L’invasion de la matrice extracellulaire est le premier obstacle que les tumeurs solides rencontrent lors de leur dissémination métastatique. Il existe deux mécanismes principaux: 1) la transition épithélio-mésenchymateuse au cours de laquelle les cellules épithéliales, à l’échelle individuelle, perdent leur cohésion intercellulaire et acquièrent des capacités de motilité pour quitter leur site d’origine ; 2) l’invasion collective dans laquelle des cellules en groupe coopèrent pour migrer collectivement en se frayant un passage à travers le microenvironnement. Dans les modèles murins, on sait maintenant que des groupes ou agrégats de cellules tumorales circulantes issus du détachement de tumeurs primaires présentent une capacité accrue à coloniser des organes à distance. Cependant, les facteurs et mécanismes sous-jacents conduisant au détachement des cellules tumorales en groupe sont peu connus. Pour étudier ces mécanismes, nous avons utilisé des sphéroïdes tumoraux, modèle expérimental tri-dimensionnel (3D), qui mime le microenvironnement ainsi que les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles de la tumeur primaire. Nos résultats indiquent que l'inhibiteur de l’activateur du plasminogène (PAI-1), une protéine matricellulaire trouvée en forte concentration dans les cancers invasifs, favorise le détachement en groupe et l’invasion collective de cellules du cancer du sein (lignée cellulaire MCF7) et du colon (lignée cellulaire HCT116) organisées en sphéroïdes tumoraux. PAI-1 a des propriétés dé-adhésives sur des cellules étalées en monocouche sur des matrices pro-adhésives et génère l’agrégation des cellules entre-elles. Ces cellules conservent leurs caractéristiques épithéliales malgré une modification importante de la dynamique du réseau d'actine.Nos résultats suggèrent que les récepteurs cellulaires de la famille des lipoprotéines de basse densité (LDL-R) sont impliqués dans les propriétés dé-adhésives de PAI-1. Dans la cellule, la transduction du signal passe par les kinases ROCK (kinase associée à la GTPase RhoA) et Janus (JAK), ce qui conduit à une phosphorylation de la chaîne légère de la myosine II (MLC2), nécessaire pour l’activité contractile de la myosine et des facteurs de transcription STAT3. En outre, ROCK, un régulateur connu de la contraction du cytoskelette d’actomyosine, est également impliqué dans l'activation de STAT3. L'inhibition de ROCK ou JAK rétablit l’adhésivité des cellules en 2D et réduit leur migration en 3D. Nos données suggèrent que PAI-1 génère des zones de forte activité contractile membranaire dans les cellules en périphérie de la tumeur via ROCK-MLC2 et JAK-STAT, ce qui promeut le détachement de groupe de cellules hautement invasives. Ce nouvel axe de signalisation fonctionnelle de PAI-1 représente une cible anti-métastatique potentielle. / Invasion of the extracellular matrix is the first obstacle that solid tumours encounter during their metastatic dissemination. There are two main mechanisms: 1) epithelial to mesenchymal transition wherein epithelial cells lose their intercellular cohesion and convert to individual migratory behaviours to escape their point of origin; 2) invasion in a collective manner, in which a group or cluster of cohesive cancer cells detaches from the tumour mass and progressively, pushes its way through the microenvironment. It is now known that circulating tumour cell clusters may result from the evasion of cohesive small groups of cells from tumours and such tumour cell clusters display an increased propensity to colonize distant organs in mouse models. However, the extracellular factor/s and the underlying mechanism that enable cell detachment, as clusters are largely unknown. To study the process of tumour cell detachment and invasion, we used a three-dimensional (3D) multicellular tumour spheroid (MCTS) model, which mimics the microenvironment as well as morphological, functional and symmetric geometry features of the primary tumour. Our results strongly indicate that the plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), a matricellular protein found in high concentration at the invasive front of most cancers, promotes cancer cell cluster detachment and a collective invasion phenotype within MCTS of breast cancer MCF7 and colon cancer HCT116 cell lines. We found that PAI-1 has a de-adhesive effect which induced a multilayered cell clustering of cells spread out on a pro-adhesive matrices in 2D monolayer cultures. Cells retained their epithelial characteristics and membrane-localized E-cadherin despite significant modification of actin dynamics. PAI-1 functions as a de-adhesive molecule most likely involved low-density lipoprotein receptors at the cell surface. We report that the downstream intracellular events may be mediated through the Rho-associated kinase (ROCK) and Janus kinases (JAK) signalling pathway, resulting in phosphorylation of either myosin light chain 2 (MLC2), which is required for myosin II-mediated contractility or STAT3 transcription factors. In addition, ROCK, a known contributor to actomyosin contractility is involved in STAT3 phosphorylation and activation. Inhibition of ROCK and JAK restored adhesion of cells on 2D substratum and reduced their migration/invasion within 3D MCTS model. Our data support a model in which PAI-1 generates actomyosin contractility and high membrane activity at the tumour periphery in a JAK-STAT/ROCK-MLC2 dependent manner promoting the detachment of highly invasive cell clusters. This novel axis of functional signalling of PAI-1 is a potential anti-metastasis target.

