Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-09-02T15:07:52Z No. of bitstreams: 1 2016_AnaPauladeCastroCantuária.pdf: 14393789 bytes, checksum: 1c0ab3f5e6fc3fd66fb4ae339ffcd9fa (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-02T19:53:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_AnaPauladeCastroCantuária.pdf: 14393789 bytes, checksum: 1c0ab3f5e6fc3fd66fb4ae339ffcd9fa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T19:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_AnaPauladeCastroCantuária.pdf: 14393789 bytes, checksum: 1c0ab3f5e6fc3fd66fb4ae339ffcd9fa (MD5) / O diabetes mellitus (DM) consiste em uma desordem metabólica caracterizada por hiperglicemia crônica que pode levar a lesão de células e tecidos. Uma das possíveis causas das lesões pode ser o desequilíbrio que ocorre no sistema imune. Nesta condição, inúmeros peptídeos já foram descritos com o potencial imunomodulador. Contudo, ainda não foi descrito na literatura o efeito desses peptídeos nas células imunes em condições de elevadas concentrações de glicose, associadas à estímulos infecciosos e inflamatórios. Sendo assim, este estudo objetivou verificar o potencial imunomodulador de peptídeos sintéticos frente a um modelo de hiperglicemia in vitro, avaliando a produção de mediadores pró- e anti-inflamatórios. Para tanto o estudo foi dividido em 3 fases: (1) avaliação da resposta in vitro das diferentes concentrações de glicose; (2) seleção dos peptídeos candidatos (LL-37, IDR-1018, IDR-1002 e DJK-6); e (3) avaliação da produção de citocinas in vitro na presença de 64 μg.mL-1 do peptídeo IDR-1018. Para tanto, foram realizados ensaio de viabilidade celular, seguido da dosagem de citocinas (ELISA e reação de Griess) em células RAW 264.7 incubadas com ou sem D-glicose, lipopolissacarídeo (LPS), recombinante interferon (rIFN)-γ e peptídeos. Foram determinadas a produção da proteína quimiotática de monócitos (MCP)-1, interleucina (IL)-1α, IL-6, fator de necrose tumoral (TNF)-α, IL-12, IL-10 e óxido nítrico (NO) na primeira e terceira fase e apenas IL-6, TNF-α e NO na segunda fase. Na primeira fase, os estímulos de glicose não foram capazes de alterar a viabilidade celular, ocorreu um aumento na produção de IL-6, TNF-α e IL-12, enquanto que a produção de IL-10 diminuiu. Na segunda fase, todos os peptídeos mantiveram a viabilidade das células. Dentre os peptídeos testados, o peptídeo IDR-1018 foi o escolhido para a fase seguinte, por diminuir a produção de TNF-α e manter os níveis basais de produção de NO, juntamente com o peptídeo LL-37, utilizado como peptídeo de comparação. E na terceira fase o IDR-1018 manteve os níveis basais de MCP-1, IL-6, IL-12 e IL-10, diminuiu a produção de TNF-α e aumentou a produção de NO, semelhante aos resultados obtidos na presença da LL-37. Desta maneira, a partir dos resultados obtidos, o peptídeo IDR-1018 sugere um efeito protetor, promovendo a manutenção dos níveis basais e não permitindo o aumento da produção dos mediadores pró-inflamatórios, para que assim não ocorra um possível dano celular. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Diabetes mellitus (DM) consists in a metabolic disorder characterized by chronic hyperglycemia, which may lead to cells and tissues damage. One of the possible causes of the injury can be the imbalance occurring in the immune system. In this condition, many peptides have been described with the immunomodulatory potential. However, it has not yet been described in the literature these peptides effects on the immune cells in conditions of high glucose concentrations, associated with infectious and inflammatory stimuli. Thus, this study aimed to verify the biotechnological potential of immunomodulatory synthetic peptides front of an in vitro hyperglycemia model, evaluating the production of pro- and anti-inflammatory mediators. For this, the study was divided into three phases: (1) assessing the in vitro response of different glucose concentrations; (2) selection of candidate peptides (LL-37, IDR-1018, IDR-1002 and DJK-6); and (3) evaluation of cytokine production in vitro in the presence of 64 μg.mL-1 IDR-1018 peptide. Therefore, there were carried cell viability assay, followed by cytokine assay (ELISA and Griess reaction) in RAW 264.7 cells incubated with or without D-glucose, lipopolysaccharide (LPS), recombinant interferon (rIFN)-γ and peptides. It were determined the production of monocyte chemoattractant protein (MCP) -1, interleukin (IL) -1α, IL-6, tumor necrosis factor (TNF)-α, IL-12, IL-10 and nitric oxide (NO) in first and third phase and only IL-6, TNF-α and NO in the second phase. In the first phase, the glucose stimuli were not capable of altering the cell viability. There was an increase in IL-6, TNF-α and IL-12 production, whereas IL-10 production decreased. In the second phase, all the peptides maintained the cell viability. Among the peptides tested, the IDR-1018 peptide was chosen for the next stage, by reducing TNF-α production and maintains basal levels of NO production, along with LL-37 peptide, used as a comparison peptide. And in the third stage, IDR -1018 maintained baseline levels of MCP-1, IL-6, IL-12 and IL-10, decreased TNF-α production and increased NO production, similar to the results obtained in the presence of LL-37. Thus, from the results, the IDR-1018 peptide suggests a protective effect in vitro, promoting the maintenance of baseline levels and not allowing the increasing production of pro-inflammatory mediators, which thereby does not happen possible cell damage.

