A biomenbrana de látex natural (BLN) da serigueira HEVEA brasiliensis, utilizada como curativo no tratamento de úlceras crônicas em humanos, mostra-se eficaz no desbridamento e no estímulo à granulação, acelerando a cicatrização. Seu mecanismo de ação ainda é desconhecido, tornando-se importante avaliar sua atividade como implante na indução tecidual, comparando-a aos outros implantes e à cicatrização normal (SHAM). Foram utilizados camundongos C57BL/6, constituído de 5 grupos distintos pelo implante subcutâneo dorsal (1cm2): 15 implantados com BLN; 15-LUVA cirúrgica (látex desnaturado); 15-ePTFE (PoliTetraFluorEtileno Expandido - implante sintético) e 15-SHAM. A atividade dos implantes foi avaliada no 2º, 7º e 14º dias, sacrificando 5 animais/grupo/tempo para biópsias (punch-4mm). Toda pele da área implantada foi recortada e fotografada. As amostras foram submetidas a estudos histológicos por HE para contagem das células inflamatórias, fibroplasia e angiogênese, utilizando o plugin \"Cell Counter\" no software ImageJ®; pelo Tricrômio de Gomori para quantificação colagênica pelo \"Threshold\" no ImageJ®, e imunohistoquímica para iNOS, IL-1?, VEGF e TGF-?1. A partir do sobrenadante do macerado das biópsias foram realizadas as dosagens de mieloperoxidase (MPO), IL-1? e de TGF-?1 por ELISA. Macroscopicamente, viu-se maior quantidade de tecido neoformado nos animais implantados com BLN já no 2º dia, diferente dos demais grupos. À histologia (HE), constatou-se que a BLN no 2º dia estimulou denso infiltrado inflamatório, principalmente neutrófilos, seguido de maior produção de MPO e de IL-1?, diferente dos demais tratamentos (P<0,01). Com 7 e 14 dias, a quantidade de IL-1? nos grupos LUVA e SHAM foi maior que a da BLN e do ePTFE, mostrando o equilíbrio no estímulo inicial da atividade inflamatória pela BLN. Quanto a angiogênese, os grupos BLN e LUVA com 7 e 14 dias apresentaram maior formação de vasos que o ePTFE e SHAM. Entretanto, na imunohistoquímica observou-se baixa expressão de VEGF no grupo BLN no 7º e 14º dia. Quanto a fibroplasia, o ePTFE com 7 dias apresentou maior fibroplasia que todos os grupos (P<0,01). No 14º dia, a BLN apresentou maior fibroplasia, embora sem diferença estatística entre os grupos. Quanto à colagênese, pelo ImageJ® (\"Threshold\") por Tricrômio de Gomori, os implantes se comportaram de maneira semelhante, inclusive com o SHAM, exceto no 14º dia que o ePTFE apresentou colagênese maior que a LUVA e BLN (P<0,01). O grupo SHAM apresentou maior concentração de TGF-beta1 que os demais grupos no sétimo dia (P<0,01), semelhante à BLN e à LUVA no 14º, entretanto maior que o ePTFE (P<0,01). Conclui-se que a biomembrana de látex da seringueira Hevea brasiliensis atua significativamente na fase inflamatória da cicatrização, importante no recrutamento neutrofílico para o local, confirmado quantitativamente pela concentração de MPO e IL-beta1 e por imunohistoquímica. Este fato parece influenciar diretamente as fases subseqüentes do processo cicatricial, confirmada pela sua capacidade estimuladora de angiogênese, provavelmente não influenciada por VEGF, e pelo estímulo à fibroplasia independente de TGF-beat1 e sem modificação na produção colagênica. / The natural latex biomembrane (NLB) from Hevea brasiliensis rubber tree, used as dressing in the treatment of human chronic ulcers, has been showed efficient in the debridement and the granulation stimulation, accelerating the healing. Its mechanism of action is still unknown, becoming important to evaluate its activity as implantation in the tissue induction, comparing it with the other implants and with the normal healing (SHAM). Mice C57BL/6, consisting of 5 distinct groups had been used of the dorsal subcutaneous implantation (1cm2): 15 implanted with NLB; 15 with surgical GLOVE (unnatural latex); 15 with ePTFE (expanded polytetrafluorethylene - synthetic implantation) and 15 without implant (SHAM). The activity of the implants was evaluated in 2nd, 7th and 14th days. Five animals for group each time were sacrificed for biopsies with 4mm punch. All skin of the implanted area was cut and photographed. The samples had been submitted to the histology studies for haematoxylin-eosin for counting the inflammatory cells, fibroplasia and angiogenesis, using \"Cell Counter\" plugin in the ImageJ® software; by Gomori\'s thrichrome for collagen quantification using \"Threshold\" in the ImageJ®, and iNOS, IL-beta1, VEGF and TGF-beta1 immunohistochemistry. From the biopsies macerated supernatant, the myeloperoxidase assay had been carried through (MPO), IL-beta1 and of TGF-beta1 by ELISA. Macroscopically, it was observed a big amount of new tissue formed in the NLB implanted animals on 2nd day, different of the other groups. In histological analyze by H&E, it was observed that the NLB in 2nd day stimulated dense inflammatory infiltrated, mainly by neutrophils, followed of bigger production of MPO and IL-beta1, different of the other treatments (P<0,01). After 7 and 14 days, the amount of IL-beta1 in the groups GLOVE and SHAM were greater than the NLB and ePTFE, showing the balance in the initial stimulation of the inflammatory activity by the NLB. About angiogenesis, both groups (NLB and GLOVE) after 7 and 14 days had presented greater formation of vessels than ePTFE and SHAM (P<0,01).However, in the immunohistochemistry was observed a low VEGF expression in the NLB group in 7th and 14th days. Related to fibroplasia, ePTFE after 7 days presented greater fibroplasia than all the groups (P<0,01). In 14th day, the NLB presented an important fibroplasia, even so without statistic difference between the groups. The collagen proliferation evaluated by the ImageJ® (\"Threshold\") applied in Gormori\'s thrichrome stained biopsies, the implants showed similar results, also with the SHAM, except in 14th day that ePTFE presented bigger collagen proliferation than the GLOVE (P<0,01).The SHAM group presented greater concentration of TGF-beta1 than the other groups in the seventh day (P<0,01), equal to the NLB and the GLOVE in 14th, however bigger than ePTFE (P<0,01).In conclusion, natural latex biomembrane (NLB) from Hevea brasiliensis rubber tree acts significantly in the inflammatory phase of the healing process, important in the neutrophilic recruitment to injury local, confirmed quantitatively by MPO and IL-beta1 concentrations and by immuno histochemistry. This fact seems to influence directly the subsequent phases of the healing process, confirmed for its stimulatory capacity of the angiogenesis, probably not influenced by VEGF, and the fibroplasia stimulation independent of TGF-beta1 and without modification in the collagen production.

