La symbiose mycorhizienne à arbuscules (SMA) est le résultat de l'interaction entre les racines de plus de 80% des familles de plantes terrestres et les champignons MA. Divers types de membranes jouent un rôle crucial dans la mise en place et le fonctionnement de la SMA chez l’hôte végétal. Si l’électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) reste la méthode la plus couramment utilisée pour des analyses protéomiques quantitatives dans la SMA, elle résout difficilement les protéines membranaires en raison de leur hydrophobicité, leur précipitation au point isoélectrique (pI) et leur faible abondance comparativement aux protéines cytosoliques. Donc peu nombreuses sont les protéines membranaires identifiées comme étant régulées en réponse à la symbiose. Afin d’avoir accès à cette catégorie de protéines et contourner les défauts de la 2-DE, l’application de nouvelles méthodes permet de réaliser des analyses quantitatives avec marquage chimique (comme l’iTRAQ) ou non (label-free). Dans ce contexte, deux méthodes de protéomique quantitative, iTRAQ-OFFGEL-CL-SM/SM et « label-free » 1-DE-CL-SM/SM, sont adoptées dans ce travail visant à identifier et quantifier les variations d’accumulation des protéines microsomales de racines de Medicago truncatula inoculées par Rhizophagus irregularis, préalable indispensable à l’analyse de leur rôle fonctionnel dans la SMA. Un protocole d’extraction donnant accès à des fractions radiculaires enrichies en protéines microsomales nécessaires pour les analyses ultérieures est décrit dans cette étude. En plus de l’analyse quantitative du protéome membranaire en réponse à la SMA, une approche méthodologique a été mise en place afin d’étudier l’impact du marquage iTRAQ sur le pI des peptides. / Arbuscular mycorrhizas (AM) are widespread symbiotic associations between plant roots and AM fungi. Deep membrane alterations are the foremost morphological changes occurring in the host plant in response to AM symbiosis. Two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) is the workhorse method in AM proteomics. Membrane proteins are under-represented in 2-DE because of their hydrophobicity, low abundance, and precipitation at their isoelectric point, thereby few are the identified membrane proteins involved in sustaining the AM symbiosis. Membrane proteomics is still challenging due to 2-DE related shortcomings, however latest trends and advancements in mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics offer enormous potential to monitor membrane protein change in abundance in large scale experiments. In the current work microsomal proteins of Medicago truncatula roots inoculated with Rhizophagus irregularis were, for the first time, scrutinised by state-of-the-art MS-based proteomic approaches iTRAQ-OFFGEL-LC-MS/MS and label-free 1-DE-LC-MS/MS. The applied workflows combine two novel proteomic procedures, label-based and -free, targeting an insight view on the membrane proteome changes in AM symbiosis. A subcellular fractionation method is herein described to access the total membrane-associated proteins with sufficient recovery and purity for their subsequent in-depth analysis. In addition to the biological gain by shedding the light on candidate AM-related membrane proteins, a methodological approach was carried out in the present work in order to elucidate the iTRAQ labelling impact on peptide isoelectric points.

Le facteur de transcription ZEBRA (EB1) du virus d'Epstein-Barr joue un rôle essentiel dans l'initiation de l'infection lytique et la production virale. L'ubinucléine a été identifiée comme un partenaire cellulaire de ZEBRA, capable de l'empêcher de se fixer à ses séquences d'ADN cibles. Le rôle de l'ubinucléine dans la cellule demeure inconnu, ainsi que les conséquences de son interaction avec ZEBRA dans les cellules infectées par l'EBV. Notre travail a permis, d'abord, de mieux caractériser l'ubinucléine dans la cellule épithéliale en l'identifiant comme une protéine des jonctions serrées. L'ubinucléine a été proposée comme un nouveau membre de la famille des protéines NACos (nuclear and adhesion complex components) possèdant une double localisation, les noyaux et les jonctions des cellules. Afin de mieux comprendre son rôle dans la cellule épithéliale, nous avons étudié par une approche protéomique couplée à la spectrométrie de masse les partenaires de l'ubinucléine et identifié les protéines LYRIC et RACK-1. Nos résultats suggèrent que l'ubinucléine est impliquée dans différents processus biologiques tels que la régulation de la prolifération et de l'adhésion cellulaires. Enfin, dans les cellules épithéliales infectées par l'EBV, les fonctions de l'ubinucléine semblent dépendre de sa localisation cellulaire. Au niveau nucléaire, l'ubinucléine régule négativement le cycle lytique et la production de particules virales en empêchant ZEBRA et d'autres facteurs cellulaires de se fixer à leurs promoteurs de type AP-1. Lorsqu'elle est séquestrée dans les jonctions serrées, l'inhibition de ZEBRA est levée permettant ainsi le bon déroulement du cycle lytique du virus.

