O psilídeo Diaphorina citri é vetor das bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus e Ca. L. americanus, associadas ao Huanglongbing (HLB) dos citros. Apesar da grande importância desta doença no mundo, sabe-se pouco sobre a atividade alimentar deste vetor, o que seria fundamental para entender o processo de transmissão desses patógenos e aprimorar estratégias de manejo da doença. Assim, esta pesquisa teve por objetivos: a) examinar aspectos morfológicos do aparato bucal de D. citri; b) caracterizar o seu comportamento alimentar em mudas de laranja doce (Citrus sinensis) através da técnica de Electrical Penetration Graph (EPG)-sistema DC; e c) avaliar o efeito da idade de folhas cítricas na penetração estiletar deste inseto e na eficiência de aquisição de Ca. L. asiaticus. Adultos de D. citri apresentam um rostro que se projeta logo após o par de coxas protoráxicas. Verificou-se que na extremidade distal desta estrutura há quatro pares de sensilas em simetria bilateral. O rostro abriga um feixe de quatro estiletes (2 mandíbulas e 2 maxilas) com comprimento médio de 512 µm. Os estiletes maxilares se acoplam formando os canais alimentar e salivar com diâmetros de 0,90 µm e 0,47 µm, respectivamente; esses dois canais se fundem próximo à extremidade distal de uma das maxilas para formar um canal comum, que se estende por, aproximadamente, 4,1 µm. No estudo de EPG, as formas de onda foram descritas quanto à amplitude, frequência, nível de voltagem e origem elétrica, sendo correlacionadas com atividades estiletares baseando-se em análises histológicas da posição da extremidade distal da bainha salivar no tecido vegetal e semelhanças com outras formas de onda descritas para afídeos. Cinco formas de onda foram descritas: (C) penetração intercelular no parênquima; (D) contato com o floema; (E1) salivação no floema; (E2) ingestão no floema; e (G) ingestão no xilema. Com um tempo médio de 206,1 min em 8 h de registro, a ingestão no floema (E2) é a principal atividade observada em D. citri. O tempo médio para atingir o floema desde a primeira prova é de 154 min, após 20,3 provas. D. citri mostra nítida preferência por folhas novas da porção superior da planta (71,3% dos indivíduos), e pela nervura principal na face abaxial das folhas (87,1%). Cortes histológicos revelam que folhas maduras apresentam lignificação nas paredes de células que compõem a camada de fibras, tecido que antecede o feixe floemático; já as folhas novas não apresentam esse espessamento, favorecendo o caminhamento estiletar rumo ao floema. Adultos de D. citri adquirem Ca. L. asiaticus com maior eficiência em folhas novas (assintomáticas) do que em folhas maduras (sintomáticas) de plantas infectadas. Aplicando-se a técnica de EPG, verificou-se que as folhas novas favorecem a alimentação floemática de D. citri; quase que a totalidade dos indivíduos avaliados sobre folhas novas assintomáticas encontraram o floema e permaneceram por mais tempo neste tecido, o que não foi constatado sobre folhas maduras sintomáticas. Esta pesquisa mostra que o comportamento alimentar de D. citri é influenciado pela idade das folhas cítricas, com implicações sobre a eficiência de aquisição da bactéria. / The Asian citrus psyllid, Diaphorina citri, is the vector of the phloem-limited bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus and Ca. L. americanus, which are associated to the serious disease known as Citrus Huanglongbing (HLB). Despite the importance of this disease worldwide, little is known about the feeding activities of the vector, which is essential to understand transmission mechanisms and establish disease management strategies. Thus, the goals of this research were to examine the morphology of D. citri mouth apparatus, to characterize its probing behavior on sweet orange (Citrus sinensis) seedlings by using the Electrical Penetration Graph (EPG)-DC technique, and to assess the effect of citrus leaf age on the stylet penetration and efficiency of acquisition of Ca. L. asiaticus. D. citri shows a coneshaped rostrum that extends itself to behind the prothoracic pair of thighs. By electron microscopy, we found four pairs of sensilla symmetrically distributed on the distal end of the rostrum. The rostrum houses a stylet bundle comprised of two mandibulae and two maxillae with mean length of 512 µm. The two maxillary stylets are hold together and have internal grooves that form the food and salivary duct, with mean diameters of 0.9 and 0.47 µm, respectively. These two canals merge at a distance of 4.1 µm from the distal tip of the stylets, forming a common duct. In the EPG study, waveforms were described according to characteristics of amplitude, frequency, voltage level and electrical origin, and correlated with stylet activities based on histological analysis of salivary sheath termini in the plant tissue and similarities with EPG waveforms previously described for aphids. Five distinct waveform types were described: (C) intercellular stylet pathway through parenchyma, (D) phloem contact, (E1) salivation in the phloem sieve tubes, (E2) phloem sap ingestion, and (G) in xylem sap ingestion. Phloem sap ingestion (E2) is the main activity observed for D. citri, with an average time of 206.1 min in 8 h of recordings. Mean time to reach sieve tubes from the first probe is 154 min, after 20.3 probes. This insect shows a clear preference for young leaves of the upper portion of the plant (71.3% of the individuals), and main vein on the abaxial leaf surface (87.1%). Mature leaves show lignification in cell walls of the fiber layer adjacent to the phloem. In contrast, young leaves do not show cell wall thickening in this fiber layer, favoring stylet pathway towards the phloem. Adults of D. citri acquired L. Ca asiaticus with greater efficiency on young (asymptomatic) leaves than in mature (symptomatic) leaves from infected plants. Applying the EPG technique, it was found that young asymptomatic leaves favor phloem feeding by D. citri, since most individuals reached phloem sieve tubes and remained longer in this tissue; this was not the case for individuals confined on mature symptomatic leaves. This study shows that feeding behavior of D. citri is influenced by citrus leaf age, with implication on efficiency of bacterial acquisition from infected plants.