Os β- glucanos são polissacarídeos que possuem atividade imunomoduladora. A colibacilose é uma das principais doenças da avicultura, pois causa grandes perdas econômicas. Diante da necessidade de se estabelecer a ação do β-glucano solúvel nas aves, foram realizados dois experimentos. Um para se avaliar os efeitos do β-glucano solúvel, administrado por diferentes vias, na produção de anticorpos séricos IgA e IgG, nos parâmetros zootécnicos e outro na infecção por Escherichia coli (EC). Os experimentos foram realizados ao mesmo tempo, em galpões diferentes, sendo alojados 160 frangos de corte da linhagem Ross (Aviagen®), do primeiro ao 42o dia de idade. β-glucano solúvel foi administrado no primeiro dia, na dose de 215µg/ave, nas seguintes vias de administração: subcutânea (SC), ocular (OC) e oral (VO). O controle negativo foi o mesmo para os dois experimentos. Os tratamentos do Experimento 1 (Vias de Administração) foram: T2(SC), T3(OC) e T4(VO). O experimento onde as aves foram desafiadas por Escherichia coli foi o Experimento 2 (β-glucano e Escherichia coli). As mesmas vias de inoculação foram também estudadas nestes tratamentos, assim: T5 (controle positivo) foi desafiado e não recebeu o β-glucano solúvel, T6(SC+EC), T7(OC+EC) e T8(VO+EC). O desafio foi realizado com E. coli sorotipo O119, por via saco aéreo torácico direito aos 14 dias de idade, sendo que cada ave recebeu 4x106 UFC. As aves foram pesadas semanalmente para a análise dos parâmetros zootécnicos e toda ração adicionada foi pesada. Aos 28, 35 e 42 dias foi colhido sangue de todas as aves para se determinar por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA indireto) as concentrações séricas de IgG e IgA totais. Nas aves infectadas foi determinado o escore de lesão, analisando a intensidade das lesões em sacos aéreos, fígado e coração. No Experimento 1 (Vias de Inoculação) os resultados mostraram concentrações séricas de IgA nas aves do T4(OC) menores que nas aves dos demais tratamentos. Em relação a IgG as aves do T4(VO) apresentaram concentrações maiores que aquelas dos demais tratamentos. No Experimento 2 (β-glucano e Escherichia coli) as aves do T7(OC+EC) tiveram as menores concentrações de IgA e apresentaram a melhor viabilidade dentre as aves dos grupos desafiados. As aves do T6(SC+EC) apresentaram concentrações maiores de IgG aos 35 e 42 dias. Quanto ao escore de lesão houve redução no grau de lesão em todos os grupos que receberam o β- glucano solúvel, exceto no saco aéreo torácico direito. Sugere-se que o uso do β- glucano solúvel possa reduzir as lesões causadas por Escherichia coli. A administração por via ocular levou a melhor viabilidade nas aves desafiadas, apesar de ter menor produção de anticorpos IgA tanto nas aves infectadas como nas aves não desafiadas. Serão necessários mais estudos para se estabelecer melhor as ações imunomoduladoras do β-glucano nas aves. / The β-glucans are polysaccharides that possess immunomodulatory activity. The colibacillosis is a major disease of poultry; it contributes to great economic losses. Faced with the need to establish the action of soluble β-glucan in birds, two experiments were conducted. One to evaluate the effects of soluble β-glucan administered by different routes, in the production of serum IgA and IgG antibodies in zootechnical parameters and other infection in Escherichia coli (EC). The experiments were performed simultaneously in different warehouses, being housed 160 broilers Ross (Aviagen ®) from first to 42nd days of age. β-glucano soluble was administered on the first day, the dose of 215µg/bird on the following routes of administration: subcutaneous (SC), ocular (OC) and oral (PO). The negative control was the same for both experiments. The treatments of the experiment called Experiment 1 (Routes of Administration) were: T2 (SC), T3(OC) and T4(VO). The experiment where birds were challenged by Escherichia coli was termed Experiment 2 (β-glucan e Escherichia coli). The same routes of inoculation were also studied in these treatments, thus: T5 (positive control), was challenged and did not receive soluble β-glucan, T6(SC+EC), T7(OC+EC) and T8(VO+EC). The challenge was performed with E. coli serotype O119, through the right thoracic air sac at 14 days of age, each bird was given 4x106 CFU. The birds were weighed weekly for analysis of zootechnical parameters ration added and the whole was weighed. At 28, 35 and 42 days blood was collected from all birds to determine by Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) serum concentrations of total IgG and IgA. In birds infected was determined the injury score by analyzing the intensity of the lesions in air sacs, liver and heart. In the Experiment 1 (Routes of Inoculation) the results showed serum IgA in birds of T4(OC) smaller than the other treatments in birds. Regarding IgG the birds of T4(VO) had levels greater than those of other treatments. In Experiment 2 (β-glucan and Escherichia coli) birds of T7(OC+EC) had the lowest concentrations of IgA and showed the best viability among groups of birds challenged. Birds of T6(SC+EC) showed higher concentrations of IgG at 35 and 42 days. As for the injury score decreased the degree of injury in all groups receiving β- glucan soluble except in right thoracic air sac. It is suggested that the use of β-glucan soluble can reduce injuries caused by Escherichia coli. The administration by ocular route led to better viability challenged birds, despite having lower production of IgA in both the infected birds as the birds not challenged. Further studies are needed to better establish the immunomodulatory actions of β-glucan in birds.