Vici syndrome is a rare, autosomal recessive disorder with severe dysfunction of multiple organ systems. Mutations in the EPG5 gene encoding ectopic P-granule autophagy protein 5, which lead to defects in the autophagic flux, are found as the genetic cause of Vici syndrome. In around 80% of cases, development of dilated and hypertrophic forms of cardiomyopathies is observed. However, the mechanisms of cardiomyopathy development and possible therapeutic targets remain to be elucidated. Interestingly, previous work in Caenorhabditis elegans showed that targeting the enzyme N-acetylglucosamine transferase (OGT) in EPG5-deficient nematodes restored fully functional autophagy. However, the effect of targeting OGT in a human Vici disease model is unknown. In order to understand more about the mechanisms of Vici cardiomyopathies and the effect of targeting OGT in Vici syndrome, we established a Vici patient-specific in vitro disease model by generating induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iVici iPSC-CMs) from fibroblasts obtained from a Vici patient. The Vici patient carried a homologous EPG5 mutation (c.4952+1G>A), which results in the aberrant splicing of the EPG5 transcript and the removal of exon 28 and introduces a frameshift and a premature stop codon at exon 29. In the iVici iPSC-CMs model, we observed some of the known Vici-associated cardiomyopathy phenotypes including cellular hypertrophy and sarcomere disarray. The aims of this study were to investigate physiological and functional properties of iVici iPSC-CMs and to provide an understanding of the molecular mechanisms driving cardiomyopathy development in Vici patients by investigating the presence of potential molecular defects in iVici iPSC-CMs. In this study we also tested the effect of pharmacological OGT inhibitors in iVici iPSC-CMs. We showed that iVici iPSC-CMs exhibited defects in the autophagosome and lysosome fusion and displayed slower beating frequency and altered beating kinetics possibly resulting from the alterations in calcium handling in iVici iPSC-CMs. We observed the accumulation of fragmented mitochondria and increase in oxidative stress and protein O-GlcNAcylation in iVici iPSC-CMs, which are possible causes of the Vici Syndrome-associated cardiomyopathies. Moreover, we found that the non-specific OGT inhibitor alloxan and the specific OGT inhibitor ST045849 could enhance the fusion between the autophagosome and the lysosome in iVici iPSC-CMs. Taken together, in the current work, we demonstrated that iVici iPSC-CMs model can recapitulate some of the disease phenotypes of Vici syndrome, and at the same time, provided further insight into the underlying mechanisms of Vici cardiomyopathy and possible pharmacological therapeutics. Future studies should focus on further investigation of the feasibility of using OGT inhibition as a therapeutic approach and of the underlying mechanisms to identify new therapeutic targets using iVici iPSC-CMs.

Ziel: Die partielle Ventrikulektomie (PLV) stellt eine chirurgische Therapieoption der terminalen Herzinsuffizienz dar. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der PLV auf die kardiale Leistungsfähigkeit untersucht sowie eine Überlebensanalyse durchgeführt. Ferner sollte eine Aussage zum Verhalten der postoperativen linksventrikulären Funktion unter Belastung gemacht werden. Dabei wurden zwei Gruppen miteinander verglichen: 1. Patienten mit idiopathischer Kardiomyopathie (Gruppe ID) und 2. Patienten mit ischämischer Myopathie (Gruppe IS). Material und Methodik: Insgesamt wurden 75 Patienten, die sich im Zeitraum von 1995 bis 1999 in der Klinik für kardiovaskuläre Chirurgie der Charité einer PLV unterzogen hatten, berücksichtigt. Die postoperativen Untersuchungen erfolgten an 19 Patienten. Die linksventrikulären Funktionsparameter wurden mittels transthorakaler und transösophagealer Echokardiographie einschließlich Stressechokardiographie erhoben. Ergebnisse: In beiden Gruppen war postoperativ eine hochsignifikante Verbesserung der NYHA-Klassifikation zu registrieren. Die echokardiographischen Untersuchungen ergaben in beiden Gruppen eine Verbesserung der Ejektionsfraktion (EF) als Maß für die linksventrikuläre Funktion. Ferner war eine Verringerung des linksventrikulären enddiastolischen Durchmessers (LVEDD) und ein signifikanter Rückgang der Mitralinsuffizienz (MI) festzustellen. Die Stressechokardiographie zeigte für die Gruppe IS eine Steigerung der Kontraktilität unter Dobutamin mit tendenziell physiologischen Befunden. (signifikanter Anstieg von EF, cardiac index (CI), fractional area change (FAC) sowie Abnahme des linksventrikulären endsystolischen Volumenindex (LVESVI)). Für die Gruppe ID konnte dies nur bedingt gezeigt werden. Bei der Überlebensanalyse ergaben sich ebenfalls ein signifikant besseres Abschneiden der Gruppe