Les anticorps thérapeutiques sont des molécules de choix pour le traitement standard de nombreuses formes de cancers. Leur application est à ce jour restreinte au compartiment extracellulaire à cause de leur taille trop importante qui les empêche de traverser la membrane cellulaire. Comme la plupart des cibles thérapeutiques du cancer semblent être situées dans le milieu intracellulaire, ce serait un plus de pouvoir exploiter les propriétés des anticorps dans les cellules pour étudier et perturber l’activité de ces cibles. Néanmoins, l’utilisation des anticorps dans le milieu intracellulaire constitue un véritable challenge, notamment à cause de la membrane cellulaire et de l’environnement réducteur du cytoplasme. L’ensemble des travaux de thèse présentés dans ce manuscrit ont permis d’établir les bases de plusieurs stratégies innovantes d’immunociblage intracellulaire et de mettre en lumière l’importance des différentes étapes de validation d’anticorps ou de fragments dérivés utilisés comme anticorps intracellulaires. La vectorisation d’anticorps complets par électroporation, le développement d’un intracorps bispécifique original anti-PCNA et la mise au point d’une méthode de mutagenèse inspirée de l’hypermutation somatique constituent les principales avancées apportées par ce travail dans le domaine de la recherche technologique en immuno biotechnologie. / Therapeutic antibodies are interesting molecules used to treat numerous pathologies such as cancer. Because of their size, their application is currently limited to the extracellular space. Indeed, antibodies cannot cross the cell membrane. Almost all therapeutic targets in cancer seem to be located inside cells, it would be beneficial to take advantage of antibodies in cells in order to neutralize the activity of these targets. The use of antibodies inside the cells is a real challenge, because of the cell membrane and the reducing environment of the cytoplasm. Several strategies of intracellular immunotargeting are presented in this thesis.

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La mucoviscidose est causée par des mutations du gène CFTR (p.Phe508del étant la plus fréquente). Celui-ci code pour la protéine CFTR qui constitue un canal chlorure exprimé à la face apicale des cellules épithéliales. Au niveau du reticulum endoplasmique (RE), le contrôle de qualité conformationnelle oriente la majorité du CFTR en cours de repliement vers une voie de dégradation. Une fraction limitée du WT-CFTR parvient cependant à se replier correctement et peut ensuite progresservers la surface cellulaire, contrairement au Phe508del-CFTR (qui est néanmoins fonctionnel). Lorsque des formes mutées sont exportées à partir du RE, grâce à des traitements correcteurs, elles sont alors instables à la membrane plasmique. Par ailleurs, il a été montré que l'organisation des microfilaments d'actine participe à l'ancrage du canal au cytosquelette et à sa stabilité. Or, la petite GTPase Cdc42 influence la dynamique de nucléation de l'actine fibrillaire. Au cours de nos travaux, nous avons testé l'implication de Cdc42 et de certains de ses effecteurs dans la régulation de WT-CFTR dans des cellules épithéliales bronchiques. Dans ce cadre, la fonction de la voie Cdc42 a été perturbée par des traitements pharmacologiques et par ARN interférence. Les résultats obtenus, principalement par biotinylation de surface, ont permis de proposer que (1) la protéine Cdc42 participe à ladégradation de formes mal repliées de CFTR dans les étapes précoces et tardives de la voie de sécrétion et (2) la voie Cdc42, par son implication dans l'organisation de l'actine F corticale, affecte l’ancrage du canal chlorure au cytosquelette et régule ainsi son recrutement dans des vésicules d'internalisation. / Cystic Fibrosis is caused by CFTR gene mutations (p.Phe508del being the most frequently encountered). The CFTR protein functions as a chloride channel expressed at the plasma membrane of epithelial cells. Its productive folding in the endoplasmicreticulum (ER) is poorly efficient and unfolded proteins are therefore targeted to degradation. Nevertheless, a limited fraction of WT-CFTR acquires a native conformation and then progesses into the secretory pathway. In the case of Phe508del-CFTR, virtually all channels are degraded at this step except through corrector treatments. Under these conditions the mutant remains unstable at the plasma membrane (although it is functionnaly competent). Furthermore, it has been shown that fibrillar actin organization is involved in CFTR tethering to the cytoskeleton and channel stability. Moreover, the small GTPase Cdc42 promotes F actin nucleation. In the present study, we aimed at testing the involvement of Cdc42, and of some of its effectors, in WT-CFTR regulation in epithelial airway cells. In this context, Cdc42 pathway function was altered through pharmacological treatments or siRNAmediated depletions. Our results, mainly obtained via cell surface biotinylation assays, led us to propose that (1) Cdc42 is involved in misfolded CFTR degradation at early and late steps of the secretory pathway, and (2) Cdc42 pathway, through its F actin organization function, affects CFTR anchoring to the cytoskeleton and thus regulates its endocytosis.