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-11-16T19:33:03Z No. of bitstreams: 1 ClaudiaSofiadeFreitasCorreiaPopovTeseParcial2017.pdf: 709320 bytes, checksum: 74c3fb3e34fa9828bc490124e9d19b7b (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-11-16T19:33:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ClaudiaSofiadeFreitasCorreiaPopovTeseParcial2017.pdf: 709320 bytes, checksum: 74c3fb3e34fa9828bc490124e9d19b7b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-16T19:33:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ClaudiaSofiadeFreitasCorreiaPopovTeseParcial2017.pdf: 709320 bytes, checksum: 74c3fb3e34fa9828bc490124e9d19b7b (MD5) Previous issue date: 2018-12-13 / Anurans represent a valuable source of bioactive molecules. These substances constitute a primary line of defense against predators and pathogenic microorganisms such as bacteria and fungi. Secreted peptides by granular glands represent a source of potential pharmacological agents with diverse functions. The structural and functional characterization of these biomolecules allows a better understanding of their function and biotechnological applications. Thus, in this work, the new peptides were isolated from H. raniceps with variable size between 11 and 16 amino acid residues, all of which contain two cysteines in their primary structure and with immunomodulatory activity: AC12, DK16 and RC11. A nuclear magnetic resonance analysis allowed to determinate a structure of these β-sheet molecules, as well as the presence of disulfide bridges that gives stability to the peptides. Regarding the structural analysis, none of the samples showed effective antimicrobial action. The immunomodulatory action profile of the samples was also checked. For this, a cytotoxicity essay of the molecules was initially tested. AC12 and DK16 did not reduce the viability of RAW 264.7 cells, decreasing inflammatory markers such as NO, IL-12 and TNF-α. They also decreased IL-10 production, a pro-inflammatory cytokine, but associated with several types of neoplasms. The peptide RC11 was shown to be toxic in RAW 264.7 strain. However, all samples were shown to be safe when tested at different concentrations in erythrocytes of Balb/c mice, presenting low hemolysis rates. In the in vivo tests, the three peptides reduced the paw edema caused by carrageenan, standing out the peptide AC12. Such data were corroborated by histological analysis of paw tissue. Regarding the immunomodulatory action with carrageenan-induced peritonitis assay, peptide AC12 was again the most significant, reducing the TNF-α dosed from the peritoneal lavage and increasing IL-10. In conclusion, AC12 has shown to be a good candidate as an anti-inflammatory agent, and could be used in the treatment of several inflammatory conditions. / Os anuros representam uma fonte valiosa de moléculas bioativas. Essas substâncias constituem a linha de defesa primária contra predadores e microrganismos patogênicos como bactérias e fungos. Peptídeos secretados pelas glândulas granulares representam uma fonte de potenciais agentes farmacológicos com funções diversas. A caracterização estrutural e funcional dessas biomoléculas permite um melhor entendimento da sua função e aplicações biotecnológicas. Assim, neste trabalho foram descritos três novos peptídeos isolados de H. raniceps com tamanho variável entre 11 e 16 resíduos de aminoácidos, todos eles contendo duas cisteínas na sua estrutura primária e com propriedades imunomoduladoras: AC12, DK16 e RC11. A análise por ressonância magnética nuclear permitiu determinar a estrutura dessas moléculas em folha-β, bem como a presença de pontes de dissulfeto que fornecem resistência e estabilidade às moléculas. Referente à análise estrutural, nenhuma das amostras mostrou ter ação antimicrobiana efetiva. Foi também verificado o perfil de ação imunomoduladora das amostras. Para tal, inicialmente foi testada a citotoxicidade das moléculas. AC12 e DK16 não alteraram a viabilidade das células RAW 264.7, diminuindo marcadores inflamatórios como NO, IL-12 e TNF-α. Também diminuíram a produção de IL-10, uma citocina pró-inflamatória, porém, associada a vários tipos de neoplasias. O peptídeo RC11 mostrou ser tóxico na linhagem RAW 264.7. Porém, todas as amostras mostraram-se seguras quando testadas em diferentes concentrações em eritrócitos de camundongos Balb/c, apresentando taxas de hemólise pouco significativas. Nos testes in vivo, os três peptídeos reduziram o edema da pata provocado por carragenina, sobressaindo o peptídeo AC12. Tais dados foram corroborados pela análise histológica do tecido da pata. Relativamente à ação imunomoduladora no ensaio de peritonite provocada por carragenina, novamente, o peptídeo AC12 teve destaque, reduzindo o TNF-α dosado do lavado peritoneal e aumentando a IL-10. Deste modo, o peptídeo AC12 mostrou ser um bom candidato a agente anti-inflamatório, podendo ser utilizado no tratamento de diversos quadros inflamatórios.

