Abstract Cancer progression is a multistep process dependent on tumour-stroma interactions. Various cell types, such as fibroblasts, endothelial, inflammatory and stem cells, as well as extracellular matrix (ECM) proteins, such as collagens, contribute to the tumour outcome. Tumour growth and invasion is accompanied by the proteolysis of ECM components mediated by various enzymes, such as matrix metalloproteases (MMPs). Proteolytic fragments released into the circulation may reflect cancer progression. The aim of this study was to develop novel in vitro methods for investigating cell invasion and for measuring cancer-associated collagen degradation. Human carcinoma cell invasion studies in vitro are often performed in organotypic cell culture models, mainly composed of rat or mouse ECM proteins. To create a human microenvironment for invasion studies, a novel organotypic model based on human uterine myoma (benign tumour) tissue was developed. Compared to the conventional collagen-based organotypic model, in the myoma model the carcinoma cell invasion depth was about eightfold and the invasion resembled, to a greater degree, the invasion pattern of dissected tissue samples of cancer patients. In addition, the invasion was easily quantified with a novel radioimmunoassay measuring type III collagen degradation products from the organotypic culture media. As human mesenchymal stem cells (MSCs) are one of the stromal cell types that may affect tumour progression, the mechanisms of stem cell invasion were also studied. On the surface of MSCs, Toll-like receptor 9 (TLR9) functions in immune defence against microbes. The activation of TLR9 with microbial DNA-resembling molecules induced human MSC invasion into the myoma tissue in a MMP-13-mediated fashion. To analyse cancer-associated soft tissue degradation, a novel enzyme immunoassay was developed. This novel assay enabled, for the first time, the measurement of type III collagen degradation products from human serum samples. In head and neck cancer patient sera, high levels of type III and type I collagen degradation products were shown to predict poor survival. In conclusion, the novel myoma model showed that the tumour microenvironment crucially affects carcinoma cell invasion. In addition, cancer-associated type III collagen degradation was successfully measured in cell cultures and in human sera by novel immunoassays. / Tiivistelmä Syövän eteneminen on monivaiheinen tapahtuma, jossa syöpäsolut ovat vuorovaikutuksessa lähiympäristönsä kanssa. Ympäristön eri solutyypit, kuten kantasolut ja sidekudoksen fibroblastit sekä soluväliaineen proteiinit kuten kollageenit, vaikuttavat syöpäsolujen invaasioon eli tunkeutumiseen ympäröivään kudokseen. Syövän invaasiossa useat entsyymit, mm. matriksin metalloproteaasit (MMP:t), hajottavat soluväliainetta. Kasvaimen kehittymisen aikana verenkiertoon vapautuu soluväliaineen hajoamistuotteita, joiden määrä voi kuvastaa sairauden etenemistä. Väitöstutkimuksen tarkoituksena oli kehittää uusia menetelmiä solujen invaasion ja syöpään liittyvän kollageenin hajoamisen tutkimiseen. Ihmisen karsinoomasolujen invaasion tutkimuksessa on perinteisesti käytetty kolmiulotteisia soluviljelymalleja, jotka koostuvat pääasiassa rotan tai hiiren soluväliaineproteiineista. Työssä kehitettiin uusi viljelymalli, jossa soluja kasvatettiin ihmisen hyvälaatuisen kohtukasvainkudospalan eli myooman päällä. Perinteiseen kollageenimalliin verrattuna myoomamallissa karsinoomasolut tunkeutuivat noin kahdeksan kertaa syvemmälle, ja solujen kasvu muistutti enemmän potilaiden syöpäkudosnäytteissä havaittua