ASF1 est un chaperon d’histones H3-H4 impliqué dans de nombreux cancers. Comme bon nombre de protéines, ce chaperon exerce ses fonctions dans la cellule à travers des interactions protéine-protéine qu’il établit avec d’autres partenaires protéiques. La présente thèse porte sur le développement d’une stratégie originale de design de peptides inhibiteurs de ce type d’interactions souvent associées à des maladies. Cette stratégie rationnelle et itérative repose sur le couplage d’épitopes de liaison provenant de différents partenaires de l’interaction, et leur stabilisation par l’introduction de résidus « ancre » permettant ainsi d’engager un grand nombre de contacts avec la cible. L’extension de cette approche vers des peptidomimes permet par la suite de surmonter les obstacles liés à l’utilisation des peptides en thérapeutique tels que la biodisponibilité et la demi-vie. Appliquée au ciblage d’ASF1, cette méthode a permis de concevoir un peptide, ip4, présentant une affinité de 3nM pour sa cible, soit 3000 fois supérieure au partenaire naturel H3. Ce même peptide a été mimé avec succès par un composé, if3, de nature oligourée. Efficacement internalisés à l’aide d’une Cell Penetrating Peptide clivable, ces inhibiteurs présentent un effet antiprolifératif provoquant la mort des cellules cancéreuse, vraisemblablement dû au ciblage spécifique d’ASF1. / ASF1 is a histone H3-H4 chaperone implicated in several cancers. Like many proteins, this chaperone mediates its cellular functions through protein-protein interactions involving various protein partners. The present thesis focuses on the development of an original strategy to design inhibitory peptides targeting such disease-associated type of biological interactions. This rational and iterative strategy relies on the tethering of binding epitopes isolated from different partners, and stabilized by “anchor” residues that engage large number of atomic contacts with the target. The further progression of this approach toward a peptidomimetic strategy overcomes obstacles commonly associated to the therapeutic use of peptides such as biodisponibility and half-life. Applied for targeting ASF1, such method allowed the conception of a peptide, ip4, presenting a 3nM affinity for its target, which is 3000 fold higher than that of the natural partner H3. This peptide could be successfully mimicked by an oligourea structure, giving rise to the peptidomimetic if3. When coupled to a cleavable Cell Penetrating Peptide, these inhibitors displayed an on-target effect where they impeded cancerous cells proliferation, ultimately resulting in cells death.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les liposomes ayant des lipides cationiques (liposomes cationiques) sont évalués dans plusieurs domaines thérapeutiques pour la libération intracellulaire des oligonucléotides antisenses et des plasmides ayant différents gènes humains. La majorité de ces liposomes sont composés de dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE) pour assurer la déstabilisation de l'endosome suite à l'endocytose, et d'un lipide cationique pour assurer l'interaction avec les molécules d'ADN négativement chargés. Bien que les liposomes cationiques ont été administrés via les voies orale, pulmonaire et systémique, leur problème de stabilité dans différents milieux biologiques n'était pas complètement résolu. Il était déjà démontré que les liposomes cationiques ayant des ADN plamidiques sont déstabilisés par les protéines anioniques se trouvant dans le plasma. Les liposomes ayant une couche de poly(éthylène glycol) (PEG) à la surface ont largement contribué au développement des liposomes à longue circulation à cause de l'interaction réduite avec les protéines plasmatiques et les membranes cellulaires. Les liposome-PEG sont normalement préparés en faisant dissoudre le lipide-PEG avec les autres lipides et les phospholipides dans la phase organique avant l'hydratation et l'association des lipides en liposomes. Cette méthode conventionnelle d'incorporation de PEG possède plusieurs inconvénients. D'une part, les chaînes polymériques sont incorporées dans l'espace interne aqueux et entre les bicouches lipidiques où l'eau est normalement enfermée. Ceci réduit significativement le volume aqueux interne et nuit à l'incorporation des médicaments dans les liposomes. D'autre part, les molécules d'ADN sont reconnues pour se lier aux lipides cationiques dans les liposomes par des forces électrostatiques en formant des complexes ADN/liposome assez stables. Dans cette étude, nous présentons deux méthodes de modification des liposomes pré-formés, l'une est une réaction chimique ayant lieu dans le milieu aqueux et l'autre est une insertion des dérivés pégylés connus pour être non-toxiques et économiques. Ces nouvelles procédures de postmodification liposonnique s'effectuent dans des conditions douces et dans des temps très courts. L'efficacité de ces nouvelles méthodes a été prouvée par les mesures du changement de diamètre et de la charge apparente à la surface des liposomes. Les liposomes classiques DOPE/DOTAP (1:1) ont un potentiel zéta (Ç) moyen de +33 mV et l'incorporation par la méthode conventionnelle de 1 et 0.5 mol% de PE-PEG2000 (Phosphatidyléthanolamine-PEG2000) et PE-PEG5000réduit complètement la charge des liposomes. Une concentration cinquante fois plus grande de M-SC-PEG (N-hydroxysuccinimidyl carbonate méthoxy-PEG) et BTC-PEG (Benzotriazolyl carbonate PEG) était nécessaire pour réduire la charge des liposomes pré-formés d'une façon significative. La méthode d'insertion membranaire du PEG1760-nnonostéarate s'avère beaucoup plus avantageuse vu le temps très minime qu'elle requiert (1 minute) d'une part, et l'efficacité d'insertion proche de 95% d'autre part, une efficacité jamais préalablement atteinte.