Os β- glucanos são polissacarídeos que possuem atividade imunomoduladora. A colibacilose é uma das principais doenças da avicultura, pois causa grandes perdas econômicas. Diante da necessidade de se estabelecer a ação do β-glucano solúvel nas aves, foram realizados dois experimentos. Um para se avaliar os efeitos do β-glucano solúvel, administrado por diferentes vias, na produção de anticorpos séricos IgA e IgG, nos parâmetros zootécnicos e outro na infecção por Escherichia coli (EC). Os experimentos foram realizados ao mesmo tempo, em galpões diferentes, sendo alojados 160 frangos de corte da linhagem Ross (Aviagen®), do primeiro ao 42o dia de idade. β-glucano solúvel foi administrado no primeiro dia, na dose de 215µg/ave, nas seguintes vias de administração: subcutânea (SC), ocular (OC) e oral (VO). O controle negativo foi o mesmo para os dois experimentos. Os tratamentos do Experimento 1 (Vias de Administração) foram: T2(SC), T3(OC) e T4(VO). O experimento onde as aves foram desafiadas por Escherichia coli foi o Experimento 2 (β-glucano e Escherichia coli). As mesmas vias de inoculação foram também estudadas nestes tratamentos, assim: T5 (controle positivo) foi desafiado e não recebeu o β-glucano solúvel, T6(SC+EC), T7(OC+EC) e T8(VO+EC). O desafio foi realizado com E. coli sorotipo O119, por via saco aéreo torácico direito aos 14 dias de idade, sendo que cada ave recebeu 4x106 UFC. As aves foram pesadas semanalmente para a análise dos parâmetros zootécnicos e toda ração adicionada foi pesada. Aos 28, 35 e 42 dias foi colhido sangue de todas as aves para se determinar por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA indireto) as concentrações séricas de IgG e IgA totais. Nas aves infectadas foi determinado o escore de lesão, analisando a intensidade das lesões em sacos aéreos, fígado e coração. No Experimento 1 (Vias de Inoculação) os resultados mostraram concentrações séricas de IgA nas aves do T4(OC) menores que nas aves dos demais tratamentos. Em relação a IgG as aves do T4(VO) apresentaram concentrações maiores que aquelas dos demais tratamentos. No Experimento 2 (β-glucano e Escherichia coli) as aves do T7(OC+EC) tiveram as menores concentrações de IgA e apresentaram a melhor viabilidade dentre as aves dos grupos desafiados. As aves do T6(SC+EC) apresentaram concentrações maiores de IgG aos 35 e 42 dias. Quanto ao escore de lesão houve redução no grau de lesão em todos os grupos que receberam o β- glucano solúvel, exceto no saco aéreo torácico direito. Sugere-se que o uso do β- glucano solúvel possa reduzir as lesões causadas por Escherichia coli. A administração por via ocular levou a melhor viabilidade nas aves desafiadas, apesar de ter menor produção de anticorpos IgA tanto nas aves infectadas como nas aves não desafiadas. Serão necessários mais estudos para se estabelecer melhor as ações imunomoduladoras do β-glucano nas aves. / The β-glucans are polysaccharides that possess immunomodulatory activity. The colibacillosis is a major disease of poultry; it contributes to great economic losses. Faced with the need to establish the action of soluble β-glucan in birds, two experiments were conducted. One to evaluate the effects of soluble β-glucan administered by different routes, in the production of serum IgA and IgG antibodies in zootechnical parameters and other infection in Escherichia coli (EC). The experiments were performed simultaneously in different warehouses, being housed 160 broilers Ross (Aviagen ®) from first to 42nd days of age. β-glucano soluble was administered on the first day, the dose of 215µg/bird on the following routes of administration: subcutaneous (SC), ocular (OC) and oral (PO). The negative control was the same for both experiments. The treatments of the experiment called Experiment 1 (Routes of Administration) were: T2 (SC), T3(OC) and T4(VO). The experiment where birds were challenged by Escherichia coli was termed Experiment 2 (β-glucan e Escherichia coli). The same routes of inoculation were also studied in these treatments, thus: T5 (positive control), was challenged and did not receive soluble β-glucan, T6(SC+EC), T7(OC+EC) and T8(VO+EC). The challenge was performed with E. coli serotype O119, through the right thoracic air sac at 14 days of age, each bird was given 4x106 CFU. The birds were weighed weekly for analysis of zootechnical parameters ration added and the whole was weighed. At 28, 35 and 42 days blood was collected from all birds to determine by Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) serum concentrations of total IgG and IgA. In birds infected was determined the injury score by analyzing the intensity of the lesions in air sacs, liver and heart. In the Experiment 1 (Routes of Inoculation) the results showed serum IgA in birds of T4(OC) smaller than the other treatments in birds. Regarding IgG the birds of T4(VO) had levels greater than those of other treatments. In Experiment 2 (β-glucan and Escherichia coli) birds of T7(OC+EC) had the lowest concentrations of IgA and showed the best viability among groups of birds challenged. Birds of T6(SC+EC) showed higher concentrations of IgG at 35 and 42 days. As for the injury score decreased the degree of injury in all groups receiving β- glucan soluble except in right thoracic air sac. It is suggested that the use of β-glucan soluble can reduce injuries caused by Escherichia coli. The administration by ocular route led to better viability challenged birds, despite having lower production of IgA in both the infected birds as the birds not challenged. Further studies are needed to better establish the immunomodulatory actions of β-glucan in birds.

