The intracellular second messenger InsP₃ is a vital molecule in the regulation of Ca²⁺ signalling. Ca²⁺ mediates a wide range of cellular activities from fertilisation and cell differentiation through to apoptoisis. Using X-ray crystal structure data and molecular modelling, a series of novel InsP₃ analogues were designed as selective InsP₃R-antagonists. Two novel synthetic routes have been developed for the synthesis of these analogues. The first route uses a Ferrier-II rearrangement to provide enantiopure inositol intermediates, whereas, the second route employs a diastereomeric resolution to obtain the enantiopure inositols. The successful synthesis of InsP₃ and a series of 5-position modified analogues are reported herein.

Le métabolisme des cellules souches embryonnaires est étroitement régulé par un équilibre entre<p>auto-renouvellement et différenciation. Ces cellules peuvent proliférer en culture de manière prolongée,<p>tout en restant indifférenciées, mais cela peut engendrer l’apparition d’anomalies karyotypiques, qui<p>accentuent la prolifération de ces cellules au détriment de leur potentiel de différenciation. Ce<p>phénomène d’adaptation à leurs conditions de culture et leurs caractéristiques communes avec les<p>cellules cancéreuses sont deux preuves majeures de la nature tumorigène de ces cellules souches.<p>Le but de ce travail a été d’élucider les voies de signalisation qui contrôlent le métabolisme des<p>cellules souches embryonnaires humaines, et plus particulièrement, leur différenciation. De plus, nous<p>avons souhaité étudier le caractère tumorigène de ces cellules et pour cela, nous avons travaillé en<p>comparant différentes lignées de cellules souches embryonnaires avec une lignée de carcinome<p>embryonnaire humain, leurs correspondantes cancéreuses. Nous avons choisi d’étudier la voie des<p>dérivés de l’inositol, dont la composante PI3K/AKT avait déjà été auparavant associée avec le<p>métabolisme des cellules souches embryonnaires murines, tout comme la composante des inositols<p>phosphates solubles qui avait été impliquée dans le contrôle de l’auto-renouvellement de ces cellules.<p>Nous avons tout d’abord étudié la distribution des inositols phosphates dans ces différents<p>modèles par HPLC et observé que leur profil différait entre les cellules souches embryonnaires normales<p>et cancéreuses, principalement au niveau de la quantité d’InsP5. L’analyse du profil des InsPs en cours de<p>différenciation spontanée a permis par la suite de mettre en évidence des modulations de ces différents<p>métabolites, avec notamment une diminution reproductible d’InsP5. Nous basant sur l’hypothèse que ces<p>modulations devaient se refléter au niveau de l’expression des enzymes régulant la production des<p>inositol phosphates, nous avons entamé une analyse par qPCR des kinases et phosphatases principales<p>impliquées dans cette voie. Nous avons effectivement pu mettre en évidence une augmentation<p>significative de deux isoformes de la triphosphate 3-kinase, ITPKB et ITPKA, en cours de différenciation<p>spontanée. Ces deux enzymes sont également davantage exprimées dans les cellules souches cancéreuses.<p>Ces augmentations d’expression ont ensuite pu être confirmées au niveau protéique pour ITPKB et au<p>niveau de leur activité enzymatique. Par ailleurs, au cours de ce travail, nous avons également mis au<p>point un modèle de différenciation dirigée de nos cellules souches embryonnaires vers des cellules<p>souches mésenchymateuses, que nous avons entièrement caractérisées et dont nous avons pu mettre en<p>évidence les propriétés immunomodulatrices. Des résultats préliminaires sont venus confirmer, dans ce<p>modèle, l’augmentation d’ITPKB préalablement observée en cours de différenciation spontanée.<p>Nous avons également montré que l’expression du gène suppresseur de tumeur PTEN était<p>augmentée en cours de différenciation spontanée des cellules souches embryonnaires humaines. A l’aide<p>de la technique d’immunofluorescence, nous avons mis en évidence une localisation subcellulaire<p>différente de PTEN dans nos cellules souches embryonnaires normales par rapport à leur<p>correspondantes cancéreuses ainsi qu’une plus faible expression de PTEN dans ces dernières, confirmant<p>ainsi nos résultats obtenus précédemment par qPCR. PTEN est le principal inhibiteur de la voie<p>PI3K/AKT dont nous avons également disséqué l’expression des effecteurs majeurs par qPCR. Nous<p>avons notamment mis en évidence une augmentation de l’expression des unités régulatrices p85α et<p>catalytique p110β en cours de différenciation. Ces mêmes enzymes étaient également surexprimées dans<p>les cellules de carcinome embryonnaire préalablement différenciées à l’aide d’acide rétinoïque.<p>En conclusion, l’ensemble de ces résultats met en évidence une modulation des voies de<p>signalisation dérivées de l’inositol en cours de différenciation spontanée et dirigée des cellules souches<p>embryonnaires, suggérant leur implication dans le contrôle de la différenciation de ces cellules. Nous<p>avons également observé des différences entre les cellules souches embryonnaires normales et<p>cancéreuses, dont l’étude devra être approfondie afin d’évaluer l’impact de ces divergences sur le risque<p>de transformation cancéreuse des cellules souches embryonnaires humaines. / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Inositol phosphates (IPs) have important cellular functions from teleomere maintenance (IP7 and IP8) to Ca2+ signaling pathways (1, 4, 5-IP3). Yet there is no robust, quantitative method to separate all the inositol phosphate isomers from IP1 to IP8. Four findings contributed heavily towards the development of a robust, quantitative IP isomer separation and identification method on the EskpertTM MicroLC 200+ QTrap 6500 system with a SelexIonTM DMS attachment. 1) TCA from inositol phosphate algal extractions was removed by elution with 100 mM ammonium carbonate, ammonium formate, or ammonium bicarbonate or by immobilized metal affinity chromatography (Fe-NTA columns). 2) A 250 mM ammonium carbonate and 25% methanol gradient was run on a weak anion exchange column to separate all the inositol phosphates from each other (IP1 through IP8. 3) Using ten different inositol phosphate isomer standards and fluoro- IP3 as an internal standard for future quantitation and recovery studies, isomer separation was obtained using SelexIonTM DMS with a 2- propanol modifier. 4) Ion suppression of inositol phosphate signals caused by 250 mM ammonium carbonate can be alleviated with a post-column dilution. The final assembled EskpertTM MicroLC 200+ QTrap 6500 system with a SelexIonTM DMS attachment and post-column dilution method was able to separate out IP isomers from IP1 to IP6 and detect IP7 and IP8. Once further optimized using the full compensation voltage range and a more polar modifier such as methanol, this method will allow the lipid biosynthesis pathways of C. reinhardtii, a promising candidate for algal biofuels, to be better studied.

Thesis (Ph. D. in Pharmacology)--Vanderbilt University, Dec. 2009. / Title from title screen. Includes bibliographical references.

This thesis investigates the development of new methodology for the identification and quantification of organic phosphorus compounds in environmental samples. Phosphorus is a vital element for primary production and one of the factors contributing to eutrophication. Eutrophication of aquatic systems leads to algal blooms, changes in ecological balance and deteriorating water quality. Difficulties in studying organic phosphorus stem from the fact that organic phosphorus is present in the environment in a variety of forms and each form may have different degradation and turnover time, having very different effects on eutrophication. New methods for the quantification of phosphorus derived from three groups of organic phosphorus compounds were developed. For the determination of phosphorus derived from DNA and phospholipids selective extraction was combined with digestion and colorimetric determination of the extracted phosphate. For quantification of inositol phosphates high performance liquid chromatography was coupled with tandem mass spectrometry using electrospray ionization.   The methods were applied to studying the distribution of these compounds in a small catchment and in the case of DNA-P and phospholipid-P, the degradation of the fractions in lake sediments. The studies showed that phosphorus bound to DNA, phospholipids and inositol phosphates constitute a sizeable part of the total phosphorus in different environmental samples. The phospholipid-P fraction was the smallest one, accounting for, on average, only a few percent of the total phosphorus in the sample. Inositol phosphates were most prevalent in the soils, with inositol hexakisphosphate accounting for over 10% of the total phosphorus content. The highest content of DNA-P was found in sediments and it was shown that DNA-P degrades more rapidly than phospholipid-P and therefore plays a more critical role in internal loading.

Chemical substances that are either produced by nature or by humankind have a consequence on the environment when they are accumulated to a great extent. One of nature’s major problem is that of the eutrophication of surface waters, which is caused by inorganic and organic phosphorus compounds and, in particular, from a group known as Inositol Phosphates. There are six different forms of these inositols and are commonly found in soil and sediment samples. The conducted project was aimed to develop an analytical method that could efficiently analyze and separate all six with repeatable results. As such, soil samples were collected two times from two forest locations and two crop field locations. The first time the soil samples were left overnight to dry in a drying oven while on the second time, the samples left to dry at room temperature. When the samples were considered dry enough, they processed to reach grain size and extracted with a mixture of NaOH and Titriplex® III. The extracted soil samples, the standard solutions containing inositols, and the spiked extracted soil samples with inositol solution were all analyzed with an instrumental combination of a Capillary Electrophoresis instrument coupled manually to an Electrospray mass spectrometer, where the first was operated at reversed mode and the second at negative mode. To achieve the best feasible separation, several background electrolyte solutions were created along with a large number of sheath liquids regulated by an LC pump, two Capillary Electrophoresis methods, and twenty-five distinct MS methods, all tested through extensive screening to obtain the best possible combination of parameters. Out of the obtained results from the runs, four background electrolyte solutions, two MS methods, one sheath liquid controlled by one specific flow rate, and one Capillary Electrophoresis method exhibited promising potentials with a satisfying outcome. However, the intense pulsation of the spray cone observed for many of the runs, the manual protrusion of the Capillary Electrophoresis fused silica capillary, and some random errors, the repeatability of the method is called into question.

One of the consequences of G-protein-coupled receptor activation is stimulation of phosphoinositol metabolism, leading to the generation of IP 3 and its metabolites 1,3,4,5-tetrakisphosphate (IP4) and inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate (IP6). Previous reports indicate that high inositol polyphosphates (IP4 and IP6) are involved in clathrin-coated vesicular recycling. In this study, we examined the effects of IP4 and IP6 on spontaneous transmitter release in the form of miniature endplate potentials (MEPP) and on enhanced vesicular recycling by high K+ at frog motor nerve endings. In resting conditions, IP4 and IP6 delivered intracellularly via liposomes, caused concentration-dependent increases in MEPP frequency and amplitude. Pretreatment with the protein kinase A (PKA) inhibitor H-89 or KT 5720 reduced the IP4-mediated MEPP frequency increase by 60% and abolished the IP6-mediated MEPP frequency increases as well as the enhancement in MEPP amplitude. Pretreatment with antibodies against phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-K), enzyme also associated with clathrin-coated vesicular recycling, did not alter the IP4 and IP6-mediated MEPP frequency increases, but reduced the MEPP amplitude increase by 50%. In our previous reports, IP3, but not other second messengers releasing Ca2+ from internal Ca2+ stores, is able to enhance the MEPP amplitude. In order to dissociate the effect of Ca2+ release vs. metabolism to IP4 and IP 6, we evaluated the effects of 3-deoxy-3-fluoro-inositol 1,4,5-trisphosphate (3F-IP3), which is not converted to IP 4 or IP6. 3F-IP3 produced an increase then decrease in MEPP frequency and a decrease in MEPP amplitude. In elevated vesicle recycling induced by high K+-Ringer solution, IP4 and IP6 have similar effects, except decreasing MEPP frequency at a higher concentration (10-4 M). We conclude that (1) high inositol polyphosphates may represent a link between IP3 and cAMP pathways; (2) the IP3-induced increase of MEPP amplitude is likely to be due to its high inositol metabolites; (3) PI 3-K is not involved in the IP 4 and IP6-mediated MEPP frequency increases, but may be involved in MEPP size.