La recherche de maïs plus tolérants au déficit hydrique est un enjeu fondamental pour la production agricole dans les prochaines décennies. Le but ce travail a été d'identifier et de caractériser des gènes impliqués dans la variation de caractères complexes affectés par le déficit hydrique chez le maïs.Nous avons tout d'abord identifié des transcrits et des protéines, dont la teneur variait entre deux mélanges de lignées recombinantes différant pour une région chromosomique influençant la croissance foliaire et la protandrie en condition de déficit hydrique. Parmi les huit gènes candidats cartographiés au niveau de la région d'intérêt, se trouvait le facteur de transcription ZmMYB31 impliqué dans la biosynthèse de la lignine. Nous avons montré que son expression était corrélée à celle de deux de ses cibles, à la teneur en lignine et à l'expression du gène ZmFatA impliqué dans la biosynthèse des acides gras, suggérant un rôle régulateur de la protéine ZmMYB31 via la synthèse de lignine et de dérivés lipidiques.Dans un second volet, nous avons montré que la sur-expression du gène candidat ZmASR1 (ZmASR1-OE) chez le maïs maintenait le rendement en condition de déficit hydrique. Des analyses transcriptomiques et protéomiques nous ont permis d'identifier 25 cibles de la protéine ZmASR1, dont sept gènes impliqués dans la biosynthèse des acides aminés branchés. Nous avons également montré qu'il existait une étroite corrélation entre 13 métabolites diminués par ZmASR1-OE, six étant connus pour être négativement corrélés à la biomasse. Enfin, des résidus phosphorylés ont été identifiés chez les protéines ZmASR1, ZmASR2 et ZmASR3, suggérant leur régulation par phosphorylation.

La néphropathie diabétique (ND) est l'une des complications graves du diabète. Elle affecte environ 30% des patients diabétiques. La microalbuminurie est actuellement l'élément diagnostique principal de la survenue de la ND mais manque de spécificité et précocité. Plusieurs études ont été consacrées à la recherche de nouveaux biomarqueurs (BM) de la ND par des approches protéomiques. Nous avons montré dans la phase initiale de notre travail que si de nombreux candidats BM avaient été identifiés, leur nature ne faisait pas consensus et que de nombreuses études, de par leur conception, ne pouvaient identifier de BM plus précoces que l'albumine. Partant de ce constat, nous avons sélectionné une cohorte originale de diabétiques de type 1 normoalbuminuriques considérés à risque de développer la ND, sur la base de l'apparition d'une microalbuminurie consécutive à un test d'effort. Une cohorte contrôle a été aussi constituée. Dans la première partie de notre travail, nous avons comparé par électrophorèse bidimensionnelle les protéomes urinaires des patients des deux coho rtes. Les BM candidats ont été ensuite identifiés par spectrométrie de masse. L'analyse fonctionnelle de ces protéines a montré que certaines sont impliquées dans la cascade de la coagulation et les mécanismes de dysfonctionnement endothélial. Le caractère diagnostique de ces protéines a été validé dans les mêmes cohortes de patients par des expériences de Western-blot. La compréhension de la nature et de la fonction physiologique des BM candidats identifiés nous a permis de mieux appréhender les mécanismes moléculaires de la pathogénèse de la ND et d'identifier des candidats biomarqueurs plus précoces que l'albumine. Ces résultats sont présentés sous la forme d'un projet d'article .La deuxième partie de notre travail expérimental est constituée d'études préliminaires visant à la recherche de protéines spécifiques urinaires, néphrine et isoformes de l'adiponectine, afin d'évaluer leur potentiel diagnostique. 