Peptídeos de defesa do hospedeiro antimicrobiano (PDHA) são componentes do sistema imune inato podem ser expressos constitutivamente ou induzidos por componentes bacterianos, citocinas, ou a combinação de ambos. Estes peptídeos possuem ação direta sobre microrganismo e são potentes imunomoduladores de células de mamíferos. A microplusina é um peptídeo antimicrobiano quelante de cobre, originário do aracnídeo Tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus, com massa molecular de 10 204 Da. Este peptídeo possue atividade bacteriostática sobre Micrococcus luteus, mas sem atividade microbicida sobre E. coli e Candida albicans. Neste trabalho foi analisado o efeito direto da microplusina em cultura de macrófagos derivados de medula óssea (MDM) tratados ou não com LPS ou IFN-&#947. Foi demonstrado que este peptídeo não teve efeito citotóxico para macrófagos, não estimulou a síntese de NO e IL-1&#946, mas aumentou a produção de TNF-&#945 e IL-6 após estímulo. O pré-tratamento dos macrófagos com microplusina, antes da adição do LPS, não modificou o nível de nitrito, TNF-&#945 ou IL-6 em resposta ao LPS. Quando os macrófagos foram pré-tratados com microplusina e posteriormente incubados com IFN-&#947 houve aumento significativo da produção de NO e TNF-&#945, confirmando a natureza pró-inflamatória deste peptídeo. Isto indica que a microplusina é um agente imunomodulador da resposta imune inata e pode auxiliar no controle de infecções por microrganismos patogênicos. / Antimicrobial host defense peptides are components of the innate immune system. They are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines or the combination of both are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines, or a combination of both. These peptides have direct action on microorganisms and are potent immunomodulators in mammalian cells. Microplusin is a copper II-chelating antimicrobial peptide from the Tick Rhipicephalus ( Boophilus) microplus, with a molecular mass of 10 204 Da. This peptide has a bacteriostatic activity against Micrococcus luteus, but no activity against E. coli and Candida albicans. The aim of the present work was to analyze the direct effect of microplusin in the culture of murine bone marrow derivated macrophages (BDM) treated or not with LPS or IFN-&#947. Our data showed that microplusin had no cytotoxic effect on macrophages, did not stimulate the synthesis of NO and IL-1&#946, but increased the production of TNF-&#945 and IL-6 after stimulation. The pre-treatment of macrophages with microplusin before LPS addition did not change the level of nitrite, TNF-&#945 or IL-6 in response to LPS. If the microplusin pre-treated macrophages were incubated with IFN-&#947 there was evidence that microplusin led to significant increase of NO and TNF-&#945 production confirming the pro-inflammatory characteristic of microplusin and its potential against pathogenic microorganisms. This indicates microplusin to be a potential immunomodulating agent of innate immunity and may help to control infections by pathogenic microorganisms.