Problemas de consolidação óssea são um grande desafio clínico, pois geram altos custos de tratamento, morbidades e prejuízos a qualidade de vida. A técnica de regeneração óssea guiada é empregada com o intuito de promover a melhora no processo de regeneração de defeitos ósseos através da utilização de barreiras biológicas, que protegem o local da lesão e favorecem a ação de células osteogênicas. A membrana de látex natural, extraído da seringueira Hevea brasiliensis tem sido apontado como um biomaterial promotor da regeneração em diferentes tecidos, e por este motivo escolhido como objeto de estudo desta pesquisa. O objetivo foi avaliar o efeito da utilização de membrana de látex natural no processo de regeneração guiada de defeito ósseo em ossos longos de ratos, através de análises estruturais, radiológicas, microscópicas e da expressão de proteínas osteogênicas. Foram utilizados sessenta ratos Wistar divididos igualmente em quatro grupos (n=15), sendo: animais tratados com membrana de látex por uma (L1) ou quatro semanas (L4) e animais que não receberam tratamento específico por uma (C1) ou quatro semanas (C4). Um defeito ósseo de 2,5 mm de diâmetro foi realizado na região medial da tíbia esquerda de cada animal. Nos animais do grupo tratado, uma membrana de látex foi posicionada sobre os defeitos ósseos. Após os períodos experimentais de uma ou quatro semanas os animais foram submetidos a eutanásia e a tíbia esquerda de cada animal foi dissecada, limpa das partes moles e submetida às análises macroscópica, densitométrica, radiológica, mecânica, histomorfométrica, estereológica e imunohistoquímica. A influência das varáveis tempo e membrana, bem como a interação tempo*membrana sobre os dados foram avaliadas. Para os dados referentes à imunomarcação de osteocalcina foi aplicado teste de modelo linear generalizado com fatores independentes. Para o restante dos resultados foi realizada análise de ANOVA multivariada com dois fatores independentes. Todas as comparações foram realizadas com ajuste de Bonferroni e adotado nível de significância de 5%. Foram observadas diferenças estatisticamente significantes em relação a variável tempo, em que grupos avaliados quatro semanas após a cirurgia apresentaram resultados superiores para as medidas de comprimento (p<0,001), massa (p<0,001), força máxima (p<0,001) e rigidez relativa da tíbia (p<0,001), bem como para as medidas de densidade radiológica (p=0,008), densidade mineral óssea (p=0,017), volume ósseo neoformado (p<0,001) e fibras de colágeno tipo III (p<0,001). Em relação à utilização da membrana de látex, os grupos tratados apresentaram resultados estatisticamente superiores para as análises de rigidez relativa (p=0,048), fibras de colágeno tipo I (p=0,018), volume ósseo neoformado (p<0,001) e expressão de osteopontina (p=0,037). Concluímos que a utilização de membrana de látex em regeneração óssea guiada em defeitos realizados em tíbias de ratos melhorou sensivelmente a regeneração do tecido. / Problems of bone consolidation are a significant clinical challenge, as they generate high treatment costs, morbidities, and damages to the quality of life. The guided bone regeneration technique is used to improve the regeneration process of bone defects through the use of biological barriers that protect the site and favor the action of osteogenic cells. The natural latex membrane extracted from the rubber tree Hevea brasiliensis has been identified as a biomaterial promoting regeneration in different tissues, and for this reason chosen as the object of study of this research. The objective was to evaluate the effect of the use of natural latex membrane in the process of guided regeneration of bone defect in long bones of rats, through structural, radiological, microscopic analysis and the expression of osteogenic proteins. Sixty Wistar rats were equally divided into four groups (n = 15): latex membrane treated animals for one (L1) or four weeks (L4) and animals that received no specific treatment for one (C1) or four weeks (C4). A bone defect of 2.5 mm diameter was performed in the medial region of the left tibia of each animal. In the animals of the treated group, a latex membrane was positioned over the bone defects. After the experimental periods of one or four weeks, the animals were submitted to euthanasia, and the left tibia of each animal was dissected, cleaned of soft parts and submitted to macroscopic, densitometric, radiological, mechanical, histomorphometric, stereological and immunohistochemical analysis. The influence of the variable time and membrane as well as the time * membrane interaction on the data were evaluated. For the data referring to the osteocalcin immunostaining, a generalized linear model with independent factors was applied. For the rest of the results, a multivariate ANOVA analysis was performed with two independent factors. All comparisons were performed with Bonferroni adjustment and adopted a significance level of 5%. Statistically significant differences were observed in relation to the time variable, in which groups evaluated four weeks after surgery presented superior results for the measures of length (p <0.001), mass (p <0.001), maximal strength (p <0.001) and stiffness (P <0.001), as well as for measurements of radiological density (p = 0.008), bone mineral density (p = 0.017), neoformed bone volume (p <0.001) and type III collagen fibers (p <0.001) ). About the use of the latex membrane, the treated groups presented statistically superior results for analyzes of relative stiffness (p = 0.048), type I collagen fibers (p = 0.018), neoformed bone volume (p <0.001) and expression of Osteopontin (p = 0.037). We conclude that the use of latex membrane in guided bone regeneration in defects performed in rat tibiae significantly improved tissue regeneration.