IS, insgesamt lag die Überlebensrate hinsichtlich kardialer Todesursachen bei 69,9 % (1. Jahr) und 66,7 % (2. Jahr). Schlussfolgerungen: Beurteilend lässt sich feststellen, dass die überlebenden und zur Nachuntersuchung erschienenen Patienten mit einer Steigerung der körperlichen Belastbarkeit und Besserung der Ventrikelfunktionsparameter von der Operation profitieren konnten, wobei sich ein besseres Abschneiden der Gruppe IS zeigte. Dazu passend wies auch die stressechokardiographische Untersuchung vor allem für die Gruppe IS postoperativ auf myokardiale Reserven hin. Die hier aufgezeigten Unterschiede der Gruppen, die sich auch in den Überlebensraten widerspiegeln, machen die Bedeutung von guten Selektionskriterien deutlich, die in weiteren Studien noch differenzierter betrachtet werden müssen. Damit zusammenhängend kommt auch der Anpassung der mit der PLV kombinierten Eingriffe an die Ursachen der Myopathien besondere Wichtigkeit zu. / Aim: Partial left ventriculectomy (PLV) represents a surgical option for the treatment of end-stage-heart failure. The aim of this thesis was an investigation of the influence of PLV on LV-function and on clinical outcome and to analyse survival in a group of patients submitted to PLV: Also, post surgical left ventricular function under stress conditions was determined. Two groups served as a basis for comparison: 1. patients with idiopathic dilated cardiomyopathy (ID group) and 2. patients with ischemic myopathy (IS group). Methods: 75 patients undergoing PLV at the clinic for cardiovascular surgery at the Charité Berlin between 1995 and 1999 were considered. LV-function was determined by transthoracic and transesophageal echocardiography including stress echocardiography. Results: The NYHA-classification improved in both groups significantly after the surgery. The echocardiography showed a significant increase in ejection fraction (EF), a reduction of left ventricular enddiastolic diameter (LVEDD) and a significant decrease in mitral insufficiency (MI). The post surgical stress-echocardiography indicated a rise of left ventricular contractility under dobutamine with a tendency to physiological results (significant increase in EF, cardiac index (CI), fractional area change (FAC) and decrease in left ventricular enddiastolic volume index (LVEDVI)) in the IS group. Concerning the ID group, these results were only partially valid. Looking at the survival rates it turned out that they are significantly higher for the IS group than for the ID group. All in all, 1-year-survival was at 69,9 % and 2-year-survival was at 66,7 %. Conclusion: It can be concluded that survivors profited from the surgery which is shown by the improvement of physical capacity and left ventricular parameters. This applies especially to patients from the IS group, which conforms to the fact that also the post surgical stress echocardiography revealed myocardial reserves for this group. The differences between the groups which have been demonstrated in these investigations and which are also reflected in survival rates stress the importance of carefully chosen selection criteria and the need for further subtly differentiated research in this special field. Considering this, also the correlation between the intervention combined with PLV and the cause of the myopathy is of great importance.

Der Großteil MHC Klasse I restringierter Epitope wird bei der Proteindegradation durch das Ubiquitin Proteasom System (UPS) generiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des UPS in der Antigenpräsenation in einer Coxsackievirus B3 (CVB3) induzierten akuten und chronischen Myokarditis untersucht. Für in vitro Degradationsexperimente mit isolierten 20S Proteasomen wurden CVB3 Polypeptide synthetisiert und die Degradationsprodukte massenspektrometrisch analysiert. Eine erhöhte Substratumsatzrate und eine Verschiebung von Schnittpräferenzen durch Immunoproteasomen oder unter dem Einfluss von PA28 führten zu einer verbesserten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente. Inflammatorische Kardiomyopathien können in Mäusen durch eine CVB3 Infektion ausgelöst werden. Resistente Stämme (C57BL/6) eliminieren das Virus vollständig, in anfälligen Mäusen (A.BY/SnJ) erfolgt keine vollständige Elimination. In Herzen gesunder Mäuse werden vorwiegend konstitutive 20S Proteasomen exprimiert. Eine myokardiale Entzündung, ausgelöst durch eine CVB3 Infektion, führte in den Herzen beider Mausstämme zu der Bildung von Immunoproteasomen, was zu einer gesteigerten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente führte. Die größte Menge immunrelevanter Fragmente wurden durch Proteasomen gebildet, die am Tag vier aus den Herzen akut erkrankender C57BL/6 Mäuse und am Tag acht aus chronisch erkrankenden A.BY/SnJ Mäusen isoliert wurden. Dies korrelierte mit der Inkorporation von Immunountereinheiten in de novo assemblierende Proteasomen und einer unterschiedlichen Interferon (IFN) Typ I Kinetik. In Geweben lymphatischen Ursprungs hingegen waren Zusammensetzung und proteolytische Aktivität der Proteasomen im Verlauf der Infektion in beiden Mausstämmen unverändert. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung einer zeitlich optimalen IFN Sekretion an der Infektionsstelle, die zu der Anpassung des UPS an die inflammatorischen Bedingungen führt. / The recognition of viral antigens bound to major histocompatibility complex (MHC) class I molecules by CD8+ T cells is crucial for virus elimination. Most MHC class I restricted antigenic peptides are produced by the Ubiquitin Proteasome System (UPS). In the present study, the impact of the UPS in antigen presentation during Coxsackievirus B3 (CVB3) induced acute and chronic myocarditis has been investigated. To examine whether the proteasome is involved in the generation of MHC class I ligands derived from the CVB3 polyprotein, polypeptides were synthesized for in vitro processing by 20S proteasomes. Mass spectrometry analysis demonstrated an enhanced generation of immunorelevant CVB3 fragments due to an increased substrate degradation rate and altered cleavage site preferences by immunoproteasomes or in the presence of PA28. Murine models of CVB3 induced myocarditis mimic human disease pattern with diverse outcomes. Permissive mice (A.BY/SnJ) develop chronic myocarditis with cardiac CVB3 persistence whereas resistant mice (C57BL/6) recover and eliminate the virus after acute infection. Constitutive 20S proteasomes are mainly expressed in hearts of healthy mice. Myocardial inflammation, caused by a CVB3 infection, resulted in immunoproteasome formation in hearts of both, resistant C57BL/6 and susceptible A.BY/SnJ mice, and was correlated with enhanced generation of immunorelevant CVB3 peptides. In concurrence with distinctive type I interferon kinetics, immunoproteasome formation and improved epitope generation peaked on day 4 post infection in resistant mice, and was delayed in susceptible mice. No alterations were observed in assembly and proteolytic activity of 20S proteasomes in lymphatic tissues during CVB3 infection, independent from mouse strain. The results emphasise the impact of a rapid adjustment of the UPS to viral infection due to early secretion of type I interferon at site of infection.

Die hypertrophe Kardiomyopathie ist eine autosomal dominant vererbte Herzmuskelerkrankung. Es kommt zu einer asymmetrischen Hypertrophie insbesondere des Herzmuskels. Symptome sind unspezifisch und reichen von Dyspnoe bis hin zu Synkopen. Gelegentlich ist der plötzliche Herztod die erste Manifestation der Erkrankung. Molekulargenetische Untersuchung des Genomes dieser Patienten zeigten, dass diese Patienten Mutationen im Proteinen des Sarkomers aufwiesen. Hierunter fällt das beta-MHC-Gen und alpha-Tropomysin-Gen. Wir untersuchten 45 nicht miteinanderverwandte Patienten auf Mutationen im beta-MHC-Gen und im alpha-Tropomysin-Gen. Folgende molekulargenetische Untersuchungen wurden angewendet: Polymerase-Ketten-Reaktion, Single-Strand-Polymorphismus-Anlyse und Sequenzierung. Bei 6 Patienten (13%) fanden wir eine Mutation im beta-Myosin-Gen. Kein Patient hatte eine Mutation im alpha-Tropomyosin-Gen. In der Literatur wird eine Mutation im beta-MHC-Gen in bis zu 35% und im alpha-Tropomyosin-Gen in bis zu 3% der Fälle angenommen. Unsere Patienten hatten die Mutationen: Exon 13 Arg403Trp und Val411Ile, Exon 19 Arg719Trp, Exon 20 Ile736Thr, Exon 21 Leu796Phe und Exon 23 Cys905Phe. Die Mutationen Arg403Trp und Arg719Trp waren vorher bereits bekannt. Die Mutationen, Ile736Thr, Val411Ile, Leu796Phe und Cys905Phe wurden in der Form von uns erstmals ermittelt. Offensichtlich besitzen unsere Patienten überdurchschnittlich häufiger Mutationen in anderen Genen, die in dieser Studie nicht untersucht wurden. Der Phänotyp der Krankheit der HCM war bei unserem Patientenkollektiv sehr heterogen, und es ließen sich keine signifikanten Unterscheidungen eststellen. So haben wir uns darauf beschränkt, bei den 6 Patienten mit Mutationen nur nach den von Burn et al. (1997) aufgestellten Risikofaktoren zu suchen, die einen plötzlichen Herztod herbeiführen können, und haben sie danach in Patienten mit einem höheren oder niedrigeren Risiko eingestuft. Kriterien für ein erhöhtes Risiko, einen plötzlichen Herztod zu erleiden, wurden von Patienten mit den Mutationen: Exon 13 Arg403Trp, Exon 13 Val411Ile, Exon 19 Arg719Trp, Exon 20 Ile736Thr und Exon 21 Leu796Phe erfüllt. Mutationen an diesen Positionen sind auch in der Literatur mit einem erhöhten Risiko für einen plötzlichen Herztod assoziiert worden. Der Patient mit der Mutation im Exon 23 Cys905Phe wies wenige Risikofaktoren auf und unterscheidet sich somit nicht von den in der Literatur beschriebenen Patienten. Wir konnten dies mit unseren Ergebnissen bestätigen. / Hypertrophic Cardiomyopathy is disease of the cardiac muscle which results in an asymmetric hypertrophy especially of the interventricularseptum of the heart. It is transmitted in an autosomal dominant way. The symptoms are unspecific reaching from dyspnoe to syncopes. Sometimes the sudden death is the first manifestation of the disease. Molekular genetic researches showed that in the patients genes Mutations in proteins of the sarkomer were detectable. Two of them are alpha-Tropomyosin and beta-Myosin Heavy Chain. We examined 45 unrelated Patient of the existence of Mutations in alpha-Tropomyosin and beta-Myosin Heavy Chain. We used following Examinations: PCR, SSCP, Sequencing. A mutation in the beta-Myosin Heavy Chain were found in 6 Patients (13%), non in alpha-Tropomyosin. Generally mutations are expected in 35% in beta-Myosin Heavy Chain and 3% in alpha-Tropomyosin. Our patients seem to have mutations in genes we did not examine in this study. We detected Mutations in: Exon 13 Arg403Trp and Val411Ile, Exon 19 Arg719Trp, Exon 20 Ile736Thr, Exon 21 Leu796Phe und Exon 23 Cys905Phe. Mutation Arg 403Trp and Arg719Trp have been known in this form before, the others were new. As the phenotypes of our patients were heterogenous and not significantly to be distinguished we looked for risk factors for sudden death as described by Burn et al. 1997 within our group of patients with mutations. Five Persons showed risk factors as discribed: Exon 13 Arg403Trp and Val411Ile, Exon 19 Arg719Trp, Exon 20 Ile736Thr, Exon 21 Leu796Phe. The person with the mutation Exon 23 Cys905Phe showed no risk factors for sudden death. Our results correlate with those of earlier studies. The patient with the mutation Exon 23 Cys905Phe was classified as a low risk patient while the other mutations correlate with a further high risk.

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Hintergrund: Die gegenwärtigen Richtlinien zur Herzinsuffizienzbehandlung schenken der Beurteilung des rechten Ventrikels nur wenig Aufmerksamkeit, da nur begrenzte Daten zu Determinanten der rechtsventrikulären Funktion und den Mechanismen, die zu seiner Insuffizienz führen bzw. der Beziehung zu den Ergebnissen zur Verfügung stehen. Fragestellung: Es war die Aufgabe der Studie, die Prävalenz der rechtsventrikulären Dysfunktion (RVD) zu bestimmen, klinische und hämodynamische Korrelate zu identifizieren und die Beziehung zu kardialer Mortalität bei Herzinsuffizienz mit reduzierter linksventrikulärer Ejektionsfraktion (LVEF) hervorgerufen durch die nicht-ischämische Kardiomyopathie (NICM) einzuschätzen. Methoden: In dieser prospektiv angelegten Studie wurden 423 Patienten mit kardiovaskulärer Magnetresonanztomographie (CMR) untersucht. Zudem wurde bei 100 Patienten zeitnah zur CMR-Untersuchung eine Rechtsherzkatheteruntersuchung durchgeführt. Die kardiale Mortalität wurde als Studienendpunkt definiert. Ergebnisse: Während einer medianen Nachbeobachtungszeit von 6,2 Jahren (IQR: 2,9 bis 7,6) starben 101 (24 %) der Patienten aufgrund eines kardialen Versagens. Es stellte sich heraus, dass die rechtsventrikuläre Ejektionsfraktion (RVEF) ein starker Prädiktor für kardiale Mortalität nach Anpassung an Alter, NYHA-Klasse, systolischen Blutdruck, Herzfrequenz, Natrium und Kreatininserumspiegel, Myokardnarbe und linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) ist. Patienten, die im Quintil mit der niedrigsten RVEF waren, hatten ein fast fünffach so hohes kardiales Mortalitätsrisiko im Vergleich zum höchsten Quintil (Hazard Ratio [95%-Konfidenzintervall (CI)]: 4,68 [2,43-9,02]; p<0,0001). Die RVEF hatte eine positive Korrelation zur LVEF (r=0,60; p=<0,0001), und eine umgekehrte Korrelation zum rechten Vorhofdruck (r=−0,32; p=0,001), mittleren pulmonalarteriellen Druck (r=−0,34, p=0,0005), transpulmonalen Gradienten (r=−0,28; p=0,006), aber keine mit dem pulmonalarteriellen Verschlussdruck (r=−0,15; p=0,13). In der multivariablen logistischen Regressionsanalyse des CMR und der klinischen und hämodynamischen Daten waren die LVEF (Odds Ratio [95%-CI]: 0,85 [0,78-0,92], p<0,0001), der transpulmonale Gradient (Odds Ratio [95%-CI]: 1,20 [1,09-1,32], p=0,0003) und der systolische Blutdruck (Odds Ratio [95%-CI]: 0,97 [0,94-0,99], p=0,02) die stärksten Prädiktoren für die RVD. Schlussfolgerungen: Die Untersuchung der RVEF mit CMR liefert wichtige prognostische Informationen unabhängig von etablierten Risikofaktoren bei Herzinsuffizienzpatienten. RVD steht in einer starken Verbindung mit beiden Kenngrößen der intrinsischen myokardialen Kontraktilität und der erhöhten Nachlast durch eine pulmonalvaskuläre Dysfunktion.