Le cancer du sein est un problème majeur de santé public dont l'incidence est en permanente augmentation. La mortalité est le plus souvent due aux métastases. Les études concernant PTPL1, la plus grande des tyrosines phosphatases cytoplasmiques, ont montré que PTPL1 présente les caractéristiques de suppresseur de tumeur. PTPL1 se trouve mutée dans plusieurs types de cancers et son expression est un marqueur de bon pronostique dans les tumeurs mammaires. Mon laboratoire a également montré que PTPL1 participe à l'effet pro-apoptotique des anti-oestrogènes dans les cellules tumorales hormono dépendantes en déphosphorylant IRSl, le substrat d'IGF1-receptor freinant ainsi la voie PI3K/AKT. PTPL1 régule également la croissance, l'invasion et l'adhésion dans les cellules cancéreuses mammaires peu agressives MCF7.Nous avons établi un modèle cellulaire de clones isogéniques capables d'exprimer PTPL1 ou ses mutants d'une manière inductible dans les cellules cancéreuses mammaires invasives MDA-MB-231. D’une part, nous avons montré un impact négatif de l'expression de PTPL1 sur le phénotype invasif de ces cellules. D'une manière intéressante, le mutant catalytiquement inactif a montré un comportement similaire à celui du contrôle de transfection. Ceci montre l'importance de l'activité catalytique de PTPL1 dans l'inhibition du phénotype agressif. Nous testons maintenant in vivo la tumorigenicité des clones chez les souris athymique.D'autre part, nous avons étudié par protéomique comparative (SILAC) la tyrosine phosphorylation globale des protéines cellulaires dans les cellules MCF-7 et MDA-MB-231 exprimant ou non PTPL1. Parmi les protéines identifiées nous retrouvons des acteurs des différentes voies de signalisations connues dans la littérature pour être impactées par PTPL1 , mais de manière remarquable plus du quart des protéines identifiées sont liées aux jonctions cellulaires ou à leur régulation. Nous avons donc étudié l'effet de la phosphatase sur les jonctions cellulaires et montré que la surexpression de PTPL1 favorise la formation d'agrégats cellulaire en culture 3D, augmente la stabilité des contacts cellulaire en vidéo-microscopie, relocalise la desmogléïne aux jonctions cellulaires et induit une réexpression de la E cadhérine aux niveau du contact cellule/cellule dans les cellules MDA-MB-231.Les jonctions et la polarité cellulaires sont très importantes en cancérologie en particulier dans le processus invasif qui est la première étape de la dissémination métastatique donc il serait maintenant important d'identifier les substrats directs de PTPL1 pour élucider la signalisation de PTPL1 vers les jonctions et proposer de nouvelles cibles thérapeutique. / The regulation of breast tumor aggressiveness by Protein Tyrosine Phosphatase PTPL1/ PTPN13Breast cancer is a major problem for public health of which the incidence continues to increase. Its mortality is often linked to metastasis formation. Studies on PTPL1, the largest protein tyrosine phosphatase, have shown that it presents the characteristics of a tumor suppressor gene. PTPL1 is mutated in several types of cancers and its expression is associated with good prognostic in prostate and breast cancers. My team has shown that PTPL1 mediates the pro apoptotic effect of anti-estrogen in hormone-sensitive tumor cells by dephosphorylating IRS1, Insulin growth factor-1 receptor substrate, thus blocking PI3K/Akt pathway. In addition, PTPL1 regulates the growth, the invasion, and the adhesion of low aggressive breast tumor cells MCF-7.Our team established an isogenic cellular model capable of expressing PTPL1 or its mutants (phosphatase-dead and substrate-trapping mutants) in an inducible fashion in invasive cells. We showed that functional PTPL1 expression has a negative impact on cell aggressive phenotypes. Interestingly, the phosphatase-dead mutant exhibits the same behavior as the transfection control. This evidences that PTPL1 activity is crucial for the inhibition of aggressiveness. We are currently testing the clones tumorigenicity in athyemic mice.Furthermore, we conducted a comparative proteomic (SILAC) in order to study the global tyrosine phosphatome in MCF-7 and MDA-MB-231 cells with or without PTPL1. Our findings suggest that PTPL1 regulates the phosphorylation of proteins involved in different signaling pathways already described in the literature to be impacted by PTPL1. Remarkably, the quarter of proteins identified belong to cell junction structure or regulation. We then studied the impact of this phosphatase on cell junctions and showed that PTPL1 overexpression enhances cell aggregate formation in 3D culture, increases cell contact stability, relocates desmoglein to the cell junctions, and induces E-cadherin re-expression at the level of cell-cell contacts in MDA-MB-231 cells.Cell junctions and polarity are very important in oncology and particularly in the invasive process which is the first step in the metastatic dissemination. Our ongoing work focuses on identifying direct substrates for PTPL1 in order to elucidate the underlying PTPL1 signal leading to cell junctions and consequently propose a novel therapeutic targets.

