Submitted by Lívia Maisa Guiraldi null (livia_maisa_g@hotmail.com) on 2016-07-27T22:27:33Z No. of bitstreams: 1 GUIRALDI LM dissertacao_final.pdf: 5832304 bytes, checksum: abf9a0919d7f06699fed2f2c09bad1b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-07-29T13:59:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 guiraldi_lm_me_bot.pdf: 5832304 bytes, checksum: abf9a0919d7f06699fed2f2c09bad1b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T13:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 guiraldi_lm_me_bot.pdf: 5832304 bytes, checksum: abf9a0919d7f06699fed2f2c09bad1b1 (MD5) Previous issue date: 2016-07-22 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A família Trypanosomatidae inclui agentes etiológicos responsáveis por ocasionar doenças em humanos e demais animais, englobando dezenas de protozoários pertencentes a diferentes gêneros, destacando-se os protozoários representantes dos gêneros Leishmania, causadores das leishmanioses e Trypanosoma, causador de tripanosomíase. Enquanto a transmissão das leishmanioses ocorre devido à picada de insetos fêmeas de flebotomíneos pertencentes ao gênero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo, a transmissão da tripanossomíase depende da espécie de tripanosoma envolvida na infecção, podendo ocorrer pela picada de insetos adultos do gênero Glossina; pelas fezes de triatomíneos, sobretudo do gênero Triatoma e mecanicamente por moscas hematófagas, principalmente do gênero Stomoxys. Além dos humanos, animais domésticos e silvestres podem atuar como reservatórios de tripanosomatídeos, incluindo os primatas não humanos, os quais estão associados com o ciclo enzoótico das leishmanioses e tripanosomíase, sendo que a infecção natural por protozoários do gênero Trypanosoma e Leishmania em mamíferos selvagens é comum na natureza. O objetivo do trabalho foi pesquisar tripanosomatídeos em primatas de cativeiro procedentes do Parque Zoológico Municipal de Bauru – SP por meio de anticorpos contra o parasito e pela amplificação do DNA do protozoário. Para tanto, foram coletadas amostras de sangue de 39 primatas. A técnica molecular de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi aplicada na pesquisa de Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis e Leishmania infantum, utilizando-se primers espécie-específicos, direcionados à região do kDNA dos parasitos, sendo todos os animais negativos. Porém, com a utilização de primers para a região ribossomal (ITS-1), específicos para a família Trypanosomatidae, 37 dos 39 (94,9%) animais foram positivos para Trypanosoma spp. Realizou-se também a prova sorológica de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania braziliensis, Leishmania infantum e Leishmania amazonensis, revelando um animal da espécie Erythrocebus patas (macaco-pata) positivo para Leishmania braziliensis com título 160. Os resultados demonstram que os primatas do zoológico estão susceptíveis à infecção por tripanosomatídeos, alertando-se para a necessidade de busca ativa de vetores flebotomíneos e triatomíneos nos recintos e arredores, como medida preventiva para o risco de infecção aos funcionários e visitantes. / The family Trypanosomatidae includes etiological agents responsible for causing diseases in humans and other animals. There are dozens of protozoa belonging to different genres, especially protozoa representatives of Leishmania genre, which causes leishmaniasis and Trypanosoma, responsible for trypanosomiasis. While the transmission of leishmaniasis is due to the bites of female sand flies belonging to the genus Phlebotomus in the Old World and Lutzomyia in the New World, the transmission of trypanosomiasis depends on the species of trypanosome involved in the infection. It may occurs by the bite of adult insects of the genus Glossina or by the feces of insects, especially by the genre Triatoma and mechanically by bloodsucking flies, especially the Stomoxys genre. In addition to humans, domestic and wild animals can act as trypanosomatids reservoirs, including non-human primates, which are associated with the enzootic cycle of leishmaniasis and trypanosomiasis; the natural infection by Trypanosoma and Leishmania protozoa in wild mammals is common in nature. The aim of the study was to investigate trypanosomatids in captive primates coming from Municipal Zoological Park of Bauru by antibodies against the parasite and the amplification of the DNA of the parasite. For this, blood samples were collected from 39 primates. The molecular technique of Polymerase Chain Reaction (PCR) was applied in research for Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis and Leishmania infantum using species-specific primers directed to the region of kDNA parasites; all animals were negative by this technique. However, with the use of primers for the ribosomal region (ITS-1) specific to Trypanosomatidae family, 37 of 39 (94.9%) animals were positive for Trypanosoma spp. It was also conducted serological evidence by the Immunofluorescente Antibody Test (IFAT) for Leishmania braziliensis, Leishmania infantum e Leishmania amazonensis, revealing one (01) animal Erythrocebus patas (patas monkey) positive for Leishmania braziliensis, with titer 160. The results show that primates from Municipal Zoological Park of Bauru are susceptible to infection by trypanosomatids, alerting the need for active search for sandfly vectors and triatomines in the grounds and surrounding areas, as a preventive measure for the risk of infection for staff and visitors. / FAPESP: 2014/12187-0

Submitted by MIRIAN DOS SANTOS PAIXÃO null (mirianspaixao@bol.com.br) on 2017-08-03T22:22:11Z No. of bitstreams: 1 Tese Final- Mirian dos Santos Paixão.pdf: 3906453 bytes, checksum: ebf95becc548ea4de5ab6f56f8c74757 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-08-04T17:33:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 paixao_ms_dr_bot.pdf: 3906453 bytes, checksum: ebf95becc548ea4de5ab6f56f8c74757 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-04T17:33:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 paixao_ms_dr_bot.pdf: 3906453 bytes, checksum: ebf95becc548ea4de5ab6f56f8c74757 (MD5) Previous issue date: 2017-07-10 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A família Trypanosomatidae é composta por protozoários flagelados da ordem Kinetoplastidae. Os protozoários do gênero Trypanosoma, causadores das tripanossomíases e gênero Leishmania, causadores das leishmanioses, são os parasitos de maior interesse médico e veterinário As tripanossomíases são causadas por diferentes espécies, dentre elas: Trypanosoma cruzi, Trypanosoma. theileri, Trypanosoma equiperdum, Trypanosoma evansi e Trypanosoma vivax, sendo os três últimos de maior importância para os animais de produção, causando prejuízos econômicos para o setor agropecuário. Com o objetivo de avaliar a ocorrência de tripanosomatídeos no municipío de Bauru-SP, região endêmica para leishmaniose, foram avaliados 200 animais, sendo 100 bovinos (Bos taurus) e 100 equídeos (Eqqus spp.), procedentes de áreas urbanas e