京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13031号 / 論医博第2113号 / 新制||医||1016(附属図書館) / 32989 / (主査)教授 妻木 範行, 教授 安達 泰治, 教授 開 祐司 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23770号 / 医博第4816号 / 新制||医||1056(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 長船 健二, 教授 安達 泰治, 教授 遊佐 宏介 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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La mesure de l’index de pression systolique de cheville (IPSC) constitue un outil simple et non invasif pour détecter les atteintes artérielles des membres inférieurs. Si la méthodologie et l’interprétation de cet index ont été standardisées, il demeure des divergences quant à certains aspects de sa mesure. Ainsi, les travaux de recherche menés ont investigué trois de ces aspects. Dans un premier temps, l’objectif était d’étudier l’évolution physiologique de l’IPSC avec l’avancée en âge au sein d’une population saine et physiquement active. Cette analyse a rapporté une relation positive entre l’IPSC et l’âge, tendance « logique » au regard des modifications structurales de l’artère avec la sénescence. Dans un deuxième temps, les investigations se sont orientées vers l’utilisation d’outils de mesures automatiques de la pression artérielle pour le calcul de l’IPSC en récupération d’un exercice physique. Nous avons mis en évidence que l’outil oscillométrique permettait d’obtenir une valeur d’IPSC post-effort plus rapide mais aussi de diminuer l’erreur standard de mesure. Dans un troisième temps, nous avons abordé les stratégies d’apprentissage de cette mesure vasculaire. La mesure de pression systolique de cheville (PASC) apparaît largement sous-enseignée comparativement à la mesure brachiale. L’objectif était d’étudier objectivement, via simulateur, l’effet d’une intervention pédagogique pratique supplémentaire sur la compétence d’étudiants novices à mesurer cette PASC. Un apprentissage pratique d’une heure permettait de diminuer l’erreur de mesure mais n’était pas suffisante pour harmoniser l’ensemble des paramètres de la mesure selon les standards de mesure existants. / The measurement of ankle to brachial pressure index (ABPI) is a simple and non-invasive diagnostic tool for detecting arterial involvement of the lower limbs. If the methodology and interpretation of this index have been standardized, there remain some discrepancies about some aspects of its measurement. Thus, the present thesis reports the investigations of three of these aspects. First, the objective was to study the physiological relationship between ABPI and age among healthy and physically active subjects. The results show a positive relationship. This trend is consistent with structural modifications of arterial wall with ageing. Second, our aim was to investigate the use of automatic blood pressure measurement tools for the calculation of ABPI during the recovery of a maximal physical exercise. We found that the use of anoscillometric blood pressure device allowed to obtain a faster postexercise ABPI faster than a manual recording and also to reduce the standard error of the measurement. Finally, we discussed the learning strategies of this peripheral vascular measurement. Indeed, it appears that the measurement of arterial systolic blood pressure at the ankle (ASBPa) is largely under-taught compared to the humeral measurement. The purpose was to objectively assess, by a simulator, the effect of an additional practical and pedagogical intervention on the ability of novice students to perform ASBP a measurement. The results suggest that a one-hour practical learning allows to significantly reduce the measurement error but is not sufficient to harmonize all of the measurement parameters according to the measurement standards.