A ce jour, l’Organisation Mondiale de la Santé estime qu’un tiers de la population mondiale est infectée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent étiologique de la tuberculose. De par un taux de mortalité et de morbidité élevé, cette maladie infectieuse constitue un véritable fléau sanitaire au niveau mondial. <p>Mtb est un pathogène intracellulaire qui infecte son hôte par voie aérienne. In vivo, il doit faire face à une série d’environnements (phagosome, granulome) stressants de par leurs activités antimicrobiennes et par leur composition en nutriments relativement pauvre. Pour pouvoir survivre et se multiplier dans ces conditions, Mtb possède un panel de transporteurs spécifiques ainsi que toute une série de mécanismes pour contrer, voire détourner les défenses immunitaires de l’hôte. Malgré cette oppostion, les mycobactéries finissent séquestrées à l’intérieur de granulomes, structure caractéristique de la tuberculose, dans un état de dormance. La mise au point de nouveaux traitements prophylactiques et thérapeutiques nécessite la compréhension des mécanismes mis en œuvre par Mtb pour survivre et se multiplier au sein de son hôte.<p><p>Le présent travail a consisté en l’étude de mécanismes favorisant la dispersion et la survie intracellulaire de Mtb chez son hôte via: <p>1)\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

In the past fifteen years, ubiquitin has emerged as a central regulator of membrane protein trafficking. In this context, covalent attachment of this small protein to lysine residues of cargo proteins, a reversible modification termed ubiquitylation, provides a signal for their targeting to the vacuolar/lysosomal lumen where they are degraded, both in yeast and higher eukaryotes. Ubiquitylation is also used as a means of controlling the function of specific proteins in several trafficking machineries. The role of lipids - and in particular of membrane domains named lipid rafts - in controlling the intracellular trafficking of membrane proteins has also been the subject of intense investigation in recent years.<p>One of the membrane proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae whose intracellular trafficking has been extensively studied is the general amino acid permease Gap1. Yet some aspects of the function of ubiquitin in the nitrogen-dependent control of this protein remain controversial. Moreover, the potential role of lipid rafts in regulating the functional properties and traffic of the Gap1 permease had not been investigated before this thesis work. <p>The first part of our work readdresses the role of Gap1 ubiquitylation, and more precisely of the modification of the permease with polyubiquitin chains linked through the lysine 63 of ubiquitin, in controlling the fate of this protein in the secretory pathway. Our observations indicate that nitrogen-induced ubiquitylation of newly synthesised Gap1 occurs in the trans-Golgi complex. However, contrary to the generally accepted view, this modification is not necessary for the permease to exit this compartment en route to the endosome but only for its subsequent targeting to the vacuolar lumen via the multivesicular body (MVB) pathway. Our results also provide evidence that K63-linked polyubiquitylation is important mostly at the late endosomal level, for proper sorting of Gap1 into the MVB pathway, whether the permease comes from the cell surface by endocytosis or directly from the secretory pathway. <p>In the second part of this work, we present a set of data providing novel insights into the controversial question of the exact nature of lipid rafts in yeast. We first showed that the Gap1 permease is associated with detergent-resistant membranes (DRMs) - the proposed biochemical equivalent of lipid rafts - when it is located at the cell surface. Our data further suggest that this may be true for most if not all yeast plasma membrane proteins. Moreover, we found that Gap1 production must be coupled to de novo synthesis of sphingolipids (SLs), major constituents of rafts, in order for the newly synthesised permease to be correctly folded, active, associated with DRMs, and stable at the cell surface. We propose a model where Gap1 would associate with newly synthesised SLs during its biogenesis and/or secretion, this association shaping the permease into its native conformation and ensuring its incorporation and stabilisation in specific lipid domains at the plasma membrane. Failure of Gap1 to acquire this lipidic microenvironment in turns leads to its ubiquitin-dependent degradation by a quality-control mechanism. This model might be valid for many other plasma membrane proteins and might account for their lateral distribution between distinct membrane domains. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Par leur activité permanente à l’état basal et en situation infectieuse, les cellules dendritiques (DC) de l’organisme orchestrent la tolérance du soi et l’élimination du non-soi, en façonnant les réponses immunes. Ce rôle immunologique complexe des DC repose en grande partie sur des mécanismes de biologie cellulaire spécifiques, qui font l’objet d’un effort considérable de caractérisation. Le travail réalisé au cours de cette thèse met en lumière une sous-population endosomale jouant un rôle clé dans les processus cellulaires de modulation de l’immunité par les DC : les endosomes IRAP+ (insulin responsive aminopeptidase). Etudiée dans différents contextes biologiques depuis 1930, IRAP s’est récemment révélée être impliquée dans l’apprêtement endo-phagosomal des antigènes exogènes par les DC, en vue de leur présentation croisée aux lymphocytes T (Saveanu et al., 2009; Weimershaus et al., 2012). Cette découverte a attiré notre attention sur les endosomes IRAP+/RAB14+ peu étudiés dans les DC. Ce travail étudie la place des endosomes IRAP dans la biologie cellulaire des DC ainsi que le rôle de ces endosomes dans les fonctions biologiques des DC. Nous avons étudié l’influence des endosomes IRAP sur les autres compartiments cellulaires et démontré leur implication dans un système endolysosomal de régulation de la réponse inflammatoire aux pathogènes. Nous avons également étudié l’impact de IRAP sur les processus de maturation des phagosomes et montré leur influence sur les processus subséquent d’élimination des pathogènes et de présentation croisée. Les endosomes IRAP+ sont donc mis en jeu dans la modulation de la maturation phagosomale et de l’inflammation, mais également dans l’optimisation de la présentation des antigènes aux lymphocytes T ; trois processus qui reposent sur une régulation fine de la compartimentation intracellulaire. L’ensemble des résultats de cette thèse définit les endosomes IRAP+ comme un des acteurs majeurs de la « régulation compartimentée » des processus cellulaires des DC, au cœur de la machinerie qui régit les équilibres de l’immunité. / Dendritic cells (DC) are central in immune system. They are permanently active in the organism at steady state and during infection, where they orchestrate tolerance against self and immunity against non-self, such a complex immunological role relies on specific cell biology mechanisms. These mechanisms are currently extensively studied. This work sheds light on a new endosomal compartment playing a crucial role in immunity modulation: IRAP (insulin responsive aminopeptidase)-containing endosomes. Studied in various contexts since 1930, IRAP was recently revealed to be required for exogenous antigen processing in endophagosomal compartment of DC and subsequent cell surface presentation to T lymphocytes (Saveanu et al., 2009; Weimershaus et al., 2012). This discovery prompted us to study IRAP+ endosomes that are poorly described in DC. This work studies IRAP-containing endosomes in DC compartments and questions their specific contribution in DC biological functions. We therefore investigated IRAP-containing endosomes relationship to other cellular compartments and demonstrated their requirement in an endolysosomal regulation system controlling pathogen related inflammation. We also studied the implication of IRAP-containing endosomes on phagosomes maturation and showed their influence on pathogen killing and cross presentation. IRAP-containing endosomes are required for several cellular functions that all rely on cellular compartmentalization. This work proposes IRAP-containing endosomes as a major actor of a “compartmental regulation” of DC functions, participating to fine tuning of immune balance.

Nous étudions deux phénomènes de transport actif dans la cellule. Cette activité est induite par des moteurs moléculaires. Leur fonctionnement général est compris, mais leurs interactions et fonctions spécifiques font émerger de nouveaux comportements.En première partie nous étudions l'extraction de tubes membranaires par la myosine 1b sur un faisceau d'actine. Ce moteur est non processif, renforcé par la force. Il est impliqué dans une voie de transport membranaire au niveau de l'appareil de Golgi. Nous modélisons ce phénomène. Nous montrons que le renforcement par la force induit l'apparition d'un régime d'extraction par fluctuation géante, et abaisse le nombre de moteurs requis pour l'extraction. Les tubes extraits par des moteurs non processifs ne présentent pas de régime oscillatoire. La croissance du tube peut s'accompagner d'une déplétion avec des moteurs non processifs. Nos prédictions sont en bon accord avec les observations expérimentales.En deuxième partie, nous étudions l'écoulement cytoplasmique dans l'embryon de C.elegans. Sa fonction supposée est le mélange du cytoplasme. Son orientation se renverse aléatoirement. Son mouvement est supporté par des microtubules et des kinésines entrainant le reticulum endoplasmique au niveau cortical. Nous modélisons ce phénomène et montrons que la transition vers l'écoulement est une brisure spontanée de symétrie. Nos prédictions sont en bon accord avec les observations expérimentales. Le point de fonctionnement du système optimise les fluctuations, ce pourrait être le mécanisme du mélange. Nos prédictions sont en bon accord avec les observations expérimentales. / We study two intracellular transport phenomena. They are powered by molecular motors. Motors general mechanisms are understood, but their interactions leads to emerging properties, and some of them have specialised functions.In the first part, we study the extraction of membrane tubes by myosin 1b supported by actin bundles. Myosin 1b is a non processive motor with catch bond property. It is implied in membrane trafficking at the Golgi apparatus level. We model this phenomenon in the frame of a collaboration with experimentalists. We show that catch bond effect induces a regime where tube extraction requires a giant length fluctuation, and the minimal number of motors allowing extraction is decreased. Tubes extracted by non processive motors do not show oscillatory regime. During tube growth motors can deplete with non processive motors. Our predictions are in good agreement with experimental observations.In the second part we study in collaboration with experimentalists the cytoplasmic streaming in C.elegans. Its function is supposed to be the mixing the cytoplasm. Its orientation reverses stochastically. Its movement is supported by microtubules and kinesins, that drive the endoplasmic reticulum at the cortical level. We model this phenomenon and show that the transition toward streaming is a spontaneous spatial symetry breaking. Our predictions are in good agreement with the experimental observations. The parameters values of the system optimize flow fluctuations, this could be the mechanism driving the mixing. Our predictions are in good agreement with experimental observations.

Les ions Ca2+ responsables de la contraction musculaire sont extrudés du réticulum sarcoplasmique (RS) via le récepteur de la ryanodine de type 1 (RyR1). Des mutations du gène de RyR1 sont responsables chez l’homme de l’hyperthermie maligne (HM) et de la myopathie à cores centraux (MCC). Nous avons caractérisé les altérations de l’efflux calcique du RS dues à de telles mutations dans la fibre musculaire de souris par électrophysiologie et imagerie confocale. L’expression des formes Y523S, R615C et R2163H de RyR1, associées à l’HM, provoque une hypersensibilité de l’efflux vis-à-vis du potentiel membranaire alors que les formes I4897T et G4896V associées à la MCC provoquent une réduction chronique de l’efflux sans modification de densité des RyR1 s ainsi que des protéines Cav1.1 et SERCA1. L’expression de la forme R4892W associée à la MCC ne modifie pas l’efflux calcique suggérant une plus faible pénétrance fonctionnelle de cette forme. Dans tous les cas, aucune indication de changement du contenu en calcium RS n’a été observée. Les résultats suggèrent que les modifications pathologiques de l’efflux calcique sont la conséquence directe de l’altération de fonction des canaux. Le deuxième objectif du travail s’est intéressé au rôle de certains phosphoinositides (PtdInsPs) dans la régulation de l’efflux calcique du RS. La surexpression de la PtdInsPs-phosphatase Mtm 1 n’a aucun effet sur l’efflux calcique alors que l’application intracellulaire de ses deux principaux substrats inhibe l’efflux, suggérant que leur accumulation dans les fibres musculaires déficientes en Mtm1 pourrait contribuer aux altérations pathologiques associées du couplage excitation-contraction / Ca2+ ions that trigger muscle contraction are released from the sarcoplasmic reticulum (SR) through the type 1 ryanodine receptor (RyR1) channel. Mutations of the gene encoding RyR1 are responsible for malignant hyperthermia (MH) and central core disease (CCD) in human. We characterized the alterations of SR Ca2+ release due to such mutations in mouse fibers using electrophysiology and confocal imaging. Expression of each of the MH-associated Y523S, R615C and R2163H mutant forms of RyR1 increases the sensitivity of Ca2+ release to membrane potential whereas forms I4897T and G4896V that are associated to CCD provoke a chronic depression of Ca2+ release with no concurrent alteration of RyR1, Cav1.1 and SERCA1 density. Expression of the CDD-associated R4892W form of RyR1 has no effect on Ca2+ release suggesting a weaker functional penetrance of this mutant form. In all cases we found no indication for a change in SR calcium content. Results suggest that pathological changes in Ca2+ release are the direct consequence of the functional alteration of the channels. The second goal of this work focused on the role of certain phosphoinositides (PtdInsPs) in the control of SR Ca2+ release. Over-expression of the PtdInsPs-phosphatase Mtm 1 does not affect Ca2+ release whereas intracellular application of its two main substrates inhibits Ca2+ release, suggesting that accumulation of these molecules in Mtm 1-deficient fibers could contribute to the associated alterations of excitation-contraction coupling

Le GABA et la glycine, principaux neurotransmetteurs inhibiteurs de la moelle épinière adulte, jouent un rôle clé dans la plasticité neuronale. Ils peuvent être excitateurs selon la concentration en chlorure du neurone cible. Celle-ci est principalement régulée par les co-transporteurs, KCC2, spécifique des neurones et NKCC1, ubiquitaire. Ces protéines font respectivement sortir et entrer les ions chlorure. Au cours du développement, l’expression de KCC2 augmente alors que celle de NKCC1 diminue, au moment où l’effet des potentiels post-synaptiques inhibiteurs sur le potentiel de membrane des neurones passe d’une dépolarisation à une hyperpolarisation. Une lésion médullaire à P0 bloque cette augmentation développementale. Cela est corrélé à une perte de fonction de KCC2, laquelle est restaurée après traitement avec un agoniste des récepteurs 5-HT2, indiquant que les voies descendantes issues du tronc cérébral, en particulier sérotoninergique, sont essentielles à la maturation du système inhibiteur. Une lésion chez l’adulte, induit une diminution de l’expression KCC2, en particulier à la surface des motoneurones et de ce fait, de la force de l’inhibition post-synaptique. Le BDNF est impliqué dans cette diminution mais son effet s’inverse 15 jours après la lésion, permettant le réacheminement de KCC2 à la surface des cellules. La phosphorylation des tyrosines et sérines serait impliquée dans l’adressage et la stabilisation de KCC2 dans la membrane plasmique alors que celle des thréonines jouerait un rôle dans son activation fonctionnelle. Ces résultats indiquent que KCC2 est une cible de choix pour restaurer l’inhibition neuronale dans la moelle épinière après traumatisme. / Le GABA et la glycine, principaux neurotransmetteurs inhibiteurs de la moelle épinière adulte, jouent un rôle clé dans la plasticité neuronale. Ils peuvent être excitateurs selon la concentration en chlorure du neurone cible. Celle-ci est principalement régulée par les co-transporteurs, KCC2, spécifique des neurones et NKCC1, ubiquitaire. Ces protéines font respectivement sortir et entrer les ions chlorure. Au cours du développement, l’expression de KCC2 augmente alors que celle de NKCC1 diminue, au moment où l’effet des potentiels post-synaptiques inhibiteurs sur le potentiel de membrane des neurones passe d’une dépolarisation à une hyperpolarisation. Une lésion médullaire à P0 bloque cette augmentation développementale. Cela est corrélé à une perte de fonction de KCC2, laquelle est restaurée après traitement avec un agoniste des récepteurs 5-HT2, indiquant que les voies descendantes issues du tronc cérébral, en particulier sérotoninergique, sont essentielles à la maturation du système inhibiteur. Une lésion chez l’adulte, induit une diminution de l’expression KCC2, en particulier à la surface des motoneurones et de ce fait, de la force de l’inhibition post-synaptique. Le BDNF est impliqué dans cette diminution mais son effet s’inverse 15 jours après la lésion, permettant le réacheminement de KCC2 à la surface des cellules. La phosphorylation des tyrosines et sérines serait impliquée dans l’adressage et la stabilisation de KCC2 dans la membrane plasmique alors que celle des thréonines jouerait un rôle dans son activation fonctionnelle. Ces résultats indiquent que KCC2 est une cible de choix pour restaurer l’inhibition neuronale dans la moelle épinière après traumatisme.