Peptídeos de defesa do hospedeiro antimicrobiano (PDHA) são componentes do sistema imune inato podem ser expressos constitutivamente ou induzidos por componentes bacterianos, citocinas, ou a combinação de ambos. Estes peptídeos possuem ação direta sobre microrganismo e são potentes imunomoduladores de células de mamíferos. A microplusina é um peptídeo antimicrobiano quelante de cobre, originário do aracnídeo Tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus, com massa molecular de 10 204 Da. Este peptídeo possue atividade bacteriostática sobre Micrococcus luteus, mas sem atividade microbicida sobre E. coli e Candida albicans. Neste trabalho foi analisado o efeito direto da microplusina em cultura de macrófagos derivados de medula óssea (MDM) tratados ou não com LPS ou IFN-&#947. Foi demonstrado que este peptídeo não teve efeito citotóxico para macrófagos, não estimulou a síntese de NO e IL-1&#946, mas aumentou a produção de TNF-&#945 e IL-6 após estímulo. O pré-tratamento dos macrófagos com microplusina, antes da adição do LPS, não modificou o nível de nitrito, TNF-&#945 ou IL-6 em resposta ao LPS. Quando os macrófagos foram pré-tratados com microplusina e posteriormente incubados com IFN-&#947 houve aumento significativo da produção de NO e TNF-&#945, confirmando a natureza pró-inflamatória deste peptídeo. Isto indica que a microplusina é um agente imunomodulador da resposta imune inata e pode auxiliar no controle de infecções por microrganismos patogênicos. / Antimicrobial host defense peptides are components of the innate immune system. They are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines or the combination of both are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines, or a combination of both. These peptides have direct action on microorganisms and are potent immunomodulators in mammalian cells. Microplusin is a copper II-chelating antimicrobial peptide from the Tick Rhipicephalus ( Boophilus) microplus, with a molecular mass of 10 204 Da. This peptide has a bacteriostatic activity against Micrococcus luteus, but no activity against E. coli and Candida albicans. The aim of the present work was to analyze the direct effect of microplusin in the culture of murine bone marrow derivated macrophages (BDM) treated or not with LPS or IFN-&#947. Our data showed that microplusin had no cytotoxic effect on macrophages, did not stimulate the synthesis of NO and IL-1&#946, but increased the production of TNF-&#945 and IL-6 after stimulation. The pre-treatment of macrophages with microplusin before LPS addition did not change the level of nitrite, TNF-&#945 or IL-6 in response to LPS. If the microplusin pre-treated macrophages were incubated with IFN-&#947 there was evidence that microplusin led to significant increase of NO and TNF-&#945 production confirming the pro-inflammatory characteristic of microplusin and its potential against pathogenic microorganisms. This indicates microplusin to be a potential immunomodulating agent of innate immunity and may help to control infections by pathogenic microorganisms.

O agregado proteico P-MAPA apresentou potencial imunomodulatório em diversos estudos, mas a sua ação sobre o sistema complemento e receptores do tipo Toll (TLRs) não é, ainda, conhecida. Neste estudo o P-MAPA promoveu ativação das vias clássica e alternativa do sistema complemento e produção de C3a e C5a. Utilizando um modelo ex vivo de sangue total humano, o composto promoveu aumento da expressão de CD11b e CD14, diminuição da expressão de C5aR, TLR2 e TLR4, em leucócitos de sangue periférico e também quando combinado com LPS, porém não promoveu alterações na expressão de C3aR. O P-MAPA induziu redução de IFN-g no plasma, aumento da produção de TNF-α, IL-8, IL-12 e peróxinitrito, mas não induziu produção de superóxido, IL-6, IL-1β, TGF-β ou IL-10. Por meio de testes in vivo, foi possível determinar a dose letal do P-MAPA. Em conjunto, os dados obtidos mostram que o P-MAPA apresenta ação pró-inflamatória em modelo ex vivo de sangue total humano e que o tratamento combinado com LPS leva a uma amplificação dos seus efeitos. / P-MAPA, a protein aggregate has been described as a promising immunomodulator, however, its role on the complement system and Toll-like receptors (TLRs) is unknown. In the study, P-MAPA has promoted activation of the complement\'s classical and alternative pathways and the production of C3a and C5a. Using an ex vivo model of human whole blood, the compound promoted increase of CD11b and CD14 expression, decrease of C5aR, TLR2 and TLR4, in peripheral blood leucocytes and when combined with LPS, but did not change C3aR expression. P-MAPA promoted reduction of IFN-g in plasma, increased production of TNF-α, IL-8, IL-12 and peroxynitrite, but did not induce the production of superoxide, IL-6, IL-1β, TGF-β or IL-10. Through in vivo tests, we were able to determine a lethal dose for P-MAPA. Altogether, our data indicate that P-MAPA has proinflammatory action in ex vivo model of human whole blood and that the treatment combined with LPS leads to amplification of its effects.

O agregado proteico P-MAPA apresentou potencial imunomodulatório em diversos estudos, mas a sua ação sobre o sistema complemento e receptores do tipo Toll (TLRs) não é, ainda, conhecida. Neste estudo o P-MAPA promoveu ativação das vias clássica e alternativa do sistema complemento e produção de C3a e C5a. Utilizando um modelo ex vivo de sangue total humano, o composto promoveu aumento da expressão de CD11b e CD14, diminuição da expressão de C5aR, TLR2 e TLR4, em leucócitos de sangue periférico e também quando combinado com LPS, porém não promoveu alterações na expressão de C3aR. O P-MAPA induziu redução de IFN-g no plasma, aumento da produção de TNF-α, IL-8, IL-12 e peróxinitrito, mas não induziu produção de superóxido, IL-6, IL-1β, TGF-β ou IL-10. Por meio de testes in vivo, foi possível determinar a dose letal do P-MAPA. Em conjunto, os dados obtidos mostram que o P-MAPA apresenta ação pró-inflamatória em modelo ex vivo de sangue total humano e que o tratamento combinado com LPS leva a uma amplificação dos seus efeitos. / P-MAPA, a protein aggregate has been described as a promising immunomodulator, however, its role on the complement system and Toll-like receptors (TLRs) is unknown. In the study, P-MAPA has promoted activation of the complement\'s classical and alternative pathways and the production of C3a and C5a. Using an ex vivo model of human whole blood, the compound promoted increase of CD11b and CD14 expression, decrease of C5aR, TLR2 and TLR4, in peripheral blood leucocytes and when combined with LPS, but did not change C3aR expression. P-MAPA promoted reduction of IFN-g in plasma, increased production of TNF-α, IL-8, IL-12 and peroxynitrite, but did not induce the production of superoxide, IL-6, IL-1β, TGF-β or IL-10. Through in vivo tests, we were able to determine a lethal dose for P-MAPA. Altogether, our data indicate that P-MAPA has proinflammatory action in ex vivo model of human whole blood and that the treatment combined with LPS leads to amplification of its effects.