La vision est considérée comme un des sens les plus importants, prenant en charge environ 80% des perceptions que nous recevons dans notre vie quotidienne. Les photorécepteurs de type cônes sont responsables de la vision centrale de haute résolution et en couleurs, et leur dégénérescence est souvent la cause de la perte de vision dans les maladies dégénératives rétiniennes (RDs). Les RDs sont un groupe hétérogène de maladies affectant des millions de personnes dans le monde, qui pour le moment sont pour la plupart sans aucune option thérapeutique. Les modèles animaux sont extrêmement utiles pour étudier le développement ou la dégénérescence de la rétine, ainsi que pour comprendre les mécanismes moléculaires des maladies génétiques héréditaires affectant les photorécepteurs. La modélisation des maladies dégénératives et du développement peut être particulièrement difficile, spécialement dans le cas de maladies humaines rares et complexes pour lesquelles aucun modèle animal exhaustif n'est disponible. De nos jours, la génération et le maintien de modèles de maladies humaines permettant une analyse approfondie du mécanisme moléculaire représente un grand défis . La technologie des cellules souches possède un grand potentiel dans la modélisation des maladies et représente un outil puissant pour générer des modèles évolutifs, sans l’utilisation d’animaux qui peuvent illustrer plus précisément les phénotypes cliniques de maladies humaines complexes. Nous avons développé un protocole pour différencier les cellules souches pluripotentes (PSCs) en feuillets rétiniens (RSs), qui sont des tissus polarisés et multicouches contenant des photorécepteurs cône et exprimant les marqueurs spécifiques du segment externe (OS), du cilium connecteur (CC) et du noyau. En utilisant à la fois des modèles de souris et des modèles humanisés à base de cellules souches, nous avons étudié le rôle de BMI1 dans les photorécepteurs matures. La protéine du groupe Polycomb Bmi1 est connue pour ses fonctions neuroprotectrices en contrôlant la sénescence et l'apoptose, et est exprimée à la fois dans le progéniteur rétinien et les neurones, mais on en sait peu sur son rôle spécifique dans la rétine adulte. Elle a été récemment associée à des troubles neurodégénératifs d'apparition tardive, et elle pourrait avoir un rôle dans la pathologie des RDs d'apparition tardive, comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA). Nous avons montré que les photorécepteurs cône et les neurones bipolaires sont générés normalement mais subissent ensuite une dégénérescence rapide chez les souris Bmi1-/- par nécroptose associée à Rip3. La dégénérescence était associée à des anomalies de compactage de la chromatine, à l'activation des répétitions en tandem et au stress oxydatif. De plus, nous montrons que BMI1 est préférentiellement exprimé dans les cônes au niveau des foyers hétérochromatiques dans la rétine humaine. Son inactivation dans les cellules souches embryonnaires humaines (hESCs) a altéré la différenciation terminale du cône et a entraîné des anomalies de compactage de la chromatine, l'activation des répétitions en tandem et l'induction de P53. Ces résultats fournissent un mécanisme expliquant comment une carence en Bmi1 conduit à la dégénérescence des cônes et révèlent des fonctions biologiques conservées et des différences pour Bmi1 dans la biologie des photorécepteurs entre la souris et l'homme. En utilisant un modèle humain basé sur les cellules souches pluripotentes induites (iPSCs), nous avons ensuite étudié le processus dégénératif chez les patients atteints de ciliopathies, un groupe de maladies génétiques hétérogènes affectant les protéines impliquées dans la structure et la fonction du cil primaire, qui sont fréquemment accompagnée d'une dégénérescence rétinienne. Nous générons des feuillets rétiniens dérivés d'iPSCs à partir de patients atteints de deux ciliopathies, les syndromes de Meckel-Gruber (MKS) et de Bardet-Biedl (BBS). Les photorécepteurs ciliopathiques présentaient des altérations communes significatives dans l'expression de centaines de gènes de développement. De plus, ils ont montré plusieurs anomalies dans la formation et le maintien du cilium interne, le positionnement du centriole mère, l'activation d'une réponse au stress aux protéines mal repliées, instabilités génomiques et l'accumulation de dommages à l'ADN. Cette étude révèle comment la combinaison des technologies de reprogrammation cellulaire et d'organogenèse avec le séquençage de nouvelle génération permet d'élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les troubles dégénératifs et développementaux de la rétine humaine. La même approche, combinant la différenciation en RSs avec des techniques de séquençage du génome à large spectre, pourrait être appliquée pour modéliser de nombreuses maladies génétiques, développementales et dégénératives affectant les photorécepteurs. Il peut également aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces maladies, au criblage de médicaments de composés ayant des effets thérapeutiques potentiels et à prédire les effets secondaires des médicaments. / Vision is considered the most important sense, taking on about 80% of the perceptions we receive in our everyday life. Cone-photoreceptors are responsible for high-resolution central vision and color discrimination, and their degeneration is frequently the cause of vision loss in retinal degenerative diseases (RDs). RDs are a heterogeneous group of diseases affecting millions of people worldwide, which at the moment are mostly without any therapeutic option. Animal models are extremely useful in studying the retina's development or degeneration and understanding the molecular mechanisms in inherited genetic disease affecting