen immunotherapy (AIT) is currently the only treatment on the market that can handle the etiology of allergic disease versus symptomatic treatments that temporarily reduce allergic manifestations. Its action is to reduce the sensitivity of the body against allergens.The aim of this thesis was to define biomarkers of clinical efficacy of AIT. The research strategy is based on the following hypothesis: dendritic cells (DCs) are involved in the success of immunotherapy. In particular, we assume that the treatment induces a decrease in DCs type 2 (DC2), which induce type 2 helper T cells, and an increase of regulatory DCs (DCreg), which induce regulatory T cells.First, we defined optimal culture conditions inducing the polarization of in vitro immature monocyte-derived DCs (MoDCs) toward a DC2 pattern. After screening several biological and pharmaceutical agents, we selected a cocktail of six molecules with some of them are pro-allergenic molecules. The phenotype of those DC2 cells and the CD4+ T cell polarization induced after coculture were characterized extensively in comparison with type 1 DC (DC1) and DCreg.In a second part, we compared the transcriptomes and the proteomes of MoDCs polarized into DC1, DC2 and DCreg by using cDNA microarrays together with label-free mass spectrometry. The differential expression of the most relevant markers was confirmed at the transcriptional and protein level. In the third part, markers were also followed in the peripheral blood from allergic patients enrolled in a randomized, double-blind, placebo-controlled AIT study. The expression of three DC2 markers was down-regulated and of three DCreg markers was up-regulated in patients who responded to the treatment and correlated with clinical efficacy. These markers could be used as follow-up read-outs of AIT efficacy in order of to discriminate responders from nonresponders.

Les maladies à prions sont des maladies neurodégénératives fatales, affectant de nombreuses espèces animales, dont l'homme. Elles se caractérisent par l'accumulation, notamment dans le système nerveux central, d'une isoforme anormale d'une protéine membranaire ubiquiste, la protéine prion cellulaire (PrPc). Il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement réellement efficace. Ces dernières années, l'immunothérapie, passive et active, basée sur l'utilisation d'anticorps dirigés contre la conformation native de la PrPc et capables de bloquer sa transconformation en forme pathogène, est apparue comme une méthode prometteuse.<br />En vue d'obtenir des anticorps susceptibles d'être utilisés en immunothérapie passive chez l'homme, nous avons développé différents protocoles d'immunisation génique chez des souris de type sauvage, une technique reconnue pour favoriser la production d'anticorps dirigés contre la conformation native de l'antigène, mais souvent décrite comme peu efficace. L'injection intramusculaire par électrotransfert de l'ADNc codant la PrP humaine nous a permis d'obtenir, en augmentant fortement le niveau d'expression in vivo de la protéine, de fortes quantités d'anticorps polyclonaux contre la PrP humaine native. Ces résultats ouvrent la voie à la production d'anticorps monoclonaux puis recombinants, dans un format d'expression qu'il reste à définir pour tester et optimiser leur potentiel thérapeutique in vivo.<br />Dans le cadre d'une approche par immunothérapie active (vaccination), nous avons essayé de rompre la tolérance immunitaire vis-à-vis de la PrPc endogène chez des souris de type sauvage. La potentialisation de la réponse en anticorps spécifiques, induite par l'électrotransfert in vivo de l'ADNc de la PrP humaine, nous a permis de mettre en évidence une réaction croisée de ces anticorps avec la PrPc murine.<br />D'un point de vue général, nos résultats pourraient contribuer à ouvrir de nouvelles perspectives pour l'immunothérapie, passive et active, de nombreuses pathologies, en particulier d'autres maladies neurodégénératives, comme la maladie d'Alzheimer, ou certains cancers caractérisés par une surexpression de protéines membranaires