Source: Masters Abstracts International, Volume: 47-06, page: 3395. Advisers: Kristy O. Murray; George L. Delclos. Includes bibliographical references.

Les virus de l’enroulement de la vigne (Grapevine leafroll-associated virus, GLRaV) sont répandus mondialement et transmis à la vigne uniquement par cochenilles (Coccoidea). En France, l’enroulement viral affecte particulièrement les vignobles des régions septentrionales.L’approche biologique de la vection a montré la capacité de Phenacoccus aceris à transmettre à la vigne les GLRaV-1, -3, -4, -5, -6, -9 et ceux du bois strié Grapevine virus A et B. Cette étude est la première démonstration de la transmission du GLRaV-6 et confirme l’absence de spécificité des cochenilles dans la transmission des Ampelovirus. Les larves néonates de P. aceris et de Neopulvinaria innumerabilis représentent un stade de développement efficace pour la transmission de ces virus. En conséquence, leurs capacités vectrices, associées à leur fort potentiel de dissémination anémophile, impliquent un risque important de dispersion naturelle de ces virus dans un vignoble infesté. Les relevés sur quatre parcelles distinctes montrent que Parthenolecanium corni, Pulvinaria vitis, Heliococcus bohemicus et P. aceris sont communes, chaque vignoble différant par la diversité spécifique, le taux de ceps infestés et l’abondance des cochenilles. L'étude épidémiologique prouve le rôle des cochenilles dans la dispersion de l’enroulement viral dans les vignobles septentrionaux. A Bonzon, la responsabilité de P. aceris dans la diffusion rapide du GLRaV-1 est mise en évidence. Cette découverte représente la première preuve en Europe d’une dispersion naturelle du GLRaV-1. A Marsannayla-Côte, l’incidence du GLRaV-1 reste faible, la colonie de P. aceris ne semblant avoir qu’un rôle très limité dans la diffusion de la maladie. L'épidémiologie moléculaire à Bonzon révèle une diversité génétique importante du GLRaV-1 à l’échelle parcellaire et fournit pour la première fois des données sur le polymorphisme génétique d'une population de GLRaV-1 ayant été dispersée par des cochenilles. / Grapevine leafroll viruses (Grapevine leafroll-associated virus, GLRaV) are present worldwide and transmitted to grapevine only by scale insect vectors (Coccoidea). In France, leafroll disease is present in all vine-growing areas, particularly in north-eastern regions. The biological approach of transmission allowed us to show the capacity of the mealybug Phenacoccus aceris to transmit the viruses GLRaV-1, -3, -4, -5, -6, -9 and the rugose wood viruses Grapevine virus A and B. This study represents the first evidence of the transmission of GLRaV-6 and confirms the absence of mealybug specificity in the transmission of Ampelovirus. First instar nymphs of P. aceris and of Neopulvinaria innumerabilis represent a very efficient development stage in the transmission of leafroll and rugose wood viruses. As a consequence, their vector capacities associated with the high potential of dispersal of these nymphs imply an important risk of natural spread of viruses in an infested vineyard. The entomological monitoring on 4 plots shows that Parthenolecanium corni, Pulvinaria vitis, Heliococcus bohemicus and P. aceris are common in vineyards, each site differing by the specific diversity, the level of infested stocks and the abundance of scale insects on stocks. The epidemiological study proves the role of scales insects in the dispersal of leafroll disease in the vineyards of north-eastern France. In Bonzon, the major role of P. aceris in the rapid spread of the GLRaV-1 is demonstrated. This finding represents the first report in Europe of a natural spread of GLRaV-1. In Marsannay-la-Côte, the incidence of the GLRaV-1 remains low and the colony of P. aceris, not associated to grapevine, seems to have only a very limited role in the disease spread. The molecular epidemiology study in Bonzon reveals an important genetic diversity of GLRaV-1 within a signle plotand supplies for the first time information on the genetic polymorphism of a GLRaV-1population being spread by scale insects.

