Au cours de cette thèse, nous avons étudié deux protéines par RMN : la créatine kinase musculaire (CK-MM) et le domaine UIM-SH3 de la protéine STAM2, seuls ou en interaction avec leurs partenaires. La CK-MM est une enzyme active sous forme dimérique. Elle appartient à la famille des guanidino-kinases et intervient dans le processus énergétique de la cellule. Le but de l’étude était d’élucider le mode de fonctionnement de la CK-MM. Pour cela, nous avons enregistré des expériences de relaxation R1, R2 et des expériences de perturbation de déplacement chimique sur la CK-MM libre et complexée avec MgADP et sous forme TSAC. Ces expériences montrent que la boucle 320s, spécifique à la reconnaissance des substrats, possède une dynamique rapide en absence de substrats et une dynamique ralentie en présence de substrats. La fixation des substrats dans les sites actifs de la CK-MM induit des modifications conformationelles importantes. La protéine STAM2 est composée de deux UBDs : VHS, et UIM et d’un domaine SH3 connu pour interagir avec des déubiquitinases UBPY et AMSH. Cette protéine est impliquée dans la voie de dégradation lysosomale. L’objectif de cette étude est la caractérisation du complexe SH3/ubiquitine. Pour cela, nous avons enregistré des expériences de perturbation de déplacement chimique et de relaxation R1, R2 et nOes sur le complexe UIM-SH3/ubiquitine. Ces expériences mettent en évidence que les domaines UIM et SH3 sont capables d’interagir chacun avec une ubiquitine, avec une affinité de l’ordre de la centaine de micromolaire. L’interface entre les UBDs et l’ubiquitine implique majoritairement des résidus hydrophobes et conservés / In this thesis, we study two proteins by NMR: the muscular creatine kinase (CK-MM) and the SH3 domain of STAM2 protein, in the free and complexed forms. CK-MM is an active homodimeric enzyme which belongs to the guanidino-phosphagen-kinase family. This enzyme is involved in energetic process in the cell. The aim of this study is to elucidate the functional mode of the CK-MM. For this purpose, we measured R1 and R2 relaxation rates and chemical shit perturbation experiments on the substrate-free CK-MM, the CK-MM/MgADP complex, and the inhibitory ternary complex CK-MM/MgADP-creatine-nitrate. The experiments show that the loop 320s, specific recognition of the substrates, possesses a fast dynamic in absence of substrates (in the order of nano-picosecond) and a slower dynamic in presence of creatine-MgADP-nitrate ion. The binding of the substrate in the two active sites induces of significant conformational modification of the CK-MM. STAM2 protein consists in two ubiquitin binding domains (VHS and UIM) and a SH3 domain which interacts with deubiquinating enzymes AMSH and UBPY. This protein is involved in the lysosomal degradation pathway. The aim of this study is the characterization of the interaction between SH3 domain of STAM2 and ubiquitin. For this, we recorded the R1, R2, nOes relaxation experiments and chemical shift perturbation experiments on the UIM-SH3/ubiquitin complex. These experiments show that SH3 and UIM domains interact each with a single ubiquitin, with affinity of the order of hundred micromolars. The interface between these UBDs and ubiquitin, involves mainly hydrophobic and conserved amino-acids

La fonction de reproduction est sous le contrôle de la neurohormone hypothalamique GnRH qui régule la synthèse et la libération des gonadotropines hypophysaires. La GnRH agit par l’intermédiaire d’un récepteur couplé aux protéines G exprimé à la surface des cellules gonadotropes, le récepteur de la GnRH (RGnRH). Ce récepteur, chez les mammifères, a la particularité d’être dépourvu de queue C terminale ce qui le rend insensible aux systèmes classiques de désensibilisation. Ainsi, les mécanismes qui régulent l’efficacité et la spécificité de sa signalisation demeurent mal connus. Nous avons recherché des partenaires d’interaction du RGnRH, jusqu’alors inconnus, avec l’idée que ces protéines en interagissant avec les domaines intracellulaires du récepteur influenceraient son couplage aux voies de signalisation. Nos travaux ont permis d’identifier le premier partenaire d’interaction du RGnRH : la protéine SET. Par des expériences de « GST pull down », nous avons montré que SET interagit directement avec le RGnRH via le premier domaine intracellulaire du récepteur. Cette interaction implique des séquences riches en acides aminés basiques sur le récepteur et les domaines N- et C-terminaux de SET. Nous avons également montré, par co-immunoprécipitation, que le RGnRH dans sa conformation native interagit avec la protéine SET dans les cellules gonadotropes alphaT3-1 et, par immunocytochimie, que les deux protéines colocalisent à la membrane plasmique. En développant au laboratoire des outils biosenseurs permettant de mesurer avec une grande sensibilité et en temps réel les variations intracellulaires de calcium et d’AMPc, nous avons mis en évidence que le RGnRH se couple non seulement à la voie calcique mais aussi à la voie AMPc dans la lignée alphaT3-1, apportant pour l’AMPc la première démonstration d’un tel couplage. En utilisant différentes stratégies expérimentales visant à diminuer ou au contraire favoriser l’interaction du récepteur avec SET (ARN antisens, peptide correspondant à la première boucle intracellulaire du récepteur, surexpression de SET), nous avons montré que SET induit une réorientation de la signalisation du RGnRH de la voie calcique vers la voie AMPc. Nos résultats concernant l’activité du promoteur du gène du Rgnrh nous conduisent à postuler que SET pourrait favoriser l’induction par la GnRH de gènes régulés via la voie AMPc et notamment celui codant le RGnRH. Nos travaux mettent également en évidence que la GnRH régule non seulement l’expression de la protéine SET dans les cellules gonadotropes mais aussi son degré de phosphorylation favorisant ainsi sa relocalisation dans le cytoplasme des cellules alphaT3-1. Ceci suggère que la GnRH exerce une boucle de régulation permettant d’amplifier l’action de SET sur la signalisation de son propre récepteur. Enfin, nous avons mis en évidence que l’expression de SET est fortement augmentée dans l’hypophyse au moment du prœstrus chez le rat, apportant ainsi la première démonstration d’une variation de SET dans un contexte physiologique. Étant donné que le couplage du RGnRH à la voie de signalisation AMPc est augmenté au moment du prœstrus, nos résultats suggèrent que SET pourrait jouer un rôle important in vivo en favorisant ce couplage à ce stade particulier du cycle œstrien. / Reproductive function is under the control of the hypothalamic neurohormone GnRH, which regulates the synthesis and the release of pituitary gonadotropins. GnRH acts on a G-protein coupled receptor expressed at the surface of pituitary gonadotrope cells, the GnRH receptor (GnRHR). This receptor, in mammals, is unique because it is devoided of the C terminal tail, which makes it insensitive to classical desensitization processes. Therefore, the mechanisms that regulate the efficacy and the specificity of its signaling are still poorly known. We searched for interacting partners of GnRHR with the idea that these proteins by interacting with the intracellular domains of the receptor could influence receptor coupling to its signaling pathways. Our work identified the first interacting partner of GnRHR: the protein SET. By GST pull down assays, we showed that SET interacts directly with GnRHR through the first intracellular loop of the receptor. This interaction involves sequences enriched in basic amino acids in the receptor and both N- and C terminal domains of SET. We also showed, by co-immunoprecipitation, that GnRHR in its native conformation interacts with the endogenous SET protein in gonadotrope alphaT3-1 cells and, by immunocytochemistry that the two proteins colocalize at the plasma membrane. By developing in the laboratory biosensors tools that allow to measure with high sensitivity and in real-time intracellular variations in calcium and cAMP concentrations, we demonstrated that GnRHR couples not only to the calcium pathway but also to the cAMP pathway in alphaT3-1 cell line, providing for cAMP the first demonstration of such coupling. Using several experimental strategies to reduce or increase receptor interaction with SET (small interfering RNA, peptide corresponding to the first intracellular loop of the receptor, overexpression of SET), we have shown that SET induces a switch of GnRHR signaling from calcium to cAMP pathway. Our results concerning the activity of the Gnrhr gene promoter led us to postulate that SET could favor the induction by GnRH of genes regulated through the cAMP pathway, notably those encoding the GnRHR. Our study also showed that GnRH regulates not only SET protein expression in gonadotropes, but also its phosphorylation level leading to its relocation in the cytoplasm of alphaT3-1 cells. This suggests that GnRH induces a regulatory loop to amplify SET action on signaling of its own receptor. Finally, we demonstrated that SET expression is markedly increased in the pituitary gland at prœstrus in female rats, providing the first demonstration of a variation of SET expression in a physiological context. Given that GnRHR coupling to the cAMP pathway is increased at prœstrus, our results suggest that SET may play an important role in vivo by promoting such coupling at this particular stage of the estrus cycle.

Deux membres des Visinin-Like Proteins (VILIPs), VILIP-1 et VILIP-3, ont été étudiés à l'aide de deux modèles membranaires biomimétiques, les monocouches de Langmuir couplées à la microscopie à l'angle de Brewster (BAM) et les bicouches lipidiques supportées (SLB) visualisées par microscopie à force atomique (AFM). A l'aide de ces deux modèles, nous avons pu montrer que les VILIPs, protéines N-myristoylées et possédant quatre mains-EF, ont une cinétique d'interaction membranaire qui augmente en présence de calcium, probablement dû à la présence d'un mécanisme type « switch calcium-myristoyle ». En revanche, l'utilisation de protéines mutées, non myristoylées, a révélé que la présence du groupement myristoyle n'est pas le seul facteur nécessaire pour que ces protéines interagissent avec la membrane. La présence d'une région N-terminale riche en résidus lysine permettrait à cette famille de protéines d'interagir via des interactions électrostatiques avec des membranes possédant des lipides anioniques et plus particulièrement du phosphatidylinositol-4,5-biphosphate (PIP2). La présence d'un faible pourcentage de ce phosphoinositide dans la membrane est responsable de l'accélération de la vitesse d'interaction membranaire des VILIPs, ce qui est cohérent avec leur location subcellulaire in cellulo. Enfin, un nouveau modèle membranaire de bicouches lipidiques suspendues sur des pilotis peptidiques (pep-tBLM) greffés sur une surface d'or a été ensuite développé. La méthode présentée dans ce manuscrit permet de créer des tBLM, de la composition lipidique souhaitée, en utilisant un peptide pilotis spécifiquement conçu durant cette thèse. La création de ce modèle a été suivie en temps réel par imagerie de résonance plasmonique de surface (SPRi) et caractérisé par AFM et par microscopie de fluorescence / Two members of the Visinin-Like Proteins (VILIPs) family, VILIP-1 and VILIP-3, have been studied using two biomimetic membrane models, the Langmuir monolayers coupled to the Brewster angle microscopy (BAM) and the supported lipid bilayers (SLB) visualized by atomic force microscopy (AFM). Using these two models, we have shown that VILIPs, N-myristoylated proteins with four EF-hands, have a membrane interaction kinetic that increases in the presence of calcium, probably due to the presence of a "calcium-myristoyl switch" mechanism. Tn contrast, the use of unmyristoylated proteins revealed that the presence of the myristoyl group is not the only factor necessary for the interaction of these proteins with the membrane. The presence of a N- terminal lysine-rich region allows this family of proteins to interact through electrostatic interactions with membranes containing anionic lipids and particularly the phosphatidylionisitol-4,5-biphosphate (PIP2). The presence of a small percent of phosphoinositide in the membrane is responsible for the acceleration of the binding rate of VILIPs, which is consistent with their subcellular location in cellulo. Finally, a new membrane model of peptide tethered lipid bilayers (pep-tBLM) grafted onto a gold surface was developed. The method described in this manuscript allows the formation of tBLM, containing the desired lipid composition, by using a home-designed peptide as tether. The formation is followed in real time by surface plasmon resonance imaging (SPRi) and has been characterized by AFM and fluorescence microscopy

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Cette thèse porte sur deux sujets intrinsèquement liés : le calcul de la constante de normalisation d’un champ de Markov et l’estimation de l’affinité de liaison d’un complexe de protéines. Premièrement, afin d’aborder ce problème de comptage #P complet, nous avons développé Z*, basé sur un élagage des quantités de potentiels négligeables. Il s’est montré plus performant que des méthodes de l’état de l’art sur des instances issues d’interaction protéine-protéine. Par la suite, nous avons développé #HBFS, un algorithme avec une garantie anytime, qui s’est révélé plus performant que son prédécesseur. Enfin, nous avons développé BTDZ, un algorithme exact basé sur une décomposition arborescente qui a fait ses preuves sur des instances issues d’interaction intermoléculaire appelées “superhélices”. Ces algorithmes s’appuient sur des méthodes issuse des modèles graphiques : cohérences locales, élimination de variable et décompositions arborescentes. A l’aide de méthodes d’optimisation existantes, de Z* et des fonctions d’énergie de Rosetta, nous avons développé un logiciel open source estimant la constante d’affinité d’un complexe protéine protéine sur une librairie de mutants. Nous avons analysé nos estimations sur un jeu de données de complexes de protéines et nous les avons confronté à deux approches de l’état de l’art. Il en est ressorti que notre outil était qualitativement meilleur que ces méthodes. / This thesis is focused on two intrinsically related subjects : the computation of the normalizing constant of a Markov random field and the estimation of the binding affinity of protein-protein interactions. First, to tackle this #P-complete counting problem, we developed Z*, based on the pruning of negligible potential quantities. It has been shown to be more efficient than various state-of-the-art methods on instances derived from protein-protein interaction models. Then, we developed #HBFS, an anytime guaranteed counting algorithm which proved to be even better than its predecessor. Finally, we developed BTDZ, an exact algorithm based on tree decomposition. BTDZ has already proven its efficiency on intances from coiled coil protein interactions. These algorithms all rely on methods stemming from graphical models : local consistencies, variable elimination and tree decomposition. With the help of existing optimization algorithms, Z* and Rosetta energy functions, we developed a package that estimates the binding affinity of a set of mutants in a protein-protein interaction. We statistically analyzed our esti- mation on a database of binding affinities and confronted it with state-of-the-art methods. It appears that our software is qualitatively better than these methods.

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Le domaine de la bioénergie moléculaire concerne le transfert et le stockage d’énergie dans les cellules biologiques. Ce projet s’articule autour de la respiration et plus précisément le mécanisme de pompage de sodium et de protons, et son couplage au transfert d’électrons. Premièrement, nous nous sommes intéressés au pompage d’ions sodium par la NADH : quinone oxidoreductase de la bactérie Vibrio cholerae. L’importance de flavines spécifiques et des résidus acides dans le transfert de sodium ont été démontrée. Par la suite, l’interaction entre protéines, notamment le cytochrome c552 et le fragment CuA de l’oxidase de type ba3 de l’organisme Thermus thermophilus a été étudié. Une réorganisation structurelle induit par le transfert d’électron a été démontrée par la spectroscopie IRTF différentielle. Enfin, dans la dernière partie de ce travail, l’interaction au sein du supercomplex bc1-aa3 de la chaîne respiratoire du Corynebacterium glutamicum a été analysée. / The field of molecular bioenergetics deals with the energy transduction in biological cells. In this project, respiration and more specifically proton and sodium pumping enzymes and their coupling to electron transfer have been in focus. First we have been interested in the Na+-pumping NADH:quinone reductase from Vibrio cholerae which is the entry site of electrons in the respiratory chain of several pathogens. The role of specific flavin cofactors and amino acids involved in Na+ transfer has been shown in a combined IR spectroscopic and electrochemical approach. The interaction between proteins, namely the cytochrome c552 and the CuA fragment from the terminal ba3 oxidase from the organism Thermus thermophilus was then investigated. Structural reorganization during electron transfer was revealed by IR spectroscopy. Finally, in the third part of the project the interaction within the bc1-aa3 supercomplex from the respiratory chain from Corynebacterium glutamicum was analyzed.

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L'auxine est une hormone végétale qui coordonne plusieurs processus de développement des plantes à travers la régulation d'un ensemble spécifique de gènes. Les Auxin Response Factors (ARF) sont des régulateurs transcriptionnels qui modulent l'expression de gènes de réponse à l’auxine. Des données récentes montrent que les membres de la famille des ARF sont impliqués dans la régulation du développement des fruits de la nouaison à la maturation. L'objectif principal de la thèse est d’étudier la part qui revient aux ARF dans le contrôle du développement et de la maturation des fruits et d’en comprendre les mécanismes d’action. L’analyse des données d’expression disponibles dans les bases de données a révélé que, parmi tous les ARF de tomates, SlARF2 affiche le plu haut niveau d'expression dans le fruit avec un profil distinctif d’expression associé à la maturation. Nous avons alors entrepris la caractérisation fonctionnelle de SlARF2 afin d’explorer son rôle dans le développement et la maturation des fruits. Deux paralogues, SlARF2A et SlARF2B, ont été identifiés dans le génome de la tomate. Nous avons montré que l’expression de SlARF2A dans le fruit est régulée par l'éthylène tandis que celle de SlARF2B est induite par l'auxine. La sous-expression de SlARF2A, comme celle de SlARF2B, entraine un retard de maturation alors que l’inhibition simultanée des deux paralogues conduit à une inhibition plus sévère de la maturation suggérant une redondance fonctionnelle entre les deux paralogues lors de la maturation des fruits. Les fruits présentant une sous-expression des gènes SlARF2 produisent de faibles quantités d'éthylène, montrent une faible accumulation de pigments et une plus grande fermeté. Le traitement avec de l'éthylène exogène ne peut pas inverser les phénotypes de défaut de maturation suggérant que SlARF2 pourrait agir en aval de la voie de signalisation de l'éthylène. L'expression des gènes clés de biosynthèse et de signalisation de l'éthylène est fortement perturbée dans les lignées sous-exprimant SlARF2 et les gènes majeurs qui contrôlent le processus de maturation (RIN, CNR, NOR, TAGL1) sont sensiblement sous-régulés. Les données suggèrent que SlARF2 est essentiel pour la maturation des fruits et qu’il pourrait agir au croisement des voies de signalisation de l'auxine et de l'éthylène. Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les ARF régulent l'expression des gènes de réponse à l'auxine, nous avons étudié l'interaction des SlARFs avec des partenaires protéiques ciblés, principalement les co-répresseurs de type Aux/IAA et Topless (TPL) décrits comme les acteurs clés dans la répression des gènes dépendant de la signalisation auxinique. Une fois les gènes codant pour les membres de la famille TPL de tomate isolés, une approche double hybride dans la levure a permis d’établir des cartes exhaustives d'interactions protéine-protéine entre les membres des ARFs et des Aux/IAA d’une part et les ARFs et les TPL d’autre part. L'étude a révélé que les Aux/IAA interagissent préférentiellement avec les SlARF activateurs et qu’à l’inverse les Sl-TPL interagissent uniquement avec les SlARF répresseurs. Les données favorisent l'hypothèse que les ARF activateurs recrutent les Sl-TPL via leur interaction avec les Aux/IAA, tandis que les ARF répresseurs peuvent interagir directement avec les Sl-TPL. Les études d’interactions ont permis également d’identifier de nouveaux partenaires comme les protéines VRN5 et LHP1, composantes des complexes Polycomb PRC impliqués dans la repression par voie épigénétique de la transcription par modification de l'état de méthylation des histones. Au total, le travail de thèse apporte un nouvel éclairage sur le rôle et les mécanismes d'action des ARF et identifie SlARF2 comme un nouvel élément du réseau de régulation contrôlant le processus de maturation des fruits chez la tomate. / The plant hormone auxin coordinates plant