1 Ben Ameur R. et al Proteomic approaches for discovering biomarkers of diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant 25, 2866-752 Ben Ameur R. et al Identification of early candidate biomarkers for diabetic nephropathy by urine proteomic analysis. To be submitted / Diabetic nephropathy (DN) is one of the most serious complications of diabetes. It affects about 30% of diabetic patients. Microalbuminuria is currently the main available marker for DN risk, but has inadequate specificity and precocity. Several published studies intended to research new biomarkers (BM) of DN by proteomic approaches. We have shown1 that, if several candidate BM were claimed, there was no consensus about their nature and that a number of studies could not identify BM earlier than albumin because of the study design. Thus, we have selected an original cohort of type 1 diabetic patients considered at risk of developing DN, on the basis of urinary albumin excretion after an exercice test. A control cohort was also enrolled. Using 2D gel electrophoresis we compared the urinary proteomes of patients from both cohorts. Then, candidate BM were identified by mass spectrometry. Functional analysis of these proteins showed that some are involved in the coagulation cascade and in mechanisms of endothelial dysfunction. The diagnostic potential of these proteins was validated by Western blotti ng. The nature and physiological function of candidate biomarkers allowed to better understand the molecular pathogenic mechanisms of DN. Results from this part of the work are shown in the form of an article2. Preliminary studies to assess the diagnostic potential research of specific urinary proteins (nephrin and different isoforms of adiponectin) are also presented.1 Ben Ameur R. et al Proteomic approaches for discovering biomarkers of diabetic nephropathy. Nephrol Dial Transplant 25, 2866-752 Ben Ameur R. et al Identification of early candidate biomarkers for diabetic nephropathy by urine proteomic analysis. To be submitted

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'un des phénomènes les plus importants survenus pendant la maturation du fruit de tomate est le changement de couleur du vert au rouge. Ce changement a lieu dans les plastes et correspond à la différenciation des plastes photosynthétiques, les chloroplastes, en plastes non-photosynthétiques qui accumulent des caroténoïdes, les chromoplastes. Dans cette thèse, nous présentons d'abord une introduction bibliographique sur le domaine de la transition chloroplaste-chromoplaste, en décrivant les modifications structurales et physiologiques qui se produisent pendant la transition. Puis, dans le premier chapitre, nous présentons des observations microscopiques de plastes isolés à trois stades de mûrissement, puis des enregistrements en temps réel de la fluorescence des pigments sur les tranches de fruits de tomate. Il a été possible de montrer que la transition chloroplaste-chromoplaste était synchrone pour tous les plastes d'une seule cellule et que tous les chromoplastes proviennent de chloroplastes préexistants. Dans le deuxième chapitre, une approche protéomique quantitative de la transition chloroplaste-chromoplaste est présentée, pour identifier les protéines différentiellement exprimées. Le traitement des données a identifié 1932 protéines parmi lesquelles 1529 ont été quantifiées par spectrométrie de masse. Les procédures de quantification ont ensuite été validées par WESTERN blot de certaines protéines. La chromoplastogénèse comprend les changements métaboliques suivants : diminution de l'abondance des protéines de réaction à la lumière et du métabolisme des glucide, et l'augmentation de la biosynthèse des terpénoïdes et des protéines de stress. Ces changements sont couplés à la rupture de la biogenèse des thylakoïdes, des photosystèmes et des composants de production d'énergie, et l'arrêt de la division des plastes. Dans le dernier chapitre nous avons utilisé la lincomycine, un inhibiteur spécifique de la traduction à l'intérieur des plastes, afin d'étudier les effets sur la maturation des fruits et sur l'expression de gènes nucléaires impliqués dans la maturation. Les résultats préliminaires indiquent que l'inhibition de la traduction des protéines dans les plastes affecte la maturation du fruit en réduisant l'accumulation de caroténoides. L'expression de plusieurs gènes nucléaires a été modifiée mais une relation claire avec le phénotype altéré de maturation n'a pas pu être établie. Au total, notre travail donne de nouveaux aperçus sur le processus de différenciation chromoplaste et fournit des données nouvelles ressources sur le protéome plaste / One of the most important phenomenons occurring during tomato fruit ripening is the color change from green to red. This change takes place in the plastids and corresponds to the differentiation of photosynthetic plastids, chloroplasts, into non photosynthetic plastids that accumulate carotenoids, chromoplasts. In this thesis we first present a bibliographic introduction reviewing the state of the art in the field of chloroplast to chromoplast transition and describing the structural and physiological changes occurring during the transition. Then, in the first chapter we present an in situ real-time recording of pigment fluorescence on live tomato fruit slices at three ripening stages. By viewing individual plastids it was possible to show that the chloroplast to chromoplast transition was synchronous for all plastids of a single cell and that all chromoplasts derived from pre-existing chloroplasts. In chapter two, a quantitative proteomic approach of the chloroplast-to-chromoplast transition is presented that identifies differentially expressed proteins. Stringent curation and processing of the data identified 1932 proteins among which 1529 were quantified by spectral counting. The quantification procedures have been subsequently validated by immune-blot evaluation of some proteins. Chromoplastogenesis appears to comprise major metabolic shifts (decrease in abundance of proteins of light reactions and carbohydrate metabolism and increase in terpenoid biosynthesis and stress-related protein) that are coupled to the disruption of the thylakoid and photosystems biogenesis machinery, elevated energy production components and loss of plastid division machinery. In the last chapter, we have used lincomycin, a specific inhibitor of protein translation within the plastids, in order to study the effects on fruit ripening and on the expression of some ripening-related nuclear genes. Preliminary results indicate that inhibiting protein translation in the plastids affects fruit ripening by reducing the accumulation of carotenoids. The expression of several nuclear genes has been affected but a clear relationship with the altered ripening phenotype could not be established. Altogether, our work gives new insights on the chromoplast differentiation process and provides novel resource data on the plastid proteome

En contrôlant le passage para- et transcellulaire des composés du sang vers le cerveau (et inversement), la barrière hémato-encéphalique (BHE) constitue la « gardienne » du compartiment cérébral. Bien que relativement connu dans son aspect physiologique, le phénotype BHE des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (BCECs) reste mal compris au regard des mécanismes moléculaires qui gouvernent son établissement et son maintien. Dans cette optique, à l’aide du modèle in vitro de BHE développé au laboratoire (co-culture de BCECs bovines et de cellules gliales de rats), nous avons réalisé deux études protéomiques comparatives afin d’identifier les protéines cytoplasmiques potentiellement impliquées dans l’induction et le maintien de ce phénotype: d’une part une approche qualitative sans marquage (label free) et d’autre part une approche quantitative grâce à un marquage isotopique préalable des protéines (isotope-coded protein label, ICPL). Les deux approches, label free et ICPL se sont révélées complémentaires et ont permis, respectivement, l’identification de 447 et de 412 protéines (dont 290 quantifiées). Quatre protéines d’un intérêt particulier dans le domaine de la BHE (phosphatase alcaline tissu-non spécifique, TNAP ; protéine 1 possédant un domaine d’homologie à Eps15, EHD1 ; superoxyde dismutase, SODC et homologue 7 de la protéine de la maladie de Parkinson PARK7, DJ-1) ont fait l’objet de caractérisations biochimiques approfondies et ouvrent des pistes d’investigation sur des potentielles voies cellulaires induites par les cellules gliales et impliquées dans le phénotype BHE. / The blood-brain barrier (BBB) controls the para- and transcellular crossing of compounds from blood to brain (and inversely) and establishes the “gatekeepers” of the brain. The major part of therapeutic drugs developed to fight the brain diseases is deemed