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Einführung in die Problemstellung der vorliegenden Arbeit 1.2 Nicht-ischämische Kardiomyopathie 1.3 Die Bedeutung des rechten Ventrikels für die Entwicklung der Herzinsuffizienz 1.4 Magnetresonanztomographie als Untersuchungsmethode 1.4.1 Einführung in die CMR 1.4.2 Allgemeine Grundlagen der MRT 1.4.3 True Fast Imaging with Steady-State Precession (TrueFISP) 1.4.4 Turbo Fast Low-Angle Shot (Turbo-FLASH) 1.5 Rechtsherzkatheter als Standarduntersuchung 1.6 Ziele der Studie 2 Patienten und Methoden 2.1 Patientenpopulation 2.2 Untersuchungsprotokoll MRT 2.2.1 Untersuchungstechnik 2.2.2 Bildanalyse 2.3 Rechtsherzkatheteruntersuchung 2.4 Verlaufsuntersuchung 2.5 Statistische Analyse 3. Ergebnisse 3.1 Basischarakteristika 3.2 Ergebnisse der Nachfolgeuntersuchung 3.3 Zusammenhang zwischen rechtsventrikulärer Dysfunktion und kardialer Mortalität 3.4 Prädiktoren der kardialen Mortalität 3.5 Bestimmungsfaktoren der rechtsventrikulären Dysfunktion 4 Diskussion 4.1 Ergebnisdiskussion 4.2 Grenzen der Studie 4.3 Schlussfolgerungen der Diskussion 4.4 Perspektiven 4.4.1 Kompetenz bei der Patientenbehandlung und Fähigkeiten der Prozedur 4.4.2 Ausblick für die zukünftige Behandlung 5 Zusammenfassung 6 Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Eidesstattliche Erklärungen Einhaltung der gesetzlichen Regeln Danksagung / Background: Current heart failure (HF) management guidelines place little emphasis on right ventricular (RV) assessment, due to limited available data on determinants of RV function and mechanisms leading to its failure, and relation to outcomes. Objective: To determine the prevalence of RV dysfunction (RVD), identify clinical and hemodynamic correlates, and assess the relation to cardiac mortality in HF with reduced left ventricular ejection fraction (LVEF) from non-ischemic cardiomyopathy (NICM). Methods: This study prospectively examined 423 patients with cardiovascular magnetic resonance (CMR). Right-heart catheterization was performed in 100 patients. The prespecified study endpoint was cardiac mortality. Results: During a median follow-up time of 6.2 years (IQR: 2.9 to 7.6) 101 (24%) patients died of cardiac causes. RVEF was a strong independent predictor of cardiac mortality after adjustment for age, HF functional class, systolic blood pressure, heart rate, serum sodium and creatinine levels, myocardial scar, and LVEF. Patients with the lowest quintile of RVEF had a near five-fold higher cardiac mortality risk compared to the highest quintile (hazard ratio [95% confidence interval (CI)]: 4.68 [2.43-9.02], p<0.0001). RVEF was positively correlated with LVEF (r=0.60, p=<0.0001), and inversely correlated with right atrial pressure (r=−0.32, p=0.001), mean pulmonary artery pressure (r=−0.34, p=0.0005), transpulmonary gradient, (r=−0.28, p=0.006) but not with pulmonary wedge pressure (r=−0.15, p=0.13). In multivariable logistic regression analysis of CMR, clinical, and hemodynamic data, LVEF, transpulmonary gradient, and systolic blood pressure were the strongest predictors of RVD (odds ratio [95% CI]: 0.85 [0.78-0.92], p<0.0001; 1.20 [1.09-1.32], p=0.0003; 0.97 [0.94-0.99], p=0.02, respectively). Conclusion: CMR assessment of RVEF provides important prognostic information independent of established risk factors in HF patients. RVD is strongly associated with both indices of intrinsic myocardial contractility and increased afterload from pulmonary vascular dysfunction.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Einführung in die Problemstellung der vorliegenden Arbeit 1.2 Nicht-ischämische Kardiomyopathie 1.3 Die Bedeutung des rechten Ventrikels für die Entwicklung der Herzinsuffizienz 1.4 Magnetresonanztomographie als Untersuchungsmethode 1.4.1 Einführung in die CMR 1.4.2 Allgemeine Grundlagen der MRT 1.4.3 True Fast Imaging with Steady-State Precession (TrueFISP) 1.4.4 Turbo Fast Low-Angle Shot (Turbo-FLASH) 1.5 Rechtsherzkatheter als Standarduntersuchung 1.6 Ziele der Studie 2 Patienten und Methoden 2.1 Patientenpopulation 2.2 Untersuchungsprotokoll MRT 2.2.1 Untersuchungstechnik 2.2.2 Bildanalyse 2.3 Rechtsherzkatheteruntersuchung 2.4 Verlaufsuntersuchung 2.5 Statistische Analyse 3. Ergebnisse 3.1 Basischarakteristika 3.2 Ergebnisse der Nachfolgeuntersuchung 3.3 Zusammenhang zwischen rechtsventrikulärer Dysfunktion und kardialer Mortalität 3.4 Prädiktoren der kardialen Mortalität 3.5 Bestimmungsfaktoren der rechtsventrikulären Dysfunktion 4 Diskussion 4.1 Ergebnisdiskussion 4.2 Grenzen der Studie 4.3 Schlussfolgerungen der Diskussion 4.4 Perspektiven 4.4.1 Kompetenz bei der Patientenbehandlung und Fähigkeiten der Prozedur 4.4.2 Ausblick für die zukünftige Behandlung 5 Zusammenfassung 6 Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Eidesstattliche Erklärungen Einhaltung der gesetzlichen Regeln Danksagung

Background and aims: Leptin resistance or leptin signalling deficiency are associated with increased risk of diabetic cardiomyopathy and heart failure, which is a leading cause of obesity- and diabetes type 2 (T2DM)-related morbidity and mortality. Various metabolic disturbances are involved in this pathogenesis, such as elevated glucose and fatty acid levels, insulin resistance and altered myocardial substrate utilization. Rodent models provided useful insights into the underlying molecular mechanisms of obese- and T2DM-associated cardiometabolic diseases, however, they cannot fully recapitulate the disease phenotype of obese or T2DM patients. The aims of this study were to study the effect of leptin receptor (LEPR) mutations on the leptin-mediated signalling pathways in human cardiomyocytes, and to investigate glucose and fatty acid metabolism in the heart under (patho)physiological conditions. Methods and results: To study the role of LEPR in human cardiomyocytes (CMs), human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) were used as a model. In the first part of this study, LEPR expression and function was investigated in wild type (WT)-iPSC-CMs by PCR and Western Blot. LEPR protein expression was almost not detectable in iPSCs and during early cardiac differentiation stages, however mRNA LEPR expression was comparable in the different steps of cardiac development. Importantly, LEPR protein expression was observed in WT-iPSC-CMs at the maturation stages, indicating that LEPR plays an important role in matured CMs. Thanks to CRISPR/Cas9 technology, LEPR mutations were introduced into iPSCs. Among the several clones obtained, 1B2 LEPRΔ/Δ-iPSC line was fully characterized and showed normal capacity to differentiate into spontaneously beating CMs. Although the B27 medium represents a well-established medium to cultivate iPSC-CMs, it has limitations for studying CM metabolism due to its high concentration of insulin and glucose, but low concentration of fatty acids. Physiological medium condition (F2) including physiological range of glucose, insulin and fatty acids was found to be fundamental to study LEPR signalling pathway in iPSC-CMs. Western blot analysis showed functional LEPR downstream pathway activation in WT-iPSC-CMs, while the absence of LEPR function was demonstrated in LEPRΔ/Δ-iPSC-CMs cultured in F2 medium. Moreover, improved medium condition, offered by the F2 medium, ameliorates insulin sensitivity as result of increased insulin-dependent AKT phosphorylation in WT-iPSC-CMs, while loss of LEPR function was associated with downregulation of insulin pathway activation. Additionally, leptin direct effect was observed on the regulation of glucose metabolism in WT-iPSC-CMs by reducing glycolytic fluxes, which was not observed in LEPRΔ/Δ-iPSC-CMs, as measured by 13C-isotope-assisted glucose metabolic flux. These data indicate that the signalling interaction between insulin and leptin is important in regulation of glucose metabolism and is abolished in LEPRΔ/Δ-iPSC-CMs. The matured WT-iPSC-CMs in F2 medium display adult CM-like metabolic phenotype such as enhanced mitochondrial respiration and glycolytic function, as measured by Seahorse analyser, compared to the same group cultured in the B27 medium. The mutation generated in LEPRΔ/Δ-iPSC-CMs caused an “energy starvation” status which led to increased AMPK phosphorylation compared to the WT group in B27 medium, which was associated with lower mitochondrial oxygen consumption rate (OCR) linked basal respiration and ATP production. In the next part of this study, the long-term leptin treatment of iPSC-CMs under physiological medium conditions in the presence of physiological range of insulin, glucose, and fatty acids (F2+) influenced LEPR downstream pathway activation such as JAK2 and AMPK suggesting a leptin-dependent role in fatty acid uptake and oxidation in WT-iPSC-CMs. On the contrary, leptin did not affect JAK2 and AMPK activation in LEPRΔ/Δ-iPSC-CMs. Culturing of (WT)-iPSC-CMs in F2+ medium demonstrated no significant difference in mitochondrial oxygen consumption, while slightly lower glycolysis and glycolytic capacity was observed. However, a leptin effect on fatty acid and glucose metabolism was observed in LEPR∆/∆-iPSC-CMs, which is independent from LEPR downstream regulation. To study the effect of high leptin levels, a medium mimicking some of the diabetic hallmarks, such as high glucose, high insulin, and high leptin levels, was used. Metabolic flexibility was observed in WT-iPSC-CMs in F3+ medium as showed by no difference in mitochondrial function in WT-iPSC-CMs in the presence or absence of high leptin. In contrast, LEPRΔ/Δ-iPSC-CMs in F3+ medium demostrated higher OCR compared to F2 medium, which is accompanied by lower glycolysis and glycolytic capacity, indicating the incapability of LEPRΔ/Δ-iPSC-CMs to use glucose as energy source, as measured by Seahorse analysis. Conclusion and outlook: Taken together, this study demonstrates the importance of leptin and LEPR at the late stage of CM maturation and the fundamental role of metabolic medium condition including physiological range of glucose and fatty acid to study the role of leptin in iPSC-CMs. In addition, LEPRΔ/Δ-iPSC-CMs in diabetic condition (F3+) represent a suitable model to investigate leptin-dependent cardiac metabolism, resulting in increased mitochondrial oxygen consumption and decreased glycolytic function, resembling the condition known in obesity-related T2DM patients. Further studies should focus on the regulation of the metabolic switch between glucose and fatty acid utilization in the absence of a functional LEPR. Understanding the contribution of leptin/LEPR signalling in human CM metabolism will shed light on novel therapeutic approaches to treat diabetic cardiomyopathy.

Die entzündliche Kardiomyopathie ist eine heterogene Erkrankung. Die häufigste Ursache ist eine Virusinfektion, wobei Parvovirus B19 (B19V) der bedeutendste Erreger ist. In dieser Arbeit wurden potenzielle Therapie für die speziellen klinischen Verläufe und deren Phänotypen untersucht. In vitro konnte gezeigt werden, dass Telbivudin in B19V-infizierten/B19V-non-structural protein-1-stimulierten humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC-1) endothelial-protektiv wirkt. In einem klinischen Versuch wurden dann 4 Patienten, bei denen eine aktive Transkription des B19V nachgewiesen wurde, für 6 Monate mit Telbivudin behandelt. Alle Patienten verbesserten sich. Ein anderes klinisches Szenario stellt die schwere Entzündung des Myokards dar, welche gewöhnlich mit einer inaktiven/persistierenden Infektion des B19V verbunden ist. Eine Behandlung mit Immunsuppressiva ist hier umstritten, da eine Reaktivierung des Virus befürchtet wird. Um diesen Aspekt weiter zu untersuchen, würde eine Therapie mit Prednisolon in Kombination mit Azathioprin bei 51 B19V-positiven und 17 B19V-negativen Patienten angewandt. Beide Gruppen profitierten in ähnlichem Maße von der Kombinationstherapie, wobei sich die Virusmenge nicht signifikant veränderte. Bei B19V-negativen Patienten konnte über die Persistenz von CD20+ B-Lymphozyten in den EMBs die Untergruppe der „Steroide non-responder“ klassifiziert werden. Im weiteren Verlauf wurden 6 Patienten mit Rituximab, einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch gegen CD20+ B-Lymphozyten gerichtet ist, behandelt. Hiervon zeigten 5 Patienten eine ausgezeichnete klinische Verbesserung. Ein Patient mit Myokarditis-induzierten kardiogenen Schock zeigt, dass die Entlastung des linken Ventrikels mittels eines Mikroaxialpumpensystems zu einer rapiden Abnahme der Entzündungszellen führt. Zusammenfassend liefert diese Arbeit Belege für die Wirksamkeit und die Notwendigkeit einer phänotypbasierten Behandlung bei der entzündlichen Kardiomyopathie. / Inflammatory cardiomyopathy is a heterogenous disease. Viral etiologies are the most common, with parvovirus B19 (B19V) being the most prominent culprit. Currently, no specific treatment for inflammatory cardiomyopathy exists. In this study, tailored treatment strategies were investigated as potential therapies for specific clinical scenarios. The antiviral drug telbivudine was investigated in the setting of EMB-proven B19V-associated inflammatory cardiomyopathy. In cell culture, telbivudine exhibited endothelial-protective effects on B19V-infected/B19V-non-structural protein-1-stimulated human microvascular endothelial cells (HMEC-1). Clinically, four B19V-positive patients improved following six-month telbivudine regimen in a single-patient use approach. The results were translated to the “PreTOPIC” clinical study, for further evaluation in a randomized placebo-controlled setting. In a different clinical scenario, severe myocardial inflammation is usually associated with inactive/persistent B19V. Here, the use of immunosuppression is controversial, fearing viral flare-up. We investigated combined prednisolone/azathioprine therapy in 51 B19V-positive and 17 B19V negative patients in a single-center observational study. Both groups gained similar benefit, while viral loads did not significantly vary. Among virus-negative phenotypes, EMB-proven CD20+ B lymphocyte persistence characterized a subgroup of steroid non-responders. In this cohort, six patients were treated with rituximab, a monoclonal antibody selectively targeting CD20+ B lymphocytes. Five patients showed outstanding clinical improvement parallel to CD20+ B lymphocyte depletion. Lastly, in a single case of myocarditis-induced cardiogenic shock, mechanical left ventricular unloading via axial flow pump proved to exert disease-modifying effects. In conclusion, this thesis provides evidence for the efficacy and need for phenotype-based inflammatory cardiomyopathy treatment.