periurbanas do município. Para entender a distribuição de fatores de riscos na análise espacial, avaliou-se fatores epidemiológicos das leishmanioses, relacionados a seu diagnóstico nos animais de produção avaliados e também em cães e em humanos em diferentes bairros do município de Bauru, visando sua compreensão e integrá-las a estratégias de controle da doença. O diagnóstico dos animais foi baseado em técnicas parasitológicas: esfregaço sanguíneo e hemocultura; sorológicas: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) e moleculares: Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e seqüenciamento. Não foram encontradas formas sugestivas de protozoários em esfregaço sanguíneo, mas a análise de hemocultura de sete animais permitiu a visualização desses protozoários. Às técnicas sorológicas para Leishmania spp., 25% dos bovinos e 16% dos eqüídeos foram reagentes à RIFI e 24% dos equídeos e 6% dos bovinos reagentes ao ELISA. A PCR foi realizada a partir de amostras de sangue, hemocultura, suabes conjuntivais e ectoparasitos, com primers que amplificam a região ITS e HSP70. A partir de amostras de sangue, 23% dos bovinos e 6% dos eqüídeos foram positivos e sete amostras de hemocultura de bovinos foram positivas, com pelo menos um dos primers. As amostras de ectoparasitos e suabes não apresentaram positividade à PCR. Em amostras de bovinos positivas à PCR foram identificadas espécies do gênero Leishmania infantum, Leishmania donovani e Trypanosoma theileri e em amostras de eqüídeos, foram identificadas espécie do gênero Leishmania: Leishmania donovani. Os resultados obtidos às provas parasitológicas, sorológicas e/ou moleculares sugerem a presença de tripanosomatídeos em animais de produção do município no Bauru-SP. No presente estudo, pela análise espacial, sugere-se o papel de proteção dos animais de produção para a ocorrência de leishmaniose em humanos. / The family Trypanosomatidae is composed of flagellate protozoa of the order Kinetoplastida, divided into 10 genera. The Trypanosoma protozoa, which cause trypanosomiasis and Leishmania genus, which cause leishmaniosis, are the parasites of major medical and veterinary interest. Trypanosomiasis is caused by different species, among them: Trypanosoma cruzi, T. theileri, T. equiperdum, T . evansi and T. vivax, which affect production animals, causing economic damages to the agricultural sector. In order to evaluate the occurrence of trypanosomatids in the municipality of Bauru-SP, a region endemic for leishmaniosis, the present study evaluated 200 animals, 100 cattle (Bos taurus) and 100 equidae (Eqqus spp.) from urban and peri-urban areas of the municipality. In the spatial analysis, in order to understand the distribution of risk factors, we evaluated the epidemiological factors of leishmaniasis, related to its diagnosis in the studied animals, in dogs and in humans as well, from different districts of Bauru city, aiming a better comprehension and the strategies for the control of this disease. The diagnosis was based on parasitological techniques: blood smear and blood culture; serological tests: Immunofluorescence Antibody Test (IFAT) and Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA); and molecular: Polymerase Chain Reaction (PCR) and sequencing. No suggestive forms of protozoa were found in blood smears, but the blood culture analysis of seven animals allowed visualization of these protozoa. To the serological techniques for Leishmania spp., 25% of the cattle and 16% of the equines were reactive to IFAT and 24% of the equines and 6% of the cattle reactive to ELISA. PCR was performed from blood samples, blood cultures, conjunctival swabs and ectoparasites, with primers from the ITS and HSP70 region. From blood samples, 23% of cattle and 6% of equines were positive and seven samples of bovine blood culture were positive, with at least one of the primers. Samples of ectoparasites and swabs showed no PCR positivity. Specimens of the genus Leishmania infantum, Leishmania donovani and Trypanosoma theileri were identified in specimens of PCR positive bovines, and species of the genus Leishmania: Leishmania donovani were identified in equine samples. The results obtained for the parasitological, serological and / or molecular tests suggest the presence of trypanosomatids in animals of the municipality of Bauru-SP. In this study, by the spatial analysis, the role of protection of the production animals for the occurrence of leishmaniosis in humans is suggested. / FAPESP: 2014/15808-6

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Trypanosomatid protozoa of Leishmania genus are vector-borne parasites that infect humans causing a wide range of diseases known as Leishmaniasis. Severity of clinical forms generally depends on infecting species, thus its correct identification becomes critical to diagnosis, prognosis and treatment. The current biochemical and molecular methods for typing strains of Leishmania species are mostly effective. Although these tools remain important in the diagnosis and identification of Leishmania, they are insufficient for definitive identification. After isolate 7 clinical parasites strains, some of them belonging to atypical cases of cutaneous/mucocutaneous and visceral Leishmaniasis, we aimed to identify the specie of Leishmania involved in these cases. By combining structural analysis of the body shape, such as presence of flagellum and kinetoplast, we saw that these parasites shared morphologic characteristics with others Tripanosomatidae, however, they were not conclusive for species identification. Since PCR and isozymes assays were unsuccessful to identify 6 out of 7 clinical isolates reported here, we proceeded to determine their genome sequence. Through whole-genome sequencing analysis of parasite strains, we showed that a new pathogenic Trypanosomatid was the etiological agent in clinical cases diagnosed as Leishmaniasis in Brazil. By comparing coding sequences of over orthologous genes within 36 Trypanosomatidae organisms, we found that this new parasite is closely related to Crithidia fasciculata, which parasites exclusively mosquitoes and is considered non-infective to humans. Phenotypic characterization of 2 of these isolates from the skin and bone marrow of the same patient showed that skin isolate was attenuated compared to the bone marrow isolate for survival in the spleen in BALB/c mice. However, both of them were able to infect and induce inflammation in the liver after 4 and 6 weeks post infection. Conversely, only skin isolate was able to survive in dermis, leading to ear swelling, accompanied of presence of parasites in the ear and lymph nodes. Besides that, bone marrow isolate infection in murine macrophages showed higher number of infected cells and also increased number of parasites within macrophages comparing to the skin isolate infection. Furthermore, bone marrow isolate negatively modulated the nitric oxide production in murine macrophages, corroborating with increased infection. Our findings raise concerns about an emerging infectious disease easily confused with Leishmaniasis, opening a research path towards epidemiological questions about identification of vectors, reservoirs, distribution and reassessment of Leishmaniasis cases in Brazil. Due to its proximity to the monoxenous Crithidia genus and the geographical location of atypical Leishmaniasis cases reported here, we proposed naming this new parasite species as Cridia sergipensis. Overall, this research provides a unique knowledge on phenotipic differences associated with diverse pathologies caused by Cridia infection. / Protozoários Tripanossomatídeos do gênero Leishmania são parasitos transmitidos por vetores que infectam hospedeiros vertebrados, causando um amplo espectro de doenças denominadas leishmanioses. A gravidade das formas clínicas depende, dentre outros fatores, da espécie, assim, a identificação correta se torna crítica para o diagnóstico, prognóstico e tratamento. As ferramentas bioquímicas e moleculares disponíveis para caracterizar espécies de Leishmania são, na maioria das vezes, eficientes. Embora essas metodologias sejam importantes para o diagnóstico e identificação de Leishmania, são insuficientes para identificação conclusiva. Após isolar 7 amostras clínicas de parasitos, sendo alguns deles de casos atípicos de leishmaniose cutânea/mucocutânea e visceral, o principal objetivo foi identificar a espécie de Leishmania envolvida. Através da análise estrutural do citoesqueleto, que envolve a presença de flagelo e cinetoplasto, por exemplo, foi observado que esses parasitos compartilham características morfológicas com outros Tripanossomatídeos, entretanto, não se pode afirmar qual a espécie em questão. Uma vez que os resultados da identificação por PCR e eletroforese de isoenzimas foram inconclusivos, foi realizado o sequenciamento total do genoma. O sequenciamento dos isolados clínicos dos pacientes diagnosticados com leishmanioses mostrou que se trata de uma nova espécie patogênica dentro do grupo dos Tripanossomatídeos. Ao comparar as sequências codificantes dos genes ortólogos de 36 Tripanossomatídeos, foi observado que esses parasitos são intimamente relacionados com Crithidia fasciculata, parasito exclusivo de mosquitos, e considerado não patogênico para humanos. A caracterização fenotípica de 2 desses isolados clínicos, sendo um deles isolado da pele e outro da medula óssea do mesmo paciente mostrou que o isolado da pele não foi capaz de estabelecer doença no baço de camundongos BALB/c infectados. Por outro lado, ambos os isolados infectaram e induziram reação inflamatória no fígado dos animais após 4 e 6 semanas de infecção. No entanto, apenas o isolado da pele foi capaz de sobreviver na derme dos camundongos, induzindo inflamação local com presença de parasitos na orelha e linfonodos. Além disso, a infecção com o isolado da medula óssea em macrófagos murinos exibiu um maior número de células infectadas e maior número de amastigotas dentro das células, comparada ao da pele. Adicionalmente, o isolado da medula óssea foi capaz de modular negativamente a produção de óxido nítrico em macrófagos murinos, corroborando com o aumento da infecção. Essas descobertas levantam preocupações sobre uma doença infecciosa emergente facilmente confundida com leishmaniose, abrindo caminhos para a pesquisa nos campos epidemiológicos, de vetores, reservatórios, distribuição e reavaliação de casos de leishmaniose. Devido a proximidade com os parasitos do gênero Crithidia e a localização geográfica de onde foram isolados, a nomenclatura de Cridia sergipensis foi proposta para agrupar essa nova espécie. O presente estudo contribui também para o conhecimento das diferenças fenotípicas associadas com as diversas patologias causadas pela infecção com Cridia. / Aracaju

La leishmaniose à Leishmania infantum est une zoonose transmise de mammifère à mammifère par la piqûre d'un insecte vecteur, le phlébotome femelle. S'il est classiquement décrit la leishmaniose viscérale avec la triade classique fièvre, pâleur et splénomégalie, de nombreuses formes cliniques peuvent être associées à ce parasite. Le portage asymptomatique est la forme la plus fréquente et la plus répandue dans l'Ancien Monde ou le Nouveau Monde. Entre la leishmaniose viscérale et le portage asymptomatique, plusieurs formes cliniques sont présentes. Ainsi certains sujets vont exprimer la leishmaniose sous forme d'adénopathies isolées. Ces formes sont intermédiaires entre une expression pauci symptomatique et une leishmaniose viscérale larvée. Alors que L. infantum n'est pas classiquement retrouvé dans des formes muqueuses, des cas ont été récemment décrits. Ces formes muqueuses isolées ne sont pas rares puisque sur les 3 CHU Marseille, Montpellier et Nice, entre 1997 et 2009, 10 cas de leishmaniose muqueuse à L. infantum ont été diagnostiquées principalement chez des sujets immunodéprimés. Il est important de faire le diagnostic de ces formes cliniques particulières puisqu'elles ont pour diagnostic différentiel des néoplasies (lymphome pour la première et néoplasie de la sphère ORL pour la seconde). Afin d'appréhender le rôle du parasite dans l'expression clinique, il a été réalisé le typage par les microsatellites de neuf souches isolées de sujets porteurs asymptomatiques. Il s'avère que ces neuf souches sont très peu polymorphes et que sept d'entre elles possèdent un génotype unique. / Leishmaniasis due to Leishmania infantum is a zoonotic disease transmitted from mammal to mammal through the bite of an insect vector the sandfly female. Beside the classical triad of visceral leishmaniasis symptoms: fever, pallor and splenomegaly, many clinical forms could be associated with this parasite infection. Asymptomatic carriage of L. infantum is the most common and the most widespread in the Old World and New World. Many other clinical forms are present and some subjects will develop only isolated lymphadenopathy. These forms are intermediate between pauci symptomatic and visceral leishmaniasis forms. Whereas L. infantum is not typically associated with mucosal forms, several cases have been described. Indeed, in the 3 academic hospitals of Marseille, Montpellier and Nice from 1997 to 2009, 10 cases were revealed mainly in immunocompromised patients. To understand the role of parasite in clinical expression, nine strains isolated from asymptomatic carriers were genotyped using microsatellite. The nine strains have few polymorphisms and seven of them are identical with a unique genotype. In addition, those strains are very different from strains of HIV-positive subjects. If the strains genetic appears to have a role in the clinical expression of the disease, the environment in which individuals live in endemic areas is associated with an excess of risk to develop visceral leishmaniasis. While in Marseille, cases of visceral leishmaniasis occur in an urban environment, they take place in Nice in a rural environment, as it is classically described. To investigate differences between parasite strains form Nice and Marseille studies with microsatellites are ongoing.

