La inestabilitat genòmica, característica intrínseca de la majoria de cèl·lules tumorals, es defineix com la capacitat que presenta una cèl·lula de generar alteracions genètiques a un ritme elevat, tenint com a conseqüència la generació d'una elevada heterogeneïtat cel·lular. Des de l'inici de l'estudi de la inestabilitat genòmica, el càncer colorectal ha esdevingut un estereotip del comportament de les cèl·lules tumorals. El càncer colorectal pot ser subdividit en dues formes diferents: els que presenten inestabilitat de microsatèl·lits (MSI) i són majoritàriament diploides, i els caracteritzats per cariotips poliploides i amb inestabilitat cromosòmica (CIN). Una part important del treball ha estat basat en l'ús de línies cel·lulars de càncer de còlon humanes. Una de les línies més utilitzades com a model de CIN és la línia cel·lular SW480. L'aplicació de les tècniques M-FISH, la cenM-FISH i mMCB va permetre descriure el cariotip molecular amb alteracions que prèviament no havien estat identificades i definir els punts de trencament (Camps et al., 2004, Oncol Rep).Per estudiar la interrelació entre la inestabilitat de microsatèl·lits i la inestabilitat cromosòmica vam utilitzar les línies de càncer de còlon KM12 com a model cel·lular, concloent que ambdós subtipus d'inestabilitats podien coexistir en una mateixa cèl·lula (Camps et al., 2004, Int J Cancer). Aquest model també ens va servir per demostrar l'evolució cariotípica de les cèl·lules originàries del tumor de còlon i les poblacions altament metastàtiques a fetge, concloent que la tetraploïdia era un fenomen genotípic clau per explicar les condicions fenotípiques de la metàstasi.Mitjançant tècniques de citogenètica molecular vam quantificar la inestabilitat cromosòmica, tant la numèrica com l'estructural, de dues línies cel·lulars de càncer de còlon, la HCT-116 (amb MSI), i la SW480 (amb CIN). Per abordar la inestabilitat cromosòmica estructural, ens vam centrar en l'estudi de les reorganitzacions cromosòmiques no clonals per cada divisió cel·lular. Per altra banda, per l'estudi de la inestabilitat numèrica vam recórrer a l'obtenció de cèl·lules binucleades. Aquests experiments ens van donar una idea del dinamisme amb el qual les alteracions numèriques tenien lloc en la línia cel·lular SW480 i els seus subclons. Alhora, ens van permetre deduir quin era l'origen més freqüent de les aneuploïdies en aquestes cèl·lules, la no-disjunció o la pèrdua anafàsica. La línia cel·lular HCT-116, cromosòmicament estable, presentava unes taxes d'alteracions estructurals i d'aneuploïdia molt baixes. Els resultats d'aquest treball ens van permetre demostrar que la inestabilitat cromosòmica numèrica era invariable entre la línia cel·lular parental SW480 i els seus subclons, però per altra banda, la taxa d'inestabilitat cromosòmica estructural augmentava dràsticament quan es generaven els sublcons a partir d'una sola cèl·lula (Camps et al., 2005, FASEB J). Aquests resultats explicarien l'heterogeneïtat estructural que presenten les cèl·lules tumorals in vivo, possible origen de les diferents subpoblacions cel·lulars, i l'elevada taxa d'aneuploïdia.Finalment, vam utilitzar un total de trenta-un tumors de còlon per analitzar les diferències genòmiques i els patrones d'expressió entre tumors que presentaven inestabilitat de microsatèl·lits i tumors que no la presentaven. La utilització de la hibridació genòmica comparada convencional i sobre microxips de cDNA van permetre descriure alteracions genòmiques amb una gran precisió i identificar gens que podrien estar involucrats en la carcinogènesis colorectal (Camps et al., 2006, Carcinogenesis). Alguns dels gens proposats i associats per primera vegada amb el càncer de còlon són RASA1 y FER, y DPEP1, localitzats en les bandes citogenètiques 5q13q21 y 16q24.3, respectivament.

ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated) i DNA-PKcs (DNA-dependent Protein Kinase, catalytic subunit) són dues proteïnes que pertanyen a la família de les PIKKs (PhosphatidylInositol 3-Kinase-related Kinase) i ambdues desenvolupen funcions importants en la via de resposta al dany en el DNA (DDR). ATM i DNA-PKcs són activades en resposta als trencaments de doble cadena del DNA (DSBs) que es produeixen a conseqüència de l'actuació de múltiples factors, entre ells les radiacions ionitzants. Un cop activades, les dues cinases realitzen funcions diferents -però significativament complementàries- en aquesta via: ATM és capaç de: (1) aturar el cicle cel·lular en qualsevol fase; (2) activar diverses proteïnes implicades en la via de reparació homòloga (HR) del DNA i (3) induir l'activació de la via de l'apoptosi cel·lular en cas que el dany sigui massiu i/o irreparable. Per la seva part DNA-PKcs és una proteïna mestra de la via de reparació no homòloga del DNA (NHEJ), on activa i regula a la resta de factors participants d'aquesta via. Finalment DNA-PKcs també pot induir la via de l'apoptosi en resposta a un dany massiu. L'absència d'alguna d'aquestes dues cinases comporta, en els individus afectes, l'aparició de síndromes d'inestabilitat cromosòmica caracteritzats per una major probabilitat de desenvolupar processos cancerígens. Les cèl·lules derivades dels individus afectes són extremadament radiosensibles i acumulen aberracions cromosòmiques. L'objectiu d'aquesta tesi doctoral és determinar quins factors contribueixen de manera específica a la radiosensibilitat i a la inestabilitat cromosòmica de les cèl·lules deficients en ATM i en DNA-PKcs. Per assolir aquest objectiu es va analitzar: (1) l'espectre d'aberracions radio-induïdes en ambdós tipus cel·lulars; (2) l'evolució i resolució d'aquestes aberracions al llarg del temps; (3) la possible implicació del metabolisme telomèric en aquestes aberracions i (4) la cinètica de reunió de DSBs de les cèl·lules deficients en ATM i la de les cèl·lules deficients en DNA-PKcs. Després de ser irradiats, ambdós tipus cel·lulars acumulen un nombre significativament elevat d'aberracions cromosòmiques. El metabolisme telomèric només contribueix de manera marginal a la inestabilitat cromosòmica en cèl·lules deficients en DNA-PKcs i no té repercussions en la línia cel·lular deficient en ATM emprada en aquest estudi. En analitzar la cinètica de reunió dels DSBs radio-induïts es va fer palès que la deficiència en DNA-PKcs indueix un alentiment de la mateixa. Una reparació més lenta de les lesions en el DNA afavoreix (1) l'acumulació de fragments cromosòmics i, alhora, (2) la reunió il·legítima dels mateixos. La cinètica alentida explica l'ampli espectre d'aberracions radio-induïdes obtingut en aquestes cèl·lules així com la seva persistència en el temps, esdevenint el principal factor responsable de la radiosensibilitat i inestabilitat cromosòmica en cèl·lules deficients en DNA-PKcs. En canvi les cèl·lules deficients en ATM reparen la majoria dels DSBs radio-induïts amb una cinètica comparable a la de les cèl·lules normals, però una fracció dels trencaments roman sense reparar inclús a llargs temps post-irradiació. Per tant, l'acumulació de trencaments pendents de ser reparats a llargs temps post-irradiació (48 i 72 h) apareix com el principal factor responsable de la radiosensibilitat i inestabilitat cromosòmica d'aquestes cèl·lules. Però com s'explica la persistència d'aquests trencaments durant vàries divisions post-irradiació? Un cop descartat un alentiment de la cinètica de reparació ens varem plantejar la possibilitat de que l'absència d'ATM impedís la correcta detecció d'aquests DSBs. Per tal d'avaluar aquesta hipòtesi es va realitzar un anàlisi de la presència de γH2AX i Mre11 en els extrems cromosòmics trencats. La majoria de les delecions cromosòmiques presents en les cèl·lules deficients en ATM presenten marcatge amb les dues proteïnes en el punt de trencament, però una fracció considerable de les mateixes (25%) no presenta cap tipus de marcatge. El resultat obtingut suggereix que els trencaments no senyalitzats no estan essent correctament detectats i que la maquinària de reparació no és activa en ells. Proposem que l'acumulació de trencaments pendents de reparar són una característica de les cèl·lules deficients en ATM, i que aquesta acumulació contribueix de manera important a la seva radiosensibilitat i inestabilitat cromosòmica. Mentre que la fracció de trencaments correctament senyalitzats per γH2AX i Mre11 podrà ser reparada al llarg del temps, la fracció de trencaments sense senyalitzar podria romandre sense reparar durant temps indefinit, contribuint especialment a la inestabilitat cromosòmica d'aquestes cèl·lules. / ATM (Ataxia-Telangiectasia Mutated) and DNA-PKcs (DNA-dependent Protein Kinase, catalytic subunit) belong to the PIKKs (PhosphatidylInositol 3-Kinase-related Kinase) family, and both proteins develop important functions in the DNA damage response pathway (DDR). ATM and DNA-PKcs are activated by the presence of DNA double strand breaks (DSBs), which are produced by multiple factors, ionizing radiations among these. Once activated, both kinases display different -but significantly complementary- functions in the DDR: ATM is able to: (1) halt the cell cycle; (2) activate several proteins implicated in the homologous repair pathway (HR) and (3) if the cell harbours massive and/or irreparable damage, ATM can initiate the apoptosis pathway. Meanwhile, DNA-PKcs is a master protein belonging to the non homologous end joining repair pathway (NHEJ), where it activates and regulates the remaining factors implied in this repair pathway. Finally, if the cell carries extensive damage DNA-PKcs can also induce the apoptosis pathway. Individuals affected by the absence of either kinase develop chromosomal instability syndromes, which are characterized by a special cancer predisposition. Cells obtained from the affected individuals are extremely radiosensitive and accumulate chromosomal aberrations.The main goal of this doctoral thesis is to determine which factors specifically contribute to the radiosensitivity and chromosomal instability of ATM and DNA-PKcs deficient cells. In order to attain this goal we analyzed: (1) the spectrum of radio-induced aberrations in both cell types; (2) the evolution and resolution of these aberrations over time; (3) the possible implication of telomeric metabolism in these aberrations and (4) the DSBs joining kinetics of ATM and DNA-PKcs deficient cells.After irradiation both cellular types accumulate a significant number of chromosomal aberrations. While telomeric metabolism contributes -although only marginally- to the chromosomal instability in DNA-PKcs deficient cells, it has no influence on the ATM deficient cell line employed in this study. Analysis of the DSBs joining kinetics demonstrates that DNA-PKcs deficiency induces a delay in the repair kinetics of radio-induced lesions. Slower DNA repair favours the accumulation of chromosomal fragments as well as their illegitimate joining displayed by DNA-PKcs deficient cells. Thus, the slower repair kinetics explain the broad aberration spectrum obtained in these cells, as well as their persistence in time, revealed to be the main factor responsible for radiosensitivity and chromosomal instability in DNA-PKcs deficient cells. On the other hand, ATM deficient cells are able to repair the majority of the radio-induced DSBs with normal joining kinetics except for a fraction of breaks, which remain unrepaired even at long post-irradiation times. Therefore, the accumulation of unrepaired breaks at long post-irradiation times (48 and 72 hr) is revealed to be the main factor responsible for the radiosensitivity and chromosomal instability of AT cells. But how can the persistence of these breaks in an unrepaired state during several cell divisions be explained? After discarding a delayed DSBs joining kinetic, we reflected upon the possibility of the absence of ATM preventing proper detection of unrepaired DSBs. In order to evaluate this hypothesis we analysed the presence of γH2AX and Mre11 signalling in the broken chromosome ends scored in AT cells. The majority of the chromosome deletions displayed both γH2AX and Mre11 labelling at the break point, but a significant fraction (25%) was devoid of any labelling. The results obtained suggest that unlabelled breaks are not being correctly detected and that the cell repair machinery is not active on them. We propose that the accumulation of breaks waiting for efficient repair is a hallmark of ATM deficient cells, and that this accumulation makes a major contribution to their radiosensitivity and chromosomal instability. While the fraction of correctly γH2AX and Mre11-labelled breaks will eventually be repaired, the fraction of unlabelled breaks remains invisible to the DNA damage repair machinery, thus especially contributing to the chromosomal instability of these cells.