L'immunothérapie cellulaire passive par injection de lymphopcytes T cytotoxiques offre des possibilités thérapeutiques nouvelles dans l'immunité anti-virale et anti-tumorale. Par rapport aux méthodes actuelles de stimulation utilisant des lignées présentatrices d'antigènes, nous essayons de développer une méthode alternative d'amplification des lymphocytes T CD8 à l'aide d'une combinaison de protéines recombinantes immobilisées sur billes.<br />L'interaction 4-1BB/4-1BBL (CD137/CD137L) constitue un des signaux de co-stimulation impliqués dans l'activation des lymphocytes T CD8 effecteurs. Le travail présenté ici décrit pour la première fois la production et la caractérisation d'une forme fonctionnelle de 4-1BBL recombinant soluble. De plus, nous montrons qu'il est possible d'amplifier in vitro des lymphocytes T mémoires anti-CMV et anti-EBV avec des complexes HLA-peptide associés à ce 4-1BBL ou à de l'anticorps anti-CD28. L'intérêt de la co-stimulation du 4-1BB est comparée à celle du CD28 dans les 2 contextes antigéniques étudiés.

Les lymphocytes T qui expriment un TCR γδ (lymphocytes T γδ) sont des lymphocytes T non conventionnels qui reconnaissent des antigènes indépendamment du CMH (complexe majeur d'histocompatibilité). Chez l'homme, la sous-population T Vγ9Vδ2, majoritaire dans le sang périphérique, joue un rôle important dans l'immunité antitumorale. Les lymphocytes T Vγ9Vδ2 reconnaissent les cellules tumorales grâce à leur TCR et/ou leurs récepteurs NK. Le travail de thèse s'est focalisé sur l'un de ces récepteurs : CRTAM et le rôle de son interaction avec son ligand Necl-2 exprimé par des cellules tumorales. Nous avons montré que les lymphocytes T Vγ9Vδ2 activés expriment CRTAM de manière transitoire. Afin d'étudier l'interaction CRTAM avec son ligand Necl-2, nous avons développé des modèles de cellules tumorales exprimant Necl-2 après transduction rétrovirale. Nous avons observé que l'interaction des lymphocytes T Vγ9Vδ2 avec des cellules tumorales Necl-2+ entraînait une diminution de l'expression de CRTAM à la surface des lymphocytes. De manière concomitante, les cellules tumorales Necl-2+ acquièrent CRTAM par un mécanisme de trogocytose. Contrairement aux lymphocytes T CD8 et les cellules NK, nous n'avons pas observé d'impact de l'interaction CRTAM/Necl-2+ sur la capacité cytotoxique et la sécrétion d'IFN-γ des lymphocytes T Vγ9Vδ2. Par contre, cette interaction induit la mort des lymphocytes T Vγ9Vδ2 par un mécanisme de type autophagique. Nos résultats suggèrent que l'expression de Necl-2 par les cellules tumorales serait un mécanisme leur permettant d'échapper à une réponse des lymphocytes T Vγ9Vδ2.

Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d'antigènes qui jouent un rôle central dans l'immunité en initiant et en orientant les réponses T primaires. Parmi elles, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules clé de la réponse anti-virale et sont également impliquées dans l'induction de tolérance. Dans le cancer du sein, la présence de pDC et de lymphocytes T régulateurs (Treg) dans les tumeurs sont des facteurs de mauvais pronostic. Nous avons développé un modèle murin de tumeur mammaire dans lequel l'échappement des tumeurs à l'immuno-surveillance semble associé à leur infiltration par des pDC et des Treg reproduisant ainsi la pathologie humaine. Les DC myéloïdes associées aux tumeurs (TAmDC) et les TApDC sont immatures et conservent leur capacité à internaliser des antigènes in vivo. De façon importante, les TApDC sont spécifiquement altérées pour leur capacité à produire des cytokines et chimiokines inflammatoires en réponse aux ligands du Toll Like Receptor (TLR)-9 mais conservent une réponse normale aux ligands du TLR7. En revanche, les TAmDC produisent spontanément de grandes quantités d'IL-10 mais ne sécrètent pas d'IL-12. Enfin, les deux sous populations sont bloquées pour leur capacité à induire l'activation des lymphocytes T CD4+. En parallèle, les pDC normales sont capables d'internaliser des corps apoptotiques de cellules tumorales à condition que celles-ci soient infectées par un virus. Ces résultats suggèrent que les pDC et les mDC sont différemment altérées dans l'environnement tumoral et fournissent de nouvelles pistes pour des stratégies d'immunothérapie dans le cancer du sein

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal