Plusieurs insectes se développant dans des milieux nutritionnellement déficients vivent en symbiose durable avec des bactéries intracellulaires (endosymbiotes) qui complémentent leur alimentation et améliorent leur pouvoir adaptatif. Alors que ces associations ont été largement étudiées sur les plans physiologiques et évolutifs, peu de travaux se sont consacrés à l’étude des mécanismes impliqués dans la tolérance et le contrôle des endosymbiotes par l’hôte. L’objectif de cette thèse est d’étudier, chez les charançons des céréales du genre Sitophilus, les particularités moléculaires et immunitaires du bactériome, un organe que l’insecte développe pour héberger les symbiotes et les isoler de sa réponse immunitaire systémique. Le bactériome du charançon exprime une réponse immunitaire modulée : des études transcriptomiques ont montré que les effecteurs de l’immunité sont peu exprimés dans cet organe, à l’exception d’un gène codant un peptide antimicrobien, la coléoptéricine A. Cette dernière interagit avec les endosymbiotes et participe à leur confinement intracellulaire. Dans une première partie, j’ai montré avec une approche d’interférence à l’ARN que l’expression du gène colA serait contrôlée par un système original qui impliquerait les gènes relish et tollip. Cette régulation « interne » au bactériome semble assurer le maintien des endosymbiotes et l’homéostasie de l’organe. Afin de comprendre comment le bactériome répond à une infection par les bactéries exogènes, j’ai suivi par RT-qPCR l’expression de gènes effecteurs de l’immunité dans le bactériome après injection systémique de bactéries à Gram positif ou négatif. Ceci a mis en évidence une réponse « externe », induite en cas d’infection, et qui aurait un rôle de protection des endosymbiotes contre les bactéries exogènes. Enfin, je me suis consacré à l’étude des changements de régulation accompagnant le passage du stade larvaire au stade adulte, marqué par une symbiose très dynamique. Le nombre d’endosymbiotes augmente fortement pendant les premiers jours de vie imaginale, puis diminue jusqu’à leur élimination complète par recyclage autophagique. Une analyse RNAseq a permis d’identifier les voies de signalisation dont l’activité accompagne cette dynamique. Une approche de RT-qPCR a également montré que l’immunité du bactériome est maintenue à un faible niveau d’activation pendant tout le processus de recyclage. Ce travail montre qu’au cours de leur évolution, les insectes ont sélectionné plusieurs stratégies pour assurer le maintien et l’ajustement de leur charge endosymbiotique en fonction de leurs besoins physiologiques : une signalisation immunitaire assurerait le confinement intracellulaire des endosymbiotes, et un ensemble de processus cellulaires incluant l’apoptose et l’autophagie semble être en associé aux voies métaboliques pour assurer le contrôle de la dynamique bactérienne et garantir le compromis bénéfice/coût de la symbiose. / Many insect species living on nutritionally unbalanced media depend on intracellular mutualistic bacteria, called obligatory endosymbionts, for their development and reproduction. Endosymbionts are housed in specialized host cells called bacteriocytes, that group together to form the bacteriome organ. Although such associations have been widely investigated on a physiological and evolutionary point of view, little is known about the mechanisms involved in the tolerance and the control of endosymbionts by the host. This work aims at deciphering the molecular and immune specificities of the bacteriome using the model system Sitophilus oryzae, the cereal weevil, and its obligate endosymbiont Sodalis pierantonius. The weevil bacteriome expresses a modulated immune response: transcriptomic studies showed that immune effector genes were lowly expressed despite the massive bacterial presence, with the exception of colA, a gene encoding for Coleoptericin A, an antimicrobial peptide. Coleoptericin A interacts with endosymbionts and participates in their intracellular seclusion. In a first chapter, I used RNA interference to demonstrate that colA gene expression may be controlled by an original system involving the genes relish and tollip. This “internal” regulation for endosymbiont control seems to maintain bacteriome homeostasis. In a second chapter, in order to understand how the bacteriome responds to an infection by exogenous bacteria, I followed up by RT-qPCR the expression of immune effector genes in the bacteriome after injection of Gram positive and Gram negative bacteria. This highlighted an “external” immune response, inducible upon infections, which may enable endosymbiont protection against exogenous intruders. In a third and last chapter, I focused on the regulation changes that accompany the switch from the larval stage to the imaginal stage, the latter being characterized by a very dynamic symbiosis. Endosymbiont load drastically increases during the first days of imaginal life, then rapidly decreases until complete elimination of the bacteria by autophagic recycling. RNAseq analysis allowed the identification of signaling pathways linked to this dynamic. A complementary RT-qPCR approach also showed that bacteriome immunity was laid low during the whole recycling process. This work shows that several strategies have been selected during host-symbiont coevolution to ensure the maintenance of the endosymbionts and the adjustment of their population depending on the insects physiological needs: immunity allows the intracellular seclusion in the bacteriocytes, and cell processes including autophagy and apoptosis are associated to metabolic pathways to control the endosymbiotic dynamics and secure the cost and benefit trade-off of symbiosis.

Mon projet a porté sur la caractérisation du mécanisme moléculaire des enzymes d'arenavirus (une 3'-5' exoribonucléase et une endonuclease) impliquées dans l'inhibition de la réponse innée IFN de type I et dans le vole de coiffe respectivement, et le développement d'une stratégie thérapeutique basée sur leur structures. Premièrement, j'ai résolu deux structures cristallographiques à haute résolution du domaine exoribonucléases du virus Mopeia (NP-exo MOPV) -un homologue du virus Lassa pathogène- en complexe avec deux ions différents. Ensuite, j'ai effectué une caractérisation fonctionnelle de l’activité exoribonucléase 3'-5' codée par ce domaine. Une corrélation entre la structure et la fonction de NP-exo MOPV démontre que; L’activité exoribonucléase 3'-5' est conservée chez les arenavirus pathogènes ainsi que chez les non-pathogènes. J'ai démontré pour la première fois que l'exoribonucléase est capable d'exciser un ARN misapparié, suggérant ainsi une potentielle activité de correction d'erreur par cette enzyme. Avec la structure de NP-exo MOPV, j'ai développé une stratégie in silico pour identifier des inhibiteurs potentiels spécifiques contre son activité et un inhibiteur a était identifié.En parallèle, nous avons résolu deux structures cristallographiques du domaine de l'endonuclease du virus de la LCMV en complexe avec deux ions catalytiques et deux composés appartenant a la famille des diketo. En résumé, ce travail éclaircit le rôle des exoribonucléases de la famille d'Arenaviridae allant de l’évasion de l'immunité innée à son implication directe dans la réplication. Il ouvre également la voie au développement des inhibiteurs contre ces nucléases. / My PhD work focused on the characterization of the molecular mechanism of two arenavirus enzymes - a 3'-5' exoribonuclease and an endonuclease - implicated in type I IFN suppression and mRNA cap-snatching respectively and the design of a structure based-drug strategy against them. First I solved two high resolution crystal structures of the exoribonuclease domain of Mopeia virus (NP-exo MOPV) -a non pathogenic homologue of the highly pathogenic Lassa virus- in complex with different metal ions. Next I performed an in depth functional characterization of the 3'-5' exoribonuclease activity encoded by this domain. By correlating the structure and function of NP-exo MOPV, I showed that; the 3'-5' exoribonuclease activity is conserved in pathogenic as well as in non-pathogenic arenaviruses. Also, I showed for the first time that this enzyme is able to excise a mismatched RNA suggesting that, arenaviruses might posses a mechanism to limit error incorporation by the RdR polymerase during replication. Using the crystal structure of NP-exo MOPV I designed a structure-based strategy to identify potential inhibitors specific for the 3'-5' exoribonuclease activity and have identified a potential inhibitor.Alongside, we solved two crystal structures of the endonuclease domain of LCMV in complex with two catalytic ions and two compounds belonging to the diketo family.In conclusion, this work has a deep implication extending the role of the Arenaviridae exoribonuclease from innate immunity evasion to direct implication in replication. It also paves the way for the development of inhibitors against these arenavirus nucleases.

Lors d'une infection virale, l'hôte déclenche une réponse rapide, la rémonse immunitaire innée, dont l'interféron (IFN) de type I est la cytokine centrale. Des motifs moléculaires associés aux micro-organismes (MAMP) sont déteectés par de nombreux récepteurs dédiés, dont les récepteurs cytoplasmiques de type RIG-I (RLR) identifiés à partir de 2004. Les RLR, au nombre de trois, RIG-I, MAD5 et LGP2, sont les ARN-hélicases composées de deux ou trois types de domaines : deux domaines CARD, resposables du recrutement de la cascade de signalisation, un domaine C-terminal CTD, site de liaison initial de l'ARN viral, et le domaine central hélicase, site secondaire de liaison àl'ARN et possédant également une activité enzymatiques ATP-dépendante. RIG-I est impliqué dans la détection de plusieurs virus dont ceux de l'ordre des mononegavirales (virus de la rage, de la rougeole, Ebola). Ce récepteur reconnait des ARN viraux possédant une région double brin adjacente à une extrémité 5'-triphosphate. Les nombreuses études menées n'ont cepnedant pas encore permis de dégager un mécanisme complet et cohérent de l'activation de RIG-I. Notre objectif était donc d'apporter des réponses molécualires quant au mécanismes d'activation de RIG-I. Dans un premier temps, l'élucidation de la structure de la protéine entière RIG-I de canard, par l'équipe de Stephen Cusack, leur a permis d'identifier une conformation auto-réprimée de la protéine. En l'absence d'ARN le domaine CARD2 interagit avec le sous domaine Hel2i du domaine hélicase. Nous avons apporté une preuve fonctionelle de cette observation. Les mutations F540 A/D, du résidu situé dans le sous domaine Hel2i, inhibent l'interaction CARD2-Hel2i et produisent des mutant constituvement actifs. A l'opposé, les mutations correspondantes dans le domaine CARD2 rendent RIG-I inactif. L'interaction CARD2-Hel2i semble donc impliquer une double auto-répression via (i) le masquage du site de liaison à l'ARN du sous-domaine Hel2i, et (ii) le masquage de résidus du domaine CARD2 impliqués dans le recrutement d'intermédiaires requis pour la transduction du signal. Par ailleurs, l'étude de mutants impliqués dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP nous a permis de proposer un nouveau rôle régulateur pour cette activité enzymatique. Dans un deuxième temsp, l'étude de la nécessité de l'oligomérisation de RIG-I pour l'activation de la réponse IFN a été menée. Eva Kowalinski, en thèse dans l'équipe de Stephen Cusack, n'observe la formation de dimères de RIG-I, in vitro, qu'en présence d'un ARN synthétique possédant deux extrémités 5'-triphosphate. Nous avons complété cette observation avec des analyse montrant que des ARN synthéttiques leader incapables d'induire la dimérisation de RIG-I in viro, activent néanmoins ce récepteur in cellula. Par ailleurs, nim'utilisation de la technique de co-immunoprécipitation, ni celle du test de complémentation basé sur la luciférase Gaussia, avec ou sans activiation par un ARN ou une infection virale, n'ont permis d'observer d'oligomérisation de RIG-I. L'auto-association de RIG-I ne semble donc pas être indispensable pour son activation. / Vertebrate are permanently threatened by infections that they manage to counteract using a dedicated system. The innate immunity allows a rapid response against viral infection, mainly through the type I interferon (IFN) production. Dedicated receptors detect microbe-associated molecular patterns (MAMPs), and among them the RIG-likereceptors (RLRs), RIG-I, MDA5 and LGP2, can sense viral RNA into the cytoplasm. RLRs are compossed of two or three different domains : two N-terminal CARDs domains are resposible for signal transduction, a C-terminal domains is the first RNA binding site, and a central helicase domainis the second RNA binding site and possesses an ATP-dependent activity. RIG-I is important for sensing of several mononegavirales, such as rabies, measle and Ebola viruses, and recongnized 5'-triphosphorylated double stranded RNA. Despite intensive studies, a full and comprehensive model of the mechanismof RIG-I activation is still lacking. Our aim was to clarify the first molecular steps of RIG-I activation. First, Stephen Cusack's team elucidated the structure of the full lenght duck RIG-I protein and identified the principle of RIG-I auto-repressed conformation. In absence of ligand RNA, CARD2 domain interacts with Hel2i subdomain of helicase domain. We confirmed this conformation with functional evidence. Mutaions F540A/D, in Hel2i subdomain, inhibits CARD2:Hel2i interaction and renders RIG-I constitutively active. In contrast, the corresponding mutations in the Hel2i contacting site of CARD2 domain produce inactive mutants. Thus CARDS;Hel2i interactio induces an auto-repressed state through a deual masking of both Hel2i RNA binding site and CARD2 residus necessary for signal transduction. Moreover, study of mutants involved in ATP binding and hydrolysis reealed a portential unsuspected regulatory role for the ATP-dependent enzymatic activity of RIG-I. Second, we studied the necessity of RIG-I oligomerization for RIG-I activation. Eva Kowalinski, PhD student in Stephen Cusack's team, observed RIG-I dimers in vitro, only in presence of synthetic RNA with two 5'triphosphorylated ends. We complete this observation with functional assays showing that synthetic leader RNA incapable to induce RIG-I oligomerization in vitro, did activate RIG-I in cellula. Moreover, we did not observe RIG-I oligomerization using either co-immunoprecipitation or Gaussia Luciferase-based-protein complementation assay, after activation with cognate RNA or viral infection. Altogether our results indicate that the self-oligomerization og RIG-I is either dispensable or very transient for signal transduction.

Les premières souches bactériennes résistantes aux antibiotiques sont connues depuis 70 ans et se sont multipliées ces dernières années posant un grave problème de santé publique. Parmi les nombreux types d’infections induites par ces bactéries, nous nous sommes intéressés aux infections intestinales qui peuvent dégénérer en maladies inflammatoires de l’intestin et cancers. Notre travail de thèse a consisté à proposer des outils thérapeutiques dans le traitement des pathologies intestinales infectieuses : des peptides antimicrobiens dérivés de la chromogranine A et des extraits de plantes de la médecine traditionnelle béninoise. La chromogranine A est une protéine libérée par les cellules nerveuses, neuroendocrines et immunitaires au cours d’un stress et maturée en peptides. Des peptides actifs contre quatre souches bactériennes pathogènes (Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Shigella sonnei et Vibrio cholera non O1) ont été identifiés et l’interaction bactérie-peptide analysée. L’étude de la combinaison peptide-antibiotique montre que la cateslytine permet de réduire les doses d’antibiotiques nécessaires. Ensuite, nous avons étudié l’implication de deux peptides sur un modèle de cellules neuroendocrines, les cellules BON. La chromofungine provoque la stimulation des cellules BON en induisant un influx de calcium extracellulaire, tandis que la catestatine est capable de bloquer l’activité de la chromofungine.Après un screening des extraits de 14 plantes du Bénin, nous avons isolé deux molécules, la sinensétine et l’O-tétraméthyléther scutellaréine, responsables de l’activité antibactérienne de Chromolaena odorata contre les pathogènes étudiés. / The first bacterial strains resistant to antibiotics appeared 70 years ago and have proliferated in recent years causing a serious public health problem. Such bacteria are responsible of several types of infections including intestinal infections with chronic inflammatory bowel diseases and cancers. This work consisted of proposing new therapeutic tools in the treatment of intestinal pathologies. In this context, we have studied antimicrobial peptides derived from chromogranin A and plant extracts used in Beninese traditional medicine for the treatment of such diseases. Chromogranin A is a protein produced by nervous, endocrine and immune cells during a stress and processed to generate biologically active peptides. We identified antimicrobial peptides, active against four pathogenic bacterial strains (Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Shigella sonnei and Vibrio cholera non O1) and analyzed the bacteria-peptide interactions. Moreover, the study of the peptide-antibiotic combination shows that cateslytin is useful for reducing doses of antibiotic drugs. In addition of this work, we have studied the effects of two peptides derived from chromogranin A on neuroendocrine cells with model of BON cells. Chromofungin stimules BON cells by inducing an influx of extracellular calcium, whereas catestatin is able to block chromofungin’s activity.With plant extracts, after a screening on 14 plants from Benin, our works enabled us to isolate two active molecules, sinensetin and O-tetramethylether scutellarein, responsible of the antimicrobial activity of Chromolaena odorata against the studied pathogenic strains.

Les acides nucléiques sont des activateurs puissants des réponses immunitaires innées. Pour lutter contre les infections, les organismes multicellulaires ont développé de multiples façons de détecter les agents pathogènes. L'une d'entre elles est la reconnaissance de l'ADN dans le cytoplasme. La présence d'ADN dans le cytoplasme est généralement liée à des infections par des bactéries ou des virus comme le VIH. La GMP-AMP synthase cyclique (cGAS) est un capteur cytosolique essentiel de l'ADN chez les mammifères. Lors de la reconnaissance de l'ADN, cGAS synthétise le petit second messager cyclique GMP-AMP (cGAMP), qui active les voies de signalisation de l’immunité innée. De plus, cGAS joue un rôle central en réponse aux microbes et au développement de maladies auto-immunes comme les interféronopathies. Cette thèse examine le rôle de cGAS en réponse aux virus et à l’ADN du soi. En explorant la réponse médiée par cGAS en présence du VIH, nous avons constaté que dans les cellules produisant du virus, le cGAMP synthétisé par cGAS est contenu dans des particules virales et des vésicules extracellulaires. Les particules virales délivrent efficacement cGAMP aux cellules cibles et activent une réponse antivirale puissante. Le transfert de cGAMP nécessite une activité catalytique de cGAS et une fusion des particules virales avec les cellules cibles. Nous avons également montré que dans le contexte d'une infection, les virus à ADN tels que MVA et mCMV peuvent conditionner cGAMP. Par conséquent, le transfert de cGAMP médié par une infection virale est un mécanisme de défense généralisé du système immunitaire inné. Nous avons également étudié l'activation du cGAS par l'ADN en se concentrant sur l'ADN de la chromatine nucléaire. Dans les cellules eucaryotes, l'ADN est compartimenté dans deux organelles: le noyau et les mitochondries. La compartimentation nucléaire de l'ADN peut être transitoirement perdue lors de la rupture de l'enveloppe nucléaire pendant la division cellulaire et lors des ruptures d'enveloppes nucléaires dans les cellules dendritiques migrantes (DC). Nous avons constaté que la rupture de l'enveloppe nucléaire ou la perte de l'intégrité de l'enveloppe nucléaire entraînent un recrutement de cGAS sur l'ADN nucléaire. Nous avons également montré que les DC présentent un pool nucléaire de cGAS à l'état basal. La rupture de l'enveloppe nucléaire pendant le cycle cellulaire conduit au recrutement de cGAS à l'ADN nucléaire. En jouant sur la localisation cGAS, nous avons montré que le cGAS est peu actif lorsqu'il se trouve dans le noyau et la transfection d'ADN exogène permet son activité enzymatique complète. L'expression du cGAS localisé dans le noyau des DC a conduit à la maturation des DC et à la production d'interféron de type I (IFN). La région N-terminale de cGAS régule la distribution nucléaire / cytoplasmique de cGAS dans les cellules en interphases et nous avons établi que les lamines A / C sont requises pour l'accès de cGAS à l'ADN nucléaire dans les DC migrantes. De façon inattendue, nous montrons que cGAS n'est pas activé lors de la rupture de l'enveloppe nucléaire. Enfin, nous identifions l'hétérochromatine pericentromérique comme étant l'ADN de liaison préférentielle pour le cGAS nucléaire exprimé dans les DC. Au total, notre étude montre que le noyau agit comme un site intracellulaire immunitaire privilégié pour l'activation de cGAS. Collectivement, nous avons montré une pertinence de l'activation de cGAS lors d'une infection virale et découvert un mécanisme « cheval de Troie » de l'incorporation de cGAMP dans la progénie virale. Nous avons également décrit des mécanismes, encore à définir, qui limitent les réponses à l'ADN de la chromatine dans le noyau. À mesure que les preuves augmentent sur la prise en charge de cGAS en réponse à des agents pathogènes, dans des maladies auto-immunes, en réponse aux dommages causés par l'ADN et dans le développement de la sénescence cellulaire, (...) / Nucleic acids are potent activators of innate immune responses. To control infections, multicellular organisms have developed multiple ways to detect pathogens. One of these is the recognition of DNA in the cytoplasm. Presence of DNA in the cytoplasm is usually linked to infections by bacteria or viruses, such as HIV. Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is an essential cytosolic sensor for DNA in mammals. Upon DNA recognition, cGAS synthetizes the small second messenger cyclic GMP-AMP (cGAMP), which activates innate immune signaling pathways. cGAS plays a pivotal role in response to microbes and in the development of autoimmune diseases such as interferonopathies. This thesis investigate the role of cGAS in response to viruses and to self DNA. By exploring the cGAS-mediated response to HIV, we found that in cells producing virus, cGAS-synthesized cGAMP is packaged in viral particles and extracellular vesicles. Viral particles efficiently deliver cGAMP to target cells and activate a potent antiviral response. The transfer of cGAMP requires cGAS catalytic activity and fusion of the viral particles with the target cells. We also showed that in the context of an infection, DNA viruses such as MVA and mCMV can package cGAMP. Therefore viral mediated cGAMP transfer is a generalized defense mechanism of the innate immune system. We further investigated cGAS activation by DNA focusing our attention on nuclear chromatin DNA. In eukaryotic cells, DNA is compartmentalized in two organelles: the nucleus and the mitochondrion. Nuclear compartmentalization of DNA can be transiently lost upon nuclear envelope breakdown during cell division and upon nuclear envelope ruptures in migrating dendritic cells (DCs). We found that nuclear envelope breakdown or loss of nuclear envelope integrity leads to cGAS recruitment on the nuclear DNA. We also showed that DCs present with a nuclear pool of cGAS at steady state. Nuclear envelope breakdown during cell cycle leads to cGAS recruitment to the nuclear DNA. By manipulating cGAS localization, we showed that cGAS is poorly active when in the nucleus, and that providing exogenous DNA unmasked its full enzymatic activity. Expression of nuclear localized-cGAS in DCs leads to DCs maturation and Type I interferon (IFN) production. The N-terminal region of cGAS regulates cGAS nuclear/cytoplasmic distribution in interphase cells and we established Lamin A/C as required for cGAS accessibility to nuclear DNA in migrating DCs. Unexpectedly, we show that cGAS is not activated upon nuclear envelope rupture. Finally, we identify the pericentromeric heterochromatin as the preferential binding DNA for expressed nuclear cGAS in DCs. Altogether, our study shows the nucleus to act as an intracellular immune-privileged site for the activation of cGAS. Collectively, we have shown relevance of cGAS activation upon viral infection and uncovered a Trojan horse mechanism of cGAMP incorporation in the viral progeny. We have also described yet to be defined regulatory mechanisms that limit responses towards chromatin DNA in the nucleus. As evidence grows for cGAS involvement in response to pathogens, in autoimmune diseases, in response to DNA damage and in the development of cell senescence, fully understanding the mechanisms of distinction between self and pathogen related DNA by the sensor will be important to develop effective means to regulate the pathway.

Les maladies infectieuses dues aux bactéries Gram + sont causes de mortalité importante à travers le monde, et de récentes études ont mis en évidence le rôle pathologique de l’interféron de type I (I IFN) dans ces maladies. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) produisent des quantités importantes d’IFN de type I suite à la détection de virus. Des données récentes suggèrent que les pDC humaines pourraient également détecter des bactéries, mais les récepteurs impliqués restent inconnus. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé l’expression des récepteurs TLR2 / 1 par les pDC. Ces deux récepteurs permettent aux pDC de détecter les lipoprotéines bactériennes. Je montre que les pDC répondent aux bactéries Gram + (M. tuberculosis, S. aureus et L. monocytogenes) par la voie TLR2 / 1. Mon travail a montré que les pDC primaires humaines expriment TLR1 et TLR2 à la fois au niveau de l'ARNm et au niveau protéique. En réponse aux lipoprotéines bactériennes, la régulation des molécules costimulatrices par les pDCs est TLR1-dépendante tandis que la sécrétion d’I-IFN est TLR2-dépendante. De plus, TLR2 et TLR1 jouent des rôles distincts au cours du priming des cellules T CD4+ naïves par les pDCs, induisant une prolifération et différentiation en sous-populations Th1 / Th2 / Treg. Je démontre en outre que ces différences reposent sur les voies de signalisation distinctes de ces deux TLR. Ce travail de thèse pose ainsi les bases pour l’exploration du rôle des pDC dans les infections bactériennes humaines. / Infections by Gram+ bacteria are worldwide life-threatening diseases where new studies are highlighting the pathological role of Type I interferon (I IFN). Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are the main source of Type I IFN following viral sensing. Recent evidence suggests that human pDCs might sense bacteria. The receptors mediating bacterial sensing in pDCs are not known. During my thesis, I focused on the characterization of pDCs TLR2/1 receptors expression. These two receptors allow pDCs to sense Gram+ bacterial lipoproteins. My work showed that human primary pDCs express TLR1 and TLR2 at the mRNA and protein level. I show that pDCs respond to the Gram+ bacteria M. tuberculosis, S. aureus and L. monocytogenes through TLR2/1 pathway. In human primary pDC, I found that in response to bacterial lipoproteins up-regulation of costimulatory molecules is TLR1-dependent while IFN-I secretion is TLR2-dependent. TLR2 and TLR1 signalling play a different role in the pDCs priming of naïve CD4+ T-cells, inducing proliferation and differentiation to TH1/TH2/Treg subsets. I further demonstrate that these differences rely on the diverse signaling pathway activated by the two TLRs. This work provides the rationale to explore pDCs activity in human bacterial infection.

Les maladies inflammatoires de l’intestin (MII), incluant la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, sont des maladies chroniques qui résultent d’un dérèglement de la réponse immunitaire aux microorganismes de la lumière intestinale. Des études de séquençages réalisées par le laboratoire du Dr. Rioux, avec ses collègues du International IBD Genetics Consortium ont identifié quatre variants rares, indépendants et causals pour les MII, dans le gène IFIH1. La protéine d’IFIH1 (MDA5) interagit avec certains virus à ARN, afin de déclencher une réponse antivirale de l’immunité innée. Nous avions émis l’hypothèse que ces variants dans IFIH1 diminuaient la réponse antivirale de l’épithélium intestinal, suite à une infection. Nous avons d’abord travaillé avec des lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCLs) obtenues à partir d’individus atteints de MII et qui sont homozygotes ou hétérozygotes composés pour ces variants, ainsi qu’à partir d’individus contrôles (IFIH1 wt). Ces LCLs ont été reprogrammées en cellules souches pluripotentes induites humaines, avant d’être différenciées en cultures épithéliales intestinales. Nos résultats ont d’abord confirmé l’impact des variants sur la structure génique et protéique (IFIH1/MDA5), dans ces modèles cellulaires. Puis, la réponse antivirale a été induite, grâce à la stimulation avec des agents (moléculaire et viral) connus pour stimulés la protéine MDA5. Nous avons démontré que ces variants dans IFIH1 induisaient effectivement une moins grande réponse antivirale, caractérisée par une plus faible expression d’IFNs, comparativement aux contrôles. Finalement, la modulation des IFNs constituerait une avenue potentiellement intéressante pour le traitement des patients atteints des MII et porteurs des variants causals. / Inflammatory Bowel Disease (IBD), including Cronh’s disease and ulcerative colitis, are chronic inflammatory diseases of the gastro-intestinal tract. IBD is associated with a disturbance of the immune response to the microorganisms of the intestinal lumen. Sequencing studies conducted by the laboratory of Dr. John Rioux, in collaboration with his colleagues of the International IBD Genetics Consortium, identified four rare and independent variants in IFIH1, associated to IBD. The protein of IFIH1 (MDA5) interacts with certain RNA viruses to trigger the innate mechanism of antiviral defense. Our hypothesis was that these IFIH1 variants decreased the intestinal epithelial antiviral response, following an infection. We first worked with lymphoblastoid cell lines (LCLs) obtained from IBD patients who are homozygotes or compound heterozygotes for the different variants, as well as from control individuals (IFIH1 wt). These LCLs were reprogrammed into human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs), before being differentiated into intestinal epithelial cultures. Our results first confirmed the impact the variants on the genetic and protein structure for these models. Then, the antiviral response was triggered by the stimulation of LCLs and intestinal epithelial cells, with agents (molecular and viral) known to stimulate MDA5. We have demonstrated that these IFIH1 variants did indeed induce a lower antiviral response, characterized by lower IFNs expression, compared to control cell lines. Finally, modulation of IFNs could be an interesting avenue for the treatment of IBD patients with the causal variants.

Depuis 2008, des épisodes de surmortalité massive d’origine multifactorielle, affectent mondialement les élevages de juvéniles d’huître creuse Crassostrea gigas dont le virus de type herpès, l’OsHV-1, peut être considéré comme un des agents pathogènes majeurs. L’immunité des huîtres, repose sur un système immunitaire inné et a longtemps été considéré comme peu spécifique et dépourvu de mémoire. Cependant, cette vision a été remise en question via des études ayant démontré l’existence d’une réponse immunitaire spécifique et mémoire chez des invertébrés. Dans le cadre de cette thèse, l’objectif était de caractériser le priming immunitaire antiviral ainsi que ses mécanismes chez l’huître face au virus OsHV-1. En stimulant les huîtres avec un agent mimétique viral, le poly(I:C), nos travaux ont montré que cette molécule protégeait spécifiquement contre l’OsHV-1 en milieu contrôlé et en milieu naturel sur le long terme, en améliorant le taux de survie des huîtres de près de 100%, mais pas d’infections bactériennes. Une approche RNA-seq nous a permis d’identifier différentes voies de signalisations immunitaires antivirales régulées suite à la stimulation par le poly(I:C). Les profils de régulation sont majoritairement maintenus dans le temps (au moins 10 jours), ce qui pourrait expliquer la protection observée. L’ensemble de ces résultats montre l’existence d’un phénomène de priming immunitaire antiviral efficace chez un Lophotrochozoaire et apporte une contribution à la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à ce phénomène. Ces travaux ont permis d’apporter des pistes de sortie de crise pour la filière ostréicole jusqu’alors inexplorées. / Since 2008, mass mortality events of multifactorial origin have affected the Pacific oyster Crassostrea gigas farms worldwide, in which a herpesvirus, the OsHV-1, can be considered as one of the major pathogens. The immunity of oysters, as for all invertebrates, is based on an innate immune system that has long been considered to be scarcely specific and to lack memory. However, in recent years this simplistic view has been questioned through studies that have demonstrated the existence of a specific immune response and memory. However, knowledge about the mechanisms underlying these phenomena still remains extremely fragmentary. The aim of this thesis was to characterize the antiviral immune priming and its mechanisms in the oyster against OsHV-1. By stimulating oysters with a viral mimic, poly(I:C), we have shown that this molecule specifically protects against OsHV-1 in controlled environment and in natural environment, protecting oysters from mass mortality events on the long term (min. 5 months) by improving oyster survival by almost 100% but does not protect against bacterial infection. A RNA-seq approach carried out during this thesis allowed us to identify different antiviral immune pathways regulated following the stimulation by poly(I:C). The regulation profiles are mostly maintained over time (at least 10 days), which could explain the observed protection. All these results show the existence of an effective antiviral immune priming phenomenon in a Lophotrochozoan and contribute to the understanding of the molecular mechanisms underlying this phenomenon. This work opens new perspectives hitherto unexplored to support oyster farming against this crisis.

La vaccination est considérée aujourd’hui comme une des méthodes les plus efficaces de se prémunir des maladies infectieuses. Cependant notre incapacité à produire un vaccin protégeant contre certaines maladies comme le SIDA ou l’hépatite C trahissent notre manque de compréhension des processus immuns. Cette thèse s’appuie sur une modèle primate non-humain associé à un vaccin vivant attenué dérivé du virus de la vaccine, le MVA (Modified Vaccinia virus Ankara) pour y décortiquer en détails la réponse immunitaire innée, mais aussi adaptative. Le MVA induit une importante réaction inflammatoire au niveau du site d’injection et dans le compartiment systémique par voie intramusculaire, sous-cutanée, et intradermique. Pourtant, l’amplitude de cette réaction immunitaire ainsi que les effecteurs cellulaires et moléculaires engagés varie selon la voie d’administration. Les conséquences en sont importantes, puisque cela est à l’origine d’une réponse adaptative plus orientée Th2 après voie sous cutanées, et plutôt Th1 après voies intramusculaires et intradermiques. Ainsi, nous mettons en évidence certaines signatures cellulaires et moléculaires susceptible d’orienter la réponse immunitaire dans notre modèle. / Vaccination is considered as one of the best therapeutic intervention to fight against infectious diseases. However, we still fail to develop protective vaccines for diseases such as AIDS or B hepatitis, which highlights our lack of knowledge of immune processes.For this thesis, we relied on a non-human primate model associated wih a vaccinia virus living attenuated vaccine derived called MVA (Modified Vaccinia virus Ankara). We deciphered innate, but also adaptive immune response using this model. MVA induces an important inflammatory reaction at the injection site and in the blood after intramuscular, subcutaneous, and intradermal administration. However, the magnitude of this immune reaction, as well as cellular and molecular effectorsin varies depending on the administration route. The consequences are important and lead to different adaptive immune profiles, with Th2 oriented response after subcutaneous route, and Th1 oriented response after intramuscular and intradermal route. It allowed us to highlight several cellular and molecular signatures that might modulate immune response in our model.