Au cours de cette thèse, nous avons étudié deux protéines par RMN : la créatine kinase musculaire (CK-MM) et le domaine UIM-SH3 de la protéine STAM2, seuls ou en interaction avec leurs partenaires. La CK-MM est une enzyme active sous forme dimérique. Elle appartient à la famille des guanidino-kinases et intervient dans le processus énergétique de la cellule. Le but de l'étude était d'élucider le mode de fonctionnement de la CK-MM. Pour cela, nous avons enregistré des expériences de relaxation R1, R2 et des expériences de perturbation de déplacement chimique sur la CK-MM libre et complexée avec MgADP et sous forme TSAC. Ces expériences montrent que la boucle 320s, spécifique à la reconnaissance des substrats, possède une dynamique rapide en absence de substrats et une dynamique ralentie en présence de substrats. La fixation des substrats dans les sites actifs de la CK-MM induit des modifications conformationelles importantes. La protéine STAM2 est composée de deux UBDs : VHS, et UIM et d'un domaine SH3 connu pour interagir avec des déubiquitinases UBPY et AMSH. Cette protéine est impliquée dans la voie de dégradation lysosomale. L'objectif de cette étude est la caractérisation du complexe SH3/ubiquitine. Pour cela, nous avons enregistré des expériences de perturbation de déplacement chimique et de relaxation R1, R2 et nOes sur le complexe UIM-SH3/ubiquitine. Ces expériences mettent en évidence que les domaines UIM et SH3 sont capables d'interagir chacun avec une ubiquitine, avec une affinité de l'ordre de la centaine de micromolaire. L'interface entre les UBDs et l'ubiquitine implique majoritairement des résidus hydrophobes et conservés

La réparation de l’ADN par excision des nucléotides (NER) est un mécanisme capable de retirer une large variété de lésions causant une distorsion de la double hélice, comme celles causées par les rayons ultraviolets (UV). Comme toutes les voies de réparation de l’ADN, la NER contribue à la prévention de la carcinogénèse en prévenant la mutation de l’ADN. Lors de ce processus, il y a d’abord reconnaissance de la lésion par la protéine XPC/Rad4 (humain/levure) qui recrute ensuite TFIIH. Ce complexe déroule l’ADN par son activité hélicase et recrute l’endonucléase XPG/Rad2 ainsi que d’autres protéines nécessaires à l’excision de l’ADN. Lors de son arrivée au site de lésion, XPG/Rad2 déplace XPC/Rad4. TFIIH agit également lors de la transcription de l’ADN, entre autres par son activité hélicase. Outre cette similarité de la présence de TFIIH lors de la transcription et la réparation, il est possible de se demander en quoi les deux voies sont similaires. Nous nous sommes donc intéressés aux interactions impliquant TFIIH et la machinerie de réparation de l’ADN. Nous avons donc entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de ces interactions. Nous avons découvert que Rad2 et Rad4 possèdent un motif d’interaction en nous basant sur d’autres interactions de la sous-unité Tfb1 de TFIIH. Par calorimétrie à titrage isotherme, nous avons observé que les segments de ces deux protéines contenant ce motif interagissent avec une grande affinité au domaine PH de Tfb1. Le site de liaison de ces segments sur Tfb1PH est très semblable au site de liaison du domaine de transactivation de p53 et au domaine carboxy-terminal de TFIIEα avec Tfb1PH, tel que démontré par résonance magnétique nucléaire (RMN). De plus, tous ces segments peuvent faire compétition les uns aux autres pour la liaison à Tfb1PH. Nous avons aussi démontré in vivo chez la levure qu’une délétion de Tfb1PH crée une sensibilité aux radiations UV. De plus, la délétion de multiples segments de Rad2 et Rad4, dont les segments d’interaction à Tfb1PH, est nécessaire pour voir une sensibilité aux rayons UV. Ainsi, de multiples interactions sont impliquées dans la liaison de Rad2 et Rad4 à TFIIH. Finalement, les structures des complexes Rad2-Tfb1PH et Rad4-Tfb1PH ont été résolues par RMN. Ces structures sont identiques entre elles et impliquent des résidus hydrophobes interagissant avec des cavités peu profondes de Tfb1PH. Ces structures sont très semblables à la structure de TFIIEα-p62PH. Ces découvertes fournissent ainsi un lien important entre la transcription et la réparation de l’ADN. De plus, elles permettent d’émettre un modèle du mécanisme de déplacement de XPC/Rad4 par XPG/Rad2 au site de dommage à l’ADN. Ces connaissances aident à mieux comprendre les mécanismes de maintient de la stabilité génomique et peuvent ainsi mener à développer de nouvelles thérapies contre le cancer. / The nucleotide excision repair pathway (NER) is a mechanism capable of removing a wide variety of helix-distorting lesions, such as those caused by ultraviolet irradiation (UV). As all DNA repair pathways, NER contributes to the prevention of carcinogenesis by preventing DNA mutation. During this process, the lesion is first recognized by the protein XPC/Rad4 (human/yeast), which then recruits TFIIH. This complex unwinds the DNA with its helicase activity and then recruits the endonuclease XPG/Rad2 and other proteins necessary for DNA excision. Upon arrival at the lesion site, XPG/Rad2 displaces XPC/Rad4. TFIIH also acts in DNA transcription, using its helicase activity. In addition to the similarity of the presence of TFIIH in transcription and DNA repair, it is possible to ask ourselves how the two pathways are similar. We were interested in the interactions involving TFIIH and the DNA repair machinery. We have therefore undertaken a structural and functional characterization of these interactions. We have found that Rad2 and Rad4 have a motif of interaction based on other interactions of the Tfb1 subunit of TFIIH. Using isothermal titration calorimetry, we found that segments of these two proteins containing this motif interact with high affinity to the PH domain of Tfb1. The binding site of these segments is very similar to Tfb1PH binding site of transactivation domain of p53 and the carboxyl-terminal domain of TFIIEα with Tfb1PH, as demonstrated by nuclear magnetic resonance (NMR). In addition, these segments can compete with each other for binding to Tfb1PH. We also demonstrated in vivo that deletion of Tfb1PH in yeast creates a sensitivity to UV irradiation. In addition, the deletion of multiple segments of Rad2 and Rad4, including segments of interaction Tfb1PH, is required to observe a sensitivity to UV. Thus, multiple interactions are involved in the binding of TFIIH to Rad2 and Rad4. Finally, the structures of the Rad2-Tfb1PH and Rad4-Tfb1PH complexes were solved by NMR. These structures are identical to each other and involve hydrophobic residues interacting with shallow grooves on Tfb1PH. These structures are very similar to the structure of TFIIEα-p62PH. These findings provide an important mechanistic link between transcription and DNA repair. In addition, they provide a model of the mechanism of the displacement of XPC/Rad4 by XPG/Rad2 at the damaged site. This knowledge helps to better understand the mechanisms of genomic stability and can lead to novel cancer therapies.

Les mécanismes cellulaires anti-prolifératifs, lesquels comprennent l’apoptose, aussi appelée la mort cellulaire programmée, l’arrêt transitoire du cycle cellulaire et la sénescence, permettent à la cellule de prévenir, en réponse à différents stress, l’accumulation de mutations pouvant conduire à une prolifération incontrôlée et, éventuellement, au développement d’une tumeur. La régulation de ces différents mécanismes requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et l’activation conduit à une hausse de l’expression de gènes directement impliqués dans l’arrêt de la prolifération. Au cours des dernières années, l’ensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en évidence la complexité de sa fonction, de même que la multitude de voies de signalisation et de protéines avec lesquelles il coopère pour maintenir l’intégrité du génome. De ce fait, l’étude des mécanismes d’activation de p53 est de mise pour la compréhension de sa régulation et, éventuellement, pour la prévention et l’élaboration de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer. L’objet de cette thèse est la mise en évidence d’un mécanisme d’activation de p53 et de la sénescence par la protéine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mécanisme implique une interaction directe entre les deux protéines, plus précisément entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit également, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage à l’ADN de façon à faciliter la phosphorylation de p53 en sérine 15. Ainsi, en interagissant à la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue à la stabilisation et à l’activation de p53. En accord avec ce modèle, l’inhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend à diminuer le nombre de cellules sénescentes suite à l’expression de l’oncogène ca-STAT5A et à réduire l’accumulation nucléaire de p53 dans ces cellules. De la même façon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifnγ-/- sont moins susceptibles d’entrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifnγ+/+, suite à une exposition à des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de l’expression des gènes cibles de p53, ce qui démontre que SOCS1 est impliquée dans l’activation de p53 in vivo. Cette thèse a également pour but de mettre en évidence l’implication de SOCS1 dans l’activation d’autres facteurs de transcription et, par le fait même, de démontrer qu’elle peut agir comme un régulateur plus général de la transcription. Une étude approfondie de l’interaction entre SOCS1 et p53 a permis de démontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides aminés 36-67) est suffisant pour l’interaction. Plus précisément, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phénylalanine 54 (F54) sont les principaux résidus impliqués. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit à l’identification d’un motif conservé dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus d’un domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces résultats, SOCS1 est en mesure d’interagir avec chacune des deux protéines. Ainsi, la capacité de SOCS1 d’interagir et de réguler l’activité de p53 peut s’étendre à d’autres facteurs de transcription. En terminant, le mécanisme présenté dans cette thèse contribue à la compréhension de la régulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en évidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle était jusqu’alors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rôle pour SOCS1 permet d’expliquer de quelle manière une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut déclencher la sénescence ou l’apoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse réguler différents facteurs de transcription permet de la qualifier de régulateur général des facteurs de transcription composés d’un domaine de transactivation acide. / In response to different stress, three anti-proliferative mechanisms, namely apoptosis, also called programmed cell death, transient growth arrest and senescence, prevent the cells from cumulating mutations that can lead to uncontrolled proliferation and, eventually, to tumor development. Regulation of these mechanisms requires the activation of proteins called tumor suppressors. One of them, p53, is a transcription factor whose stabilization and activation lead to an increase in expression of genes directly implicated in cell cycle arrest. In the past years, studies about p53 showed how much its function is complex and with how many signaling pathways and proteins it cooperates to maintain genome integrity. Thus, studying the activation mechanisms of p53 is essential to understand its regulation and, thereby, to prevent tumor development and to elaborate new strategies for cancer treatment. The first aim of this thesis is to show a new activation mechanism of p53 and of senescence by the protein SOCS1, a suppressor of cytokine signaling. This mechanism implies a direct interaction between the two proteins, specifically between the SH2 domain of SOCS1 and the N-terminal transactivation domain of p53. SOCS1 also interacts with the DNA damage-regulated kinases ATM and ATR via its C-terminal domain, which contains a SOCS Box, to facilitate the phosphorylation of p53 on its serine 15. Thus, by interacting at the same time with p53 and ATM, SOCS1 contributes to stabilization and activation of p53. In accordance with this model, SOCS1 inhibition in human normal fibroblasts decreases the number of senescent cells in which the activated oncogene STAT5A is expressed and reduces p53 nuclear accumulation in these cells. In the same way, T cells from Socs1-/-Ifnγ-/- mice are less likely to undergo apoptosis than T cells from Socs1+/+Ifnγ+/+ mice, after exposure to γ radiation. In both contexts, the expression of p53 target genes is decreased, which indicates that SOCS1 is implicated in p53 activation in vivo. This thesis also aims to show the role of SOCS1 in the activation of other transcription factors and, thereby, to show that it can act as a more general regulator of transcription. A detailed study of the interaction between SOCS1 and p53 showed that the transactivation domain II of p53 (amino acids 36-67) is sufficient for the interaction. Specifically, it seems that tryptophan 53 (W53) and phenylalanine 54 (F54) are essential for the interaction. A structural analysis of this p53 region highlights an acid transactivation domain actually conserved in many others transcription factors, such as p63, p73 and E2F1. In accordance with this observation, SOCS1 is able to interact with both proteins. Thus, the capacity of SOCS1 to interact with p53 and to regulate its activity may extend to other transcription factors. The mechanism showed in this thesis contributes to the understanding of p53 regulation and highlights a new function for the SOCS1 protein. Indeed, until now, SOCS1 was mostly known to be a negative regulator of the JAK/STAT pathway. Moreover, this new role for SOCS1 explains how an aberrant cytokine signaling can trigger senescence or apoptosis. Finally, the fact that SOCS1 can regulate different transcription factors allows us to consider it as a general regulator of transcription factors containing an acid transactivation domain.

Les papillomavirus sont de petits virus à ADN double brin qui infectent les cellules de l’épithélium de la peau et des muqueuses d’une variété de vertébrés causant des lésions bénignes telles des verrues. Certains de ces virus sont également associés au développement de lésions malignes, notamment le cancer du col utérin. La protéine régulatrice E2 des papillomavirus est impliquée dans diverses fonctions contribuant à l’établissement de l’infection par ces virus. Entre autre, E2 régule la transcription des gènes viraux, participe à l’initiation de la réplication de l’ADN viral en s’associant à l’hélicase virale E1 et est responsable du maintien et de la ségrégation de l’épisome viral au cours de la division cellulaire. Toutes ces activités sont attribuables à la capacité de E2 à s’associer au génome viral et à interagir avec des protéines virales et cellulaires. De plus, ces fonctions sont elles-mêmes régulées par des modifications post-traductionnelles de la protéine E2. Plusieurs études ont été réalisées afin de découvrir les mécanismes de régulation des fonctions de E2 mais le rôle exact des différents domaines de E2 dans ces contrôles reste à être défini. En premier lieu, nous nous sommes intéressés à l’interaction entre E2 et Brd4(L) qui avait été définie comme étant essentielle à la ségrégation de l’épisome. Plusieurs caractéristiques associées à la protéine Brd4(L) telles que sa capacité à lier les lysines acétylées des histones, son interaction avec le complexe Mediator et sa participation à l’activation de la transcription en formant un complexe avec pTEFb, nous ont permis d’émettre l’hypothèse que l’interaction E2-Brd4(L) est nécessaire à l’activité transcriptionnelle de E2. Nous avons démontré que la protéine Brd4(L) interagit avec le domaine de transactivation de E2 de divers types de papillomavirus. De plus, cette interaction implique les résidus de E2 essentiels à son activité transcriptionnelle. Ainsi, ces résultats proposent que l’association E2-Brd4(L) serve à la régulation de la transcription des gènes viraux. Dans un second temps, nos recherches se sont concentrées sur l’existence d’une interface de dimérisation au sein du domaine de transactivation de E2 et de son implication dans les activités transcriptionnelles et réplicatives de la protéine. Nos études ont aussi mis en évidence que l’intégrité de la structure de ce domaine contribue au bon fonctionnement de la réplication du génome viral. Cette découverte suggère que la dimérisation de E2 peut réguler l’initiation de la réplication et propose l’existence d’un niveau de régulation additionnel impliquant l’état de la structure quaternaire de la protéine E2 et une modulation de l’interaction entre E1 et E2 à cette étape du cycle viral. Finalement, l’étude de l’instabilité de la protéine E2 nous a permis de définir une région importante dans le domaine flexible de la protéine, nécessaire à sa dégradation par le protéasome. De plus, la présence de résidus conservés localisés dans ce domaine, sont associés à la dégradation et portent la signature d’un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS, suggérant que la stabilité de la protéine E2 est régulée par sa localisation au sein de la cellule. Ces études démontrent l’existence de nouvelles stratégies de régulation des activités transcriptionnelle et réplicative de la protéine E2 des papillomavirus. La compréhension de ces mécanismes nous permet de mieux cerner les étapes favorisant l’établissement et la progression du cycle viral et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques contre les infections aux papillomavirus. / Papillomaviridae is a family of small double-stranded DNA viruses known as papillomaviruses (PV) which infect skin and mucosal epithelial cells where they cause benign lesions such as warts. A subset of these viruses is associated with the development of malignant lesions and is the causal agent of cervical cancer. Papillomavirus E2 regulatory protein is involved in several functions leading to the establishment of the viral infection. These activities include the regulation of viral genes transcription, it participation to the initiation of viral DNA replication by recruiting the viral helicase E1, and to the maintenance and segregation of the viral episome during cellular division. All these functions are associated to the ability of E2 to bind specifically the viral genome, to interact with viral and cellular proteins and to acquire post-translational modifications. The first article of this thesis led to the identification of Brd4(L) as the major protein associated to E2 protein of different papillomavirus types. This interaction involves the amino acids associate to the transcription function of E2. The protein Brd4(L) was identified originally as a factor that maintains epigenetic memory by it interaction with acetylated histones during mitosis. This association with the chromatin, it interaction with Mediator complex and it participation to the cellular transcription by recruiting pTEFb complex allowed us to propose that the interaction between Brd4 and E2 is essential to the regulation of viral gene transcription. The second part of this work based on previous characterization of the transactivation domain dimerization interface; investigate the role of this surface in the transcriptional and replicative activities of E2. Our studies demonstrated that the integrity of the TAD dimerization interface may contribute to the DNA replication activity of E2. This discovery suggests that the dimerization interface may regulate the viral DNA replication by the redox state of the E2 protein. A fine characterization of this interface may provide new aspect of the interaction between E1 and E2 in the context of viral cycle. Finally, the third section of this thesis define a region of E2 protein associated to it degradation by the proteasome. This study also demonstrates that the stability of E2 is related to its cellular localization and suggests that the highly conserved residues found in this region may represent a PY-NLS nuclear localization signal signature. This thesis shows the existence of different approaches to regulate the transcriptional and the replicative activities as well as the stability of the papillomavirus E2 protein to favor the establishment and the progression of viral cycle.

La régulation de l’expression des gènes est ce qui permet à nos cellules de s’adapter à leur environnement, de combattre les infections ou, plus généralement, de produire la quantité exacte de protéine nécessaire pour répondre à un besoin spécifique. Parmi les joueurs les plus importants dans cette régulation de l’expression des gènes on retrouve les microARN (miARN). Ces petits ARN de 22 nucléotides sont présents chez la majorité des espèces multicellulaires et sont responsables du contrôle direct de plus de 30% des gènes exprimant des protéines chez les vertébrés. La famille de miARN lethal-7 (let-7) est composée de miARN parmi les plus connus et ayant des fonctions cruciales pour la cellule. La régulation du niveau des miARN let-7 est essentielle au bon développement cellulaire. La biogenèse de ces miARN, du transcrit primaire jusqu’à leur forme mature, est régulée principalement par Lin28, une protéine pluripotente très conservée. Cette protéine est composée d’un domaine cold shock (CSD) et de deux domaines de liaison au zinc. C’est grâce à ces domaines de liaison à l’ARN que Lin28 peut lier et inhiber la maturation des miARN let-7. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’interaction entre Lin28 et le microARN précurseur let-7g afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l’inhibition de la biogenèse du miARN. À l’aide de techniques biochimiques et biophysiques, nous avons d’abord défini les principaux déterminants de l’interaction entre Lin28 et la boucle terminale du miARN précurseur let-7g (TL-let-7g). Nous avons conclu que le domaine C-terminal de Lin28, composé d’un motif riche en lysines et arginines ainsi que de deux motifs de liaison au zinc, permet à la protéine de lier spécifiquement et avec haute affinité un renflement riche en guanine conservé chez les précurseurs de la famille let-7. Aussi, parce que la séquence et la spécificité de liaison à l’ARN de ce domaine C-terminal sont semblables à celles de la protéine NCp7 du VIH, nous avons défini ce dernier comme le domaine NCp7-like de Lin28. Par la suite, nous avons caractérisé la multimérisation de trois protéines Lin28 sur la boucle terminale de pre-let-7g. Ceci a permis de réconcilier d’apparentes contradictions retrouvées dans la littérature actuelle concernant les sites de liaison de Lin28 lors de sa liaison aux miARN précurseurs. Nous avons identifié trois sites de liaison à haute affinité sur TL-let-7g qui sont liés dans un ordre précis par trois protéines Lin28. Lors de la formation du complexe multimérique, le CSD permet une déstabilisation de l’ARN, ce qui rend accessible plusieurs sites de liaison. Le domaine NCp7-like permet plutôt un assemblage ordonné de la protéine et facilite la liaison initiale de cette dernière. Ces nouveaux résultats rendent possible la mise au point d’un nouveau modèle de l’interaction entre Lin28 et le miARN précurseur let-7g. En conclusion, les études réalisées dans cette thèse apportent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle d’une importante famille de miARN et permettront de guider les futures études dans le domaine de recherche en pleine effervescence qu’est celui de la biogenèse des miARN. / The regulation of gene expression is what allows our cells to adapt to their environment, to fight infections or, more generally, to express the appropriate level of proteins to meet a specific need. The microRNAs (miRNAs) are among the most important players in the regulation of gene expression. These small RNAs of 22 nucleotides are present in most multicellular species and are responsible for the direct control of more than 30% of protein-expressing genes in vertebrates. The miRNA lethal-7 (let-7) family consist of some of the most studied miRNAs and plays crucial roles in the cell. The appropriate regulation of the let-7 miRNAs level is essential for proper cellular development. The biogenesis of these miRNAs, from the primary transcript to their mature form is mainly regulated by Lin28, a highly-conserved pluripotent protein. This protein is composed of a cold shock domain (CSD) and two zinc-binding domains. These RNA-binding domains allow Lin28 to bind and inhibit the maturation of the let-7 miRNA. The objective of this thesis is to characterize the interaction between the Lin28 protein and the let-7g miRNA precursor to better understand the role of this protein in the inhibition of miARN biogenesis. Using biochemical and biophysical techniques, we first identified the main determinants of the interaction between Lin28 and the terminal loop of the precursor miRNA let-7g (TL-let-7g). We concluded that the C-terminal domain of Lin28, composed of a lysine-rich and arginine-rich motif in addition to two zinc-binding motifs, is sufficient to bind with high affinity a conserved guanine-rich bulge located on the TL-let-7g. In addition, because the sequence and RNA-binding specificity of this C-terminal domain are similar to those of the HIV protein NCp7, we defined this region as the NCp7-like domain of Lin28. Subsequently, we characterized the multimerization of three Lin28 proteins on the terminal loop of pre-let-7g. This study helped to reconcile apparent contradictions found in the current literature regarding the Lin28-binding sites on miRNA precursors. We identified three high-affinity binding sites on TL-let-7g that are bound in a stepwise manner by the three Lin28 proteins. As part of the formation of the multimeric complex, both RNA-binding domains of Lin28 play an important role. The CSD destabilizes the RNA and this exposes several binding sites, whereas the NCp7-like domain allows an orderly protein assembly and facilitates the initial binding of the protein. These results lead us to propose a new model for the interaction between Lin28 and pre-let-7g. In conclusion, these studies provide a better understanding of the molecular mechanisms involved in the post-transcriptional regulation of an important family of miRNAs and will help guide future projects in the expanding research area of miRNA biogenesis.

L’ARN polymérase II (ARNPII), l’enzyme responsable de la transcription des ARN messagers, procède au décodage du génome des organismes vivants. Cette fonction requiert l’action concertée de plusieurs protéines, les facteurs généraux de la transcription, par exemple, formant un réseau d’interactions protéine-protéine, plusieurs étant impliquées dans la régulation de l’ARNPII à différents niveaux. La régulation de la transcription a été largement étudiée durant les quatre dernières décennies. Néanmoins, nous en connaissons peu sur les mécanismes qui régulent l’ARNPII avant ou après la transcription. Dans la première partie de cette thèse, nous poursuivons la caractérisation du réseau d’interactions de l’ARNPII dans la fraction soluble de la cellule humaine, travail qui a débuté précédemment dans notre laboratoire. Ce réseau, développé à partir de la méthode de la purification d’affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse (AP-MS) et à des méthodes d’analyses bioinformatiques, nous amène une foule d’informations concernant la régulation de l’ARNPII avant et après son interaction avec la chromatine. Nous y identifions des protéines qui pourraient participer à l’assemblage de l’ARNPII telles des chaperonnes et les protéines du complexe R2TP/prefoldin-like ainsi que des protéines impliquées dans le transport nucléocytoplasmique. Au centre de ce réseau se trouvent RPAP4, une GTPase qui semble se positionner à l’interface entre ces protéines régulatrices et l’ARNPII. Nous avons donc entamé l’étude la fonction de RPAP4, ce qui nous a menés à la conclusion que RPAP4 est essentielle à l’import nucléaire de l’ARNPII au noyau, où elle exerce sa fonction. Nous avons également montré que les motifs G et GPN sont essentiels à la fonction de RPAP4. Le traitement des cellules avec le bénomyl nous montre aussi que la fonction de RPAP4 et l’import nucléaire de l’ARNPII requièrent l’action des microtubules. La deuxième partie de la thèse s’intéresse à une autre protéine positionnée au centre du réseau, RPAP2. Cette dernière partage plusieurs interactions avec RPAP4. Elle est aussi essentielle à la localisation nucléaire de l’ARNPII et interagit directement avec celle-ci. RPAP4 et RPAP2 étant toutes deux des protéines cytoplasmiques qui font la navette entre le noyau et le cytoplasme, nous présentons des évidences que RPAP4 est impliquée dans l’export nucléaire de RPAP2 pour permettre à celle-ci d’être disponible dans le cytoplasme pour l’import de l’ARNPII dans le noyau. Dans la troisième partie de la thèse, nous étudions plus en profondeur les modifications post-traductionnelles de RPAP4, ce qui nous aide à mieux comprendre sa propre régulation et sa fonction auprès de l’ARNPII. RPAP4 est phosphorylée en mitose par la MAP kinase ERK5. Cette phosphorylation favorise l’interaction entre RPAP4 et RPAP2, ce qui empêche RPAP2 d’interagir avec l’ARNPII pendant la mitose, prévenant du même coup, son interaction avec la chromatine pendant cette phase du cycle cellulaire où la transcription est presque inexistante. / RNA polymerase II, the enzyme responsible for transcription of messenger RNA, decodes the genome of living organisms. This function requires the concerted action of several proteins, including transcription factors, which form a protein-protein interaction network. Many of them are implicated in the regulation of RNAPII transcription. Although regulation of transcription has been largely studied during the last four decades, little is known about mechanisms that regulate RNAPII prior and after the transcription reaction. In the first part of this thesis, we continue the characterization of the RNAPII interaction network of RNAPII in the soluble fraction of the human cell. This network, developed using tandem affinity purification method coupled with mass spectrometry (AP-MS) and bioinformatic analysis, provides a wealth of information about RNAPII regulation prior and after its interaction with chromatin for transcription. We identified proteins that can be involved in RNAPII assembly, including chaperones and the cochaperone complex R2TP prefoldin-like, and proteins involved in nucleocytoplasmic shuttling. RPAP4 is a GTPase that occupies a central position in this network being at the interface between these regulatory proteins and RNAPII. We therefore started to study the function of RPAP4, which lead us to conclude that RPAP4 is essential for RNAPII nuclear import. We also report that G domains and the GPN motif are essential for RPAP4 function. Treatment of the cells with benomyl suggests that microtubules are required for RPAP4 function and RNAPII nuclear import. The second part concerns another protein found in the network that is also centrally positioned in the network, called RPAP2. RPAP2 shares many interactions with RPAP4. This protein is also essential for the nuclear import of RNAPII as it interacts directly with it. RPAP4 and RPAP2 being cytoplasmic proteins that shuttle between the cytoplasm and the nucleus, we show evidences that RPAP4 is implicated in RPAP2 nuclear export to make it available for RNAPII nuclear import. In the third part, we study RPAP4 post-translational modifications, which help us to understand its own regulation and its function with RNAPII. RPAP4 is phosphorylated in mitosis by the MAP kinase ERK5. This phosphorylation promotes the interaction between RPAP4 and RPAP2. It prevents RPAP2 and RNAPII interaction and RNAPII chromatin localization in mitosis where transcription is mostly nonexistent.