Orientadora: Mariselma Ferreira. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Nanociências e Materiais Avançados.

Orientadora: Mariselma Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Nanociências e Materiais Avançados, 2009

Submitted by LEANDRA ERNST KERCHE SILVA null (leakerche@gmail.com) on 2017-03-02T20:29:44Z No. of bitstreams: 1 Tese Leandra Versão Final.pdf: 8949571 bytes, checksum: 3379799c19a1298e8da231c910b37d91 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-08T14:55:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_lek_dr_prud.pdf: 8949571 bytes, checksum: 3379799c19a1298e8da231c910b37d91 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T14:55:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_lek_dr_prud.pdf: 8949571 bytes, checksum: 3379799c19a1298e8da231c910b37d91 (MD5) Previous issue date: 2017-02-03 / Biomateriais podem ser definidos como dispositivos que entram em contato com sistemas biológicos tanto na forma de sólidos quanto de líquidos e géis. Para um novo biomaterial, são necessários testes toxicológicos e de interação in vitro e in vivo. O látex é uma substância branca e leitosa que exsuda da casca da Hevea brasiliensis quando a mesma é perfurada e que tem sido apontado como um biomaterial promissor. O látex quando centrifugado em alta velocidade é separado em três frações: a fração com partículas de borracha, uma fração aquosa chamada fração C e uma fração de fundo chamada fração B. A fração C é a fração metabolicamente ativa do látex. Assim, o presente estudo investigou os potenciais efeitos antioxidantes, citotóxicos, genotóxicos e antitumorais da fração C do látex da Hevea brasiliensis. Para isso, foram utilizados os testes de sequestro de radicais livres e capacidade antioxidante total em meio in vitro sem células; o teste do MTT, o ensaio do cometa, avaliação de morte celular com coloração com Hoechst 33342 e Iodeto de Propídio (PI) e avaliação de parâmetros bioquímicos de estresse oxidativo em meio in vitro com duas linhagens celulares, a CHO-k1, linhagem de células normais de epitélio de ovário de hamster, e a B16F10, linhagem de células de melanoma murino; e a ação da fração C na indução de carcinoma de células escamosas (SCC) em camundongos SKH-1 por exposição crônica à radiação UVB. Nossos resultados mostraram que a fração C é antioxidante, com capacidade para sequestrar os radicais HO• e NO• e o H2O2. A fração C não alterou a viabilidade celular das células CHO-k1, não induziu danos no DNA dessas células, não induziu apoptose e necrose e nem alterou a quantidade de tiol total e de malonaldeído (MDA) nessas células. No entanto, para a linhagem celular B16F10, a fração C mostrou atividade antitumoral, reduzindo a viabilidade celular, induzindo danos no material genético, induzindo morte celular e alterando os níveis de tiol e MDA nessas células. Nos animais que foram expostos cronicamente à radiação UVB, a fração C protegeu os eritrócitos e a pele dos animais do estresse oxidativo promovido pela irradiação e protegeu as células da pele de transformação maligna para SCC. Em resumo, nossos resultados mostraram que a fração C do látex da H. brasiliensis apresenta propriedades terapêuticas antioxidantes e antitumorais. / Biomaterials can be defined as devices that come in contact with biological systems in the form of solids, liquids and gels. In vitro and in vivo toxicological tests are needed for a new biomaterial to come out. Latex is a white and milky solution that exsudes from Hevea brasiliensis bark when perforated, and it has been appointed as a new promising biomaterial. When centrifuged in high speed, latex can be separated in three parts: rubber particle fraction, aqueous C-serum fraction and a bottom fraction called B-serum. Cserum is the part that is metabolically active. In this way, the aim of this work was to investigate potential antioxidant, cytotoxic, genotoxic and antitumor effects of latex Cserum from Hevea brasiliensis. For this purpose, we used in vitro free-radical scavenger and total antioxidant capacity tests; MTT test, comet assay, staining with Hoechst 33342 and Propidium Iodide (PI) to evaluate cell death, and evaluation of biochemical parameters of oxidative stress in Chinese hamster ovary epithelium normal cell line, CHO-k1, and murine melanoma cell line, B16F10; and C-serum effects in the induction of squamous cell carcinoma (SCC) in SKH-1 mice by chronic UVB exposure. Our results