La dérégulation des tyrosine kinases (TK) joue un rôle majeur dans la tumorigénèse et la progression tumorale des cancers du sein. Dans ce contexte, mon travail de thèse s'est focalisé sur la caractérisation des mécanismes moléculaires régulés par les TK associés à l'invasion cellulaire à travers deux axes d'études distincts : la régulation de l'invasion cellulaire par la protéine TOM1L1 dans les cancers du sein ERBB2-positifs et le rôle des TK ABL/ARG dans l'invasion cellulaire des cancers du sein triple-négatifs (n'exprimant ni ERBB2, ni les récepteurs hormonaux) (TN). TOM1L1 est une protéine du trafic vésiculaire à domaine GAT initialement caractérisée au laboratoire comme un régulateur négatif de l'activité mitogénique de la TK Src. Cependant, nos travaux indiquent que les gènes codant pour TOM1L1 et le récepteur TK ERBB2, localisés au niveau du chromosome 17q, sont co-amplifiés dans environ 50% de ces cancers et associés à un mauvais pronostic suggérant une activité oncogénique non-anticipée de TOM1L1. Mon travail de thèse montre que le récepteur ERBB2 régule indirectement la phosphorylation de la sérine 321 de TOM1L1 afin de permettre son association avec la protéine du trafic vésiculaire TOLLIP au niveau d'endosomes Rab7/MT1-MMP-positifs. Ainsi localisée, TOM1L1 favorise le recrutement membranaire de la métalloprotéase MT1-MMP au niveau de structures d'invasion cellulaire spécifiques, les invadopodes, amplifiant ainsi la capacité invasive des cellules ERBB2+. Des données récentes indiquent que les TK ABL/ARG sont aussi impliquées dans la régulation des invadopodes des cellules des cancers TN. Grace à une approche préliminaire d'inhibition pharmacologique (Imatinib, Nilotinib), mes travaux de thèse ont permis de dévoiler un rôle anti-invasif non-anticipé de ABL dans certaines lignées de cancers du sein TN, dont nous recherchons actuellement le mécanisme. / Deregulation of tyrosine kinases (TK) plays crucial role in breast cancer tumorigenesis and metastatic progression. In this context, my work tried to decipher the molecular mechanisms of tyrosine kinases-induced cell invasion via two distinct research axes: the regulation of cell invasion by TOM1L1 in ERBB2-positive breast cancers and the role of ABL/ARG TK in triple-negative (TN) breast cancer cells (negative for ERBB2 and hormonal receptors expression). The GAT domain-containing vesicular trafficking protein TOM1L1 was first identified in the lab as a negative regulator of Src mitogenic activity. Here, we show that ERBB2 and TOM1L1, located on chromosome 17q, are co-amplified in 50% of breast tumor samples and define a subgroup of ERBB2-positive tumors with poor prognosis. We then studied TOM1L1 pro-oncogenic function and found that TOM1L1 regulates exclusively ERBB2-driven cell invasion. This effect requires indirect ERBB2-induced TOM1L1 phosphorylation on serine 321 and interaction with the endosomal sorting protein TOLLIP at Rab7/MT1-MMP-positive endosomes. Thus, TOM1L1 promotes membrane recruitment of MT1-MMP into specialized invasive structures called invadopodia and, as such, promotes cell invasion. Recent observations show that ABL/ARG TK are also involve in invadopodia regulation of TN breast cancers. With a preliminary pharmacological-inhibition strategy (Imatinib,Nilotinib), my work shows an unanticipated anti-invasive function of ABL in some TN cell-lines. We are currently looking for ABL kinases molecular mechanisms involved in this effect.

Cette thèse vise à améliorer notre connaissance des processus évolutifs et écologiques liés aux invasions biologiques au travers de l'étude de populations envahissantes et non envahissantes de la petite fourmi de feu, Wasmannia auropunctata. Cette espèce présente un polymorphisme du système de reproduction original. Dans les populations ancestrales, les reines et les mâles se reproduisent selon le mode de reproduction sexué classique des hyménoptères (haplo-diploïde). Dans d'autres populations, les reines sont parthénogénétiques et les mâles sont produits de manière clonale via les œufs pondus par la reine. Ces reines et ces mâles produisent néanmoins des ouvrières stériles sexuellement. Ce mode de reproduction clonal semble associé indirectement au succès d'invasion des populations. Dans un premier temps nous avons identifié les mécanismes sous-jacents au système de reproduction des populations clonales. Nos résultats montrent que les reines utilisent la parthénogenèse automictique associée à une réduction du taux de recombinaison pour la production de reines, l'androgenèse pour la production des mâles et la reproduction sexuée pour la production d'ouvrières stériles. La fixation des génomes parentaux dans les descendances successives permet la reproduction entre individus d'une même cohorte en évitant la dépression de consanguinité dans la descendance ouvrière. Nous avons ensuite montré que le changement de système de reproduction de la sexualité vers la clonalité est associé à un changement adaptatif permettant aux ouvrières des populations clonales de mieux tolérer les températures stressantes caractéristiques des localités envahies, comparativement aux ouvrières des populations sexuées ancestrales. Enfin, l'utilisation d'une approche multidisciplinaire couplant des modèles de distribution d'espèces, des analyses de génétique des populations et des expériences en laboratoire, nous a permis de montrer que les changements évolutifs clefs associés au succès d'invasion des populations, ont lieu dans des habitats marginaux de l'aire native, avant la dispersion vers des localités distantes