ABCG2 est un transporteur de la famille ABC impliqué dans le phénotype de résistance aux drogues développé par certaines cellules, par exemple les cellules cancéreuses. Ce transporteur a aussi un rôle physiologique de détoxication de composés endogènes, notamment les porphyrines, molécules indispensables mais qui présentent une toxicité potentielle. Cette toxicité nécessite une prise en charge particulière, évitant à ces composés d’être libres en solution. Dans ce contexte, nous avons fait l’hypothèse qu’ABCG2 pourrait participer à cette détoxication en limitant l’accumulation des porphyrines dans les cellules en les présentant à un partenaire extracellulaire. Nous montrons qu’ABCG2 transporte de l’hème ainsi que certains de ses dérivés et précurseurs et que ces porphyrines, contrairement aux autres substrats d’ABCG2, se fixent sur un domaine extracellulaire spécifique d’ABCG2, ECL3, composé d’environ 70 acides aminés. L’affinité d’ECL3 pour les porphyrines est de 0,5 à 3,5 μM, suffisamment affine pour permettre leur fixation après transport.Nous montrons aussi que l’albumine sérique humaine, impliquée dans la détoxication de l’hème, récupère les porphyrines fixées sur ECL3 par une interaction directe avec ABCG2. L’ensemble de ce travail a donc permis d’une part de mieux comprendre le rôle d’ABCG2 dans la régulation de l’homéostasie des porphyrines, notamment l’hème, et d’autre part, de façon originale, d’identifier le mécanisme moléculaire par lequel cette détoxication s’effectue. / ABCG2 belongs to the ABC-transporter family, involved in drug resistance developed by cells, notably cancer cells. This transporter has also a physiological role of endobiotic detoxification, in particular porphyrins that are essential but potentially toxic molecules. This toxicity implies a specific handle, to avoid them to remain free in solution. In that context, we hypothesized that ABCG2 participate to this detoxification, limiting the intracellular porphyrin accumulation by presenting them to an extracellular partner. We show that ABCG2 transports heme and some of its derivatives and precursors. Interestingly, these porphyrins, unlike other ABCG2 (non-porphyric) substrates, can bind to an extracellular domain, specific of ABCG2, ECL3, 70 residues-long. ECL3 displays affinities for porphyrins in the range of 0.5 to 3.5 μM, high enough to allow their binding after transport. We also show that human serum albumin, implicated in heme detoxification, releases porphyrins bound to ECL3 by a direct interaction with ABCG2. This work established a better comprehension of ABCG2 role in porphyrin and in particular heme homeostasis regulation. In addition, our results contribute to elucidate part of the molecular mechanism by which such regulation is carried out.

Les invertases de plantes (Invs) hydrolysent de manière irréversible le saccharose en fructose et glucose. En fonction de leur pH optimum et de leur localisation subcellulaire, les Invs sont classées en trois groupes : alcaline et neutre (A/N-Inv), vacuolaire (VI) et de paroi (CWI). Le but de notre étude a été de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les régulations post-traductionnelles d'une VI de Solanum lycopersicum (VINV). L'ADNc codant pour VINV a été cloné et exprimé dans le système hétérologue Pichia pastoris. Après purification, la caractérisation biochimique a été réalisée et a montré des résultats comparables à ceux obtenus précédemment pour d'autres Invs. La structure tridimensionnelle de VINV a été résolue par cristallographie aux rayons X à 2,75 Å et il s'agit de la première structure d'une VI décrite jusqu'ici. Des expériences de mutagénèse dirigée ont permis d'identifier certains acides aminés impliqués dans la catalyse : le nucléophile, le catalyseur acide/base, le stabilisateur d'état de transition et un résidu qui module le pKa du catalyseur acide/base. Par ailleurs, la régulation de l'activité de VINV a été étudiée. La N-glycosylation de VINV recombinante semble être importante pour la stabilité de la structure. De plus, l'activité VINV peut aussi être modulée par un inhibiteur protéique spécifique. Une approche de génomique fonctionnelle a été utilisée, et un inhibiteur d'invertase vacuolaire putatif (SolyVIF) de S. lycopersicum a été identifié dans la banque de données des Solanacées. L'ADNc codant pour SolyVIF a été cloné et exprimé dans le système hétérologue Escherichia coli Rosetta gami (DE3). / Plant invertases (Invs) hydrolyze irreversibly sucrose into fructose and glucose. Based on their pH optima and subcellular localization, Invs are categorized into three groups: alkaline and neutral invertase (A/N-Inv), vacuolar invertase (VI), and cell wall invertase (CWI). The goal of our study was to better understand mechanisms involved in the molecular regulation of a VI from Solanum lycopersicum (VINV) at post-translational levels. The VINV cDNA was cloned and heterologously expressed in Pichia pastoris. After purification, the biochemical characterization was performed and showed comparable results with those obtained previously for other characterized Invs. The three-dimensional structure of VINV was solved by X-ray crystallography to 2.75 Å resolution and it was the first structure of a plant VI described so far. Mutations experiments allowed to identify important amino acids: the nucleophile, the acid/base catalyst, the transition-state stabilizer and a residue that modulate pKa of the acid/base catalyst. Moreover, the regulation of VINV at different post-translational levels was studied. N-glycosylation of recombinant VINV seems to be important for structure stability. VINV activity can also be modulated by specific proteinaceous inhibitor. A functional genomics approach was used, and a putative vacuolar invertase inhibitor (SolyVIF) of S. lycopersicum was identified in the Solanaceae data bank. SolyVIF cDNA was cloned and heterologously expressed in Escherichia coli Rosetta gami (DE3). Recombinant protein was purified and characterized.