show that latex C-serum is an antioxidant compound that was able to scavenge HO• and NO• radicals and H2O2. C-serum did not alter the cell viability in CHO-k1 cells and it did not promote DNA damage in these cells, it did not alter the levels of apoptotic and necrotic cells for this cell lineage and did not alter total thiol and MDA levels in these cells. However, for B16F10 cells, latex C-serum presented antitumor effect, reducing cell viability, inducing DNA damage and cell death, and altering total thiol and MDA levels in these cells. In the animals chronically exposed to UVB radiation, latex C-serum protected the erythrocytes and skin cells from oxidative stress promoted by the irradiation, and prevented skin cells from malignant transformation to SCC. In summary, this work shows that latex C-serum from Hevea brasiliensis present antioxidant and antitumor therapeutic properties.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2018-04-18T19:00:37Z No. of bitstreams: 1 RODRIGO ANSALONI DE OLIVEIRA.pdf: 564136 bytes, checksum: 846f6a16985a9180c2d4d7056354c90d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-18T19:00:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RODRIGO ANSALONI DE OLIVEIRA.pdf: 564136 bytes, checksum: 846f6a16985a9180c2d4d7056354c90d (MD5) Previous issue date: 2017-03-08 / The use of medicinal plants, including extracts, of popular use as a therapeutic resource is a widespread trend in the Brazilian population. Euphorbia tirucalli is widely used by Brazilian popular medicine in the treatment of lesions, infectious diseases, tumors and inflammatory diseases. Through this work. Objective: To evaluate the genotoxic and antigenotoxic activity of Euphorbia tirucalli (aveloz). Methodology: Latex was obtained from a plant specimen, in the city of Goiânia, and diluted to the concentration of 1mg / ml. To evaluate the genotoxic and antigenotoxic activity of the aqueous solution of Euphorbia tirucalli latex were performed by the micronucleus test in the hematopoietic bone marrow of mice. The cytogenetic analysis of the slides was performed in order to detect possible chromosomal changes and / or losses (micronuclei) in the polychromatic erythrocytes of the bone marrow of the animals submitted to the different treatments. Results: In the treatments concomitant with the aqueous solutions of latex of Euphorbia tirucalli and Mitomycin C, there was a decrease in micronuclei numbers in 2000 EPC. The results allowed to conclude that the aqueous solutions of Euphorbia Tirucalli latex presented genotoxic, antigenotoxic, cytotoxic and anticitotoxic activity and the concomitant use of the aqueous solutions of the latex of Euphorbia tirucalli and Mitomycin C was not indicated, as the genotoxic and cytotoxic effects of MMC were decreased And thus not achieving the expected effect of this highly genotoxic agent. / A utilização de plantas medicinais, incluindo os extratos, de uso popular como recurso terapêutico é uma tendência generalizada na população brasileira. A Euphorbia tirucalli é amplamente utilizada pela medicina popular brasileira no tratamento de lesões, doenças infecciosas, tumores e doenças inflamatórias. Por meio deste trabalho. Objetivo: Avaliar a atividade genotóxica e antigenotóxica de Euphorbia tirucalli (aveloz). Metodologia: O látex foi obtido de um exemplar da planta, na cidade de Goiânia, e diluído para a concentração de 1mg/ml. Para a avaliação da atividade genotóxica e antigenotóxica da solução aquosa do látex da Euphorbia tirucalli foram realizadas pelo teste de micronúcleo na medula óssea hematopoiética de camundongos. A análise citogenética das lâminas foi realizada com a finalidade de se detectar possíveis alterações e/ou perdas cromossômicas (micronúcleos) nos eritrócitos policromáticos (EPC) da medula óssea dos animais submetidos aos diferentes tratamentos. Resultados: Nos tratamentos concomitantes com as soluções aquosas do látex da Euphorbia tirucalli e Mitomicina C, houve diminuição dos números de micronúcleos em 2.000 EPC. Os resultados permitiram concluir que as soluções aquosas do látex da Euphorbia Tirucalli apresentaram atividade genotóxica, antigenotóxica, citotóxica e anticitotóxica e não indicado o uso concomitante das soluções aquosas do látex da Euphorbia tirucalli e Mitomicina C, pois os efeitos genotóxicos e citotóxicos da MMC foram diminuídos e assim não obtendo o efeito esperado deste agente altamente genotóxico.

OLIVEIRA, Raquel Sombra Basílio de. Caracterização bioquímica e mecanismo de ação do efeito protetor in vivo de proteínas do látex de Calotropis procera (Ait.) R. Br. sobre infecção letal induzida por Salmonella enterica subespécie enterica sorotipo Typhimurium. 2010. 109 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2010. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-04T13:28:34Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_rsboliveira.pdf: 10124085 bytes, checksum: 7913896b3ed24d365503af04dded020c (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T19:47:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_rsboliveira.pdf: 10124085 bytes, checksum: 7913896b3ed24d365503af04dded020c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T19:47:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_rsboliveira.pdf: 10124085 bytes, checksum: 7913896b3ed24d365503af04dded020c (MD5) Previous issue date: 2010 / Latex of the medicinal plant Calotropis procera (Apocynaceae) possesses molecules displaying different pharmacological activities, including pro- and anti-inflammatory. In this study immune inflammatory modulation of the soluble protein fraction (LP) recovered from the latex was investigated in experimental models of sepsis induced by CLP and inoculation of the S. Typhimurium. Biochemical aspects of laticifers proteins were investigated and biochemical, pharmacological and histopathological parameters were evaluated in experimental animals. LP protected animals and a unique dose (30 mg/Kg; i.p.) lead to 100% survival while non-treated infected animals (Salmonella group) reached 100% mortality within 24 h. Protection was only observed when LP was given 24 earlier of infection. LP did not exhibit in vitro bactericide activity suggesting indirect mechanism of action, probably by immune modulation. After 4 and 24 h of infection bacteria was similarly disseminated in liver, spleen and peritoneal fluid, local of bacteria inoculum. However, in blood viable bacteria was reduced only in animals given laticifers proteins. The protective effect of LP was also observed in its three sub-fraction, denominated of PI, PII and PIII, obtained after protein fractionation by ion exchange chromatography on a CM-Sepharose performed at pH 5.0. Neither, heat-treatment (100 C, 30 min) nor inhibition of its endogenous proteolytic enzymes, by iodoacetamide, eliminated the protective effect of LP. Nitric oxide (NO) an important signaling molecule was augmented in serum of non-treated animals whereas it was unaltered in control and LP/PI-treated animals 24 h after infection. Increasing of NO in serum is known to directly contribute to inhibit neutrophil migration in septic animals. Accordingly, failure of neutrophil migration to the infectious focus in septic animals was confirmed. Conversely, in animals given LP and PI, influx of neutrophils was evident. In addition, NO was also elevated in the infectious focus of LP/PI treated animals, probably due neutrophil activity as part of their microbicidal activity. Activity of adenosine deaminase (ADA) was measured locally after 4 and 24 h of infection was initiated. ADA was augmented in LP/PI treated animals and unaltered in non treated animals. Thrombocytopenia was observed in non treated animals but not in LP/PI protected animals. Neutrophilia and lymphopenia were documented in non-treated animals. Neutrophilia would result of high NO content in serum, which inhibits neutrophil migration and lymphopenia is part of immune suppression caused by sepsis. Neutrophilia was observed 7 days after infection in animals given LP/PI, suggesting a hematopoiesis stimulus. Lymphopenia first observed (24 h) in septic animals was only detected after 7 days in PL/PI treated animals. Activity of oxalacetic-glutamic transaminase was altered in all groups while glutamic-pyruvic transaminase not. Lactate dehydrogenase was augmented in all groups. Histopathological examination of liver and spleen revealed tissue damage caused by sepsis, but these alterations appeared later (7 days) in PL/PI-treated animals. Results reported in this study suggest that PL modulates immune inflammatory activity in septic animals by an indirect mechanism that remains to be investigated. Activity of LP leads to animal survival, even under infection. It is proposed that LP modulates NO synthesis, reducing NO levels in serum of infected animals and abolishing the failure of neutrophil migration. The pharmacological properties of LP previously described in classical models of inflammation, is now confirmed in a model of systemic inflammatory response elicited by microbial infection. / O látex da planta medicinal Calotropis procera (Apocynaceae) possui moléculas com diferentes atividades farmacológicas, dentre estas, pró- e antiinflamatória. Neste trabalho, o efeito imunomodulatório da fração de proteínas solúveis do látex (PL) foi investigado em modelos experimentais de sepse induzida por CLP e por inoculação de S. Typhimurium. Aspectos bioquímicos das proteínas do látex foram investigados e parâmetros bioquímicos, hematológicos e histopatológicos foram determinados em animais experimentais. PL exibiu um significativo efeito protetor nos animais. Uma dose de 30 mg/Kg levou à sobrevivência de até 100%, comparada com 100% de mortalidade no grupo de animais infectados e não tratados (grupo Salmonella). Este efeito foi somente observado quando PL foi administrado 24 horas antes da indução da sepse. PL não apresentou atividade antibacteriana in vitro sugerindo um mecanismo de ação indireto, possivelmente intervindo nos processos imunes. A população microbiana no fígado, baço e fluido peritoneal - local do foco infeccioso - estava similar entre todos os grupos, 4 e 24 horas após inoculação bacteriana. No sangue, entretanto, a quantidade de bactérias viáveis estava reduzida apenas nos animais tratados com proteínas do látex. O efeito protetor de PL foi revisto através de suas três sub-frações protéicas, denominadas de PI, PII e PIII, obtidas através de fracionamento por cromatografia de troca iônica em coluna de CM-Sepharose a pH 5,0. As três sub-frações protéicas apresentaram efeito protetor e de forma similar. Nem o tratamento térmico de PL (100 °C, 30 min.) ou inibição de suas proteases endógenas com iodoacetamida alterou o efeito protetor observado. O óxido nítrico (NO), um importante sinalizador molecular, estava aumentado no soro de animais do grupo Salmonella enquanto que animais protegidos com doses de PL e PI apresentaram níveis similares ao controle após 24 horas da infecção. Este resultado corroborou com a observação de que animais com sepse letal apresentaram falência na migração de neutrófilos para o foco infeccioso enquanto que, de forma evidente, animais tratados com PL ou PI favoreceram o influxo de células para a cavidade peritoneal. Além disto, nestes animais, o nível de NO estava aumentado no foco infeccioso, uma provável atividade dos neutrófilos presentes como parte de sua atividade microbicida. A atividade da adenosina desaminase (ADA) mensurada no foco infeccioso, após 4 e 24 horas de infecção, estava aumentada apenas nos animais tratados com PL ou PI, e inalterada em animais do grupo Salmonella. Plaquetopenia foi observada em animais com sepse, mas não em animais protegidos com PL ou PI. Neutrofilia e linfopenia ocorreram em animais do grupo Salmonella. Neutrofilia seria concordante com o elevado teor de NO, um inibidor da migração de neutrófilos, enquanto que a linfopenia é parte da imunossupressão estabelecida na sepse. Em animais tratados com PL ou PI foi observada neutrofilia sete dias após a infecção, sugerindo um estímulo na hematopoiese. Linfopenia, observada no início da sepse (24 h), só ocorreu aos sete dias nos animais tratados com PL ou PI. Atividade de transaminase glutâmico oxalacética estava aumentada em todos os grupos. Transaminase glutâmico pirúvica não teve atividade alterada. A atividade da lactato desidrogenase estava aumentada em todos os grupos. Análises histopatológicas do fígado e baço mostraram que os danos teciduais causados pela sepse foram retardados nos animais tratados com PL, como observado após sete dias. A análise integrada de todos os resultados sugere que as proteínas do látex modulam a resposta imunoinflamatória por mecanismo indireto, revertendo à falência da migração de neutrófilos causada pela sepse letal e, desta forma, induzem uma resposta imunológica ainda não esclarecida, que permite a sobrevivência dos animais, mesmo sob infecção. Os resultados sugerem que a modulação de NO estaria diretamente envolvida no efeito protetor final observado. As propriedades farmacológicas de PL previamente descritas em modelos clássicos de inflamação são agora confirmadas em um modelo de resposta inflamatória sistêmica resultante de um processo infeccioso previamente estabelecido.

NASCIMENTO, Camila Tauane Monteiro do. Expressão heteróloga de uma osmotina laticífera e desenvolvimento de protocolos para extração da proteína recombinante a partir de corpos de inclusão. 2016. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2016. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T15:11:48Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:31:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:31:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) Previous issue date: 2016 / In the previous step to this work, a protein identified as osmotin (CpOsm) was purified from Calotropis procera latex which showed strong antifungal activity. The protein was expressed in prokaryotic and eukaryotic systems, but a suitable protocol for purification has not been achieved. In the present work, from inclusion bodies (IB) obtained from Escherichia coli BL21 (DE3) proceeded to a survey by different solubilization protocols of proteins in an attempt to obtain the recombinant protein (rCpOsm) soluble, and then evaluates it as its activity and finally, exploring new methods for purification. The bacterial culture was induced at different conditions of temperature and time of induction. IB were subjected to chemical treatments with surfactants (CTAB; Cetrimide; ARG-12, a derivative surfactant Argenine) and a denaturing agent (guanidine hydrochloride); physical treatment by sonication and the enzymatic treatment with protease native C. procera latex. Electrophoresis assays suggested that two chemical surfactants were effective in solubilizing rCpOsm while not ARG-12. Although these cationic compounds solubilized rCpOsm more than other proteins of IB, while the sonication process samples produced with a greater variety of soluble proteins including rCpOsm. The enzymatic treatment showed that IB proteins are, in some range, digested while rCpOsm did not. All samples were evaluated for action on Colletotrichum gloeosporiodes after dialysis and lyophilization and showed inhibitory activity of spore germination and mycelial growth. However, it was shown that the activity could be related to the solubilising agents. Insoluble proteins obtained from E. coli containing the plasmid integrity, taken as a negative control showed no activity in these assays. The rCpOsm solubilized by CTAB was subjected to chromatography on Ni ++ column (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7.0; in hydrophobic media (FenilSepharose CL-4B) and ion exchange (Resource-S). None of the applied protocols resulted in the purification of rCpOsm and these data repeated what was observed previously for rCpOsm purified from Pichia pastoris. / Em etapa anterior a este trabalho, uma proteína identificada como osmotina (CpOsm) foi purificada do látex de Calotropis procera a qual apresentou forte atividade antifúngica. A proteína foi expressa em sistemas procarionte e eucarionte, mas um protocolo adequado para sua purificação não foi alcançado. No presente trabalho, partindo de corpos de inclusão (CI), obtidos de E. coli BL21(DE3) procedeu-se uma prospecção por diferentes protocolos de solubilização de suas proteínas, na tentativa de obter a proteína recombinante (rCpOsm) solúvel, para então avaliá-la quanto a sua atividade e por fim, prospectar novos métodos para sua purificação. A cultura bacteriana foi induzida em diferentes condições de temperatura e tempo de indução. Após 3 horas de indução a 37 °C, 180 rpm, os CI foram lisados e submetidos a tratamentos químicos com surfactantes (CTAB; Cetrimida; ARG-12: um surfactante derivado de argenina) e um agente desnaturante (Cloridrato de Guanidina); tratamento físico por sonicação (4 ciclos de 2,5 min. cada a 50% de potência) e tratamento enzimático com protease nativa do látex de C. procera. Ensaios de eletroforese sugeriram que os dois surfactantes químicos foram eficientes na solubilização de rCpOsm enquanto que ARG-12 não. Ainda, estes compostos catiônicos solubilizaram rCpOsm mais do que as demais proteínas dos CI, enquanto que o processo de sonicação produziu amostras com maior diversidade de proteínas solúveis, incluindo rCpOsm. O tratamento enzimático mostrou que proteínas de CI são, em algum alcance, digeridas enquanto que rCpOsm não. O efeito do tratamento dos CI com protease foi analisado por imagens de microscopia de força atômica e as diferenças de estrutura entre os CI tratados e não tratados documentados. Todas as amostras foram avaliadas quanto à ação sobre Colletotrichum gloeosporiodes após diálise e liofilização. Os produtos dos tratamentos com surfactantes apresentaram atividade antifúngica, demonstrando atividade inibitória de germinação de esporos e crescimento micelial. Entretanto, foi demonstrado que a atividade poderia estar relacionada aos agentes solubilizantes. Proteínas insolúveis obtidas de E. coli contendo o plasmídeo íntegro, tomadas como controle negativo, não apresentaram atividade nestes ensaios. A rCpOsm solubilizada com CTAB foi submetida a cromatografia em coluna de Ni++ (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7,0; em meio hidrofóbico (FenilSepharose CL-4B) e troca iônica (Resource-S). Nenhum dos protocolos aplicados resultou na purificação de rCpOsm e estes dados repetem o que foi observado previamente para a rCpOsm purificada a partir de Pichia pastoris.

VIANA, Carolina de Araújo. Caracterização bioquímica e atividades biológicas de quitinases laticíferas de Calotropis procera. 2015. 181 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Vitor Campos (vitband@gmail.com) on 2016-09-01T23:13:32Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_caviana.pdf: 4184651 bytes, checksum: cb48948d5a8582e15dd64207712d9789 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T21:14:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_caviana.pdf: 4184651 bytes, checksum: cb48948d5a8582e15dd64207712d9789 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T21:14:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_caviana.pdf: 4184651 bytes, checksum: cb48948d5a8582e15dd64207712d9789 (MD5) Previous issue date: 2015 / Calotropis procera is a latificer plant in the Apocynaceae family. Defensive proteins with activity against phytophagous insects and phytopathogenic fungi in latex have been described. Latex’s proteic fraction also performs pharmacological activities, such as selective cytotoxic effect in carcinogenic cells. From the proteic fraction effective against neoplastic cells, this work had the goal to identify and further characterize cytotoxic protein(s) biochemically, biologically, and evaluate their biotechnological prospects. Soluble proteins in latex (LP) have been fractioned in ion-exchange matrix, and the fraction capable of cytotoxicity was further fractioned in another ion-exchange matrix (Mono-Q) coupled to a medium-pressure system. P4 was identified as cytotoxic fraction, showing an IC50 of 2.2, 1.2 and 2.9 mg/mL for the cell lines HCT-116, Ovcar-8 and SF-295, respectively. Proteomic analysis of the cytotoxic fraction by two-dimensional electrophoresis allowed 15 spots to be identified, comprising acid proteins (pI among 4 and 6) with 30 kDa apparent molecular weight. All spots were identified as chitinases when evaluated by mass spectrometry, and showed intact mass of 27.4 kDa. The sample reacted positively to the Schiff reagent, suggesting glycosilations. The carbohydrate content was estimated at 12.8%. The amino-terminal sequence obtained (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revealed 50% similarity with Solanum lycopersicum, Oryza sativa and Nicotiana tomentosiformes chitinases, among others. The enzymes showed strong chitinolytic activity, with optimal pH varying between 5-6 and optimal temperature of 25 °C. The chitinolytic activity was diminished when treated with increasing concentrations of DTT (3, 10 and 30 mM), which suggests the presence of disulfide bonds stabilizing the enzyme. Circular dichroism analyses indicate a larger presence of alpha helices in the structure and that the isoforms has low resistance to pH and temperature variation. High-resolution images generated through atomic force microscopy suggested sample homogeneity and a hexameric configuration. The chitinases did not inhibit mycelial growth of phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum and Colletotrichum gloeosporioides, however reduced the germination C. gloeosporioides spores. In consonancy the chitinases did not induce spore oxidative stress, but caused a slight change in membrane permeability of the evaluated spores. Laticifer chitinases (0.1% w/w) showed a strong deleterious effect on the phytophagous insect Callosobruchus maculatus. Effects produced a 57% survival reduction, larval weight reduction (7.8 mg ± 0.2 / 4.0 ± 0.8), adult insets emergence reduction (50%), in addition to prolonging the mean maturation time from 28 to 33 days. The chitinases (2 mg/Kg, i.v.) showed a strong anti-inflammatory activity, reducing 95% of neutrophil infiltration into the peritoneal cavity in mouse in an inflammation induced by carrageenan assay. L-NAME and Aminoguanidine, two inhibitors of nitric oxide synthase, reversed this effect, possibly indicating involvement of nitric oxide in the effects observed. This action was associated to a reduction of pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1 levels within the peritoneal cavity and increased serum levels of pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6 and IL-1. The conclusion is reached that many isoforms of chitinases coexist in C. procera latex. These proteins act possibly in defense against insects, though low action against fungi is shown. Laticifer chitinases were identified as latex proteins cytotoxic on neoplastic cells and they have even been able to modulate pro-inflammatory cytokines levels and nitric oxide in an acute inflammation model. C. procera laticifer chitinases represent interesting molecules for biotechnology prospection in plant defense and pharmacology. / Calotropis procera é uma planta laticífera, pertencente à família Apocynaceae. Proteínas de defesa foram descritas no látex com atividade contra insetos fitófagos e fungos fitopatogênicos. A fração proteica do látex também apresenta atividades farmacológicas, dentre tais efeito citotóxico seletivo em células carcinogênicas. A partir da fração proteica efetiva sobre células neoplásicas, o trabalho teve por meta central identificar proteína(s) citotóxica(s) e proceder a sua caracterização bioquímica, biológica e suas perspectivas biotecnológicas. As proteínas solúveis do látex (PL) foram fracionadas em matriz de troca iônica e a fração proteica detentora da citotoxicidade foi refracionada em outra matriz de troca iônica (Mono-Q) acoplada a sistema de média pressão. P4 foi identificado como a fração citotóxica, apresentando uma IC50 de 2,2, 1,2 