Les mutacions germinals en el gen APC són les responsables de la majoria de casos de poliposi adenomatosa familiar. APC participa en diferents processos cel·lulars que inclouen la regulació del cicle cel·lular, l'apoptosi, l'adhesió cel·lular, la migració cel·lular, la transducció de senyals, l'acoblament de microtúbuls i la segregació dels cromosomes. Encara que tots aquests processos estan potencialment lligats amb el càncer, sembla que la funció supressora tumoral del gen resideix en la seva capacitat per regular de manera acurada els nivells intracel·lulars de la β-catenina, component central de la via de Wnt. Aquesta via és important en el desenvolupament embrionari per determinar llinatges cel·lulars específics i en l'homeòstasi cel·lular de determinats teixits com la mucosa intestinal. A part del seu paper clau en la via de Wnt, APC participa en la inestabilitat cromosòmica del càncer colorectal, encara que els mecanismes concrets a través dels quals actua són encara desconeguts en bona part. Els resultats descrits en els tres capítols d'aquesta tesi donen lloc al concepte global que és en les lesions benignes del còlon, els adenomes, ja siguin de pacients de FAP com de càncer colorectal esporàdic, on s'acumulen gran nombre d'alteracions genètiques que afecten a mecanismes molt diversos del funcionament cel·lular, essent especialment importants aquelles alteracions que afecten a la via de Wnt. Totes les alteracions detectades permeten la progressió tumoral ja que afecten a la proliferació, mitosi i moltes altres funcions importants per la cèl·lula. El coneixement de les alteracions moleculars que afecten als adenomes és important per proporcionar més evidències dels mecanismes moleculars i cel·lulars implicats en els primers estadis de la progressió tumoral i donar lloc a noves estratègies de diagnòstic precoç i teràpies preventives, tan importants en la lluita contra el càncer. / Classical Familial Adenomatous Polyposis (FAP) syndrome is caused by APC germline mutations. APC plays important roles in different cellular processes such as cell cycle regulation, apoptosis, cellular adhesion, cellular migration, signal transduction, microtubule binding and chromosome segregation. Although all these processes are potentially related to cancer, it seems that the main tumoral suppressor activity is mediated by its capacity to accurately regulate the β-catenin intracellular levels, which is a central member of the Wnt signalling pathway. This pathway is important in the embryonic development and in cellular homeostasis in certain tissues such as intestinal mucosa. In colorectal cancer, APC is not only believed to be playing a key role in Wnt signalling, but also it is important in chromosomal instability (CIN), although the mechanisms in which APC is participating are still largely unknown.The results presented in this thesis and divided in 3 chapters give us the general idea that in the benign lesions of the colon, called adenomas, in FAP and in sporadic colorectal cancer patients, is where a great number of genetic alterations are accumulated affecting different functional mechanisms in the cell. Those aberrations that alter the Wnt signalling pathway are especially important in the process of tumorigenesis. All the reported alterations enable the tumoral progression because they target proliferation, mitosis and other important functions of the cell. A better understanding of the molecular defects in adenomas is crucial to discover all the molecular and cellular mechanisms operating in the early stages of colorectal cancer and give clues for early diagnosis and prevention.

Tot i que la hipometilació global i regional del DNA va ser la primera alteració epigenètica detectada en tumors, les dificultats en el seu estudi, així com la manca de metodologies específiques que en permetin un anàlisi detallat, han fet que desconeguem en gran mesura els efectes que aquest fenomen té per a la cèl·lula tumoral. En aquesta tesi ens vàrem proposar realitzar estudis globals i específics que permetessin establir possibles associacions entre la hipometilació i la inestabilitat genètica en tumors primaris humans. En primer lloc es va dur a terme la caracterització dels patrons de metilació globals en una sèrie de tumors colorectals. Aquest anàlisi ens va permetre observar una correlació positiva entre el grau de desmetilació dels tumors primaris i el nombre d'alteracions cromosòmiques que aquests acumulen. Per a continuar aprofundint en l'estudi de la hipometilació en tumors, i donada la manca de metodologies específiques per a realitzar aquesta mena d'estudis, ens vàrem proposar desenvolupar una nova metodologia d'anàlisi de la metilació, centrada en l'anàlisi dels elements repetitius dispersos Alu, els quals contenen una fracció important de la metilació del DNA en humans. Així es com va sorgir la nova metodologia Amplification of UnMethylated Alu (AUMA), recollida en el segon treball. L'aplicació d'AUMA a una sèrie de tumors colorectals ens ha permès identificar elements repetitius Alu desmetilats al llarg de tot el genoma i també ens ha permès identificar elements Alu amb alteracions de la metilació en tumors. Un anàlisi bioinformàtic paral·lel ens ha permès complementar els resultats obtinguts experimentalment. En aquest treball hem desenvolupat també una nova metodologia de quantificació d'elements Alu desmetilats, la qual hem anomenat Quantification of UnMethylated Alu (QUMA) i de la qual no hi ha cap precedent en la literatura. De l'estudi d'una de les alteracions de la metilació detectades en patrons AUMA n'ha sorgit el tercer treball d'aquesta tesi. En aquest cas hem fixat la nostra atenció en un element repetitiu MIR desmetilat en teixit normal, el qual s'hipermetila en tumors amb una elevada freqüència. L'estudi de l'estat de metilació de les illes CpG dels gens adjacents a aquest element MIR ens ha conduït a la identificació de 8 noves illes CpG hipermetilades en tumors i línies cel·lulars de càncer colorectal. L'anàlisi de les modificacions d'histones associades al silenciament d'aquests gens ens ha permès identificar patrons de cromatina molt semblants als descoberts recentment en cèl·lules mare embrionàries, connectant així la biologia de les cèl·lules mare amb el desenvolupament del càncer. / Although hypomethylation was the first tumor-associated DNA methylation alteration in tumors to be discovered, its role in tumorigenesis has remained basically unexplored, mainly due to the lack of specific methodologies of study. In the first work, we performed a global analysis of DNA methylation and genetic alterations in a series of colorectal tumors. Results indicate that a positive correlation exists between the degree of DNA hypomethylation and the number of genetic alterations that a tumor cell accumulates. In order to gain insight into the role that DNA hypomethylation might play in tumor development, we proposed to develop new methodologies that would allow performing both global and specific analyses of DNA hypomethylation, constituting the second work in this thesis. The new methodology mainly targets Alu repeats, which have been previously found to be heavily methylated in most somatic tissues, and has been therefore named Amplification of unMethylated Alu (AUMA). AUMA application to a series of primary colorectal tumors allowed the genome-wide identification of multiple unmethylated Alu elements in normal tissues, as well as Alu elements with altered methylation patterns in tumors. We also aimed to develop a quantification method, which was named Quantification of UnMethylated Alu (QUMA). Both AUMA and QUMA experimental results were complemented using a bioinformatic approach, which indicated that there is a stronger pressure to methylate younger Alu elements, among which there are elements able to retrotranspose. In a third work, we focused on the specific analysis of an AUMA target. A MIR element unmethylated in normal colorectal mucosa was found to undergo extensive hypermethylation in a large proportion of tumors. DNA methylation analysis of promoter CpG methylation of genes around the MIR element allowed the identification of 8 clustered genes whose CpG islands become hypermethylated in colorectal tumors and cell lines. Histone modification profiling across the promoters of the DNA methylated genes identified chromatin profiles that closely resemble those found in embryonic stem cells, therefore linking stem cells biology with cancer development.

La muñeca es una articulación compleja con un mecanismo de estabilización muy complicado. Se conocen bien las estructuras anatómicas que aseguran una correcta transmisión de cargas a través de ella de un modo estático, se ignoran, en cambio, muchos de los mecanismos dinámicos neuromusculares que modulan dicha transmisión de forma óptima. La evolución natural de una lesión ligamentosa que ocasiona inestabilidad en el carpo, suele ser una artrosis generalizada e incapacitante para el enfermo. Sin embargo, no son raros los casos en que una lesión ligamentosa no cursa con dolor ni causa una gran incapacidad funcional. En estos casos, se ha postulado la posibilidad de que la acción muscular ha compensado el fallo de función ligamentosa, evitando de esta manera que se produzca una inestabilidad articular. Para valorar la influencia que tienen los músculos periarticulares en la posición y orientación de los huesos del carpo cuando los ligamentos primarios fallan, hemos realizado un estudio con veinte antebrazos de cadáver criopreservados, que previamente no presentaban ninguna lesión ligamentosa ni ósea que pudiera alterar el resultado del estudio. Simulamos la contracción muscular mediante la carga axial de los músculos motores directos de la muñeca (FCR, FCU, APL, ECRL y ECU), de manera proporcional al área de sección fisiológica y actividad electromiográfica de cada músculo, antes y después de crear una inestabilidad escafolunar en diez antebrazos, y una inestabilidad lunopiramidal en otros diez. El movimiento que presentan los huesos del carpo se registra a través de un dispositivo de rastreo en las tres direcciones del espacio, mediante unos sensores colocados en escafoides, piramidal y hueso grande; comparamos situaciones similares de carga muscular, antes y después de cada inestabilidad con el test de Wilcoxon. En los casos con inestabilidad escafolunar, observamos que la acción de los músculos supinadores de la fila distal (ECRL y APL) no altera significativamente el movimiento de los huesos del carpo después de producir la disociación. El FCU, aunque es un supinador tiene un efecto negativo sobre esta articulación, ya que produce rotaciones opuestas en el escafoides y el piramidal aumentando la disociación. La contracción aislada del ECU, produce una pronación de la fila proximal y distal, que desestabiliza al escafoides en los tres planos del espacio, produciendo la típica subluxación rotatoria del escafoides. El FCR, aunque es un pronador de la fila distal y del piramidal, produce una supinación en el escafoides, con lo que provoca un acercamiento dorsal de la pareja piramidal-semilunar al escafoides, relajando la articulación, por lo que su efecto es beneficioso para este tipo de inestabilidad. En cuanto a la inestabilidad lunopiramidal, el efecto de los músculos supinadores de forma aislada (APL, ECRL y FCU) aumenta la flexión del piramidal y produce una supinación de la pareja escafoides-semilunar provocando una incongruencia articular y el típico resalte de esta inestabilidad. En cambio, el efecto aislado del ECU, produce cambios en la movilidad de los huesos del carpo que benefician a la articulación lunopiramidal, manteniéndola reducida. Por lo tanto, podemos concluir que ante una inestabilidad escafolunar dinámica, la fisioterapia de la mano debería basarse en la inhibición del ECU y del FCU y en el entrenamiento propioceptivo del ECRL, APL y FCR; en cambio, cuando existe una inestabilidad lunopiramidal hay que potenciar la contracción isométrica del ECU, e inhibir la acción de los músculos supinadores (APL, ECRL y FCU). Por otra parte, la manera de ferulizar la muñeca sería forzando una supinación intracarpiana y una desviación cubital de la muñeca en los casos con lesión aguda parcial del ligamento escafolunar, y mediante una pronación intracarpiana en los casos con lesión aguda parcial del ligamento lunopiramidal. / Twenty cadaveric forearms were tested using a wrist testing apparatus designed to investigate the mechanisms of muscle stabilization of the wrist. In ten specimens we created a scapholunate ligament disruption, while another ten we did a lunotriquetral dissociation. The specimens were set in a jig allowing the distal row to migrate proximally and rotate around the axis of pronosupination. Five wrist motor tendons (FCR, FCU, ECU, ECRL and APL) were loaded with specific weights. Reactive rotations of the scaphoid, triquetrum and capitate were measured by an electromagnetic motion tracking device before and after sectioning specific carpal ligaments. We compared similar situations of load before and after creating the dissociation with the Wilcoxon test. With scapholunate dissociation the action of supinator muscles (ECRL and APL) do not alter the movement of the carpal bones; the FCU has a negative effect on the scapholunate joint, as it produces opposite rotations between the scaphoid and lunate that increase the instability. Individual loading of ECU induces a pronation of the distal and proximal row, that destabilizes the scaphoid in the three space planes, producing the typical rotary subluxation of the scaphoid. The FCR has a supination effect on the scaphoid while it pronates the triquetrum and the distal row, this keeps the scapholunate joint closed. With the disruption of the lunotriquetral ligaments, individual loading of the supinator muscles (APL, ECRL and FCU), increases significantly the amount of flexion and supination exhibited by the triquetrum, this produces a joint incongruity that determines the presence of the typical lunotriquetral clunking. However, the ECU protects against carpal collapse, keeping the joint reduced. In conclusion, we can suppose that hand therapy in dynamic scapholunar dissociations should aim at proprioceptionally training the ECRL, APL and FCR muscles and an inhibition of ECU and FCU; while in dynamic lunotriquetral dissociations we must emphasize isometric contraction of the ECU and inhibit the action of the supinator muscles. Anyway, splinting of the wrist should be with intracarpal supination and wrist ulnar deviation in case of partial injury of scapholunate ligament, and with intracarpal pronation in case of partial injury of lunotriquetral ligament.

Estudios recientes han permitido estimar que aproximadamente un 5% del genoma consiste en duplicaciones segmentarias (DS), secuencias de entre 1-100 kb con un nivel de similitud de más del 95% (Eichler, 2001). Las regiones flanqueadas por duplicaciones segmentarias son susceptibles de sufrir reordenamientos mediante recombinación homóloga no alélica y se ha hipotetizado que estas regiones representan puntos calientes de inestabilidad genómica propensos a variación en número de copia (CNVs). Esta variación estructural (deleciones, duplicaciones e inversiones) representa una fuerza mutacional infravalorada en la contribución a las enfermedades genéticas, y en particular en los loci susceptibles a retraso mental. La aparición de nuevas tecnologías como los arrays de CGH o el MLPA permiten el análisis de alta resolución para la identificación de alteraciones genéticas y variaciones en número de copia a nivel de todo el genoma. La aplicación de estas tecnologías ha permitido, recientemente, establecer la implicación de microdeleciones y microduplicaciones en diversas enfermedades genéticas, como por ejemplo el retraso mental (RM). Las técnicas convencionales (cariotipo, FISH, CGH o PCR) de las que disponemos actualmente para el estudio de enfermedades genéticas como el retraso mental no son los suficientemente sensibles para la detección de reordenamientos submicroscópicos. Disponiendo de la tecnología y el material adecuado, es posible la caracterización molecular nuevas variantes geonómicas en retraso mental. Debido a la gran cantidad de casos de RM en los que se desconoce su etiología, el objetivo principal de esta tesis ha sido la caracterización de variantes genómicas responsables de RM aplicando nuevas tecnologías: aCGH del cromosoma X y MLPA. El MLPA se basa en la detección simultánea del número de copias de una secuencia específica mediante la hibridación genómica del DNA con una mezcla de sondas específicas. La cantidad relativa del producto amplificado se correlaciona con el número de copias de la secuencia diana de esa sonda. Por otro lado, los arrays de CGH permiten detectar reordenamientos cromosómicos desequilibrados de <1 Mb. Con el uso de clones genómicos distribuidos de forma que cubran la totalidad del cromosoma X se puede generar un array específico que permitirá obtener un cariotipo molecular de este cromosoma a nivel de 100kb, lo que permitirá detectar microdeleciones, microduplicaciones e inversiones del cromosoma X. Esta parte del proyecto que incluye tanto el diseño, la construcción y validación del array como la hibridación de las muestras se realiza de forma coordinada con el Centro de Regulación de Barcelona (CRG).Para este estudio se seleccionaron pacientes procedentes de familias con herencia compatible con un RM ligado al cromosoma X. Estas familias procedían del Departamento de Bioquímica y Genética Molecular del Hospital Clínico de Barcelona y del grupo GIRMOGEN (Grupo Investigación Retraso Mental de Origen Genético). A todos ellos se les había realizado previamente un cariotipo, se había descartado la expansión del triplete CGG el gen FMR1, responsable del Síndrome del X frágil y no se habían detectado reordenamientos subteloméricos. Gracias a la aplicación de estas tecnologías hemos identificado y caracterización de nuevas variantes genómicas implicadas en RM (11,5%). La detección de reordenamientos cripticos en pacientes afectos de estas enfermedades nos ha permitido establecer una correlación genotipo/fentipo e identificar nuevos genes y mecanismos implicados en el desarrollo del RM. / "CARACTERIZATION OF GENOMIC VARIANTS. APLICATION OF NEW TECHONOLOGIES TO THE STUDY OF MENTAL RETARDATION" TEXT:Mental Retardation (RM) is a common disorder affecting 1-3% of general population. X-linked MR represents and important group inside MR. Nowadays OMIM lists 359 entries about XLMR although only 44 X-linked genes are known to cause XLMR (syndromic and non-syndromic). On the other hand, subtelomeric rearrangements comprise 5-7% of MR with unknown genetic origin. There are few reports about submicroscopic rearrangements that affect X chromosome due to the difficulties that implicate these studies. CGHarray (array-based comparative genomic hibridization) measures submicroscopic DNA copy number changes and allows the simultaneous high-resolution mapping of these changes onto the genome sequence. With the construction and application of a specific CGH microarray, it will be possible to characterize different molecular variants inside this chromosome in those cases of MRLX without molecular diagnosis. On the other hand, MLPA is based in the simultaneous detection of the number of copies of a specific sequence through hybridization of genomic DNA with a mixture of specific probes. The main objective of the present project is to identify submicroscopic duplications and deletions affecting chromosome X in patients with non-syndromic. For this study we selected patients from families with an inheritance consistent with an XLMR. These families came from the Department of Biochemistry and Molecular Genetics at the Hospital Clinical of Barcelona and the GIRMOGEN group (Research Group for Mental Retardation of Genetic Origin). The application of new techonolgies such as MLPA o aCGH has led to the identification of new rearrangements in the X chromosome responsible for MR (11,5%). The detection of cryptic rearrangements in MR patients has enabled us to establish a gentype/phenotype correlation and to identify new genes and mechanisms involved in the development of MR.