Pleckstrin homology (PH) domains, which play an essential role in membrane trafficking and signal transduction, recognize phosphoinositides with a diverse range of affinities and specificities. The PH domains of the Grp1 family of Arf GTPase exchange factors recognize a select group of phosphoinositides with dramatic differences in specificity, despite 90% sequence identity. The work described in this thesis has focused on the structural basis for these differences. The structure of the Grp1 PH domain revealed structural determinants for phosphoinositide recognition. Through a wide range of crystallographic and biochemical means, the structural basis that accounts for the differential binding affinities amongst the Grp1 family PH domains has also been determined. Furthermore, examination of the structural details of these PH domains bound to different inositol phosphate groups have aided in understanding the structural mechanisms by which all PH domains recognize phosphoinositides.

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L’Ins(1,4,5)P3 joue un rôle évident dans la signalisation cellulaire :il permet la libération du Ca 2+ des stocks intracellulaires par son action au niveau de récepteurs spécifiques. Pour mettre fin à son action, l’Ins(1,4,5)P3 peut être dégradé par une Ins(1,4,5)P3 5-phosphatase en Ins(1,4)P2, un métabolite inactif. L’Ins(1,4,5)P3 peut aussi être transformé en Ins(1,3,4,5)P4 par une Ins(1,4,5)P3 3-kinase. L’Ins(1,3,4,5)P4 semble posséder des capacités de signalisation propres ou au contraire liées à celles de l’Ins(1,4,5)P3.<p>L’Ins(1,3,4,5)P4 est aussi le point de départ de toute une série d’inositol hautement phosphorylés, dont les rôles ne sont pas clairs. Trois isoformes de l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase existent (A, B et C). Ces isoformes possèdent un domaine catalytique carboxy-terminal bien conservé. Par contre, les domaines amino-terminaux sont spécifiques et leur permettraient d’établir des interactions ou de subir des régulations propres. Pour tenter d’élucider le rôle fonctionnel de l’Ins(1,3,4,5)P4, nous avons généré et analysé des souris déficientes pour les isoformes B et C de cette enzyme.<p>Les souris déficientes pour l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase C ne présentent pas de phénotype évident, ce qui suggère que son rôle n’est pas crucial ou que son absence peut être compensée par une autre enzyme.<p>Les souris déficientes pour l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase B, par contre, présentent une immunodéficience caractérisée par une absence spécifique des lymphocytes T αβ périphériques. Cette absence fait suite à un blocage dans la différenciation du précurseur du lymphocyte, le thymocyte. Les caractéristiques de la signalisation induite par le récepteur de surface (TCR) permettent la sélection des thymocytes, de manière à constituer un pool de lymphocytes T restreints pour le MHC et tolérants pour le soi. Nous avons montré que ces phénomènes de sélection étaient défectueux dans les thymocytes mutants, du fait de leur hyporéactivité à la stimulation par le TCR. Le mécanisme responsable de cette hyporéactivité n’est pas encore élucidé. A première vue, la mobilisation de Ca 2+ ne semble pas altérée dans ces thymocytes mutants en réponse à des stimulations classiques. Cependant, d’autres types de stimulation, se rapprochant plus de celles réellement rencontrées par le thymocyte in vivo, doivent encore être investigués. L’intégrité d’autres voies de signalisation cruciales du lymphocyte T doit aussi être vérifiée.<p>En conclusion, l’isoforme B de l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase et l’Ins(1,3,4,5)P4 qu’il produit jouent un rôle crucial dans la différenciation du thymocyte, par un mécanisme qui reste encore à déterminer. / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished