Die hier vorgestellte Studie untersucht systematisch die angeborene Immunabwehr gegen L. pneumophila auf Ebene des gesamten Wirtsorganismus, sowie auf molekularer Ebene in Alveolar- und Knochenmarksmakrophagen. Mittels in vivo Transkriptomanalysen werden Typ I und II Interferone (IFN) als Hauptregulatoren der frühen pulmonalen Genexpression in der L. pneumophila-Infektion identifiziert. Infektionsexperimente in Wildtyp- und IFN-Rezeptor-defizienten Tieren offenbaren, dass Typ I und II IFNe maßgeblich die antibakterielle Abwehr gegen L. pneumophila vermitteln. Für die Bekämpfung der Infektion in der Lunge werden CD11c+ Zellen als wichtigste Empfänger der IFN-Signale identifiziert. Des Weiteren wird durch Behandlung von CD11c+ Alveolarmakrophagen mit IFNen ex vivo das intrazelluläre bakterielle Wachstum inhibiert. Mittels subzellulärer quantitativer Massenspektrometrie wird gezeigt, dass die Proteinkomposition der Legionellen-enthaltenden Vakuole substanziell durch beide IFNe modifiziert wird. In einer vergleichenden Netzwerkanalyse werden diese Proteomdaten mit eigenen und öffentlich zugänglichen Transkriptomdaten verglichen. Hierdurch können klar abgegrenzte Untergruppen von einerseits transkriptionell durch IFN-regulierten Proteinen sowie andererseits ausschließlich räumlich IFN-regulierten Proteinen unterschieden werden. Unter den durch IFN an der Vakuole angereicherten Proteinen wird Immunoresponsive gene 1 (IRG1) als zentraler Effektor identifiziert, welcher das Wachstum von L. pneumophila durch die Produktion des antibakteriellen Metaboliten Itaconsäure inhibiert. Zusammenfassend stellt diese Studie eine umfassende Ressource von IFN-vermittelten Effekten auf die Genexpression sowie auf das Proteom der bakteriellen Vakuole dar und deckt einen zellautonomen Abwehrmechanismus gegen L. pneumophila auf, welcher durch die IRG1-abhängige Produktion von Itaconsäure vermittelt wird. / The study presented here systemically examines the innate immune response against L. pneumophila on whole organism level as well as on a molecular level within macrophages, L. pneumophilas’ host cell. In vivo transcriptome analyses identify type I and II interferons (IFNs) as master regulators of the early pulmonary gene expression during L. pneumophila infection. Infection experiments in wild-type mice and mice lacking type I and/or II IFN signaling reveal a severe defect of antibacterial defense when IFN signaling is absent. CD11c+ cells were found to be the main targets of IFNs to restrict infection in the lung, and IFNs inhibited bacterial growth in CD11c+ alveolar macrophages ex vivo. Subcellular quantitative mass spectrometry shows that both IFNs substantially modify the protein composition of Legionella-containing vacuoles. Comparative network analysis, combining these proteome data with transcriptome data as well as public database data reveals distinct subsets of transcriptionally regulated IFN-stimulated genes (ISGs) on the one hand, but interestingly also exclusively spatially IFN-regulated vacuolar proteins. Among IFN-regulated vacuolar proteins, Immunoresponsive gene 1 (IRG1) was identified as a central effector that restricts growth of L. pneumophila through production of the antibacterial metabolite itaconic acid in macrophages. Collectively, this study provides a comprehensive resource of IFN-mediated effects on gene expression and the bacterial vacuolar proteome, and uncovers a cell-autonomous defense pathway against L. pneumophila, which is mediated by IFNs, IRG1 and itaconic acid.

Legionella pneumophila ist ein fakultativ intrazellulär replizierendes Bakterium und der Erreger der Legionärskrankheit, einer schweren Pneumonie. Das Typ IVB Dot/Icm Proteinsekretionssystem und dessen Effektoren sind wesentlich an der Virulenz des Bakteriums beteiligt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der Patatin-ähnlichen Proteine von L. pneumophila - insbesondere von PatA, das vom Dot/Icm Sekretionssystem in Wirtszellen eingeschleußt wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Ergebnisse erzielt: Die 11 Patatin-ähnlichen Proteine von L. pneumophila zeigen hauptsächlich Lysophospholipase A-Aktivität. PatA besitzt außerdem Phosphatidylglyzerol-spezifische Phospholipase A-Aktivität. Serin-72, welches in ein G-X-S-X-G Lipasemotiv eingebettet ist, ist für die Aktivität des Proteins essentiell. PatA ist nach Expression in A549 Epithelzellen in der Zytoplasmamembran oder einer damit eng assoziierten Struktur lokalisiert, die lipolytische Aktivität ist hierfür nicht entscheidend. Die Deletion einer C-terminalen Proteinregion führt zum Verlust der membranständigen Lokalisation. Virulenzattenuierte L. pneumophila Mutanten bilden unter Präsenz von Amöben - im Gegensatz zu Wildtypstämmen - eine Koloniemorphologie aus, die Scattermorphologie genannt wurde. Auf Basis der Scattermorphologie wurde eine Transposon-mutagenisierte Legionella Klonbank auf Wirtszellkolonisationsdefekte überprüft. Dabei wurden 119 kolonisationsdefekte Mutanten isoliert und 70 neue putative Wirtszellkolonisationsgene, darunter zwei Gene Patatin-ähnliche Proteine (patD, patF), identifiziert. patD befindet sich in einem Operon mit bdhA, dem Gen einer putativen 2-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase. Das Operon spielt eine Rolle im Poly-Beta-Hydroxybutyrat (PHB) Stoffwechsel des Bakteriums und wird für die Replikation in Wirtszellen benötigt. Die Studie liefert die ersten experimentell fundierten Ergebnisse, die die Bedeutung des PHB-Metabolismus für die Virulenz des Bakteriums belegen. / Legionella pneumophila is the causative agent of Legionnaires’ disease, a potentially fatal pneumonia. One mayor virulence determinant is the Dot/Icm Type IVB secretion system and its effector proteins. Aim of the present work was the characterization of patatin-like proteins of L. pneumophila, and in particular PatA, which is carried by the Dot/Icm secretion system into host cells. Within this work following results were obtained: The 11 patatin-like proteins of L. pneumophila possess majorly lysophospholipase A activity. L. pneumophila PatA additionally shows Phosphatidylglycerole-specific phospholipase A activity. Serin-72, which is embedded in an G-X-S-X-G lipase motiv is essential for the lipolytic activity of PatA. PatA locates to, or close to, the cytoplasmic membrane when expressed in A549 epithelial cells. The lipolytic activity of PatA is not required for membrane targeting and deletion of a C-terminal region abolishes proper targeting. Virulence attenuated L. pneumophila mutants, develop an easy recognizable phenotype during co-culture with A. castellanii on agar plates that was named „scatterphenotype“. On the basis of the scatterphenotype, a new assay was developed allowing screening of huge clone banks with respect to amoebae sensitivity, a marker for reduced virulence. Here, a collection of several thousand transposon mutagenized L. pneumophila clones was screened and a total of 119 amoebae sensitive mutants was isolated. Among those, 70 novel putative host cell colonization and virulence genes were identified including two members of the patatin-like protein family (patD, PatF). patD is cotranscribed with bdhA, therefore forming an operon. bdhA encodes a putative 3-hydroxybutyrate dehydrogenase. The operon is involved in the poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) metabolism of L. pneumophila and is needed for replication in host cells. The study provides the first experimentally funded data showing the linkage of PHB metabolism and virulence of L. pneumophila.

Bakterielle Infektionen aktivieren den Transkriptionsfaktor NF-κB. Dies trägt sowohl zur Immunantwort, als auch zum Überleben der Wirtszellen bei. In Infektionen mit dem Bakterium Helicobacter pylori stellt diese doppelte Funktion einen mechanistischen Link zwischen der chronischen Entzündung und der Krebsentstehung dar. Für das intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila ist das Überleben der Wirtszelle notwendig für die Vermehrung. Bisher sind jedoch bei beiden Infektionen die Signalwege, die zur NF-κB-Aktivierung führen, nicht ausreichend untersucht. Um NF-κB analysieren zu können, wurden hier monoklonale Zelllinien hergestellt, die ein Fusionsprotein der NF-κB-Untereinheit p65 mit GFP stabil exprimieren. Die Kerntranslokation von p65-GFP kann mit Fluoreszenz-Mikroskopie visualisiert und mit automatischer Bildanalyse quantifiziert werden. Mit dieser Methode konnte zum ersten Mal eine durch ein Bakterium induzierte Oszillation von p65-GFP gezeigt werden. In einem RNAi-basierten Hochdurchsatzscreen wurde diese Methode eingesetzt um neue Faktoren im NF-κB-Signalweg zu identifizieren. Dabei wurde die Infektion mit H. pylori mit den Induktoren TNFα und IL-1β verglichen. Insgesamt wurden 24 Regulatoren identifiziert. Die Identifikation dieser Faktoren vertieft nicht nur unser Verständnis des NF-κB-Signalweges, sondern bietet auch neue molekulare Ziele für mögliche zukünftige Therapien. Bei der detaillierten Analyse der L. pneumophila-induzierten NF-κB-Aktivierung konnte ein einzigartiger, zwei-phasiger Ablauf gezeigt werden. Zunächst verursachte bakterielles Flagellin eine starke, aber kurze Aktivierung. Später war p65 dauerhaft über Stunden im Kern lokalisiert, was eng an die Replikation der Bakterien gekoppelt war. Da die kontinuierliche Kernlokalisation für Transkriptionsfaktoren der NF-κB Familie sehr ungewöhnlich ist, könnte dies ein Hinweis für eine Manipulation durch das Bakterium sein, um das Überleben der Wirtszelle zu sichern. / Infection with pathogens leads to activation of the transcription factor NF-κB. This contributes both to the immune response as well as survival of host cells. In infection with the bacterium Helicobacter pylori, this dual function provides a mechanistic link between the chronic inflammation and cancer development. In infection with the intracellular pathogen Legionella pneumophila, the survival oft he host cell is necessary for replication. However, in both infections, the signaling pathways leading to NF-κB activation are not well understood. Here, in order to investigate NF-κB activation, monoclonal cell lines were generated that stably express the NF-κB subunit p65 fused to GFP. Nuclear translocation of p65-GFP can be visualized by fluorescence microscopy and quantified by software-based picture analysis. Using this technology, oscillations of p65-GFP nuclear translocation could be shown after H. pylori infection. To identify new factors important for NF-κB activation, the new assay was used to conduct an RNAi-based screen. In the screen, infection with H. pylori was compared to induction with the cytokines TNFα and IL-1β. In total, 24 key regulators for NF-κB were identified. The identification of these factors broadens our understanding of NF-κB signaling and could provide targets for future therapies. Finally, detailed observation of NF-κB activation induced by L. pneumophila in single cells revealed a unique, biphasic NF-κB activation. During the first hours, bacterial flagellin induced strong but transient activation. Then, p65 translocated continuously to the nucleus over hours without oscillation. Testing an array of bacterial mutants, a tight link between bacterial replication and continuous NF-κB activation could be shown. Because this continuous nuclear localization is very unusual for a transcription factor of the NF-κB family, this indicates that L. pneumophila could manipulate NF-κB to ensure host cell survival.

Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2007. / Title from PDF of title page. Document formatted into pages; contains 90 pages. Includes vita. Includes bibliographical references.

Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2007. / Includes vita. Includes bibliographical references (leaves 70-84). Also available online.

Legionella est une bactérie pathogène, ubiquitaire des environnements aqueux. L'utilisation des eaux de surface, par les centrales nucléaires, provoque un réchauffement de ces eaux, qui associé aux conditions de fonctionnement peut entraîner sa prolifération. Afin de limiter le développement de cette bactérie, en deçà des seuils réglementaires, EDF met en œuvre un traitement à la monochloramine dans ses circuits. Notre étude a eu pour but d’améliorer les connaissances sur les associations entre les légionelles et leur principal hôte : les amibes, et sur les facteurs susceptibles d’influencer leur sensibilité au traitement biocide. Nous avons, tout d’abord, mis en évidence la permissivité de 12 souches d’amibes à 2 souches de L. pneumophila. La température est apparue comme le paramètre le plus influant, la prolifération de Legionella semble favorisée à 40°C. Puis, nous avons cherché à développer un protocole pour séparer Legionella selon son état d’association. Ce protocole n’est pas abouti à l’heure actuelle. Finalement, nous avons comparé la sensibilité, de Legionella, dans différents états physiologiques et étudié l’impact de la qualité de l’eau et des MES. Les cellules post-amibes et dans une moindre mesure, les cellules en phases stationnaires sont les moins sensibles. L’effet de la matrice a été mis en évidence pour l’eau de Vienne, par contre la sensibilité n’a pas été modifiée suite à l’élimination ou l’enrichissement en MES. Cette étude constitue une base de connaissances nouvelles pour orienter les choix de gestion du traitement anti-Legionella à la monochloramine et d’exploitation des circuits. / Legionella is a pathogenic gram negative bacterium, ubiquitously found in waterborne environment. The use of surface water, in open recirculating cooling circuits of nuclear power plants, causes a warming of these waters, which may cause proliferation of Legionella. To limit the development of this bacterium, under the legal thresholds, EDF implements a monochloramine treatment. The aim of our study was to improve the knowledge on the association between Legionella and their main host : amoebae, and on the factors that may influence their susceptibility to biocide treatment. We first showed the permissiveness of 12 strains of amoebae to 2 strains of L. pneumophila. Temperature is appeared as the most influential parameter, the proliferation of Legionella seems favored at 40°C. Then, we searched to develop a protocol to quantify Legionella according to its state of association. This protocol is not operational, yet. Finally, we compared the sensitivity of Legionella, under different physiological states and studied the impact of water quality and suspended matter. Post-amoeba cells and at a lesser extent, stationary cells, are the less sensitive. The effect of the matrix was demonstrated for the Vienne river water, on the other side the elimination or enrichment in suspended matter has not modified the sensitivity. This study provides a basis for a better knowledge to manage monochloramine treatment against Legionella, and for operating cooling systems.