photoreceptors. Modeling human developmental and degenerative diseases can be particularly challenging, especially in the case of rare and complex diseases where no exhaustive animal models are available. Generation of sustainable human disease models that allow in-depth analysis of the molecular mechanism is one of the big challenges nowadays. Stem cell technology holds great potential in disease modeling and represents a new powerful tool for generating scalable and animal-free models that can more accurately illustrate clinical phenotypes of complex human diseases. We developed a protocol to differentiate pluripotent stem cells (PSCs) into retinal sheets (RSs), which are polarized, multi-layered tissues containing cone photoreceptors and expressing outer segment (OS), connecting cilium (CC), and nuclear specific markers. Using both mouse and stem cells-based humanized models, we first investigate the role of BMI1 in mature photoreceptors. The Polycomb group protein Bmi1 is known for its neuroprotective functions by controlling senescence and apoptosis and is expressed in both retinal progenitor and neurons, but little is known about its specific role in the adult retina. It has been recently linked to late-onset neurodegenerative disorders, and it could have a role in the pathology of late-onset RDs, such as Age-related Macular Degeneration (AMD). We showed that cone photoreceptors and bipolar neurons are generated normally but then undergo rapid degeneration in Bmi1-/- mice through Rip3-associated necroptosis. Degeneration was associated with chromatin compaction anomalies, activation of tandem-repeats, and oxidative stress. Furthermore, we show that BMI1 is preferentially expressed in cones at heterochromatic foci in the human retina. Its inactivation in human embryonic stem cells (hESCs) impaired cone terminal differentiation and resulted in chromatin compaction anomalies, activation of tandem-repeats, and P53 induction. These findings provide a mechanism explaining how Bmi1 deficiency leads to cone degeneration and reveal conserved biological functions and differences for Bmi1 in photoreceptor biology between mouse and man. Using an induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) based human model, we then investigate the degenerative process in patients with ciliopathies, a group of heterogeneous genetic diseases affecting proteins involved in primary cilium structure and function frequently accompanied by retinal degeneration. We generate iPSC-derived retinal sheets from patients affected by two ciliopathies, Meckel-Gruber (MKS) and Bardet-Biedl syndromes (BBS). Ciliopathic photoreceptors displayed significant common alterations in the expression of hundreds of developmental genes. Moreover, they showed several anomalies in the formation and maintenance of cilia, the mother centriole's positioning, the activation of a stress response to misfolded proteins, genomic instabilities, and DNA damage accumulation. This study reveals how combining cell reprogramming and organogenesis technologies with next-generation sequencing enables the elucidation of molecular and cellular mechanisms involved in human retinal degenerative and developmental disorders. The same approach, combining photoreceptor sheet differentiation and wide-genome expression profile, could be applied to model many genetic, developmental, and degenerative diseases affecting photoreceptors. It may help elucidate the molecular mechanisms underlining these diseases, drug screening of compounds with potential therapeutic effects, and predict drug side effects.

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13159号 / 論医博第2146号 / 新制||医||1029(附属図書館) / (主査)教授 河本 宏, 教授 前川 平, 教授 髙折 晃史 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

The rubella virus (RV) was the first virus shown to be teratogenic in humans. The wealth of data on the clinical symptoms associated with congenital rubella syndrome is in stark contrast to an incomplete understanding of the forces leading to the teratogenic alterations in humans. This applies not only to RV, but also to congenital viral infections in general and includes (1) the mode of vertical transmission, even at early gestation, (2) the possible involvement of inflammation as a consequence of an activated innate immune response, and (3) the underlying molecular and cellular alterations. With the progress made in the development of pluripotent stem cell-based models including organoids and embryoids, it is now possible to assess congenital virus infections on a mechanistic level. Moreover, antiviral treatment options can be validated, and newly emerging viruses with a potential impact on human embryonal development, such as that recently reflected by the Zika virus (ZIKV), can be characterized. Here, we discuss human cytomegalovirus (HCMV) and ZIKV in comparison to RV as viruses with well-known congenital pathologies and highlight their analysis on current models for the early phase of human development. This includes the implications of their genetic variability and, as such, virus strain-specific properties for their use as archetype models for congenital virus infections. In this review, we will discuss the use of induced pluripotent stem cells (iPSC) and derived organoid systems for the study of congenital virus infections with a focus on their prominent aetiologies, HCMV, ZIKV, and RV. Their assessment on these models will provide valuable information on how human development is impaired by virus infections; it will also add new insights into the normal progression of human development through the analysis of developmental pathways in the context of virus-induced alterations. These are exciting perspectives for both developmental biology and congenital virology.