kasvutapaa. Invaasion voimakkuuden määrittämiseen kehitettiin vasta-aineisiin perustuva menetelmä, jolla mitattiin soluviljelmän kasvatusliuokseen myoomakudoksesta vapautuneiden tyypin III kollageenin hajoamistuotteiden määrää. Koska kantasolujen tiedetään voivan vaikuttaa syöpäkasvaimen leviämiseen, tutkimme myös ihmisen luuytimen kantasolujen invaasiota. Kantasolujen pinnalla TLR9-reseptori osallistuu immuunipuolustukseen mikrobeja vastaan. Kun reseptoria aktivoitiin mikrobi-DNA:ta muistuttavilla molekyyleillä, kantasolut alkoivat invasoitua myoomakudokseen ja MMP-13:n aktiivisuus soluissa lisääntyi. Syöpään liittyvän pehmytkudoksen hajoamisen tutkimiseksi kehitettiin vasta-ainemenetelmä, jolla onnistuttiin ensi kertaa mittaamaan potilaiden seeruminäytteistä tyypin III kollageenin hajoamistuotteita. Pään ja kaulan alueen syöpäpotilailla korkean tyypin III kollageenin hajoamistuotepitoisuuden todettiin liittyvän huonoon ennusteeseen. Tutkimus osoitti, että kasvaimen ympäristö vaikuttaa olennaisesti syöpäsolujen leviämiseen. Syöpään liittyvää tyypin III kollageenin hajoamista pystyttiin työssä kehitetyillä menetelmillä mittaamaan sekä soluviljelmistä että potilaiden seeruminäytteistä.

Abstract The recommendation for infants to sleep supine has decreased the incidence of sudden infant death syndrome by more than a half, but as another consequence, a dramatic rise has been observed in the incidence of acquired cranial asymmetry (deformational plagiocephaly, DP). According to recent data, almost half of otherwise healthy infants are affected by some degree of DP at 7 to 12 weeks of age, and especially in the USA and some Central European countries, major effort is put into treatment of severe DP. However, little is known of the prognosis of DP in the absence of intervention, and although primary preventive strategies are often recommended, a lack of evidence on the effectiveness of such measures persists. Furthermore, although 3D imaging is nowadays frequently used on infants with DP, no data is available on the accuracy of the measurements used to quantify cranial asymmetry. In the present study, the efficacy of a primary preventive program in reducing the incidence of DP was tested in a randomized, controlled trial. The course of DP in the absence of active treatment was studied throughout the first year of life, and factors impacting the prognosis of DP were investigated. The diagnostic accuracy of four 3D stereophotogrammetry-based measurements was also analyzed and compared, with a goal of determining their optimal cut-off values for DP. DP was less prevalent and less severe in the intervention group infants at the end of the RCT (3 months). The point prevalence of DP peaked at 3 months, whereafter spontaneous improvement in DP was seen throughout the follow-up period until 12 months of age. A preferential infant head position at 3 months was the strongest predictor of a subsequently unfavorable course of DP. Cranial asymmetry seen at birth was transient, and none of the older infants with torticollis had presented neck imbalance at birth, but rather appeared to develop the condition postnatally concomitantly with DP. Although all studied asymmetry-related measurements performed well regarding diagnostic accuracy, OCLR produced the most accurate classification of DP. In conclusion, primary preventive guidelines would likely aid in reducing the burden from both DP itself and associated healthcare costs, although substantial spontaneous improvement from DP can usually be expected. The cut-off values defined for the asymmetry-related measurements have clinical implication in both making the diagnosis of DP and determining the target outcomes for treatment. / Tiivistelmä Imeväisten nukuttaminen selällään on vähentänyt kätkytkuolemien määrää alle puoleen aiemmasta, mutta käytäntö on myös huomattavasti lisännyt asentoperäisen, ei-synostoottisen vinokalloisuuden esiintyvyyttä; tuoreen tutkimustiedon mukaan jopa lähes joka toisella imeväisellä on nähtävissä jonkinasteista asentovinokalloisuutta 7–12 viikon iässä. Etenkin USA:ssa ja muutamissa Keski-Euroopan maissa vaikea-asteista asentovinokalloisuutta hoidetaan aktiivisesti kypäräortoosein, mutta samanaikaisesti tietämys tilan luonnollisesta kulusta on vähäistä. Vaikka riskitekijöitä tunnetaan ja ehkäiseviä toimenpiteitä usein suositellaan, ei niiden tehosta ole juuri näyttöä. Nykyään 3D-pintakuvantamista käytetään usein vinokalloisten imeväisten seurannassa, mutta epäsymmetrian mittaamiseen käytettyjen muuttujien osuvuudesta ei ole tietoa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää vastasyntyneiden vanhemmille annettavan vauvan käsittelyohjeistuksen vaikutusta asentovinokalloisuuden ilmaantuvuuteen satunnaistetussa, kontrolloidussa asetelmassa. Lisäksi pitkäaikaisseurannassa kartoitettiin asentovinokalloisuuden luonnollista kulkua ja ennusteeseen vaikuttavia tekijöitä suomalaisilla imeväisillä. Tutkimuksessa myös analysoitiin ja vertailtiin 3D-kuvista laskettavien epäsymmetriaa mittaavien muuttujien diagnostista osuvuutta. Käsittelyohjeita saaneiden lapsilla oli 3 kuukauden iässä merkittävästi vähemmän asentovinokalloisuutta ja kalloasymmetria oli lievempää kuin verrokkiryhmässä. Asentovinokalloisuuden esiintyvyys oli korkeimmillaan juuri 3 kuukauden iässä, jonka jälkeen merkittävää spontaania palautumista oli havaittavissa koko 12 kuukauden ikään jatkuneen seurannan ajan. Vastasyntyneillä nähty kalloasymmetria oli puolestaan ohimenevää, eikä myöskään vastasyntyneenä dokumentoitu kaulan liikerajoitus lisännyt myöhemmän vinokalloisuuden riskiä, vaan vinokalloisilla usein tavattava torticollis (kierokaula) näytti kehittyvän ensimmäisten elinviikkojen aikana yhdessä vinokalloisuuden kanssa. 3 kuukauden iässä havaittu imeväisen halu pitää päätään aina samaan suuntaan käännettynä oli yhteydessä kalloasymmetrian huonompaan spontaaniin palautumiseen. Tutkituista epäsymmetriaa mittaavista muuttujista OCLR erotteli vinokalloiset parhaiten. Yhteenvetona voidaan todeta, että ennaltaehkäisevä ohjeistus voisi vähentää vinokalloisuutta ja siitä aiheutuvia hoitokuluja kustannustehokkaasti, mutta vinokalloisuudelta on lupa odottaa myös merkittävää spontaania palautumista. Tutkimuksessa määritellyillä epäsymmetriaa mittaavien muuttujien raja-arvoilla on käyttöä sekä diagnostiikan että hoidon tavoitteiden määrittelemisen saroilla.

Abstract Desmoglein 3 (Dsg3) is an adhesion receptor in desmosomes, but relatively little is known about its role in cancer. In this study, the function of Dsg3 was investigated in oral squamous cell carcinoma (SCC) cell lines in vitro using locally established human leiomyoma tumor microenvironment (TME) matrices. Since Dsg3 has been identified as a key regulator in cell adhesion, we hypothesized that it may play a role in oral SCC cells adhesion and motility. Thus, one aim of the study was to explore this hypothesis by both gain and loss of function methods in four human buccal mucosa SCC SqCC/Y1 cell lines: transduction of vector control (Ct), full-length (FL) or two different C-terminally truncated Dsg3 mutants (Δ238 and Δ560). Live cell imaging was performed for 2D migration and 3D sandwich, alongside other assays. In 3D