La voie JAK / STAT est une voie majeure de signalisation intracellulaire, activée par plusieurs cytokines, y compris par les interférons (IFNs). Mon laboratoire a précédemment établi que l'endocytose et le trafic du récepteur de l’IFN alpha/beta (IFNAR) jusqu’à l'endosome précoce, joue un rôle clé dans l’activation de la voie de signalisation JAK/STAT et dans les activités antivirales et antiprolifératives induites par les IFNs de type I. Le récepteur de l’IFN de type I se compose de deux sous-unités: IFNAR1 et IFNAR2. Durant le trafic du récepteur vers l'endosome précoce, les deux sous-unités prennent des itinéraires différents - IFNAR1 est ubiquitiné et dégradé au lysosome tandis que IFNAR2 est recyclé vers la membrane plasmique. Les mécanismes moléculaires permettant un trafic différent des IFNAR1 et IFNAR2 restent mal compris.J’ai tout d’abord étudié le trafic intracellulaire des sous-unités IFNAR1 et IFNAR2 et j’ai pu montrer que les protéines Rab4 et Rab11 sont nécessaires au recyclage d’IFNAR2 à la membrane plasmique. Par la suite, j’ai identifié le complexe rétromère endosomal - VPS26A/VPS29/VPS35 comme un partenaire d’interaction avec IFNAR2 nécessaire pour son recyclage. En outre, j’ai montré que le complexe rétromère contrôle la séparation spatiotemporelle des sous-unités IFNAR1 et IFNAR2 au niveau de l'endosome précoce. En effet, la déplétion du complexe rétromère entraine une prolongation de l’association endosomale de deux sous-unités et une prolongation de la signalisation JAK/STAT induite par l’IFN tant pour la réponse précoce (phosphorylation de STAT1) que la réponse à plus long terme (expression des gènes stimulés par l'IFN). Des résultats en cours de publication par l’équipe montrent un rôle d’ESCRT-0 dans l’initiation de la signalisation JAK/STAT. J’ai montré que le rôle de la machinerie ESCRT dans ce processus est limité au complexe ESCRT-0. Les sous-complexes en aval d’ESCRT-0, bien que nécessaires à la dégradation d’IFNAR1, ne sont pas impliqués dans l’activation de la voie JAK/STAT.En conclusion, ces résultats nous ont permis d’établir un modèle dans lequel le retromère joue un rôle clef dans la régulation spatio-temporelle du tri endosomal d’IFNAR et de la signalisation JAK/STAT au niveau de l’endosome précoce. Après la séparation rétromère-dépendante des sous-unités du récepteur et la terminaison de la signalisation JAK/STAT, la dégradation lysosomale d’IFNAR1 est assurée par la machinerie ESCRT en aval d’ESCRT-0. / The JAK/STAT pathway is a major intracellular signaling pathway that is activated by several cytokines including interferons (IFNs). My laboratory has previously established that endocytosis and trafficking of the IFN alpha/beta receptor (IFNAR) to the early endosome is key for the activation of JAK/STAT signaling and for the antiviral and antiproliferative activities induced by type I IFNs. The functional type I IFN receptor - IFNAR - consists of two subunits: IFNAR1 and IFNAR2. Upon endocytosis to the early endosome, both subunits take different trafficking routes – IFNAR1 is ubiquitinated and degraded in the lysosome, whereas IFNAR2 recycles back to the plasma membrane. The molecular mechanisms behind the separation of IFNAR1 and IFNAR2, as well as their distinct trafficking routes remain poorly understood.First, I studied the intracellular trafficking of IFNAR1 and IFNAR2 subunits and showed the requirement for Rab4 and Rab11 in IFNAR2 recycling to the plasma membrane. Next, I identified the endosomal retromer complex – VPS26A/VPS29/VPS35 as an IFNAR2 interacting partner, required for IFNAR2 recycling. Additionally, I was able to show that retromer controls the spatiotemporal separation of IFNAR1 and IFNAR2 subunits at the early endosome. Indeed, retromer depletion resulted in prolonged endosomal association of both subunits and prolonged activation of IFN-induced JAK/STAT signaling, at both early (STAT1 phosphorylation) and longer time response (IFN-stimulated gene expression). Unpublished results of our team indicate the role of ESCRT-0 in initiation of the IFN-mediated JAK/STAT signaling. I found that role of the ESCRT machinery in this process is limited to the ESCRT-0. ESCRT subcomplexes downstream of ESCRT-0, although required for IFNAR1 degradation, are not involved in activation of the JAK/STAT pathway.In conclusion, these results permit us to draw a model in which the retromer is a key spatiotemporal regulator of IFNAR endosomal sorting and the JAK/STAT signaling at level of the early endosome. Once retromer-mediated subunits separation is accomplished and JAK/STAT signaling is terminated, ESRCT machinery downstream to ESCRT-0 mediates IFNAR1 lysosomal degradation.