La vaccination est l'un des plus grands progrès réalisés en santé publique. Toutefois, malgré de nombreuses connaissances sur le système immunitaire, de nombreux pans d’ombre empêchent la conception de vaccins contre des pathogènes complexes. Pour pallier ce problème, une meilleure compréhension des modes d'action des vaccins est requise. En particulier, la plupart des vaccins nécessitent plusieurs immunisations pour induire une mémoire immunitaire adaptative au long terme, mais l'impact du délai entre primo-vaccination, induisant une mémoire primaire, et rappel(s) la restimulant pour générer une mémoire secondaire, est peu défini. De plus, la réponse immunitaire innée, induite à chaque immunisation et façonnant l'immunité adaptative, reste peu caractérisée dans ce contexte vaccinal. En vaccinant des macaques cynomolgus avec le virus de la vaccine modifiée Ankara, selon un schéma de primo-vaccination suivie d’un rappel homologue à deux mois, et en utilisant la cytométrie de masse couplée à des analyses bio-informatiques, nous avons caractérisé la réponse innée induite par chaque immunisation. Les réponses innées diffèrent entre primo-vaccination et rappel, avec induction par la primo-vaccination d’une modification phénotypique tardive des cellules innées, suggérant une meilleure capacité à répondre au rappel. De surcroît, la réduction à deux semaines du délai entre primo-vaccination et rappel abroge la mobilisation de ces cellules innées phénotypiquement modifiées et altère la qualité de la réponse humorale. En définitive, en plus de la réponse innée précoce, ce projet a mis en évidence l'induction par la primo-vaccination d'un vraisemblable entraînement inné tardif, un concept émergent traduisant la capacité de mémorisation des cellules innées via des modifications épigénétiques. Ce vraisemblable entraînement, non seulement des monocytes et cellules tueuses naturelles, mais aussi des cellules dendritiques et surprenamment des neutrophiles, est corrélé à la qualité de la mémoire immunitaire adaptative, de manière hautement dépendante du délai entre primo-vaccination et rappel. Ces résultats contribuent à ouvrir la voie vers l’optimisation rationnelle des futurs vaccins, via l'optimisation des calendriers vaccinaux et la valorisation de l'entraînement inné. / Vaccination is one of the best achievements made in public health. However, designing vaccines against complex pathogens is currently challenging. The immune system is indeed uncompletely characterized, despite large amount of accumulated knowledges. A better understanding of vaccine-induced immunity is then required to optimize vaccine design. In particular, while most vaccines require several immunizations to induce a long-lasting adaptive immune memory, little is known on the impact of the delay beween the prime inducing a primary memory and the boost restimulating it to induce a secondary memory. Also, the innate immunity induced by each immunization and shaping the adaptative immunity is poorly characterized in this vaccine context.We studied the innate immune responses in cynomolgus macaques immunized with the modified vaccinia virus Ankara, following an homologous prime-boost vaccination at two months apart. We applied mass cytometry and bioinformatic analyses to characterize the innate response induced by each immunization. We showed that prime and boost vaccination triggered distinct innate responses. Actually, prime induced late phenotypic modifications of innate cells. These phenotypic changes suggest a stronger ability to react to the boost. Moreover, reducing the delay between prime and boost to two weeks impeded the mobilization of these phenotypically modified innate cells, and qualitatively altered humoral response.In conclusion, beyond the early innate responses, these results highlight the late induction by the prime of "likely trained" innate cells. This emerging concept corresponds to the ability of innate cells to display memory features based on epigenetic modifications. This "likely training" occured not only on monocytes and NK cells, but also on dendritic cells and strikingly on neutrophils. It was deeply connected with adaptive immune memory establishment, in a prime-boost delay dependant fashion. These findings contribute to pave the way towards to the rationale design of future vaccines, via vaccine schedule optimization and harnessment of innate training.