e 2,9 µg/mL para as linhagens celulares HCT-116, Ovcar-8 e SF-295, respectivamente. A análise proteômica da fração citotóxica por eletroforese bidimensional permitiu identificar 15 spots, contendo proteínas ácidas (pI entre 4 e 6) e com massa molecular aparente de 30 kDa. Quando avaliados por espectrometria de massas todos esses spots foram identificados como quitinases e apresentaram massa intacta de 27,4 kDa. A amostra reagiu positivamente ao reagente de Schiff, sugerindo glicosilações. O teor de carboidratos foi estimado em 12,8%. A sequência amino terminal obtida (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revelou 50% de similaridade com quitinases de Solanum lycopersicum, Oryza sativa, Nicotiana tomentosiformes dentre outras. As enzimas apresentaram forte atividade quitinolítica, com pH ótimo variando entre 5-6 e temperatura ótima de 25 °C. A atividade quitinolítica foi reduzida quando tratada com concentrações crescentes de DTT (3, 10 e 30 mM) o que sugere a presença de pontes dissulfeto estabilizadoras da enzima. Análises por dicroísmo circular indicam a presença majoritária de alfa-hélices na estrutura e que as isoformas se mostraram pouco resistentes a variações de temperatura e pH. Imagens de alta resolução geradas por microscopia de força atômica sugeriram homogeneidade na amostra e um arranjo hexamérico foi evidenciado. As quitinases não inibiram o crescimento micelial dos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum e Colletotrichum gloeosporioides, mas reduziram a germinação de esporos de C. gloeosporioides. Em consonância as quitinases não induziram estresse oxidativo nos esporos, mas causaram leves alterações na permeabilidade membranar dos esporos avaliados. As quitinases laticíferas (0,1 % m/m) apresentaram forte efeito deletério sobre o inseto fitófago Callosobruchus maculatus. Os efeitos produziram 57% de redução na sobrevivência larval, redução do peso de larvas (7,8 mg ± 0,2 /4,0 ± 0,8) e emergência de insetos adultos (50%), além de prolongar de 28 para 33 dias o tempo médio de desenvolvimento de insetos adultos. As quitinases (2 mg/Kg, e.v.) apresentaram forte atividade anti-inflamatória, reduzindo em 95% a infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal em ensaio de inflamação induzido por carragenina em camundongos. Este efeito foi revertido por L-NAME e Aminoguanidina, dois inibidores da enzima óxido nítrico sintase, indicando o possível envolvimento do óxido nítrico no efeito observado. Esta ação foi associada à redução dos níveis das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1 na cavidade peritoneal e do aumento dos níveis séricos das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-6 e IL-1. É concluído que várias isoformas de quitinases coexistem no látex de C. procera. Estas proteínas atuam possivelmente na defesa contra insetos, mas têm pouca ação contra fungos. As quitinases laticíferas foram identificadas como as proteínas citotóxicas do látex sobre células neoplásicas e ainda foram capazes de modular os níveis de citocinas pró-inflamatórias e síntese de óxido nítrico em modelo de inflamação aguda. As quitinases do látex de C. procera representam interessantes moléculas para prospecção biotecnológica em defesa vegetal e farmacologia.

La cáscara de huevo es considerada como un residuo agroindustrial que genera un impacto negativo en el medio ambiente ocasionado por el crecimiento de la industria de ovoproductos y por una mala gestión de residuos. Por dicho motivo, la presente investigación tuvo como propósito aprovechar los residuos de cáscara de huevo como insumo para la elaboración de pintura látex de color para proponer una solución social, ambiental y técnica. El trabajo experimental se desarrolló en la Planta Piloto de Alimentos de la UNMSM, donde en primera instancia se recolectaron 28.73 kg de cáscara de huevo procedentes del Centro de Producción Tottus, las cuales pasaron por un proceso de separación de membrana proteica para luego ser secadas a 55.3 º C por 100 minutos. Luego, las muestras secas fueron molidas con un molino eléctrico Y800 por 1 minuto a una velocidad de 34000 RPM, enseguida dicho producto fue separado con un tamiz de abertura de malla 325 y posteriormente se formuló la pintura látex. En la investigación se comparó el tratamiento patrón A (pintura látex marca TAMSA) con un tratamiento B que contiene 32.60 % de CaCO3 de cáscara de huevo y TiO2 al 4.89% y con un tratamiento C formulado con 34.28 % de CaCO3 de cáscara de huevo. Asimismo, se evaluó las características fisicoquímicas de viscosidad, densidad, poder cubriente, tiempo de secado, color en coordenadas R, G, B para cada tratamiento y el aspecto cualitativo mediante la aplicación en un pared de concreto. Los resultados obtenidos del análisis fisicoquímico fueron analizados con el software estadístico Minitab v.14 con un nivel de significancia de 0.05 y mediante la aplicación del modelo estadístico Anova unifactorial completamente aleatorizado, una prueba de confirmación y una prueba de comparaciones múltiples para identificar en que tratamientos existen diferencias significativas. En los resultados se verificó que la cáscara de huevo contiene 90.37 ± 0.97 % de carbonato de calcio, además el análisis granulométrico confirmó que este carbonato presentó un tamaño de partícula menor a 45 µm apto para ser utilizado en pintura látex de color. Finalmente, los resultados del análisis estadístico determinaron que el tratamiento B no presenta diferencias significativas con el tratamiento patrón. / Tesis