inefficient in vivo due to the presence of the BBB that they are unable to cross. Although relatively well known in its physiological aspect, the BBB phenotype of brain capillary endothelial cells (BCECs) remains largely under known and misunderstood in regards of the molecular mechanisms that govern its establishment and its maintenance. To this goal, using the in vitro BBB model developed in the laboratory (co-culture of bovine BCECs with rat glial cells), we performed two differential proteomic studies to identify the main cytoplasmic proteins involved in the establishment and maintenance of this phenotype: a qualitative label free approach and a quantitative isotope-coded protein labeling (ICPL) approach.The two different approaches, label free and ICPL, are complementary and led to the identification of 447 and 412 proteins, respectively. Four proteins of particular interest for BBB (tissue-non specific alkaline phosphatase, TNAP; Eps15 homology domain containing protein 1, EHD1; superoxide dismutase, SODC and Parkinson disease protein 7 homolog PARK7, DJ-1) have been more deeply studied and they open new discovery prospects related to cellular pathways induced by glial cells and involved in the BBB phenotype.

Les contaminations multiples par des métaux et métalloïdes menacent la structure et le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Pourtant, les mécanismes d'action des polluants, leurs interactions et leur toxicité dans un contexte de réchauffement climatique sont encore peu abordés. Parallèlement, nous avons un besoin urgent de marqueurs d'alerte (i.e., précoces, sub-létaux) des effets de ces substances. Par ailleurs, une attention croissante est actuellement portée au protéome des êtres vivants, considéré comme une entité dynamique, modifié par les conditions du milieu. Dans ce contexte, nous avons travaillé en laboratoire avec comme espèce modèle le crustacé amphipode Gammarus pulex avec trois objectifs: (1) évaluer les effets de deux éléments métalliques (cadmium et arséniate) seuls ou en interaction sur des organismes exposés en conditions contrôlées, (2) appréhender les effets de la température en tant que facteur confondant potentiel des réponses mesurées, et (3) rechercher l'existence d'une réponse singulière potentielle du protéome d'individus exposés aux éléments métalliques seuls ou en mélange ; à plusieurs températures. Il s'agissait donc à la fois de réaliser une analyse diagnostique susceptible de fournir des marqueurs d'intérêt aptes à révéler précocement un stress chimique et de dresser les bases d'une approche pronostique permettant de mieux prédire les conséquences à l'échelle individuelle d'une dégradation anthropique du milieu / Multiple metal and metalloid contaminations impair aquatic ecosystem community structure and functioning. However, the mechanistic understanding of individual pollutant toxic effects, but also of their interaction effects in a "global warning" context are still rarely tackled. However, aquatic ecosystem managers have an urgent need of early warning indicators (i.e. early, sub-lethal) of toxicant effects. Recently, an increasing attention has been turned to studies of the proteome of species/populations, which is considered as a dynamic entity modified by environmental conditions. In this context, we have worked with a model organism, Gammarus pulex (crustacea, amphipoda), under laboratory controlled conditions. Three objectives have been defined: (1) assessing the single and combined effects of two metals (i.e. arsenate and/or cadmium), (2) understanding the potential confounding effect of temperature on measured physiological and behavioural responses of gammarids and (3) investigating the existence of a singular response of the proteome of individuals exposed to different single or combined metal concentrations, at several tested temperatures. The major goals were first applying a diagnostic analysis to provide valuable biomarkers early indicating metallic stress, and second developing the foundations for a prognostic approach better predicting the organismal consequences of toxic contaminations due to the anthropogenic degradation of aquatic ecosystems