Este trabalho foi realizado com o objetivo de identificar cigarrinhas vetoras ou potenciais vetoras de Xylella fastidiosa Wells et al. em pomares cítricos do litoral norte da Bahia, determinando-se as espécies predominantes com ênfase na subfamília Cicadellinae. Os levantamentos foram conduzidos no período de março/2002 a fevereiro/2003, em cinco propriedades do litoral norte do Estado da Bahia, nos municípios de Alagoinhas, Inhambupe e Rio Real, em pomares de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] cv. Pêra, enxertada sobre limão cravo (Citrus limonia Osbeck) com idade de 7 a 9 anos. Em cada pomar, foram instalados 15 cartões adesivos amarelos de 8,5 X 11,5 cm, dispostos em um espaçamento de 40x40 m. Os cartões foram amarrados a 1,5 m de altura em ramos da face norte, na periferia da copa, sendo substituídos periodicamente. Também foram realizadas avaliações periódicas na vegetação rasteira presente nas entrelinhas dos pomares através de rede de varredura, amostrando-se, em cada avaliação, cinco pontos escolhidos aleatoriamente e efetuando-se 30 redadas por ponto. Os dados de coleta foram submetidos a uma análise faunística, calculando-se os índices de constância, freqüência, abundância, dominância, diversidade, eqüitabilidade e similaridade. Coletaram-se 1860 espécimes pertencentes a 54 espécies de sete famílias da subordem Auchenorrhyncha, sendo a maioria deles das famílias Cicadellidae (84,3%) e Membracidae (14,2%). Um maior número de espécies de Auchenorrhynca foi observado em pomar vizinho a mata nativa pouco degradada. A subfamília Cicadellinae, que inclui os vetores de X. fastidiosa, foi a mais representativa em número de espécies (15) e de indivíduos coletados (63,92%). Observou-se variação na composição de espécies de Cicadellinae dependendo do método e local de amostragem, evidenciando-se a existência de dois grupos de potenciais vetores habitando a copa das laranjeiras e a vegetação rasteira. Acrogonia flagellata Young, A. citrina Marucci & Cavichioli, Homalodica sp. e Cicadellini sp.1 predominaram nos cartões adesivos amarelos (árvores cítricas), enquanto que Hortensia similis (Walker) e Erythrogonia dubia (Medler) foram dominantes na rede de varredura (vegetação rasteira). Entre as espécies de Cicadellinae já conhecidas como vetoras de X. fastidiosa em citros, apenas A. citrina, Bucephalogonia xanthophis (Berg) e Ferrariana trivittata (Signoret) foram observadas, sendo que as duas últimas foram de ocorrência acidental na vegetação rasteira. Entre os novos potenciais vetores, A. flagellata, Homalodisca sp. e Cicadellini sp.1 são espécies predominantes nos pomares cítricos do litoral norte da Bahia, devendo ser investigadas quanto à capacidade de transmissão de X. fastidiosa para citros. / This study was carried out to identify vectors or potential vectors of Xylella fastidiosa Wells et al. in citrus groves of the north coast of Bahia State, Brazil, based on a faunistic survey and determination of predominant sharpshooter leafhoppers (subfamily Cicadellinae). The survey was carried out from March/2002 to February/2003 in five old sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck, cv. Pêra, grafted on rangpur lime (Citrus limonia Osbeck); 7-9 years old] groves of northeastern Bahia State, located in Alagoinhas, Inhambupe and Rio Real. Fifteen yellow sticky cards (8,5 X 11,5 cm) were installed 40x40 m apart in each grove, hanged at the height of 1.5 m on the upper north side of citrus canopies. Cards were replaced monthly or fortnightly. A sweep net was periodically used to sample leafhoppers in the herbaceous weeds inside the groves, by selecting five points at random and performing 30 sweeps in each point (sample unit). Data was uses to calculate indices of constancy, frequency, abundance, dominance, diversity, equitability and similarity. A total of 1860 specimens of 54 species belonging to 7 families of suborder Auchenorrhyncha were collected, most of them in the families Cicadellidae (84,3%) and Membracidae (14,2%). A larger number of species was observed in a grove located nearby a non-degraded native wood. The subfamily Cicadellinae, which includes the sharphooter vectors of X. fastidiosa, showed the largest number of species (15) and specimens (63,92%). There was a variation in Cicadellinae species composition depending upon the sampling method, which indicates that two distinct groups of potential sharpshooter vectors are inhabiting the citrus canopy and the weedy vegetation. Acrogonia flagellata Young, A. citrina Marucci & Cavichioli, Homalodica sp. e Cicadellini sp.1 predominate in the yellow sticky cards hanged on the citrus canopy, whereas Hortensia similis (Walker) e Erythrogonia dubia (Medler) were dominant species on weeds. Among the Cicadellinae species already known as vectors of X. fastidiosa in citrus, only A. citrina, Bucephalogonia xanthophis (Berg) e Ferrariana trivittata (Signoret) were found; the two latter species were accidentally trapped by sweep net in the weedy vegetation. Among the new potential vectors, A. flagellata, Homalodisca sp. e Cicadellini sp.1 are predominant species in citrus groves of the north coast of Bahia and should be tested with respect to their ability to transmit X. fastidiosa to citrus.

A cultura do tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é importante mundialmente devido ao alto consumo de seus frutos. Nos últimos anos surgiram nesta cultura no Brasil alguns vírus emergentes com altas taxas de disseminação, como begomovírus e crinivírus, transmitidos pela Bemisia tabaci biótipo B, que podem causar danos à produção do tomateiro. A espécie de begomovírus atualmente mais encontrada no Brasil, em plantios de tomateiro, é o Tomato severe rugose virus (ToSRV). De 2002 a 2004, pesquisadores relataram incidências desse vírus em mais da metade das amostras com sintomas de geminiviroses coletadas em vários estados brasileiros e sua presença continua sendo verificada frequentemente. No ano de 2006, um crinivírus, o Tomato chlorosis virus (ToCV), foi relatado no Brasil, infectando plantas de tomate no Estado de São Paulo e atualmente encontra-se presente em diveros estados brasileiros. Os objetivos desse trabalho foram: determinar os períodos mínimos de acesso à aquisição e à inoculação do ToSRV e do ToCV pela B. tabaci biótipo B; identificar o período de retenção do ToSRV no inseto e a interação do ToSRV e do ToCV na aquisição e na transmissão por esse aleirodídeo. Também foi avaliada a eficiência do inseticida cloridrato de cartape no controle da disseminação primária e secundária do ToSRV pela B. tabaci biótipo B em tomateiros em gaiolas em casa de vegetação. Finalmente avaliou-se a eficiência do aleirodídeo Trialeurodes vaporariorum na transmissão de um isolado brasileiro do ToCV. Os períodos mínimos de acesso à aquisição e à inoculação de ambos os vírus pela B. tabaci biótipo B foram de cinco minutos. O tempo de retenção do ToSRV em B. tabaci biótipo B foi de 25 dias. A eficiência de um único adulto de B. tabaci na transmissão simultânea do ToSRV e do ToCV para tomateiros foi de 44,7%, similar àquela da transmissão isolada do ToRSV (47,4%) e do ToCV (44,7%). A eficiência de T. vaporariorum na transmissão do ToCV foi inferior à da B. tabaci biótipo B. Usando 40 insetos por vaso com duas plantas as eficiências de transmissão foram 57,7% e 100%, respectivamente. O inseticida cloridrato de cartape reduziu a infecção secundária do ToSRV pela B. tabaci biótipo B, mas não foi eficiente para reduzir a infecção primária em tomateiros. / Tomato (Solanum lycopersicum) is one of the leading vegetables grown and consumed in Brazil and in the world, after potato. The importance of tomato is related to its high consumption worldwide and also its nutritive value. Presently the most important virus diseases responsible for yield losses on tomato crops in Brazil are those caused by begomovirus and crinivirus, both transmitted by Bemisia tabaci biotype B. At the moment the prevalent species of begomovirus is Tomato severe rugose virus (ToSRV). From 2002 to 2004, researchers reported incidence of this virus in more than half of the symptomatic tomato samples collected in several Brazilian states. In 2006, a crinivirus, Tomato chlorosis virus (ToCV), was reported for the first time in Brazil, infecting tomato plants in the State of São Paulo and at present the virus occurs in several Brazilian states. The objectives of this study were to determine the minimum acquisition and inoculation access periods of ToSRV and ToCV by B. tabaci biotype B; identify the retention period of ToSRV in the insect; and the interaction of ToSRV and ToCV on the transmission by this aleyrodidae. It was also evaluated the effectiveness of the insecticide cartap hydrochloride in controlling the primary and secondary spread of ToSRV by B. tabaci biotype B on tomato plants in a greenhouse. Finally, it was evaluated the efficiency of Trialeurodes vaporariorum in the transmission of a Brazilian isolate of ToCV. The minimum acquisition and inoculation access periods for both viruses by B. tabaci biotype B were five minutes. The maximum retention time of ToSRV in B. tabaci biotype B was 25 days. The efficiency of a single adult of B. tabaci to simultaneously transmit ToSRV and ToCV to tomato plants was 44.7%, similar to the transmission of ToRSV (47.4%), and ToCV (44.7%) separately. T. vaporariorum was less efficient than B. tabaci on the transmission of ToCV. Using 40 insects per pot with two plants, transmission efficiencies were 57.7% and 100%, respectively. The insecticide cartap hydrochloride reduced secondary infection of ToSRV transmitted by B. tabaci biotype B, but was not effective in reducing the primary infection in tomato.

Huanglongbing (HLB), considerada uma das mais graves doenças dos citros, está associada a Candidatus Liberibacter spp., bactérias endógenas restritas ao floema e de difícil cultivo em meio de cultura. Diferentemente de outras doenças que afetam plantas cítricas, ainda não foram encontradas dentro do gênero Citrus espécies resistentes ao HLB. Genes de interesse agronômico têm sido empregados na transformação genética de citros visando a resistência a doenças. Dentre estes, destacam-se os que conferem resistência a bactérias incluindo attA, que codificam os peptídeos antibacterianos atacinas, e hrpN, que ativam a produção de proteínas harpinas, relacionadas ao sistema de defesa. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência de plantas de laranja doce contendo o gene da atacina A (attA) ou o gene da harpina (hrpN) à Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) utilizando duas formas de inoculação: borbulhões infectados e o inseto vetor da bactéria, Diaphorina citri. Para as plantas contendo o gene hrpN, apenas o segundo método foi utilizado. Os principais sintomas do HLB foram observados aos quatro e oito meses após a inoculação por borbulhões. A infecção das plantas foi confirmada com a detecção de CLas por PCR (quatro e oito meses) e Rt-qPCR (oito meses). Em plantas inoculadas por D. citri, os sintomas foram observados oito e doze meses após a inoculação, assim como a detecção da bactéria por PCR. Após 15, 17 e 18 meses, foi realizada uma nova avaliação por Rt-PCR a partir de spots (imprints em membrana) de folhas. Rt-PCR foi empregado também em spots dos psilídeos utilizados na inoculação. Não foi possível avaliar a resistência ao HLB em plantas contendo o gene attA ou hrpN a partir da inoculação por D. citri. Os resultados de detecção da bactéria nas plantas e nos psilídeos utilizados para inoculação indicam que, possivelmente, não ocorreu a inoculação devido ao baixo percentual de psilídeos que continham CLas utilizados. Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA inoculadas por borbulhões infectivos, oito eventos (cinco de laranja Pera, dois de laranja Hamlin e um de laranja Valência) apresentaram menores títulos bacterianos e algumas também demonstraram redução dos sintomas do HLB quando comparadas com plantas não transgênicas, oito meses após a inoculação, indicando uma possível ação do peptídeo atacina A contra o agente causal do HLB. / Haunglongbing (HLB), considered one of the most serious diseases of citrus, is associated to Candidatus Liberibacter spp., endogenous and phloem-inhabiting bacteria not easily grown in culture medium No species within the genus Citrus is known to resist this bacterial infection. The use of genes of agronomic interest for genetic transformation aiming disease resistance in citrus has been reported. Among these genes, attA that codes for the antibacterial peptides attacin, and hrpN, that codes for proteins harpin that activate the plant defense system may have potential in searching for HLB resistance. The objective of this study was to evaluate the resistance of sweet orange containing attA or hrpN to Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) inoculated through infected budstick grafting or the insect vector, Diaphorina citri. For the plants containing hrpN, only the second method was used. The most obvious HLB symptoms were observed four and eight months after inoculation by infected budstick when CLas also was detected by PCR (four months) and RT-qPCR (eight months). For those inoculated with D. citri, symptoms were observed and bacteria detected eight and twelve months after inoculation. Fifteen, 17 and 18 months after inoculation, a new attempt was made for CLas detection, now through Rt-PCR from leaf and psyllids imprinting spots on membrane. It was not possible to evaluate the HLB resistance in plants containing attA or hrpN gene from D. citri inoculation. The results of CLas detection in plants and psyllids indicate that possibly there was no inoculation due the low rate of psyllids contained CLas used. Among the plants containing attA, five, two and one event of, respectively, Pera, Hamlin, and Valencia sweet orange had lower bacterial titers than those non transgenic plants and some also showed milder HLB symptoms, eight months after inoculation, suggesting a possible effect of attacin A against the causal agent of HLB.

Orientador: Alessandra Alves de Souza / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T17:07:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Niza_Barbara_M.pdf: 2368175 bytes, checksum: 2c97ffad74e7a3e1c33ae99c78818b99 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A citricultura brasileira é um importante setor para a economia do país, contribuindo com superávits comerciais e geração de empregos, entretanto, o setor passa por uma grave crise econômica em decorrência do alto custo de produção e do baixo valor pago pela caixa de laranja no Brasil. O principal motivo do alto custo de produção é a alta incidência de pragas e doenças que atingem essa cultura. Dentre as doenças, a Clorose Variegada do Citros (CVC) causada pela bactéria Xylella fastidiosa e transmitida a seus hospedeiros por cigarrinhas vetoras, é a que até hoje causou mais danos à citricultura brasileira. O mecanismo de patogenicidade da X. fastidiosa permanece não conclusivo porém a hipótese mais aceita está relacionada à facilidade da bactéria em colonizar o hospedeiro, ou seja, em se movimentar e multiplicar dentro dos vasos do xilema da planta infectada, seguido da formação do biofilme. O conhecimento da doença bem como das interações planta-patógeno e vetor-patógeno estão muito avançados para a doença de Pierce (PD), doença causada pela X. fastidiosa em videiras nos Estados Unidos. Esse avanço no conhecimento para PD ocorreu principalmente devido à obtenção de estirpes geneticamente modificadas da bactéria, permitindo a execução de estudos funcionais e de colonização. A implementação da aquisição de X. fastidiosa em sistema de dieta artificial para estudos com o vetor também foi de grande contribuição para esse avanço, uma vez que esse sistema elimina a utilização de plantas fonte para aquisição da bactéria. Em citros, sabe-se que existem fontes de resistência natural à CVC como tangerinas, tangors, limas e limões, entretanto, todas as variedades de laranja doce plantadas no Brasil são suscetíveis a essa doença. Sabe-se também que há uma resposta genética diferente entre um genótipo resistente e o suscetível quando inoculados com X. fastidiosa, porém, não se conhece como se dá a colonização in planta, e se existe uma correlação entre a resposta genética da planta e o comportamento da bactéria. Buscando melhorar o entendimento dos fatores envolvidos no patossistema CVC este trabalho teve como objetivo a obtenção de uma estirpe patogênica de X. fastidiosa de citros transformada com a proteína verde fluorescente (GFP) afim de avaliar sua colonização in planta em genótipos parentais e híbridos de citros, resistentes e suscetíveis, além da implementação da aquisição de X. fastidiosa por cigarrinhas vetores por meio do sistema de dieta artificial. A obtenção do transformante de X. fastidiosa expressando GFP permitiu o acompanhamento da colonização da bactéria nos vasos do xilema de plantas suscetíveis e resistentes e a avaliação mostrou uma colonização diferenciada entre caule e pecíolo. Também foi verificado um padrão diferencial de colonização dos caules de genótipos suscetíveis em relação aos resistentes, no qual a bactéria parece não capaz de se mover em genótipos resistentes, permanecendo aprisionada no xilema primário dessas plantas, sugerindo um possível mecanismo de resistência. A implementação da aquisição de células bacterianas em sistema de dieta artificial foi estabelecida com sucesso para vetor e estirpe de X. fastidiosa em citros, abrindo perspectivas para vários estudos na área de interação vetor-patógeno e transmissão da CVC / Abstract: The citrus agribusiness is an important segment for the country economy, contributing to employment and trade surpluses, however, it is passing through an economic crisis on behalf of the high cost of production and the low price paid by the orange box in Brazil. The main reason for the high cost of production is the high incidence of pests and diseases affecting this crop. Among the diseases, the Citrus Variegated Chlorosis (CVC) is caused by the bacterium Xylella fastidiosa and transmitted to its hosts by sharpshooters, and it is the disease that more damage have been causing to the citrus agribusiness in Brazil. The X. fastidiosa pathogenicity mechanism still not clear but the currently accept hypothesis is related to its facility to colonize the host, in other words, on move and multiply within the xylem vessels of an infected host, followed by the biofilm formation. The knowledge about the disease and the interactions between plant-pathogen and vector-pathogen are advanced for the Pierce disease, which is caused by X. fastidiosa on grapes in the United States. This occurs mainly on behalf of bacterial mutant¿s obtainment, allowing functional and colonization studies, besides the artificial diet system establishment for insect vectors studies, once this system eliminates the use of source plant acquisition, a limiting factor for X. fastidiosa acquisition since its colonization in host plants is random. In citrus, is known that natural resistant sources against CVC exists like tangerine, tangors, limes and lemons, while all the sweet orange varieties grown in Brazil are susceptible. Also, was verified a different genetic response between a resistant and a susceptible genotype when inoculated with X. fastidiosa, although, the colonization process in planta still unkown as well as if there is a correlation between the plant genetic response and the bacterial behavior. In order to better understand the factors involved in the CVC pathosystem, this work had the goal of obtain a pathogenic X. fastidiosa strain from citrus transformed with the green fluorescent protein (GFP) to evaluate its colonization in planta on parent and hybrid citrus genotypes, resistant and susceptible, besides de X. fastidiosa artificial acquisition by the insect vector using the artificial diet system. Was obtained a X. fastidiosa strain transformed with the GFP which allowed the bacterial colonization monitoring within the xylem vessels of resistant and susceptible plants and this evaluation showed a differential colonization of stems and petioles. Was also verified a different stem colonization pattern between resistant and susceptible genotypes on which the bacteria seems to be not able to move in resistant ones, staying contained into the primary xylem of these plants, suggesting a possible mechanism of resistance. The bacterial cells acquisition on artificial diet system was successfully established using a citrus insect vector and bacterial strain, opening perspectives for various studies on vector-pathogen interaction and transmission of CVC / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Huanglongbing (HLB), considerada uma das mais graves doenças dos citros, está associada a Candidatus Liberibacter spp., bactérias endógenas restritas ao floema e de difícil cultivo em meio de cultura. Diferentemente de outras doenças que afetam plantas cítricas, ainda não foram encontradas dentro do gênero Citrus espécies resistentes ao HLB. Genes de interesse agronômico têm sido empregados na transformação genética de citros visando a resistência a doenças. Dentre estes, destacam-se os que conferem resistência a bactérias incluindo attA, que codificam os peptídeos antibacterianos atacinas, e hrpN, que ativam a produção de proteínas harpinas, relacionadas ao sistema de defesa. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência de plantas de laranja doce contendo o gene da atacina A (attA) ou o gene da harpina (hrpN) à Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) utilizando duas formas de inoculação: borbulhões infectados e o inseto vetor da bactéria, Diaphorina citri. Para as plantas contendo o gene hrpN, apenas o segundo método foi utilizado. Os principais sintomas do HLB foram observados aos quatro e oito meses após a inoculação por borbulhões. A infecção das plantas foi confirmada com a detecção de CLas por PCR (quatro e oito meses) e Rt-qPCR (oito meses). Em plantas inoculadas por D. citri, os sintomas foram observados oito e doze meses após a inoculação, assim como a detecção da bactéria por PCR. Após 15, 17 e 18 meses, foi realizada uma nova avaliação por Rt-PCR a partir de spots (imprints em membrana) de folhas. Rt-PCR foi empregado também em spots dos psilídeos utilizados na inoculação. Não foi possível avaliar a resistência ao HLB em plantas contendo o gene attA ou hrpN a partir da inoculação por D. citri. Os resultados de detecção da bactéria nas plantas e nos psilídeos utilizados para inoculação indicam que, possivelmente, não ocorreu a inoculação devido ao baixo percentual de psilídeos que continham CLas utilizados. Dentre as plantas transgênicas contendo o gene attA inoculadas por borbulhões infectivos, oito eventos (cinco de laranja Pera, dois de laranja Hamlin e um de laranja Valência) apresentaram menores títulos bacterianos e algumas também demonstraram redução dos sintomas do HLB quando comparadas com plantas não transgênicas, oito meses após a inoculação, indicando uma possível ação do peptídeo atacina A contra o agente causal do HLB. / Haunglongbing (HLB), considered one of the most serious diseases of citrus, is associated to Candidatus Liberibacter spp., endogenous and phloem-inhabiting bacteria not easily grown in culture medium No species within the genus Citrus is known to resist this bacterial infection. The use of genes of agronomic interest for genetic transformation aiming disease resistance in citrus has been reported. Among these genes, attA that codes for the antibacterial peptides attacin, and hrpN, that codes for proteins harpin that activate the plant defense system may have potential in searching for HLB resistance. The objective of this study was to evaluate the resistance of sweet orange containing attA or hrpN to Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) inoculated through infected budstick grafting or the insect vector, Diaphorina citri. For the plants containing hrpN, only the second method was used. The most obvious HLB symptoms were observed four and eight months after inoculation by infected budstick when CLas also was detected by PCR (four months) and RT-qPCR (eight months). For those inoculated with D. citri, symptoms were observed and bacteria detected eight and twelve months after inoculation. Fifteen, 17 and 18 months after inoculation, a new attempt was made for CLas detection, now through Rt-PCR from leaf and psyllids imprinting spots on membrane. It was not possible to evaluate the HLB resistance in plants containing attA or hrpN gene from D. citri inoculation. The results of CLas detection in plants and psyllids indicate that possibly there was no inoculation due the low rate of psyllids contained CLas used. Among the plants containing attA, five, two and one event of, respectively, Pera, Hamlin, and Valencia sweet orange had lower bacterial titers than those non transgenic plants and some also showed milder HLB symptoms, eight months after inoculation, suggesting a possible effect of attacin A against the causal agent of HLB.