caractérisées par des conditions environnementales similaires. / The main goal of this thesis is to provide new insights on the evolutionary processes associated to biological invasions through the study of invasive and non-invasive populations of the little fire ant, W. auropunctata. This species is characterised by an eccentric breeding system polymorphism. In ancestral populations, queens and males reproduce following the classical sexual reproduction system of hymenopteran species (haplo-diploid). In some other populations, queens reproduce by parthenogenesis and the males are reproduced clonally through queens' eggs. These clonal queens and males nevertheless produce sterile workers sexually. Interestingly this clonal reproduction seems indirectly associated with the invasive success of populations. In this study, we first identified the mechanisms underlying the breeding system of clonal populations. Our results indicate that queens use automictic parthenogenesis associated with a drastic reduction of meiotic recombination rate, androgenesis and sexual reproduction for the production of queens, males, and sterile workers respectively. The fixation of parental genomes in the successive generations allows individuals from the same cohort to reproduce together avoiding inbreeding depression in their worker offspring. We also found that the change of breeding system from sexuality to clonality is associated with an adaptive change that allow workers from clonal populations to better tolerate the stressing temperatures of invaded areas better than workers from ancestral sexual populations. Finally, we used a developed mutlidisciplinary approach combining niche modelling, genetic analyses and laboratory experiments, and found that the above evolutionary changes occur within the native range in marginal habitats prior to long-distance dispersal events into localities that display similar environmental conditions.

Les invasions biologiques étant des processus raisonnablement limités dans le temps et l’espace, elles fournissent un cadre propice à l’étude de modèles complexes par simulation numérique. Nous mettons à profit la méthode de Calcul Bayésien Approché (ABC) pour étudier l’invasion du frelon asiatique (Vespa velutina), en estimant les paramètres d’un modèle probabiliste démographique et génétique spatialement explicite. La croissance des populations dans chaque unité paysagère est décrite par une fonction des conditions environnementales locales, tandis que les flux migratoires entre populations sont tirés dans des lois dont les densités sont fonctions de la distance géographique à parcourir. Certains paramètres de ces fonctions sont inconnus et doivent être estimés. Conditionnellement à la démographie, un processus de coalescence permet de simuler l’histoire génétique de l’échantillon. Une fois la simulation achevée, la procédure ABC permet de accepter/rejeter les valeurs de paramètres en fonction de la plausibilité des données génétiques qu’ils permettent de générer. La comparaison de modèles étant une étape clé de la méthodologie ABC, cela impose que différentes versions de simulateurs de coalescence puissent être rapidement développées. A cette fin, cette thèse propose Quetzal, une bibliothèque assez générale pour pouvoir aisément s’adapter à un grand nombre de modèles possibles, et qui inclue des algorithmes originaux et génériques. Les principaux concepts de programmation permettant d’utiliser et d’étendre Quetzal sont également exposés à travers les différents chapitres. Enfin, nous mettons à profit les particularités du contexte d’étude du frelon asiatique pour développer une méthodologie spécifique reposant sur le formalisme des partitions floues et qui permet, en recentrant l’analyse sur les processus démographiques très récents, de réduire le nombre d’hypothèses, le nombre de paramètres et le coût simulatoire de l’analyse. / Because biological invasions are processes well delimited in both space and time, they offer a unique framework in which complex models can be studied by numerical simulations. We use the Approximated Bayesian Computation method (ABC)to study the Vespa velutina invasion, estimating the parameters of spatially explicit demographic and genetic probabilistic model. The population growth in each landscape unit is described by a function of the local environmental features, whereas the migration flux between populations are sampled in laws which densities are functions of the geographical distance. Some of the parameters of these functions are unknown and should be estimated. Conditionally to the demography, a coalescence process allows for simulating the genetic history of the sample. Once the simulation done, the ABC method allows for accepting/rejecting the parameters values as a function of the data plausibility they generate. Models comparison is a key step in ABC methodology: this requires that various versions of coalescence-based simulators can be quickly developed. To this end, this thesis offers Quetzal, a library general enough to be easily adapted to an open-ended number of models variants. It includes original and generic algorithms. The main programming concepts required to use and extend Quetzal are presented through the various chapters. Finally, we take advantage of the biological context to develop a specific methodology built on the fuzzy partitions formalism. It allows to focus only on the very recent demographic processes, and consequently to reduce the number of hypothesis,the number of parameters, and the simulation cost of the analysis.