Le recours aux cellules souches pour améliorer la réparation et guérison des blessures et maladies musculosquelettiques chez le cheval est de plus en plus fréquent. Les développements récents dans la reprogrammation cellulaire ont permis le développement de nouvelles sources de cellules souches pour ces thérapies régénératives. Des cellules souches pluripotentes induites (iPS) autologues peuvent être dérivées de cellules adultes par la reprogrammation directe à travers l'expression induite des gènes de pluripotence. Le clonage par transfert nucléaire (SCNT) suivi de la dérivation de cellules souches embryonnaires (ES) permet la reprogrammation indirecte des cellules adultes. Cependant, l’efficacité de ces deux méthodes pour la dérivation de cellules pluripotentes génétiquement stables est faible. Nous avons donc combiné les techniques SCNT et iPS dans le but de développer un protocole efficace de dérivation de cellules iPS autologues à partir de fibroblastes de la peau équine. Quatre facteurs de reprogrammation ont été introduits dans les cellules fibroblastes de fœtus clonés (ntFF) ainsi que les cellules ES provenant d’embryons clonés (ntES) pour induire leur reprogrammation en cellules iPS autologues. Les cellules ntFF-iPS et ntES-iPS ont des capacités prolifératives avancées et expriment des marqueurs de pluripotence importants. Par contre, les cellules ntES ont une efficacité de reprogrammation significativement supérieure aux cellules nt-FF et forment des colonies trois fois plus rapidement. Contrairement aux cellules ntES, les cellules ntES-iPS démontrent une augmentation de l’expression des marqueurs de pluripotence et survivent à la culture cellulaire prolongée. Les résultats présentés dans ce mémoire attestent que l’utilisation de la reprogrammation secondaire de cellules FF et ES clonées permet la production de cellules souches pluripotentes autologues stables chez le cheval. / For veterinarians, regenerative medicine in horses has focused mainly in the use of stem cells for arthritis, tendon and ligament repair, indicating a need for treating musculoskeletal injuries. The recent developments in cell reprogramming have paved the way for alternative cell sources for stem cell therapies. Autologous pluripotent stem cell lines can be derived from adult cells either by direct reprogramming through induced expression of pluripotency genes (iPS) or indirectly by reprogramming through somatic cell nuclear transfer (SCNT) followed by the derivation of embryonic stem cells (ESC). However, outcome efficiencies of SCNT and iPS protocols are invariably low, indicating that alone neither of these reprogramming routes is sufficient for deriving genetically and epigenetically stable pluripotent stem cells. We hereby report on the production of autologous equine iPS cells by combining SCNT and iPS reprogramming protocols. Adult skin fibroblasts were used for SCNT, and the resulting cloned embryos were either used to obtain cloned fetal fibroblast cells (ntFF), or used for ESC culture (ntES). Cells were then transfected with reprogramming factors to derive autologous iPS cells. Both ntFF-iPS and ntES-iPS cells are capable of extensive proliferation and express important pluripotency factors. However, ntES reprogramming efficiency is significantly higher than ntFF cells, with ntES-iPS colonies forming three times faster. Additionally, ntES-iPS cells showed improved pluripotency marker expression when compared with ntES cells. The results presented in this memoir indicate that stable equine iPS cell lines may be readily obtained from secondary reprogramming of cloned ntFF and ntES cells, opening novel avenues for developing autologous pluripotent stem cell therapies.