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Die ersten identifizierten Krankheitsgene der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) kodierten alle für Proteine des Zytoskeletts. Deshalb wurde DCM als Erkrankung des Zytoskeletts bezeichnet. Bei der hypertrophen Kardiomyopathie (HCM) wurden bisher mehr als 250 Mutationen in neun Sarkomerprotein-Genen beschrieben. Deshalb wurde HCM als Erkrankung des Sarkomers bezeichnet. In den letzten Jahren wurde dieses Konzept durch Entdeckung von Mutationen in Sarkomerprotein-Genen bei DCM jedoch in Frage gestellt. Vor diesem Hintergrund haben wir die Sarkomerprotein-Gene beta-MHC und Troponin T bei 46 nicht verwandten DCM-Patienten untersucht. Das systematische Mutationsscreening wurde mit Hilfe von SSCP-Analyse und DNA-Sequenzierung durchgeführt. Im beta-MHC-Gen konnten wir die zwei Missense-Mutationen Ala223Thr und Ser642Leu bei zwei jungen Patienten identifizieren. Beide Mutationen wurden weder bei 136 HCM-Patienten noch bei 88 Kontrollen gefunden. Mit dem Editor for Structural Alignment of Proteins (STRAP) wurden die Mutationen auf die Proteinstruktur des Myosins projiziert. Hier ist erkennbar, dass Ala223Thr in der oberen 50 kDa Domäne und Ser642Leu in der Aktin-Myosin-Bindungsregion liegt. Der Austausch von Alanin zu Threonin könnte die Raumstruktur des Proteins verändern, Thermostabilität verringern und die Proteinfaltung und somit die Proteinmotilität beeinträchtigen. In der Aktin-Myosin-Bindungsregion liegt neben Ser642Leu die bereits bekannte DCM-assoziierte Mutation Ser532Pro. Durch eine Verminderung der Krafterzeugung könnten die beiden Mutationen zu DCM führen. Ferner wurden die zwei stummen Mutationen IVS11+23A>T und Asp376Asp und sechs Polymorphismen identifiziert. Im Troponin T-Gen wurden keine Mutationen, jedoch sechs Polymorphismen beobachtet. Es ergab sich kein Anhaltspunkt auf eine funktionelle Relevanz der stummen Mutationen oder Polymorphismen. Wir konnten also bestätigen, dass Mutationen in Sarkomerprotein-Genen sowohl zu HCM als auch zu DCM führen können. / All of the initially identified disease-causing genes in dilated cardiomyopathy (DCM) encoded proteins of the cytoskeleton. Therefore DCM has been termed a disease of the cytoskeleton. In hypertrophic cardiomyopathy (HCM) more than 250 mutations in nine sarcomeric protein genes have been identified so far. Therefore HCM has been termed a disease of the sarcomere. However, in the last few years this concept has been queried by findings of mutations in sarcomeric protein genes in DCM. According to this consideration we screened the sarcomeric protein genes beta-MHC and troponin T in 46 patients with DCM. Systematic mutation screening was done using SSCP analysis and DNA sequencing. In the beta-MHC gene we identified the two missense mutations Ala223Thr and Ser642Leu in two young patients. Both mutations were neither found in 136 HCM patients nor in 88 controls. Using the Editor for Structural Alignment of Proteins (STRAP) the mutations were projected onto the protein structure of myosin. Ala223Thr turned out to be localized in the upper 50 kDa domain and Ser642Leu in the actin-myosin-interface region. The exchange from alanine to threonine might alter the spatial structure of the protein, decrease its thermostability and affect the protein folding and thus the protein motility. Closely to Ser642Leu the DCM-associated mutation Ser532Pro is located in the actin-myosin-interface region. By a decrease in force production both mutations might cause DCM. Furthermore we identified the two silent mutations IVS11+23A>T and Asp376Asp and six polymorphisms. In the troponin T gene no mutations but six polymorphisms were detected. No evidence was found for functional relevance of the silent variants or polymorphisms. Thus, we could confirm that mutations in sarcomeric protein genes can lead to both HCM and DCM.