La question de la coexistence entre espèces est cruciale dans le contexte des changements globaux, où certaines espèces colonisent de nouveaux écosystèmes, tel le cas des espèces invasives. Dans les habitats discontinus, la coexistence entre espèces invasives et natives gagne à être considérée à la lumière de la théorie des métacommunautés, et en particulier en examinant séparément les processus de dispersion et les interactions locales afin de déterminer leurs effets relatifs. Les approches observationnelles en milieux naturels permettent par ailleurs la prise en compte de la complexité des relations possibles. C’est le travail abordé dans cette thèse à travers l’exemple de l’effet de l’invasion de l’écrevisse de Louisiane sur les amphibiens natifs dans des réseaux de mares. La densité des larves et la distribution des amphibiens ont montré la conccurrence avec l’écrevisse dans les mares. Grâce à la génétique du paysage, la dispersion de l’écrevisse s’est révélée fortement contrainte par le caractère discontinu des habitats, contrairement à celle des amphibiens, bien qu’elle ait été variable parmi les trois espèces étudiées. Les analyses d’isotopes stables ont montré que malgré sa position centrale dans les réseaux trophiques, l’écrevisse n’avait pas de fortes interactions trophiques avec les amphibiens, tout au plus un effet indirect par la modification de l’habitat. Sur la base des mécanismes considérés ici, la coexistence entre les amphibiens natifs et l’écrevisse invasive semble ainsi envisageable. Des suites de ce travail sont envisageables à l’échelle des communautés grâce à l’ADN environnemental. / The question of species coexistence is crucial in the context of global changes, where some species colonize new ecosystems, such as the case of invasive species. In patchy habitats, the coexistence between invasive and native species gains at being considered in the light of the metacommunity theory, and particularly by examining separately the processes of dispersal and local interactions to determine their relative effects. Besides, observational approaches in natural habitats allow to account for the complexity of the possible relationships. It is the work tackled in this thesis through the example of the effect of the red swamp crayfish on native amphibians in pond networks. The density of larvae and the distribution of native amphibians showed the co-occurrence with the crayfish in ponds. Owing to landscape genetics, the dispersal of crayfish was shown to be highly constrained by the patchy nature of habitats, contrary to that of amphibians, although it was variable among the three species considered. The stable isotope analyses showed that, despite its central position in the food webs, the crayfish did not have strong trophic interactions with amphibians, all the more an indirect effect through habitat modification. On the basis of the mechanisms considered here, the coexistence between native amphibians and the invasive crayfish seem possible. Perspectives from this work are envisaged at the community scale using environmental DNA.

L'interaction des glycosphingolipides de la membrane plasmique avec les protéines de liaison aux glucides (lectines) est d'une importance vitale pour l'infection de la cellule hôte par divers virus et bactéries. Dans ce travail, nous avons exploré l’interaction des lectines LecA de la bactérie P. aeruginosa et de la sous-unité B de la toxine Shiga (StxB) de S. dysenteriae avec son récepteur à membrane plasmatique, le globotriaosylcéramide (Gb3). De plus, nous avons étudié l'interaction de la bactérie complète P. aeruginosa avec Gb3. Afin de déchiffrer l'interaction lectine-Gb3 en l'absence d'autres composants cellulaires, nous avons utilisé les systèmes de membrane artificielle - vésicules unilamellaires géantes (GUV) et bicouches lipidiques supportées (SLB). Nous avons observé la liaison de la lectine en utilisant différents modes de microscopie à fluorescence (confocal, TIRF, etc.). Nous examinons la liaison des deux lectines aux domaines membranaires de différents ordres et compositions. Nous avons constaté que StxB préfère des domaines membranaires plus ordonnés alors que LecA est moins préférentiel. De plus, les deux lectines induisent la réorganisation des domaines membranaires: StxB stabilise les domaines ordonnés, les réduit et induit la formation des nouveaux domaines ordonnés. D'autre part, LecA ainsi que la bactérie P. aeruginosa induisent la dissolution des domaines ordonnés. Nous pensons que ces processus de réorganisation membranaire sont cruciaux pour l’infection bactérienne. / The interaction of plasma membrane glycosphingolipids with the carbohydrate binding proteins (lectins) is of vital importance for the infection of the host cell by various viruses and bacteria. In this work, we explored the interaction of the lectins LecA from the bacterium P. aeruginosa and B subunit of Shiga toxin (StxB) from S. dysenteriae with its plasma membrane receptor globotriaosylceramide (Gb3). Moreover, we studied the interaction of the complete bacterium P. aeruginosa with Gb3. In order to decipher the lectin-Gb3 interaction in absence of other cellular components we employed the artificial membrane systems – Giant unilamellar vesicles (GUVs) and Supported lipid bilayers (SLBs). We observed the lectin binding using different modes of fluorescence microscopy (confocal, TIRF, etc…). We examine the binding of both lectins to the membrane domains of different ordere and composition. We found that StxB prefers more ordered membrane domains whereas LecA is less preferential. Moreover, both lectins induce the reorganization of the membrane domains: StxB stabilizes ordered domains, shrinks them and induces the formation of the novel ordered domains. On the other hand LecA, as well as the bacterium P. aeruginosa induce the dissolution of the ordered domains. We believe, these membrane reorganization processes are crucial for the bacterial infection.

Les trois enzymes de la famille PRL (PRL-1,2,3), représentent un groupe de protéines tyrosine phosphatases intrigantes, impliquées dans un très grand nombre de maladies. Elles ont gagné beaucoup d'attention ces dernières années dans le contexte tumoral puisqu’elles sont très fréquemment associées à la formation de métastases, la prolifération cellulaire, l'invasion et la migration cellulaire. Bien que les propriétés oncogéniques des PRLs ne fassent plus de doute, ces phosphatases sont très peu caractérisées dans un contexte physiologique. Ainsi, aucun substrat biologique n’a été clairement identifié à ce jour et très peu de fonctions biologiques leurs sont associées, malgré un très haut degré de conservation inter-espèce suggérant un rôle critique de ces protéines dans les fonctions cellulaires. La caractérisation de la souris déficiente pour PRL-2 indique que cette phosphatase est probablement impliquée tout au long du développement. La phosphorylation des protéines est un phénomène important pour la régulation de l'angiogenèse en jouant des fonctions critiques et réversibles sur les voies de signalisation cellulaire. Cela nous a incités, dans le cadre de cette thèse, à étudier le rôle de PRL-2 dans la morphogenèse vasculaire en utilisant à la fois des modèles in vitro et un modèle de souris déficientes pour PRL-2. Dans le modèle murin de l'angiogenèse rétinienne, nous avons trouvé que la délétion de PRL-2 entraîne un retard dans la formation du plexus vasculaire avec une réduction de la vascularisation. De plus, on observe une angiogenèse et une ramification excessive au niveau du front vasculaire chez les souriceaux. En effet, le front de croissance des rétines de souris PRL-2 KO présente une densité vasculaire plus élevée associée à un bourgeonnement endothélial actif et multidirectionnel. Ces données présentent PRL-2 comme un composant potentiel du réseau de signalisation complexe qui orchestre la néo-angiogenèse. Nous avons ensuite examiné les conséquences de la perte de PRL-2 sur le comportement des cellules endothéliales in vitro. Nous avons observé des modifications de migration et d’invasion dans différents modèles. En particulier, l’absence de PRL-2 accroît le bourgeonnement de capillaires dans des tests d'angiogenèse in vitro, ce qui est en accord avec les données in vivo. En utilisant plusieurs siRNA, nous avons montré que la voie de signalisation de PRL-2 est liée à la signalisation VEGF/VEGFR. En effet, la stimulation des cellules endothéliales par le VEGF dépend de la présence ou de l'absence de PRL-2. En outre, une autre voie altérée par la régulation négative de PRL-2, est celle de Notch ainsi que celle du facteur de transcription Hey2. Ceci est cohérent avec les données in vivo où nous avons démontré un effet important sur la différenciation artérioveineuse. Ces données introduisent PRL-2 en tant que composant novateur du réseau de signalisation complexe qui orchestre l'angiogenèse développementale et, éventuellement, pathologique. / The three Phosphatase of Regenerative Liver (PRL-1, -2, -3) represent an intriguing group of protein tyrosine phosphatases that has been implicated in a number of diseases. They have gained much attention in the context of cancer. Indeed, they have been constantly associated with metastasis, cell proliferation, cell invasion and migration. To date, however, little is known about their physiological function and no biological substrates have been clearly identified. All three PRLs are highly conserved among mammals, underscoring the idea that they might have important roles in cellular functions. Characterization of the PRL-2 knockout mouse indicates that this phosphatase is likely involved throughout development. Protein phosphorylation is implicated in angiogenesis by playing critical and reversible functions in cell signaling pathways. This prompted us, in the frame of this thesis, to investigate the role of PRL-2 in vascular morphogenesis using both in vitro models and genetic loss-of-function mouse models. In the retinal angiogenesis mouse model, we found that PRL-2 deletion leads to delay in the formation of the retinal vascular plexus with a reduction of the advancing vasculature across the vitreal surface. Furthermore, excessive angiogenesis and branching at the leading edge in 6 day old pups is observed. Indeed, the growing front of PRL-2 KO mouse retinas showed a higher vascular density due to active, multidirectional hypersprouting of the vasculature. This data introduces PRL-2 as a potential component of the complex signaling network that orchestrates neo-angiogenesis. Based on these findings, we have examined whether the absence of PRL-2 can modify the behavior of endothelial cells in vitro. We showed an altered migration in various assays. In particular, sprouting in in vitro angiogenesis assays is altered, which is in agreement with the in vivo data. By using several siRNA, we showed that the signaling pathway of PRL-2 is dependent to VEGF/VEGFR signaling. Indeed, the stimulation of endothelial cells by VEGF is dependant of the presence or absence of PRL-2. Furthermore, other targets altered by PRL-2 downregulation, are Notch and the Hey2 transcription factor, which is consistent with in vivo data as we showed a strikingly effect on arteriovenous differentiation. Taken together, these data introduce PRL-2 as a novel component of the complex signaling network that orchestrates developmental and, possibly, pathological angiogenesis.