As leishmanioses americanas são zoonoses em que o homem é um hospedeiro acidental, nas quais várias espécies de Leishmania, de vetores e reservatórios (silvestres, sinantrópicos ou domésticos) estão envolvidas. Com a destruição da cobertura vegetal, várias regiões do Brasil vêm registrando mudanças no seu quadro epidemiológico, frequentemente envolvendo transmissão peridomiciliar tanto na leishmaniose visceral americana (LVA), tendo como agente etiológico a Leishmania (L.) infantum chagasi, como a leishmaniose tegumentar americana (LTA), com várias espécies de Leishmania atuando como agentes. No município de São Paulo casos autóctones de LTA têm sido registrados nas proximidades da Serra Cantareira onde vetores estão presentes, assim como em vários parques públicos. A LVA tem como principal vetor a Lutzomyia longipalpis e o cão doméstico, o principal reservatório e sua ocorrência vem se expandindo através do território brasileiro. O Parque Estadual do Jaraguá está localizado no município de São Paulo em área de confluência de rodovias que percorrem a área de expansão da LVA ou recebem fluxo de veículos destas rodovias. Tendo-se presente o panorama acima, este estudo investigou a fauna flebotomínea no Parque Jaraguá, quanto à diversidade e abundância das espécies, considerando ambientes impactados em maior ou menor grau, assim como a presença de infecção natural pela Leishmania em flebotomíneos, e para a espécie mais abundante, sua distribuição mensal e ritmo horário noturno. As capturas ocorreram de Setembro de 2015 a Dezembro de 2016, utilizando armadilhas do tipo CDC instaladas em oito pontos, e Shannon nas cores branca e preta instaladas na mata em peridomicílio. Fêmeas coletadas nas armadilhas de Shannon e de um dos pontos amostrados com CDC foram dissecadas e submetidas a um PCR para a busca de infecção natural por Leishmania spp. Foram capturados um total de 673 espécimes divididos em 9 gêneros e 15 espécies. Pi. fischeri foi a espécie mais abundante nos diversos pontos de coletas e a única capturada nas armadilhas de Shannon. Destaca-se a coleta de uma fêmea semelhante à de Lu. longipalpis. A armadilha branca possui picos das 19 20h e 00 01h, ao passo que na preta, os picos ocorrerem das 22 23h e das 01 02. Na armadilha branca, a atividade se estendeu durante a noite toda e início da manhã, na preta apenas até no horário das 02-03hr. Nas armadilhas CDC, a média de espécimes de Pi. fischeri por armadilha foi mais elevada no inverno, mas a análise Pearson e de Spearmam não mostrou correlação significante em relação à chuva mensal e temperaturas mínima e máxima no dia da coleta. A investigação da infecção natural obteve resultados negativos para Leishmania spp. Apesar desse resultado, a dominância de Pi. fischeri, espécie antropofílica e suspeita de atuar na transmissão de agente de leishmaniose tegumentar e visceral, assim como a sua presença em mata e peridomicílio, com atividade noturna coincidente com a da população, identifica-se possibilidades e circunstâncias de risco de transmissão leishmanioses na área. A presença de uma fêmea semelhante à de Lu. longipalpis, indica a necessidade de mais estudos para confirmação da espécie e avaliação de risco de instalação da LVA nessa área do município / American leishmaniases are zoonoses in which several species of Leishmania, vectors and reservoirs (wild, synanthropic or domestic) are involved, and the man is considered an accidental host. With the destruction of native vegetation, several Brazilian regions have been registering changes in the epidemiological profile of these zoonoses which often involve peridomestic transmission in both American visceral leishmaniasis (AVL) and American cutaneous leishmaniasis (ACL). In the city of São Paulo autochthonous cases of ACL have been recorded in areas close to the reserve of the Serra Cantareira and state parks with residual forests where vectors have been registered. AVL, having Lutzomyia longipalpis as main vector and domestic dogs as main reservoirs, is spreading through the Brazilian territory. The Jaraguá State Park is located in the municipality of São Paulo in an area of confluence of highways that cross the route of expansion of this disease or receive vehicular flows from these highways. Considering this scenery, this study investigated the phlebotomine fauna in the Jaraguá state Park, regarding the diversity and abundance of the species, taking account the degree of impact in the vegetation coverture, as well as the presence of natural infection by Leishmania spp. in sand flies, and also the monthly distribution and nocturnal rhythm of the most abundant species. Captures were undertaken from September 2015 to December 2016, using CDC light traps installed at eight points, and Shannon traps in the white and black colors installed in the forest and peridomicile. Females collected in the Shannon traps and of one of the CDC trap were dissected and submitted to PCR for investigation of natural infection by Leishmania spp. A total of 673 specimens were collected, divided into 9 genera and 15 species. Pintomyia fischeri was the most abundant species at several collection points and the only one caught in Shannon traps. The collection of a female similar to that of Lutzomyia longipalpis is highlighted. The white trap has peaks from 7-20 p.m. and 10:00 p.m., while in black, peaks occur from 22-23 p.m. and 1-2 p.m. In the white trap, activity lasted all night and early morning, and in the black only until 02-03hr. In the CDC traps, the average of specimens of Pi. fischeri per trap was higher in the winter, but the Pearson and Spearman analysis showed no significant correlation with monthly rainfall and minimum and maximum temperatures on the day of collection. The investigation of the natural infection resulted negative for Leishmania sp. Despite this result, the dominance of Pi. fischeri, an anthropophilic species and suspected of acting on the transmission of ACL agent, as well as its presence in forest and peridomicile, with nocturnal activity coinciding with that of the human population, identifies possibilities and circumstances of risk of leishmaniasis transmission in the area . The presence of a female similar to that of Lu. longipalpis indicates the need for further studies to identify correctly the species and assess the risk of LVA installation in this area of the municipality of São Paulo and other neighbors

Leishmaniases is a group of diseases caused by parasites of the genus Leishmania. The estimated number of deaths from visceral leishmaniases ranges from 20,000 to 50,000 annually. The most common treatment over the past 60 years has been pentavalent antimonials. Besides the doubtful effectiveness, they present several disadvantages such as the need for parenteral administration, large doses, long treatment, severe toxicity and parasite resistance. Buparvaquone (BPQ), a drug used for veterinary treatment of theileriosis, showed promising activity against Leishmania spp. However, due to its low aqueous solubility and bioavailability, it has failed in in vivo tests. The use of nanotechnologies has the potential to overcome these drawbacks due to the following advantages: increase in drug water-solubility, increase in therapeutic efficacy and treatment toxicity reduction. Therefore, the present work aimed the development, optimization, physical-chemical evaluation and in vitro performances of nanostructured lipid carriers (NLC) for BPQ encapsulation. The NLC preparation was performed by high pressure homogenization, and surface response and factorial design were applied to formulation optimization. In vitro dissolution profiles were evaluated in phosphate buffer pH 7.4 with tween 80 0.07% w/v or sodium dodecyl sulfate 1% w/v and simulated body fluid pH 7.4. Cytotoxicity was evaluated in mouse peritoneal macrophages and leishmanicidal activity in L. infantum amastigotes. Six optimized NCL were prepared and they showed solubility improvement from 1.5- fold to 611-fold when compared with free BPQ, depending on the formulation and medium. Dissolution profiles showed the NLC formulation suitability for BPQ regarding oral administration, the release could reach 83.29% of a 4mg dose in 30 minutes for formulation of 175.1 nm, while the free drug could be dissolved only 2.89% of the same dose after 4 hours. Moreover, formulation of 230.7 nm showed 81.42% of drug release in in phosphate buffer pH 7.4 with dodecyl sulfate 1.0% w/v after 30 minutes, while BPQ did not dissolved. Cytotoxicity assay showed the safety of all formulations. The iv CC50 values were close to 500 µM, while the IC50 against amastigotes was only 456.5 nM for free BPQ. Developed NLCs showed an increase in IC50 from 2.0 to 3.1-fold when compared to free drug in the in vitro leishmanicidal evaluation. Therefore, the NLC containing BPQ are a promising alternative for the treatment of leishmaniases as oral and parenteral drug dosage forms. Additionally, they have a potential use for lymphatic targeted drug delivery, which can be an innovative approach for this neglected disease. / Leishmanioses são um grupo de doenças causadas por parasitas do gênero Leishmania. O número estimado de óbitos por leishmaniose visceral varia entre 20.000 e 50.000 por ano. O tratamento mais comum nos últimos 60 anos tem sido os antimônios pentavalentes. Além da eficácia duvidosa, eles apresentam várias desvantagens, como a necessidade de administração parenteral, altas doses, tratamento prolongado, toxicidade severa e resistência parasitária. Buparvaquona (BPQ), um fármaco usado para tratamento veterinário da teileriose, mostrou atividade promissora contra Leishmania donovani. No entanto, devido à sua baixa solubilidade e biodisponibilidade aquosa, falhou em testes in vivo. O uso das nanotecnologias tem o potencial de superar esses obstáculos devido às seguintes vantagens: aumento da solubilidade em água, aumento da eficácia terapêutica e redução da toxicidade do tratamento. Portanto, o presente trabalho objetivou o desenvolvimento, otimização, avaliação físico-química e avaliação do desempenho in vitro de carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) para o encapsulação da BPQ. A preparação do NLC foi realizada por homogeneização de alta pressão e superfície de resposta e planejamento fatorial foram aplicados à otimização das formulações. Os perfis de dissolução in vitro foram avaliados em tampão fosfato pH 7.4 com tween 80 a 0.07% p/v ou dodecilsulfato de sódio 1.0% p/v e fluido corporal simulado pH 7.4. A citotoxicidade foi avaliada em macrófagos peritoneais de camundongos e atividade leishmanicida em amastigotas de L. infantum. Foram preparados quatro NCL otimizados e mostraram melhora da solubilidade de 1,5 a 611 vezes quando comparado com a BPQ livre, dependendo da formulação e do meio. Os perfis de dissolução mostraram a adequação da formulação NLC para BPQ em relação à administração oral. A dissolução pode atingir 83,29% de uma dose de 4.0 mg em 30 minutos para a formulação de 175,1 nm, enquanto o fármaco livre dissolveu apenas vi 2,89% da mesma dose após 4 horas. Além disso, a formulação de 230,7 nm mostrou 81,42% de liberação do fármaco em tampão fosfato pH 7.4 com dodecil sulfato de sódio 1.0% p/v após 30 minutos, enquanto o BPQ não se dissolveu. O teste de citotoxicidade mostrou a segurança de todas as formulações. Os valores CC50 foram próximos de 500 µM, enquanto o IC50 em amastigotas foi de apenas 456,5 nM para BPQ livre. Os NLC desenvolvidos mostraram um aumento no IC50 de 2,0 a 3,1 vezes quando comparado ao;fármaco livre na avaliação leishmanicida in vitro. Logo, as NLC contendo BPQ são uma alternativa promissora para o tratamento de leishmanioses como formas farmacêuticas oral e parenteral. Além disso, eles têm um uso potencial para a sítio-específico ao sistema linfático, o que pode ser uma abordagem inovadora para esta doença negligenciada.

As leishmanioses americanas são zoonoses em que o homem é um hospedeiro acidental, nas quais várias espécies de Leishmania, de vetores e reservatórios (silvestres, sinantrópicos ou domésticos) estão envolvidas. Com a destruição da cobertura vegetal, várias regiões do Brasil vêm registrando mudanças no seu quadro epidemiológico, frequentemente envolvendo transmissão peridomiciliar tanto na leishmaniose visceral americana (LVA), tendo como agente etiológico a Leishmania (L.) infantum chagasi, como a leishmaniose tegumentar americana (LTA), com várias espécies de Leishmania atuando como agentes. No município de São Paulo casos autóctones de LTA têm sido registrados nas proximidades da Serra Cantareira onde vetores estão presentes, assim como em vários parques públicos. A LVA tem como principal vetor a Lutzomyia longipalpis e o cão doméstico, o principal reservatório e sua ocorrência vem se expandindo através do território brasileiro. O Parque Estadual do Jaraguá está localizado no município de São Paulo em área de confluência de rodovias que percorrem a área de expansão da LVA ou recebem fluxo de veículos destas rodovias. Tendo-se presente o panorama acima, este estudo investigou a fauna flebotomínea no Parque Jaraguá, quanto à diversidade e abundância das espécies, considerando ambientes impactados em maior ou menor grau, assim como a presença de infecção natural pela Leishmania em flebotomíneos, e para a espécie mais abundante, sua distribuição mensal e ritmo horário noturno. As capturas ocorreram de Setembro de 2015 a Dezembro de 2016, utilizando armadilhas do tipo CDC instaladas em oito pontos, e Shannon nas cores branca e preta instaladas na mata em peridomicílio. Fêmeas coletadas nas armadilhas de Shannon e de um dos pontos amostrados com CDC foram dissecadas e submetidas a um PCR para a busca de infecção natural por Leishmania spp. Foram capturados um total de 673 espécimes divididos em 9 gêneros e 15 espécies. Pi. fischeri foi a espécie mais abundante nos diversos pontos de coletas e a única capturada nas armadilhas de Shannon. Destaca-se a coleta de uma fêmea semelhante à de Lu. longipalpis. A armadilha branca possui picos das 19 20h e 00 01h, ao passo que na preta, os picos ocorrerem das 22 23h e das 01 02. Na armadilha branca, a atividade se estendeu durante a noite toda e início da manhã, na preta apenas até no horário das 02-03hr. Nas armadilhas CDC, a média de espécimes de Pi. fischeri por armadilha foi mais elevada no inverno, mas a análise Pearson e de Spearmam não mostrou correlação significante em relação à chuva mensal e temperaturas mínima e máxima no dia da coleta. A investigação da infecção natural obteve resultados negativos para Leishmania spp. Apesar desse resultado, a dominância de Pi. fischeri, espécie antropofílica e suspeita de atuar na transmissão de agente de leishmaniose tegumentar e visceral, assim como a sua presença em mata e peridomicílio, com atividade