La reconnaissance de l’implication du système immunitaire dans le cancer a guidé l’industrie vers de développement d’immunothérapies nombreuses et prometteuses. Or, à l’ère de l’immuno-oncologie, on constate un manque criant de modèles précliniques capables de simuler les interactions immunitaires entre un patient et sa tumeur. Pour remédier à cette situation, nous avons développé des modèles de souris humanisées combinant la reconstitution immunitaire de souris immunodéficiente et l’injection de lignées tumorales issues d’un même donneur. L’utilisation de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) a permis notamment le développement de multiples lignées tumorales à partir d’un seul donneur sain, facilitant ainsi l’accès aux cellules immunitaires nécessaires à l’humanisation des souris. La transformation des cellules primaires ou dérivées d’iPSC a été faite par la transduction lentivirale des proto-oncogènes de la télomérase (hTERT), de Ras oncogénique (HRASV12) et de la région précoce du viruse simen 40 (SV40ER) encodant les gros et petits antigènes T (LgT et SmT). Cette approche permis de générer des tumeurs de haut grade, agressives et peu différenciées à l’aide de fibroblastes primaires et de cellules hépatiques, de cellules souches neurales et d’astrocytes dérivés d’iPSC. Dans tous les cas, les tumeurs ainsi générées ont été efficacement reconnues, infiltrées et souvent rejetées par le système immunitaire autologue implanté. Le rejet partiel de la plupart de ces tumeurs ouvre toutefois la porte à l’évaluation préclinique d’immunothérapies diverses reposant sur les réactions immunitaires anti-tumorales de l’hôte. Par exemple, nous avons pu étudier l’impact d’un traitement d’inhibition du point de contrôle immunitaire PD-1 sur la croissance de tumeurs d’origine fibroblastique où une augmentation marquée du taux d’infiltration immunitaire humaine a été observé sans toutefois mener à une réduction significative du fardeau tumoral. Nous avons aussi pu produire, de façon autologue, des lymphocytes T exprimant un récepteur d’antigène chimérique (CAR) contre le ganglioside GD2, un antigène tumoral préalablement identifié et détecté sur les tumeurs de cellules souches neurales générées par notre approche. L’efficacité cytotoxique de ces CAR a ainsi pu être validée in vitro dans un système autologue. Finalement, nous avons utilisé le modèle de tumeurs fibroblastiques dans des contextes immunitaires autologues et allogéniques pour déterminer si le potentiel immunomodulateur des cellules stromales mésenchymateuses (MSC) pouvait affecter la croissance tumorale. Selon nos résultats, les MSC n’auraient aucun effet ni sur le taux d’émergence et de croissance tumoral, ni sur l’infiltrat immunitaire, suggérant que leur utilisation thérapeutique serait sécuritaire en ce qui concerne ce type de tumeurs ayant préalablement un microenvironnement tumoral immunosuppresseur. En somme, les modèles innovateurs décrits dans cette thèse visent à améliorer la qualité prédictive des modèles murins précliniques en immuno-oncologie en récapitulant certaines interactions immunitaires entre un patient et sa tumeur. La grande flexibilité de cette approche permettra d’adapter aisément le modèle aux problématiques d’intérêt, tant fondamentales que précliniques. / Identification of the human’s immune system implication in cancer has guided the biotech industry towards the development of numerous and promising cancer immunotherapies. However, in the era of immuno-oncology, a distinct lack preclinical models can simulate the interactions between a patient’s tumor and immune cells. To tackle this issue, we developed humanized mouse models combining immune reconstitution of immunodeficient mice and injection of tumor cells lines from the same human donor. The use of induced pluripotent stem cells (iPSC) allowed the generation of multiple tumorigenic cell lines from a single donor, facilitating access to autologous immune cells necessary for mouse immune humanization. The transformation of primary or iPSC-derived cell lines was done using lentiviral transduction of proto-oncogenes telomerase (hTERT), oncogenic Ras (HRASV12) and simian virus 40 early region (SV40ER) encoding large and small T antigens (LgT and SmT). This approach allowed to generate high grade, aggressive and undifferentiated tumors from primary fibroblasts and iPSC-derived hepatic cells, neural stem cells and astrocytes. In all cases, such tumors were efficiently recognized, infiltrated and often rejected by the implanted autologous immune system. However, partial rejection of most tumors allows for preclinical evaluation of targeted immunotherapies relying on the hosts’ pre-existing immune response. For instance, we could study the impact of PD-1 checkpoint blockade inhibition on tumor growth in fibroblastic tumors where a significant increase in tumor infiltration was observed, but without an associated decrease in tumor burden. We could also produce autologous chimeric antigen receptor (CAR)-expressing T lymphocytes against GD2 ganglioside, a previously described tumor antigen detected on our neural stem cell-derived tumor cells. Cytotoxic efficiency of these autologous CAR T cells could thus be validated in vitro. Finally, we used our fibroblast-derived tumor models in autologous and allogeneic settings to determine if mesenchymal stem cells’ (MSC) immunomodulatory potential could impact tumor growth. Our results showed that MSC had no effect neither on tumor emergence and growth nor on immune infiltration, suggesting therapeutic use of these cells should be safe regarding such tumors already harboring a strongly immunodeficient microenvironment. Overall, the novel models described in this thesis aim at improving the predictive capacity of mouse pre-clinical models in immuno-oncology by recapitulating some immune interactions between a patient and its tumor. The great flexibility of this approach will allow for easy adaptation to many research problematics both preclinical and fundamental.