sandwich, we tested the effects of the monoclonal antibody, AK23, targeting the extracellular domain of Dsg3 in SqCC/Y1 cells. Our results showed that loss of Dsg3 disrupted cell adhesion and protein expression. In 2D assays, FL and Dsg3 mutants migrated faster with higher accumulated distances than Ct. In contrast with 2D, mutants showed accelerated invasion over the Ct in 3D models. The AK23 antibody inhibited only the invasion of FL cells. The TME in vivo consists of cellular and matrix elements playing a leading role in carcinoma progression. To study carcinoma cells invasion in vitro, mouse Matrigel® and rat type 1 collagen are the most commonly used matrices in 3D models. Since they are non-human in origin, they do not perfectly mimic human TME. To address this, we have developed a solid organotypic myoma disc model derived from human uterus leiomyoma tumor. Here, we introduce a novel Myogel, prepared from leiomyoma similar to Matrigel®. We validated Myogel for cell-TME interactions in 3D models, using SqCC/Y1 and HSC-3 cell lines. Compared with Matrigel® and type I collagen, oral SCC cell lines invaded more efficiently in Myogel containing matrices. This study describes promising 3D models using human TME mimicking Myogel which is suitable to analyze oral SCC cells both in carcinoma monocultures and in co-cultures, such as with TME fibroblasts. We also introduce a possible novel therapeutic target against Dsg3 to suppress cancer cell invasion. / Tiivistelmä Desmogleiini 3 (Dsg3) on desmosomien adheesioreseptori, jonka merkityksestä syövässä tiedetään vähän. Koska Dsg3 on tärkeä epiteelisolujen välisissä liitoksissa, oletimme sillä olevan vaikutusta myös suun karsinoomasolujen tarttumisessa ja niiden liikkuvuudessa. Testasimme hypoteesiamme muuttamalla Dsg3:n toimintaa ihmisen posken karsinoomasolulinjassa SqCC/Y1, josta oli aiemmin valmistettu neljä erilaista muunnosta: tyhjän vektorin sisältävä kontrollisolulinja (Ct), kokopitkää Dsg3 tuottava solulinja (FL), sekä kaksi Dsg3 C-päästä lyhennettyä mutanttisolulinjaa (Δ238 ja Δ560). Immunofluoresenssi-menetelmää käyttäen analysoimme solulinjoissamme solujen välisiä liitoksia. Lisäksi mittasimme solujen liikkeitä 2D-migraatio- ja 3D-sandwich-kokeissa. Testasimme myös Dsg3:n solunulkoista osaa tunnistavan monoklonaalisen vasta-aineen (AK23) vaikutusta solujen invaasioon. Osoitimme, että Dsg3:n rakenteen muuttaminen ja toiminnan estyminen häiritsi solujen tarttumista. 2D-kokeissa sekä FL että mutanttilinjat (Δ238 ja Δ560) migroivat kontrollisoluja nopeammin ja pidemmälle, mutta 3D-kokeissa vain mutanttilinjat invasoituivat kontrollisoluja tehokkaammin. AK23-vasta-aine esti vain FL-solujen invaasiota. Syöpäsolujen 3D-invaasiota mittaavissa kokeissa käytetään yleensä hiiren kasvaimesta valmistettua kaupallista Matrigeeliä® tai rotan kudoksista eristettyä tyypin I kollageenia. Tutkimusryhmämme on jo aiemmin kehittänyt organotyyppisen myoomamallin, jossa valmistamme myoomakudosnapit ihmisen kohdun leiomyoomakasvaimista. Tässä työssä valmistimme leiomyoomasta Myogeelia, vertasimme sitä Matrigeeliin®, sekä tutkimme tarkemmin Myogeeli-valmisteen soveltuvuutta 3D-tutkimuksiin. Totesimme, että kielen (HSC-3) ja posken (SqCC/Y1) karsinoomasolut invasoituivat tehokkaimmin Myogeeli-pitoisissa matrikseissa kuin Matrigeeliä® tai kollageeniä sisältävissä kasvatusalustoissa. Tutkimustulostemme perusteella Myogeeli-pohjaiset 3D-mallit soveltuvat hyvin sekä syöpäsolulinjojen invaasiotutkimuksiin että yhteisviljelmiin, joissa syöpäsoluja viljellään yhdessä syöpäkasvaimen ympärillä olevien solujen, kuten fibroblastien, kanssa.