O Greening ou Huanglongbing (HLB) é a doença mais devastadora dos citros na atualidade. Levantamentos mostram que a enfermidade está presente em cerca de 60% dos talhões do parque citrícola paulista, demostrando sua grande capacidade de disseminação. O psilídeo-asiático-dos-citros, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psylidae) é um importante vetor dos agentes causais associados ao HLB. Sua capacidade de dispersão está intimamente relacionada ao progresso da doença no campo. Não se tem conhecimento dos principais fatores que possam interferir no deslocamento do inseto até plantas cítricas. Sendo assim, a presente pesquisa teve como objetivo investigar a influência de alguns fatores ambientais sobre a dispersão do psilídeo D. citri, discutindo-os em relação à epidemiologia do HLB dos citros. Inicialmente foram realizados testes em laboratório para adaptação da metodologia de marcação, liberação e recaptura usando pó fluorescente. Grupos de psilídeos adultos foram marcados e sua sobrevivência avaliada, verificando a influência de quatro cores distintas de pó fluorescente (amarelo, azul, rosa e verde). Posteriormente realizaram-se estudos de campo com quatro liberações de psilídeos, com marcadores distintos, em quatro áreas experimentais circulares e adjacentes, sendo formadas por círculos concêntricos localizados a 18, 24 e 30 m de cada centro de liberação. Os insetos foram monitorados visualmente e por armadilhas adesivas amarelas. Nas 1ª e 2ª liberações, foi verificado o efeito das coberturas vegetais milho (Zea mays L.) e capim-braquiária (Brachiaria decumbens Stapf.) na dispersão de D. citri. Já nas 3ª e 4ª liberações, foi estudado o efeito de brotações no deslocamento do inseto. A influência dos ventos foi avaliada em ambas as situações. A análise de sobrevivência indicou que não houve interferência das quatro cores de pó fluorescente em D. citri, sendo a marcação visível no corpo dos insetos durante os 48 dias de avaliação. De acordo com as análises fatoriais, não foi observada qualquer interferência da cobertura vegetal milho, medindo 2 m de altura, na dispersão do inseto. Na presença de brotações, adultos de D. citri dispersaram menos em busca de novos hospedeiros, acumulando-se nas primeiras linhas de plantas cítricas. Após 6 horas da liberação, a capacidade de dispersão máxima de D. citri foi três vezes maior na condição de ausência de brotações. A dispersão média e a área total abrangida variaram assimptoticamente com o tempo, ou seja, o inseto possui inicialmente grande velocidade de dispersão, porém esta tende a se estabilizar com o incremento do tempo. Esses resultados deixam claro que D. citri realiza movimentos dependendo das condições fenológicas de seus hospedeiros, ressaltando a grande importância de se intensificar métodos de controle regionais em épocas em que o fluxo vegetativo das plantas cítricas não é tão intenso. / Greening or Huanglongbing (HLB) is the most devastating disease of citrus today. Surveys show that the disease is present in about 60% of the park stands citrus Sao Paulo, demonstrating its great ability to spread. The Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psylidae) is an important vector of the causative agents associated with HLB. Its ability to spread is closely related to disease progression in the field. There is no knowledge of the main factors that can affect the movement of the insect to citrus plants. Thus, the present study aimed to investigate the influence of some environmental factors on the dispersal of psyllid D. citri, discussing them in relation to the epidemiology of HLB of citrus. Initially tests were performed in the laboratory to adapt the methodology of marking, release and recapture using fluorescent powder. Groups of adult psyllids were marked and their survival assessed by checking the influence of four different colors of fluorescent powder (yellow, blue, pink and green). Subsequent studies were conducted with four field releases psyllids, with distinct markers on four experimental areas adjacent circular and being formed by concentric circles located at 18, 24 and 30 m for each center release. The insects were monitored visually and by yellow sticky traps. In the 1st and 2nd releases, was to determine the effect of cover crops maize (Zea mays L.) and grass (Brachiaria decumbens Stapf.) in the dispersal of D. citri. In the 3rd and 4th releases, were studied the effect of shootings in insect movement. The influence of the wind has been evaluated in both situations. Survival analysis indicated that there was no interference of the four colors of fluorescent powder on D. citri, and marking was visible on the body of insects during the 48 days of evaluation. According to the factor analysis, no interference of vegetation corn (measuring 2 m in height) was observed in the dispersal of the insect. In the presence of shoots, adult D. citri less dispersed looking for new hosts and it accumulate in the first lines of citrus plants. After 6 hours of release, the D. citri maximum dispersal was three times higher in the condition of absence of shoots. The dispersal medium and the total area covered varied asymptotically with time, ie the insect has initially high speed dispersal, but this tends to stabilize with increasing time. These results clearly show that D. citri performs movements depending on the phenology of its hosts, emphasizing the importance of intensifying regional control methods at times when the flow of plant citrus is not intense.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica utilizada como biopesticida contra insetos, principalmente Lepidoptera, Coleoptera e Diptera, e na produção de organismos geneticamente modificados. Com a descoberta da capacidade de Bt se movimentar sistemicamente em plantas, potencialmente atingindo insetos sugadores, surge uma nova possibilidade para o controle de Diaphorina citri Kuwayama, que transmite bactérias associadas ao Huanglongbing, uma séria doença da citricultura. O objetivo do trabalho foi desenvolver sistemas de aquisição de Bt por D. citri, in vitro e in planta, para estudos de patogenicidade. Uma estirpe de Bt transformada com o gene green fluorescent protein (Btk-gfp), cultivada em meio NYSM, foi usada como marcador de aquisição pelo inseto e movimentação nas plantas. Para o sistema de aquisição in vitro, selecionaram-se dietas com base na sobrevivência e atividade alimentar de D. citri. Btk-gfp foi adicionada à dieta selecionada, composta por uma solução de sacarose a 30% em água mineral com corantes alimentícios (verde 0,1% e amarelo 0,4%). A dieta foi acondicionada em um sachê formado por duas membranas de Parafilm®, sobre a parte inferior de uma placa de Petri de 40 mm de diâmetro (gaiola de alimentação). Dez insetos foram confinados em cada gaiola para períodos de acesso à aquisição (PAA) de até 48 h, estabelecendo-se 10 gaiolas por tratamento; como controle, utilizou-se a dieta sem Btk-gfp. Para testes de aquisição in planta, suspensões de Btk-gfp foram inoculadas em ramos novos cortados e no solo, próximo à haste de seedlings de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de murta [Murraya paniculata (L.) Jack], e em diferentes concentrações, avaliando-se a movimentação da bactéria após um período de 48 h. Posteriormente, adultos e ninfas de D. citri foram confinados nestas plantas para avaliar a aquisição de Btk-gfp, usando-se plantas inoculadas apenas com água como controle. Para os bioensaios de patogenicidade a D. citri, 21 estirpes de Bt foram testadas no sistema de aquisição em ramos cortados de murta e 5 estirpes em ramos cortados de laranja para ninfas de 3º. ínstar. In vitro, testaram-se 3 estirpes contra ninfas de 3º. ínstar e 9 contra adultos. Btgfp foi absorvido pelas raízes e ramos novos cortados de seedlings de laranja doce e de murta, e translocado até as folhas, mostrando movimentação sistêmica. Esta estirpe foi adquirida por adultos e ninfas de D. citri que se alimentaram nos ramos novos cortados, mantidos em suspensão bacteriana. O sistema de alimentação in vitro permitiu a aquisição de Bt-gfp (pellet ressuspendido na dieta de sacarose com corantes) por adultos de D. citri com apenas 12 h de PAA, mas 30 h é um período ótimo para exposição do inseto ao sistema. Nenhuma das nove estirpes testadas no sistema in vitro foi patogênica aos adultos de D. citri. Das 21 estirpes testadas contra ninfas de 3º. ínstar em ramos novos de murta, cinco causaram mortalidade de 24 a 45%, em 5 dias. Essas cinco estirpes também foram testadas contra ninfas dem ramos de citros cortados, causando mortalidade de 35 a 75% em 48 h. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium widely used as a biopesticide against insect pests, mainly Coleoptera, Lepidoptera and Diptera, or for engineering genetically-modified plants. The recent finding that Bt is able to move systemically within plants, potentially targeting piercing-sucking insects, suggests that the bacterium may be effective for microbial control of Diaphorina citri Kuwayama, the vector of Huanglongbing-associated bacteria, a serious citrus disease. The goal of this research was to develop in vitro and in planta acquisition systems of Bt by D. citri for pathogenicity assays. A transformed Bt strain with the green fluorescent protein gene (Btk-gfp), grown in NYSM medium, was used as a marker to demonstrate bacterial acquisition by the insect and movement within the plants. Artificial diets were selected for the in vitro acquisition system based on insect survival and feeding activity. Btk-gfp was added to the selected diet, a 30% sucrose solution in mineral water with green (0.1%) and yellow (0.4%) food coloring. The diet was placed inside a Parafilm® membrane sachet, covering the opening of the lower half of a 40-mm diameter culture plate, and forming the feeding cage. Ten D. citri adults or nymphs were introduced in each cage and allowed acquisition access periods (AAP) of up to 48 h on the diet; as a control, a diet without Btk-gfp was used. For testing the in planta acquisition system, Btk-gfp suspensions were inoculated in young stem cuttings or in the soil, near the stem of Citrus sinensis (L.) Osbeck and Murraya paniculata (L.) Jack seedlings, as well as in different concentrations, and bacterial movement was assessed after 48 h; plants inoculated with water were used as controls. D. citri adults and nymphs were confined on inoculated plants to verify Btk-gfp acquisition. In pathogenicity assays, 21 Bt strains were tested against 3rd instars of D. citri using the acquisition system with stem cuttings of M. paniculata and 5 strains were tested using citrus stem cuttings. The in vitro acquisition system was used to test pathogenicity of 3 and 9 Bt strains against 3rd-instar nymphs and adults, respectively. Bt-gfp absorbed by roots or young stem cuttings of inoculated C. sinensis and M. paniculata was detected in the leaves, showing systemic movement. Bt-gfp was isolated from groups of nymphs and adults that were fed on inoculated stem cuttings or on artificial diets with bacterial suspension, showing that both in planta and in vitro acquisition take place. D. citri adults can acquire Bt-gfp within 12 h of AAP to the artificial diet with bacterium inoculum, but 30 h is the optimum AAP. None of the nine Bt strains assayed in vitro were pathogenic to D. citri adults. Of 21 strains tested for pathogenicity against nymphs using inoculated stem cuttings of M. paniculata, five caused mortality rates varying from 24 to 45% mortality within 5 days. These five Bt strains were also tested against D. citri nymphs using young stem cuttings of C. sinensis, causing mortality rates of 35 to 75% within 48 h.