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Devido à similaridade clínica e histopatológica com esta doença, a encefalomielite autoimune experimental (EAE) apresenta um modelo clínico experimental amplamente aceito da EM, devido ao fato de ambos terem processos fisiopatológicos mediados por células Th1 e citocinas pró-inflamatórias, como Interferon-gama (INF-γ), Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e, mais recentemente, células Th17, produtores principalmente de IL-17, e radicais oxigenados, como NO e H2O2 produzidos principalmente por células fagocitárias. Os medicamentos hoje utilizados para a EM atuam sobre esses mediadores inflamatórios, porém, apresentam inconvenientes como, custo elevado e/ou efeitos adversos pronunciados. Devido a isso, a pesquisa por novas drogas para o tratamento da EM, concentra-se em substâncias que sejam capazes de modular a produção desses mediadores inflamatórios com maiores vantagens para o paciente. No presente estudo a EAE foi induzida em camundongos fêmeas da linhagem C57BL/6 com a MOG35-55 e os animais foram tratados com a Licochalcona A (isolado e purificado a partir da Glycyrhizza inflata) em doses de 15 e 30 mg/kg/dia e com o trans-cariofileno (obtido comercialmente em doses de 25 e 50 mg/kg/dia por gavagem (via oral) a partir do 10° dia até o pico dos sintomas clínicos da doença. Para verificar o efeito deste tratamento os seguintes parâmetros foram utilizados: avaliação clínica dos animais, realizada diariamente através da pesagem e pontuação dos escores neurológicos; análise histopatológica por hematoxilina e eosina do tecido cerebral e medula espinhal; produção de NO, avaliada pelo método de Griess; produção de H2O2, pelo método de Pick & Mizel, ambos em cultura de células peritoneais;níveis de IFN-γ, IL-17, TNF-α, quantificados por ELISA no sobrenadante de cultura de esplenócitos. O resultados mostraram que tanto a Licochalcona A, como principalmente o trans-cariofileno nas maiores doses administradas causaram redução significativa na neuroinflamação e desmielinização no SNC. Os níveis de NO, H2O2, IFN-γ, IL-17, TNF-α também apresentaram acentuada redução estando correlacionados com a melhoria dos sintomas clínicos. Os resultados sugerem que a Licochalcona A e o trans-cariofileno podem modular a produção de mediadores inflamatórios, interferindo sobre a patogênese da EAE. Tais substâncias podem ser instrumentos importantes para o tratamento de doenças desmielinizantes inflamatórias do SNC, tais como a EAE, o modelo clínico experimental mais utilizado para a esclerose múltipla. / The multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) with features to be chronic, progressive, inflammatory and demyelinating. Due to the clinical and histopathological similarity with experimental autoimmune encephalomyelitis disease (EAE) this became a widely accepted study animal model of MS because both have pathophysiological processes involving Th1 cells and soluble pro-inflammatory cytokines such as Interferon-gamma (INF-γ), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and more recently Th17 cells, primarily producers of IL-17, oxygen free radicals as NO and H2O2 by phagocytic cells. Drugs currently used in fact act on these inflammatory markers but have many disadvantages such as high cost and/or pronounced adverse effects. Due to that, the search for new drugs to treat MS focuses on substances that are able to modulate the production of these inflammatory mediators with greater advantages to the pacient. In the present study EAE was induced in female mice C57BL6 lineage with the MOG35-55 and the animals were treated with Licochalcone A (isolated and purified from Glycyrhizza Inflata) in doses 15 and 30 mg/Kg/dia and with trans-caryophyllene (obtained commercially in doses of 25 and 50 mg/Kg/dia by gavage (oral administration) from day 10° until the peak of the clinical symptoms of the disease. To verify the effect of this treatment the following parameters were used: clinical evaluation, was made by a neurological score of symptoms and weighing; histopathological analysis, for hematoxylin and eosin staining of the brain and spinal cord tissue at the end of the experiment; production of NO, evaluated by Griess method; production of H2O2; by Pick Mizel, both in culture of peritoneal cells; quantification of IFN-γ, IL-17, TNF-α was made by ELISA on the surface of spleen cells culture. Both Licochalcone A, as mainly the trans-caryophyllene in higher doses caused significant reduction in neuroinflamação and demyelination in the CNS. The levels of NO, H2O2, IFN-γ, IL-17, TNF-α also showed sharp reduction being correlated with the improvement of clinical symptoms. The results suggest that the Licochalcone A and trans-caryophyllene can modulate the production of inflammatory mediators, interfering on the pathogenesis of EAE. Such substances may be important instruments for treatment of CNS demyelinating inflammatory diseases such as EAE, animal model more used for multiple sclerosis.