development through the regulation of a specific set of auxin-regulated genes and Auxin Response Factors (ARFs) are transcriptional regulators modulating the expression of auxin-response genes. Recent data demonstrated that members of this gene family are able to regulate fruit set and fruit ripening. ARFs are known to act in concert with Aux/IAA to control auxin-dependent transcriptional activity of target genes. However, little is known about other partners of ARFs. The main objective of the thesis research project was to gain more insight on the involvement of ARFs in fruit development and ripening and to uncover their interaction with other protein partners beside Aux/IAAs. Mining the tomato expression databases publicly available revealed that among all tomato ARFs, SlARF2 displays the highest expression levels in fruit with a marked ripening-associated pattern of expression. This prompted us to uncover the physiological significance of SlARF2 and in particular to investigate its role in fruit development and ripening. Two paralogs, SlARF2A and SlARF2B, were identified in the tomato genome and transactivation assay in a single cell system revealed that the two SlARF2 proteins are nuclear localized and act as repressors of auxin-responsive genes. In fruit tissues, SlARF2A is ethylene-regulated while SlARF2B is auxin-induced. Knock-down of SlARF2A or SlARF2B results in altered ripening with spiky fruit phenotype, whereas simultaneous down-regulation of SlARF2A and SlARF2B leads to more severe ripening inhibition suggesting a functional redundancy among the two SlARF2 paralogs during fruit ripening. Double knock-down fruits produce less climacteric ethylene and show delayed pigment accumulation and higher firmness. Exogenous ethylene treatment cannot reverse the ripening defect phenotypes suggesting that SlARF2 may act downstream of ethylene signaling. The expression of key ethylene biosynthesis and signaling genes is dramatically disturbed in SlARF2 down-regulated fruit and major regulators of the ripening process, like RIN, CNR, NOR, TAGL1, are under-expressed. The data support the notion that SlARF2 is instrumental to fruit ripening and may act at the crossroads of auxin and ethylene signaling. Altogether, while ethylene is known as a key hormone of climacteric fruit ripening, the ripening phenotypes associated with SlARF2 down-regulation bring unprecedented evidence supporting the role of auxin in the control of this developmental process. To further extend our knowledge of the molecular mechanism by which ARFs regulate the expression of auxin-responsive genes we sought to investigate interactions SlARF and putative partners, mainly Aux/IAAs and Topless co-reppressors (TPLs) reported to be key players in gene repression dependent on auxin signaling. To this end, genes encoding all members of the tomato TPL family were isolated and using a yeast-two-hybrid approach comprehensive protein-protein interaction maps were constructed. The study revealed that Aux/IAA interact preferentially with activator SlARFs while Sl-TPLs interact only with repressor SlARFs. The data support the hypothesis that activator ARFs recruit Sl-TPLs co-repressors via Aux/IAAs as intermediates, while repressor ARFs can physically interact with Sl-TPLs. Further investigation indicated that SlARFs and Sl-TPLs can interact with polycomb complex PRC1 PRC2 components, VRN5 and LHP1, known to be essential players of epigenetic repression of gene transcription through the modification of histones methylation status. These data establish a potential link between ARFs and epigenetic regulation and thereby open new and original perspectives in understanding the mode of action of ARFs. Altogether, the thesis work provides new insight on the role of ARFs and their underlying action mechanisms, and defines SlARF2 as a new component of the regulatory network controlling the ripening process in tomato.

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