Legionella pneumophila (Lp) est un pathogène accidentel de l'homme capable d'infecter les macrophages alvéolaires et les pneumocytes. Au cours de l'infection, Legionella se confronte à différents types d'agents antibactériens, dont les peptides antimicrobiens (PAMs) produit par l'hôte et les antibiotiques à activité intracellulaire administrés aux patients. Le mécanisme d'action des PAMs humains à l'encontre de Legionella, ainsi que le niveau de résistance aux antibiotiques de la bactérie sont à ce jour encore peu documentés. Mes travaux ont pour but de contribuer à une meilleure connaissance de l'activité anti-Legionella de ces molécules. La première partie de cette étude a consisté à évaluer la sensibilité d'isolats cliniques de Lp sg 1 à 8 antibiotiques, afin de déterminer le seuil épidémiologique de sensibilité de la bactérie à ces différentes molécules. Nous avons démontré que l'ensemble des isolats cliniques sont sensibles aux antibiotiques testés. Les résultats ont révélé l'existence d'une sous-population présentant une sensibilité réduite aux macrolides. L'analyse des génomes a permis de corréler cette sensibilité diminuée à la présence de la pompe à efflux LpeAB spécifique des macrolides. Cette pompe est présente uniquement dans trois complexes clonaux centrés sur le ST1, le ST701 et le ST1335.La seconde partie de cette étude a été consacrée à la caractérisation de l'activité antibactérienne des PAMs humains LL-37 et HBD-3, ainsi qu'à l'identification de leur(s) mécanisme(s) d'action contre Legionella. L'ensemble des tests réalisés montre que LL-37 et HBD-3 induisent une perte de cultivabilité des légionelles par des modes d'action différents. Les résultats suggèrent que LL-37 agit par perméabilisation des membranes de L. pneumophila. Nos résultats ont également montré que les deux peptides exercent une activité inhibitrice sur la réplication intracellulaire des légionelles, au moins en partie grâce à une collaboration avec la cellule hôte / Legionella pneumophila (Lp) is an accidental human pathogen which can infect alveolar macrophages and pneumocytes. During infection, Legionella have to deal with to various types of antibacterial agents, such as antimicrobial peptides (AMPs) produced by the host, and antibiotics with intracellular activity administered to patients. The mechanism of action of human AMPs against Legionella, and the resistance level to antibiotics of the bacterium are still poorly described. Our work aimed to contribute to a better understanding of the anti-Legionella activity of these molecules. The first part of this study consisted in the evaluation of the susceptibility of clinical Lp sg1 isolates to 8 antibiotics, to determine the epidemiological cut-off values of these different molecules. We demonstrated that all clinical isolates are susceptible to the tested antibiotics. The results revealed the presence of a subpopulation displaying a reduced susceptibility to macrolides. The analysis of the genomes allowed us to correlate this reduced susceptibility to le presence of the LpeAB macrolides efflux pump, found specifically in the sequence types ST1, ST701 and ST1335.The second part of this study was dedicated to the characterization of the antibacterial activity of the human AMPs LL-37 and HBD-3, and to the identification of their mechanism(s) of action against Legionella. All of the experiments show that LL-37 and HBD-3 induce a loss of cultivability by different mode of action. The results suggest that LL-37 is able to permeabilize the membrane of the L. pneumophila cells. Our findings also show that both peptides inhibit the intracellular replication of L. pneumophila, in part through collaboration with the host cell

Les circuits et réseaux d’eau subissent épisodiquement des problèmes de contamination par des microorganismes tels que Legionella pneumophila, conduisant à la dégradation de la qualité microbiologique de l’eau circulante. De nouveaux moyens de traitements doivent être mis en place de façon notamment à limiter l’usage de biocides chimiques. Ce travail de thèse s’inscrit dans cette problématique et a pour objectif d’identifier de nouveaux composés actifs contre L. pneumophila en tenant compte de son comportement et de ses interactions au sein de son microenvironnement. De manière à obtenir des composés produits par des souches bactériennes appartenant à la même niche écologique que L. pneumophila, une campagne de prélèvement d’eau a été réalisée. Un total de 273 isolats environnementaux ont été isolés et testés contre L. pneumophila. Les résultats obtenus indiquent que 178 de ces isolats (65%) présentent une activité anti-Legionella. Quatre souches ont ensuite été sélectionnées (Aeromonas bestiarum SW257, Rahnella aquatilis SW265, Flavobacterium spp. PW52 et Pseudomonas spp PW329) et les composés actifs produits ont été caractérisés. A. bestiarum SW257 produit un peptide anti-Legionella. Flavobacterium sp. PW52 produit un mélange de composés anti-Legionella ayant des propriétés tensioactives, les flavolipides. Pseudomonas sp. PW329 produit des composés organiques volatiles, identifiés par SPME-GC-MS, actifs contre L. pneumophila. Enfin, R. aquatilis SW265 produit un sidérophore à activité anti-Legionella. / Water is essential to sustain life and water sources used for human consumption must be biologically safe, to avoid any risk for health. Indeed, the most common and widespread health risk associated with drinking water are infectious diseases caused by pathogenic microorganisms such as Legionella pneumophila. However, more efforts are needed to control disinfection by-products and minimize people exposure to potentially hazardous chemicals while maintaining adequate disinfection to ensure good water quality. Thus, this work aimed to find natural antibacterial compounds to control L. pneumophila growth using bacteria from freshwater environments. Environmental aquatic bacteria were sampled from five freshwater sources to get a large culturable bacterial collection. A total of 273 bacterial isolates were recovered and screened for their ability to produce anti-Legionella compounds. Among those, 178 (65%) were shown to be active against L. pneumophila. Four strains (Aeromonas bestiarum SW257, Rahnella aquatilis SW265, Flavobacterium spp. PW52, and Pseudomonas spp PW329) were next selected for the characterization of their active compounds. A. bestiarum SW257 produces an anti-Legionella peptide, and Flavobacterium spp PW52 produces a mixture of anti-Legionella compounds with surface active properties, named flavolipids. Finally Pseudomonas sp. PW329 delivers many volatile organic compounds, and R. aquatilis SW26 produces a anti-Legionella siderophore.

Flyer zur am 13. Dezember 2012 in Kraft getretenen Zweiten Verordnung zur Änderung der Trinkwasserverordnung. Hauptbestandteil ist die verpflichtende Untersuchung der Warmwasserinstallation in Mietshäusern auf eine mögliche Belastung mit Legionellen. In öffentlichen Gebäuden wie Schulen, Pflegeeinrichtungen oder Kliniken sind diese Kontrollen längst Pflicht und sichern so die Gesundheit von Patienten und Bewohnern.

Water disinfection systems utilizing electrolytically generated copper:silver ions (200:20 to 400:40 ug/L) and low levels of free chlorine (0.1 to 0.4 mg/L) were evaluated at room (21-23°C) and elevated (39-40°C) temperatures in filtered well water (pH 7.3) for their efficacy in inactivating Legionella pneumophila (ATCC 33155). A contact time of 24 hr was necessary for copper:silver (400:40 ug/L) to achieve a 3 log₁₀ reduction in bacterial numbers at room temperature. As the copper:silver concentration increased to 800:80 ug/L (K = 7.50 x 10⁻³ log₁₀ reduction/min), the inactivation rate significantly (p ≤ 0.05) increased. In water systems at room temperature with and without copper:silver (400:40 ug/L), the inactivation rates significantly increased as the free chlorine concentration increased from 0.1 mg/L (K = 0.397 log₁₀ reduction/min) to 0.4 mg/L (K = 1.047 log₁₀ reduction/min). All disinfection systems, regardless of temperature or free chlorine concentration, showed increased inactivation rates when 400:40 ug/L copper:silver was added; however, this trend was significant only at 0.4 mg/L free chlorine.