La progression métastatique des cancers est responsable de 90% des décès liés à la maladie. Cette cascade est initiée par l’invasion des cellules cancéreuses du stroma péritumoral, et conduit à leur dissémination dans l’organisme.Mon travail de thèse a eu pour but d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires régulant l’invasion des cancers colorectaux (CRC), qui est le 2ème cancer le plus répandu dans le monde. Grâce à une analyse réalisée sur des échantillons humains de tumeurs primaires, nous avons révélés que les cellules de CRC utilisent un mode d’invasion collective dans lequel elles gardent une architecture glandulaire spécifique des épithelia. Afin d’étudier les voies de signalisation régulant cette invasion, nous avons utilisé des modèles organotypiques récapitulant l’architecture des glandes de CRC (cystes de Caco-2 et tumoroïdes de xénogreffes derivés de patients) dans des tests d’invasion utilisant du collagen-I. Du fait de son rôle central dans la régulation de la motilité cellulaire, la voie des RhoGTPases était un bon candidat à la régulation de l’invasion collective des CRC. Dans un screen utilisant des siRNA ciblant tous les effecteurs connus des RhoGTPases, seule la déplétion des protéines kinases ROCK a déclenché l’invasion collective dans notre système expérimental. Nous avons démontré que l’inhibition de ROCK2 et non de ROCK1 était suffisante pour induire la formation de cellules leader, permettant la polarisation leader/follower requise pour l’invasion collective. Nos résultats montrent que l’inhibition de ROCK2 déclenche l’invasion collective par l’inhibition de MyosinII combinée à l’activation du facteur d’échange nucléotide guanine (GEF), FARP2, et de RAC1. Notre étude permet donc d’identifier FARP2 comme un nouvel effecteur de ROCK2 et le positionne comme un nouveau médiateur du crosstalk entre RhoA et RAC1 dans la régulation de l’invasion collective des CRC. En conclusion, nous avons décrit une nouvelle voie de signalisation dépendante de ROCK2 contrôlant l’invasion collective de glandes de CRC. De façon intéressante, notre étude révèle un rôle anti-invasive de ROCK2 contredisant son rôle pro-invasive décrit dans l’invasion de cellules individuelles. Cela suggère que ROCK2 assure des rôles distincts en fonction du mode d’invasion adopté par les cellules cancéreuses et remet en question le bénéfice thérapeutique de l’inhibition de ROCK proposé pour bloquer l’invasion des cellules cancéreuses. / Metastatic progression of cancer is responsible for 90% of the disease related death. It is a multi-step process which is initiated by invasion of the peritumoral stroma by cancer cells and which leads to the dissemination of cancer cells in the organism.My PhD work aimed at identifying the molecular and cellular process driving colorectal carcinoma (CRC) invasion, which is the 2nd most frequent cancer worldwide. Our analysis of live and human primary cancer specimen revealed that CRC cells used a collective mode of invasion to disseminate, in which cells retain an epithelium specific -glandular architecture. To investigate the signaling pathways regulating this mode of invasion, we used 3D organotypic models recapitulating the features of CRC glands (Caco-2 cysts and Patient derived Xenografts (PDX) tumoroids) in collagen-I based organotypic invasion assays and in microscopy-based analyses. Because of its central role in the regulation of cell motility, we postulated that RhoGTPases signaling pathways could control the collective of CRC. In a siRNA based- screen targeting all the known effectors of RhoGTPases we found that only ROCK kinases downregulation induced collective invasion in our experimental settings. We demonstrated that ROCK2 but not ROCK1 inhibition was sufficient to promote Leader cell formation, which induced the leader/follower polarization necessary for collective invasion. Our results revealed that ROCK2 inhibition triggered collective invasion through the concomitant inhibition of MyosinII and activation of the guanine nucleotide exchange factor (GEF) FARP2 and the RhoGTPase RAC1. We therefore identify FARP2 as a new effector of ROCK2 and a mediator of the RhoA-RAC1 crosstalk in the regulation of collective invasion. In conclusion our study proposes a new ROCK dependent-signaling pathway in the regulation of collective invasion of highly polarized CRC glands models. Importantly, we found ROCK2 to be an anti-invasive protein which is in contradiction with its described pro-invasive role in single cell invasion. This suggests distinct roles of ROCK which may depend on the mode of invasion adopted by the cells and questions the benefice of proposed ROCK inhibition strategies to block cancer cell invasion.

Le mélanome uvéal (MU) est une tumeur rare, affectant 500 à 600 nouveaux cas par an en France, mais il s’agit de la tumeur intraoculaire la plus fréquente chez l’adulte. Cette tumeur est due à la transformation des mélanocytes dérivés de la crête neurale et localisés dans l’uvée (choroïde, corps ciliaire et iris). C’est une tumeur très agressive puisque, malgré le traitement de la tumeur primaire, jusqu’à 50% des patients développeront des métastases hépatiques. En effet, malgré les nombreux efforts fournis pour le développement de nouvelles thérapies, celles-ci se sont révélées jusqu’à présent peu efficaces. Ainsi, une meilleure compréhension du processus métastatique et l’identification des gènes impliqués dans celui-ci sont des enjeux importants pour permettre le développement de nouvelles thérapies. Une analyse transcriptomique réalisé dans le laboratoire a permis d’identifier la phosphatase PRL-3 dont la surexpression est en corrélation avec le développement métastatique et le mauvais pronostic de survie des patients. Des études fonctionnelles ont montré que les cellules de MU exprimant PRL-3 avaient une capacité de migration et d’invasion accrue par rapport aux cellules exprimant une forme mutante catalytiquement inactive de la phosphatase. L’implication de PRL-3 dans le développement tumoral et le processus métastatique a été très largement décrite dans de nombreux cancers et son mécanisme d’action et ses cibles sont en cours d’investigation. De façon intéressante, certaines cibles de PRL-3 sont des protéines liées au cytosquelette. Dans le but d’identifier de nouvelles cibles de PRL-3 dans le MU, nous avons réalisé une analyse phosphoprotéomique qui nous a permis de mettre en évidence la protéine CRMP2. CRMP2 est une protéine liée au cytosquelette dont le rôle a majoritairement été décrit dans le système nerveux. CRMP2 joue un rôle dans le guidage axonal, l’extensition des neurites, la dynamique des microtubules et le trafic vésiculaire. Au cours de ma thèse, j’ai pu confirmer que dans les cellules de MU, PRL-3 modifie l’état de phosphorylation de CRMP2 en particulier sur les résidus T514 et S522. De plus, CRMP2 et PRL-3 interagisse et cette interaction aboutit à une diminution de la phosphorylation de CRMP2 sur le T514, ce qui suggère que CRMP2 est une cible directe de PRL-3. Des études fonctionnelles ont montré que l’extinction de CRMP2 par ARN interférent augmente la vitesse de migration et l’invasion des cellules de MU qui expriment PRL-3. CRMP2 est donc un frein à la migration et l’invasion des cellules de MU. La migration et l’invasion accrue dans ces cellules sont corrélées à un réarrangement du réseau d’actine avec une diminution des fibres de stress. L’étude des propriétés micro-rhéologiques des cellules de MU montre également que l’expression de PRL-3 et/ou l’extinction de CRMP2 augmente la viscosité, l’élasticité et la dureté du cytoplasme. L’extinction de CRMP2 ne modifie pas ces propriétés dans les cellules exprimant déjà PRL-3 ce qui montre que l’effet de l’extinction de CRMP2 est équivalent à celui de déphosphorylation. Enfin, dans les tumeurs l’expression de CRMP2 est associée à un bon pronostic de survie. Au cours de ma thèse, j’ai également participé à la création d’une carte du réseau d’interaction des molécules et des voies de signalisation impliquant PRL-3 dans le développement du cancer dans le cadre du projet NaviCell. Cette carte a été intégrée à la base de donnée ACSN. / Uveal melanoma (UM) is a rare tumor (500 to 600 new cases by year in France) but this is the most common intraocular cancer in adult. This tumor is due to melanocytes transformation derived from neural crest and localized in uvea (choroid, ciliary body and iris). Despite the primary tumor treatment, up to 50% of patients will develop metastases mostly localized in liver within the years following diagnosis. The median survival rate of metastasis formation is only six months. Indeed, there are currently no effective treatments against metastasis. Therefore, a better comprehension of UM metastatic process and identification of the genes involved are major issues for the development of new therapies. A transcriptomic analysis done in our laboratory allows to identify the phosphatase PRL-3 whose overexpression is correlated with metastatic development and patients poor prognosis. Besides being a bad prognosis marker, functional studies showed that UM cells expressing PRL-3 migrate faster and are more invasive than cells expressing the catalytic dead mutant of the phosphatase. The role of PRL-3 in tumorigenesis and metastatic development is well described, and numerous studies investigate his mechanism of action and his intracellular substrates. Interestingly, some of the identified PRL-3’s targets are cytoskeletal proteins. In order to identify new PRL-3’s targets in UM, we realized a phosphoproteomic analysis that allows us to identify CRMP2. CRMP2 is a cytoskeletal protein that has been mostly described in the nervous system. CRMP2 plays a role in axonal guidance, neuritis extension, microtubules dynamics and vesicular trafficking. During my PhD, I confirmed that in UM cells, PRL-3 expression modify the phosphorylation state of CRMP2 in particular on T514 and S522 residues. Moreover, CRMP2 and PRL-3 interact together and CRMP2 is less phosphorylated on the T514 following the interaction, which suggests that CRMP2 is a target of PRL-3. Furthermore, we showed that CRMP2 KO by shRNA increases UM cells velocity and invasion in cells expressing PRL-3. So CRMP2 is a brake to the migration and invasion process in UM cells. These observations are correlated with a reorganization of actin cytoskeleton with a reduction of stress fibers. The study of the microrheological properties of UM cells showed that PRL-3 expression and/or CRMP2 KO increases the viscosity, elasticity and stiffness of the cytoplasm. CRMP2 KO changes these properties only when PRL-3 is not functional which suggests that concerning the micro-rheology, CRMP2 KO is equivalent the its dephosphorylation by PRL-3. Finally, in UM tumors, CRMP2 expression are correlated with good survival prognosis. My PhD also gave me the opportunity to participate to the creation of a map about interactions and signaling pathways involving PRL-3 in cancers as part of the NaviCell project. This map was integrated in ASCN database.