noturna coincidente com a da população, identifica-se possibilidades e circunstâncias de risco de transmissão leishmanioses na área. A presença de uma fêmea semelhante à de Lu. longipalpis, indica a necessidade de mais estudos para confirmação da espécie e avaliação de risco de instalação da LVA nessa área do município / American leishmaniases are zoonoses in which several species of Leishmania, vectors and reservoirs (wild, synanthropic or domestic) are involved, and the man is considered an accidental host. With the destruction of native vegetation, several Brazilian regions have been registering changes in the epidemiological profile of these zoonoses which often involve peridomestic transmission in both American visceral leishmaniasis (AVL) and American cutaneous leishmaniasis (ACL). In the city of São Paulo autochthonous cases of ACL have been recorded in areas close to the reserve of the Serra Cantareira and state parks with residual forests where vectors have been registered. AVL, having Lutzomyia longipalpis as main vector and domestic dogs as main reservoirs, is spreading through the Brazilian territory. The Jaraguá State Park is located in the municipality of São Paulo in an area of confluence of highways that cross the route of expansion of this disease or receive vehicular flows from these highways. Considering this scenery, this study investigated the phlebotomine fauna in the Jaraguá state Park, regarding the diversity and abundance of the species, taking account the degree of impact in the vegetation coverture, as well as the presence of natural infection by Leishmania spp. in sand flies, and also the monthly distribution and nocturnal rhythm of the most abundant species. Captures were undertaken from September 2015 to December 2016, using CDC light traps installed at eight points, and Shannon traps in the white and black colors installed in the forest and peridomicile. Females collected in the Shannon traps and of one of the CDC trap were dissected and submitted to PCR for investigation of natural infection by Leishmania spp. A total of 673 specimens were collected, divided into 9 genera and 15 species. Pintomyia fischeri was the most abundant species at several collection points and the only one caught in Shannon traps. The collection of a female similar to that of Lutzomyia longipalpis is highlighted. The white trap has peaks from 7-20 p.m. and 10:00 p.m., while in black, peaks occur from 22-23 p.m. and 1-2 p.m. In the white trap, activity lasted all night and early morning, and in the black only until 02-03hr. In the CDC traps, the average of specimens of Pi. fischeri per trap was higher in the winter, but the Pearson and Spearman analysis showed no significant correlation with monthly rainfall and minimum and maximum temperatures on the day of collection. The investigation of the natural infection resulted negative for Leishmania sp. Despite this result, the dominance of Pi. fischeri, an anthropophilic species and suspected of acting on the transmission of ACL agent, as well as its presence in forest and peridomicile, with nocturnal activity coinciding with that of the human population, identifies possibilities and circumstances of risk of leishmaniasis transmission in the area . The presence of a female similar to that of Lu. longipalpis indicates the need for further studies to identify correctly the species and assess the risk of LVA installation in this area of the municipality of São Paulo and other neighbors

Leishmaniases is a group of diseases caused by parasites of the genus Leishmania. The estimated number of deaths from visceral leishmaniases ranges from 20,000 to 50,000 annually. The most common treatment over the past 60 years has been pentavalent antimonials. Besides the doubtful effectiveness, they present several disadvantages such as the need for parenteral administration, large doses, long treatment, severe toxicity and parasite resistance. Buparvaquone (BPQ), a drug used for veterinary treatment of theileriosis, showed promising activity against Leishmania spp. However, due to its low aqueous solubility and bioavailability, it has failed in in vivo tests. The use of nanotechnologies has the potential to overcome these drawbacks due to the following advantages: increase in drug water-solubility, increase in therapeutic efficacy and treatment toxicity reduction. Therefore, the present work aimed the development, optimization, physical-chemical evaluation and in vitro performances of nanostructured lipid carriers (NLC) for BPQ encapsulation. The NLC preparation was performed by high pressure homogenization, and surface response and factorial design were applied to formulation optimization. In vitro dissolution profiles were evaluated in phosphate buffer pH 7.4 with tween 80 0.07% w/v or sodium dodecyl sulfate 1% w/v and simulated body fluid pH 7.4. Cytotoxicity was evaluated in mouse peritoneal macrophages and leishmanicidal activity in L. infantum amastigotes. Six optimized NCL were prepared and they showed solubility improvement from 1.5- fold to 611-fold when compared with free BPQ, depending on the formulation and medium. Dissolution profiles showed the NLC formulation suitability for BPQ regarding oral administration, the release could reach 83.29% of a 4mg dose in 30 minutes for formulation of 175.1 nm, while the free drug could be dissolved only 2.89% of the same dose after 4 hours. Moreover, formulation of 230.7 nm showed 81.42% of drug release in in phosphate buffer pH 7.4 with dodecyl sulfate 1.0% w/v after 30 minutes, while BPQ did not dissolved. Cytotoxicity assay showed the safety of all formulations. The iv CC50 values were close to 500 µM, while the IC50 against amastigotes was only 456.5 nM for free BPQ. Developed NLCs showed an increase in IC50 from 2.0 to 3.1-fold when compared to free drug in the in vitro leishmanicidal evaluation. Therefore, the NLC containing BPQ are a promising alternative for the treatment of leishmaniases as oral and parenteral drug dosage forms. Additionally, they have a potential use for lymphatic targeted drug delivery, which can be an innovative approach for this neglected disease. / Leishmanioses são um grupo de doenças causadas por parasitas do gênero Leishmania. O número estimado de óbitos por leishmaniose visceral varia entre 20.000 e 50.000 por ano. O tratamento mais comum nos últimos 60 anos tem sido os antimônios pentavalentes. Além da eficácia duvidosa, eles apresentam várias desvantagens, como a necessidade de administração parenteral, altas doses, tratamento prolongado, toxicidade severa e resistência parasitária. Buparvaquona (BPQ), um fármaco usado para tratamento veterinário da teileriose, mostrou atividade promissora contra Leishmania donovani. No entanto, devido à sua baixa solubilidade e biodisponibilidade aquosa, falhou em testes in vivo. O uso das nanotecnologias tem o potencial de superar esses obstáculos devido às seguintes vantagens: aumento da solubilidade em água, aumento da eficácia terapêutica e redução da toxicidade do tratamento. Portanto, o presente trabalho objetivou o desenvolvimento, otimização, avaliação físico-química e avaliação do desempenho in vitro de carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) para o encapsulação da BPQ. A preparação do NLC foi realizada por homogeneização de alta pressão e superfície de resposta e planejamento fatorial foram aplicados à otimização das formulações. Os perfis de dissolução in vitro foram avaliados em tampão fosfato pH 7.4 com tween 80 a 0.07% p/v ou dodecilsulfato de sódio 1.0% p/v e fluido corporal simulado pH 7.4. A citotoxicidade foi avaliada em macrófagos peritoneais de camundongos e atividade leishmanicida em amastigotas de L. infantum. Foram preparados quatro NCL otimizados e mostraram melhora da solubilidade de 1,5 a 611 vezes quando comparado com a BPQ livre, dependendo da formulação e do meio. Os perfis de dissolução mostraram a adequação da formulação NLC para BPQ em relação à administração oral. A dissolução pode atingir 83,29% de uma dose de 4.0 mg em 30 minutos para a formulação de 175,1 nm, enquanto o fármaco livre dissolveu apenas vi 2,89% da mesma dose após 4 horas. Além disso, a formulação de 230,7 nm mostrou 81,42% de liberação do fármaco em tampão fosfato pH 7.4 com dodecil sulfato de sódio 1.0% p/v após 30 minutos, enquanto o BPQ não se dissolveu. O teste de citotoxicidade mostrou a segurança de todas as formulações. Os valores CC50 foram próximos de 500 µM, enquanto o IC50 em amastigotas foi de apenas 456,5 nM para BPQ livre. Os NLC desenvolvidos mostraram um aumento no IC50 de 2,0 a 3,1 vezes quando comparado ao;fármaco livre na avaliação leishmanicida in vitro. Logo, as NLC contendo BPQ são uma alternativa promissora para o tratamento de leishmanioses como formas farmacêuticas oral e parenteral. Além disso, eles têm um uso potencial para a sítio-específico ao sistema linfático, o que pode ser uma abordagem inovadora para esta doença negligenciada.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-12-26T18:25:25Z No. of bitstreams: 1 joao_r_o_farias_ioc_bcm_0004_2009.pdf: 3748757 bytes, checksum: 6590fd1d1afea051ff70fc2fba034b09 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-26T18:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joao_r_o_farias_ioc_bcm_0004_2009.pdf: 3748757 bytes, checksum: 6590fd1d1afea051ff70fc2fba034b09 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / As leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania transmitidos pela picada de flebotomíneos infectados. Os atuais métodos de combate a estas moléstias têm se mostrado ineficazes e maiores conhecimentos sobre a interação Leishmania-flebotomíneos são necessários para o desenvolvimento de novas formas de controle. Com o emprego da técnica de amostragem diferencial por RT-PCR (DDRT-PCR), foi encontrado anteriormente em nosso laboratório um cDNA codificante para uma quitinase intestino-específica de Lutzomyia longipalpis, nomeada LlChit1A. Foi visto que este produto do gene LlChit1 possui altos níveis de transcrição em fêmeas adultas 3 dias após a alimentação sangüínea, indicando um possível papel na degradação da matriz peritrófica (MP). Neste trabalho, um fragmento do LlChit1A foi usado para sondar uma biblioteca genômica de L. longipalpis, possibilitando o isolamento de um clone contendo o gene codificador desta enzima, que recebeu o nome LlChit1G. A amplificação por PCR e seqüenciamento deste gene revelaram a presença de 4 introns que interrompem a seqüência codificante para a LlChit1A. Foi visto por RT-PCR que o gene LlChit1 também está ativo em larvas, transcrevendo mais duas novas formas de splicing, nomeadas LlChit1B e LlChit1C. Estes dois novos transcritos possuem códons de parada, introduzidos a partir do quarto íntron, que interrompem a tradução do domínio de ligação à quitina codificado pelo último éxon. As possíveis novas enzimas codificadas devem atuar na digestão de alimentos ricos em quitina de maneira similar ao proposto para outras quitinases de inseto sem este domínio funcional. A região flanqueadora 5’ (RF5’) do clone genômico também foi amplificada por PCR e seqüenciada, evidenciando um possível promotor mínimo. Curiosamente, um gene ortólogo de Phlebotomus papatasi contém o começo da seqüência UTR 5` idêntica ao começo do RNAm da quitinase de L. longipalpis. Isso pode ser um indício de um possível sistema promotor conservado em flebotomíneos e com possível atuação na regulação da espessura da MP. Através da técnica de PCR invertido foi amplificada e seqüenciada uma região a montante do gene, não presente no LlChit1G. Análises de bioinformática indicaram a presença de um possível envolvimento de ecdisona no controle deste promotor. Através da anotação de ESTs codificantes para a seqüência completa ou parcial de proteínas similares a quitinases de L. longipalpis e P. papatasi foi possível identificar possíveis ortólogos de glicosideohidrolases da família 18. As seqüências primárias correspondentes ao domínio catalítilico encontrado nesta família foram comparadas por filogenia a seqüências já publicadas. / Leishmaniasis is a disease caused by Leishmania protozoa transmitted by the bite of infected sand flies. Current methods used to combat this illness have been shown to be inefficient, and better knowledge of aspects related to Leishmania-sand fly interaction are necessary for the development of new controlling methods. A cDNA codifying for a midgut-specific chitinase of Lutzomyia longipalpis, nominated LlChit1A, was previously identified in our laboratory using differential display RT-PCR (DDRT-PCR). It was found that the LlChit1 gene had high transcription levels 3 days after blood meal, which indicated a putative role on peritrophic matrix (PM) degradation. A LlChit1A fragment, was used for screening a L. longipalpis genomic library, which led to the isolation of a clone called LlChit1G, containing the chitinase gene. The PCR amplification and sequencing of this gene revealed 4 introns which interrupt the LlChit1A cDNA sequence. RT-PCR showed that the LlChit1 gene is also expressed in larvae where it transcribed two new forms of splicing, called LlChit1B and LlChit1C. These two transcripts possess early stop codons in the last intron, interrupting the translation of the chitin binding domain (CBD) codified by the last exon. These putative enzymes possibly act in the digestion of chitin rich food, as previously observed for others insect chitinases without this functional domain. The flanking region 5’ (FR5’) present in the genomic clone was also sequenced, evidencing a possible minimum promoter. Curiously, the initial part of this 5’ UTR sequence was identical to the initial part of a Phlebotomus papatasi orthologous gene. This may be an indication of a promoter system conserved among sandflies, with possible performance in the control of PM thickness, which seems to occur exactly at the moment and place of Leishmania attachment to the epithelium of the midgut. The use of inverted PCR allowed the sequencing of a region upstream the chitinase gene, which is not present in the genomic clone. Bioinformatics analyzes suggested the participation of ecdysone on the expression control of this gene. The annotation for ESTs codifying complete and partial chitinase like proteins from L. longipalpis and P. papatasi provided the identification of 4 new genes from the first specie and 5 new genes from the later. These genes codify for protein conserved domains with high similarity to the catalytic domain of family 18 glycosylhydrolases. Phylogenetic trees were also constructed.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-04-18T18:08:55Z No. of bitstreams: 1 Ana Paula Almeida de Souza Validação de proteinas...pdf: 2348379 bytes, checksum: 16135e91d8da506bd6d51b00312ae853 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-18T18:08:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ana Paula Almeida de Souza Validação de proteinas...pdf: 2348379 bytes, checksum: 16135e91d8da506bd6d51b00312ae853 (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz / O controle das populações de flebotomíneos, a contenção das epidemias nas fases iniciais e a facilitação do diagnóstico precoce dos indivíduos parasitados são estratégias traçadas pela OMS para a vigilância e controle da leishmaniose. Neste contexto, os testes sorológicos utilizando tanto o sonicado de glândula salivar (SGS) dos flebotomíneos quanto o antígeno solúvel de Leishmania (SLA) são importantes ferramentas para o controle/diagnóstico das Leishmanioses. No entanto, os testes realizados a partir da utilização de antígenos obtidos de frações brutas, apesar de apresentarem alta sensibilidade, alguns destes antígenos apresentam reação cruzada com epítopos compartilhados por outros patógenos/vetores. Além disso, o preparo dos antígenos não tem adequada reprodutibilidade devido a grande dificuldade de obtenção e/ou padronização destes. No presente trabalho, objetivamos identificar biomarcadores para a vigilância e o controle das Leishmanioses, utilizando proteínas recombinantes da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores de exposição ao vetor e proteínas recombinantes da Leishmania para obtenção de um diagnóstico sorológico mais preciso para a Leishmaniose Tegumentar humana. Numa primeira etapa, foram realizados testes imunoenzimáticos contra as proteínas recombinante da saliva do vetor L. longipalpis (rLJM11 e rLJM17) para estimar a positividade anti-saliva num pequeno número de soros de crianças de uma área endêmica para Leishmaniose Visceral. Foi observado que os soros que reconhecem o SGS do L. longipalpis também reconhecem em diferentes proporções as proteínas rLJM17 e rLJM11. Ademais, as proteína recombinantes foram capazes de detectar a soroconversão anti-saliva de soros de uma segunda área endêmica para LV, havendo aumento no reconhecimento quando utilizadas as duas proteínas recombinantes de forma combinada. Além disso, a análise das curvas ROC evidenciou o desempenho superior da combinação das proteínas rLJM17 + rLJM11. Estes dados foram confirmados com a avaliação das proteínas frente um grande painel de 1.077 amostras de soro de indivíduos de uma outra área endêmica para LV. Nesta etapa, nossos resultados indicam que as proteínas rLJM11+rLJM17 representam uma ferramenta epidemiológica promissora que pode auxiliar na implementação de medidas de controle contra a Leishmaniose Visceral. Numa segunda etapa, testes imunoenzimáticos foram realizados contra uma série de proteínas recombinantes da Leishmania (HSP70, H2A, H2B, H3, H4 e KMP11) a fim de selecionarmos proteínas antigênicas contra soros de pacientes com Leishmaniose Cutânea (LC) e Leishmaniose Mucosa (LM) e que apresentassem elevada especificidade quando testadas contra soros de indivíduos com outras patologias (doença de Chagas, Lúpus Eritematoso Sistêmico, Hanseníase e Tuberculose). Para avaliar a eficácia das proteínas recombinantes foram utilizadas curvas ROC, possibilitando a seleção de antígenos possivelmente mais eficientes que o SLA no imunodiagnóstico da Leishmaniose. As proteínas recombinantes HSP70 e H2A foram selecionadas por apresentarem elevada sensibilidade, sendo reconhecida por anticorpos dos soros de pacientes com LM e LC respectivamente. Na última etapa dos experimentos, utilizando soros de indivíduos que apresentavam outras patologias, observou-se que a reação cruzada diminui frente aos antígenos recombinantes, especialmente para a rHSP70, quando comparamos à observada para o SLA. Nossos resultados mostram a elevada antigenicidade da rHSP70, sugerindo a possibilidade de utilização desta proteína recombinante para o sorodiagnóstico da Leishmaniose Tegumentar. Neste trabalho foi possível identificar e validar o uso de proteínas recombinantes do parasito e da saliva dos flebotomíneos como biomarcadores para o sorodiagnóstico e avaliação da exposição às leishmanioses. / The population control of sand flies, containment of epidemics in the early stages and facilitating early diagnosis of infected individuals are strategies outlined by WHO for surveillance and control of Leishmaniasis. In this context, serologic tests using both the salivary gland sonicate (SGS) of sandflies as soluble Leishmania antigen (SLA) are important tools for the control / diagnosis of Leishmaniasis. However, tests based on the use of antigens derived from crude fractions, despite showing high sensitivity, some of these antigens cross-react with epitopes shared by other pathogens / vectors. Moreover, the preparation of antigens has adequate reproducibility due to difficulty in obtaining and / or standardization of these. In this study, we aimed to identify biomarkers for the surveillance and control of Leishmaniasis, through use of recombinant proteins from the saliva of sandflies as biomarkers of exposure to vector and through the use of recombinant proteins of Leishmania to get a more accurate serodiagnosis for human leishmaniasis. On the first step, ELISAs were performed against the recombinant protein from the saliva of the vector L. longipalpis (rLJM11 and rLJM17) to estimate the positive anti-saliva on a small number of sera from children from an endemic area for VL. It was observed that the sera that recognize the SGS of L. longipalpis also recognize in different proportions of rLJM17 and rLJM11 proteins. Further, each recombinant protein was able to detect anti-saliva seroconversion in sera from a second endemic area for VL, with increase in recognizing when the two recombinant proteins were used in combination. Furthermore, the ROC analysis showed the superior performance of the combination of rLJM17 + rLJM11, these data confirmed using a large panel of 1077 serum samples from individuals from another endemic area for LV. At this stage, our results indicate that proteins rLJM11 + rLJM17 represent a promising epidemiological tool that can assist in the implementation of control measures against Visceral Leishmaniasis. In a second step, ELISAs were performed against a series of recombinant proteins of Leishmania (HSP70, H2A, H2B, H3, and H4 KMP11) so antigenic proteins were selected against serum from patients with cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL) and that presented high specificity when tested against sera from patients with other diseases (Chagas disease, Systemic Lupus Erythematosus, Leprosy and Tuberculosis). To identify the effectiveness of recombinant proteins, ROC curves were used to select antigens possibly more efficient than SLA. Recombinant proteins HSP70 and H2A were selected for having high sensitivity in recognizing sera from patients with LM and LC respectively. In the last experimental stage using sera from individuals with other pathologies, it was observed that the reduced cross-reactivity against the recombinant antigen, especially for rHSP70 when compared to that observed for the SLA. Our results show the high antigenicity of rHSP70, suggesting the possibility of using this recombinant protein for serodiagnosis of Leishmaniasis. In this work, it was possible to identify and validate the use of recombinant proteins of the parasite and of the saliva of sandflies as biomarkers for serodiagnosis and assessment of exposure to Leishmaniasis.