The species Acacia langsdorfii Benth is a tree with scarce geographical distribution not happening report in the literature regarding pharmacotherapeutics properties. The genus Acacia is the largest second in the family Leguminosae and one of the largest is considered in Angiospermas, presenting more of 1.200 species presenting cosmopolitan and typical character of semi-arid hot areas distributed in tropical and temperate hot areas of everyone. The objective of this work is to contribute to the knowledge of chemical composition and biological activity of extracts derived from the leaf and stem of Acacia langsdorfii Benth, hitherto not studied. Several species of Acacia are used traditionally for the treatment of many different diseases. However, of this species, only known to their extracts show immunomodulatory activity and trypanocidal. From the hexane fraction of the stem, was isolated, by chromatographic methods, a steroid and a triterpenoid which were identified as stigmasterol and lupeol, respectively. It was isolated and purified a mixture of triterpenoid of the lupane series (where one is lupeol). The lupeol is the chemical constituent majority. From the Hexane fraction of leaves, was isolated and purified a diterpenoid and triterpenoid, which were identified as ent-atisan-7α,16α-diol and lupeol, respectively. The lupeol is the chemical constituent majority. In addition, from the ethyl acetate fraction of leaves was isolated and purified by column chromatography, two flavan-3-ols, one flavanone and two flavones which were identified by spectroscopic techniques such as catechin, epicatechin, naringenin, 4'-hydroxy-5,6,7-trimethoxyflavone and morin-3-O-rutinoside, respectively. The morin-3-Orutinoside is the chemical constituent majority of this fraction. The structures were identified using spectroscopic techniques of IR, MS, 1D and 2D NMR (H1, C13, DEPT 90 °, 135 °, DEPT, COSY, HSQC, HMBC and NOESY), and determinations of the melting point, rotation optical and comparisons with literature data. Substances ent-atisan-7α,16α-diol, morin-3-O-rutinoside, 4'-hydroxy-5 ,6,7-trimethoxyflavone were first reported in the genus. The hexane fractions derived from both the stem and leafs showed a high rate (> 90%) inhibits activity the proliferation of Plasmodium falciparum. The fractions derived from both the stem and leafs showed a high rate (> 80%) inhibits activity the linfoproliferation. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A espécie Acacia langsdorfii Benth é uma árvore com distribuição geográfica escassa não ocorrendo registro na literatura quanto às suas propriedades fármaco-terapêuticas. O gênero Acacia é o segundo maior na família Leguminosae e é considerado um dos maiores nas Angiospermas, apresentando mais de 1.200 espécies apresentando caráter cosmopolita e típico de regiões quentes semi-áridas distribuídas em regiões quentes tropicais e temperadas de todo o mundo. O objetivo deste trabalho é contribuir para o conhecimento da composição química e da atividade biológica dos extratos oriundos da folha e do caule da espécie Acacia langsdorfii Benth, até então não estudada. Diversas espécies de Acacia são utilizadas tradicionalmente para o tratamento das mais diferentes patologias. Porém, Não há registro na literatura quanto às propriedades fármaco-terapêuticas desta espécie, apenas sabe-se que seus extratos apresentaram atividade imunomoduladora e tripanocida. Da fração de hexano do caule foram isolados, por métodos cromatográficos, um esteróide e um triterpenóide, os quais foram identificados como sendo estigmasterol e lupeol, respectivamente. Também foi isolado e purificado uma mistura contendo triterpenóides da série lupano (onde um é o lupeol). Da fração hexânica das folhas foi isolado e purificado um diterpenóide e um triterpenóide, os quais foram identificados como sendo ent-atisan-7α,16α-diol e lupeol, respectivamente. Além disso, da fração acetato de etila das folhas foi isolado e purificado por cromatografia em coluna dois flavan-3-óis, uma flavanona e duas flavonas as quais foram identificadas por técnicas espectroscópicas como sendo catequina, epicatequina, naringenina, 4’-hidroxi-5,6,7-trimetoxiflavona e morina 3-O-rutinosídeo respectivamente. A morina 3-O-rutinosídeo é o constituinte químico majoritário desta fração. As estruturas foram identificadas com o uso de técnicas espectroscópicas de IV, RMN 1D e 2D (H1, C13, DEPT 90°, DEPT 135°, COSY, HSQC, HMBC e NOESY) e espectrométrica (EM), além de determinações do ponto de fusão, rotação óptica e comparações com dados da literatura. As substâncias ent-atisan-7α,16α-diol, morina 3-O-rutinosídeo, 4’-hidroxi-5,6,7-trimetoxiflavona foram relatadas pela primeira vez no gênero. As frações oriundas do hexano, tanto do caule como em folhas, apresenta um alto índice (> 90%) de atividade inibidora da proliferação do Plasmodium falciparum. As frações obtidas da partição do extrato em etanol das folhas e caule da A. langsdorfii apresentaram uma alta inibição da linfoproliferação (>80%).