La tuberculose, maladie très ancienne, est plus que jamais présentée sur la scène sanitaire mondiale avec 9 millions de nouveaux cas par an. Cette maladie, qui demeure une cause majeure de mortalité, est un des problèmes les plus difficiles à résoudre en santé publique et à échelle internationale. Les diverses programmes de lutte, lancés par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), pour prévenir et garantir la guérison des patients tuberculeux, se heurtent à des difficultés qui hypothèquent leur efficacité. En effet, l'expansion du virus de rinimunodéficience humaine (VIII) et son influence néfaste sur la susceptibilité à la tuberculose, l'accroissement rapide de la tuberculose multirésistante, la pauvreté ainsi que la croissance démographique, sont un ensemble de facteurs préjudiciables à l'application des mesures préventives et curatives. Les contextes économiques difficiles conduisant indubitablement au cumul de ces facteurs, ont fait une césure entre les pays riches et les pays pauvres quant à l'incidence et la révolution de la tuberculose à échelle mondiale. Pour atténuer la disparité des résultats des luttes antituberculeuses, les méthodologies employées en épidémiologie de la tuberculose doivent s'inscrire dans une démarche d'efficacité. Les marqueurs moléculaires, indispensables à l'identification et à la classification des souches appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis (MTC) ont chacun des potentialités qui leur sont propres dont il convient de cerner pour une utilisation adéquate dans les études épidémiologiques et phylogénétiques. Le but de cette thèse consiste à extraire des connaissances nouvelles des résultats de génotypage stockées dans les bases de données, connaissances relatives au polymorphisme du support génomique pour estimer la contribution de chaque marqueur dans la classification de MTC. Le recours à différentes méthodes de reconstruction phylogénétique et de modélisation des données fut indispensable. A la lumière des résultats obtenus, cette thèse propose une nouvelle méthodologie de classification, pour rétablissement d'une phylogéographie robuste de MTC en relation avec l'histoire des migrations humaines qui aurait débutée en Afrique subsaharienne. Chaque méthode de génotypage ayant une efficience et un cout propres, qu'il convient de mesurer par rapport aux moyens disponibles et aux résultats escomptes, il est donc intéressant de renforcer la connaissance des marqueurs et de proposer différentes alternatives menant à la classification des mycobactéries. Ainsi, les résultats obtenus dans cette thèse apportent plus de cohérence aux solutions proposées pour la caractérisation des clones de MTC circulant dans le monde. / Tuberculosis, very old disease, is more than ever presented on the global health scene with 9 million new cases per year. This disease, which remains a major cause of mortality is one of the most intractable public health and international issues. The various control programs, launched by the World Health Organization (WHO) to prevent and guarantee the cure of tuberculosis patients face difficulties that undermine their effectiveness. Indeed, the expansion of human virus rinimunodéficience (VIII) and its negative influence on susceptibility to tuberculosis, the rapid growth of multidrug-resistant tuberculosis, poverty and population growth, are a set of factors detrimental to application of preventive and curative measures. The difficult economic circumstances undoubtedly leading to accumulation of these factors have a break between rich and poor countries about the impact and the revolution of tuberculosis worldwide. To address the disparity of the results of tuberculosis struggles, the methodologies used in epidemiology of tuberculosis must be part of a process efficiency. Molecular indispensable to the identification and classification of strains belonging to the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) markers each have their own potentials that need to be identified for proper use in epidemiological and phylogenetic studies. The purpose of this thesis is to extract new knowledge of the results of genotyping data stored in databases, knowledge of the polymorphism of genomic carrier to estimate the contribution of each marker in the classification of TCM. The use of different methods of phylogenetic reconstruction and modeling data was essential. In light of the results obtained, the thesis proposes a new classification methodology for a robust recovery phylogeography of TCM in connection with the history of human migration have started in sub-Saharan Africa. Each genotyping method with cost efficiency and equity, should be measured in relation to the resources available and discounts results, it is interesting to strengthen the knowledge of markers and propose alternatives leading to the classification of mycobacteria. Thus, the results obtained in this thesis bring more coherence to the proposed characterization of clones MTC circulating worldwide solutions.

La leishmaniose à Leishmania infantum est une zoonose transmise de mammifère à mammifère par la piqûre d'un insecte vecteur, le phlébotome femelle. S'il est classiquement décrit la leishmaniose viscérale avec la triade classique fièvre, pâleur et splénomégalie, de nombreuses formes cliniques peuvent être associées à ce parasite. Le portage asymptomatique est la forme la plus fréquente et la plus répandue dans l'Ancien Monde ou le Nouveau Monde. Entre la leishmaniose viscérale et le portage asymptomatique, plusieurs formes cliniques sont présentes. Ainsi certains sujets vont exprimer la leishmaniose sous forme d'adénopathies isolées. Ces formes sont intermédiaires entre une expression pauci symptomatique et une leishmaniose viscérale larvée. Alors que L. infantum n'est pas classiquement retrouvé dans des formes muqueuses, des cas ont été récemment décrits. Ces formes muqueuses isolées ne sont pas rares puisque sur les 3 CHU Marseille, Montpellier et Nice, entre 1997 et 2009, 10 cas de leishmaniose muqueuse à L. infantum ont été diagnostiquées principalement chez des sujets immunodéprimés. Il est important de faire le diagnostic de ces formes cliniques particulières puisqu'elles ont pour diagnostic différentiel des néoplasies (lymphome pour la première et néoplasie de la sphère ORL pour la seconde). Afin d'appréhender le rôle du parasite dans l'expression clinique, il a été réalisé le typage par les microsatellites de neuf souches isolées de sujets porteurs asymptomatiques. Il s'avère que ces neuf souches sont très peu polymorphes et que sept d'entre elles possèdent un génotype unique. / Leishmaniasis due to Leishmania infantum is a zoonotic disease transmitted from mammal to mammal through the bite of an insect vector the sandfly female. Beside the classical triad of visceral leishmaniasis symptoms: fever, pallor and splenomegaly, many clinical forms could be associated with this parasite infection. Asymptomatic carriage of L. infantum is the most common and the most widespread in the Old World and New World. Many other clinical forms are present and some subjects will develop only isolated lymphadenopathy. These forms are intermediate between pauci symptomatic and visceral leishmaniasis forms. Whereas L. infantum is not typically associated with mucosal forms, several cases have been described. Indeed, in the 3 academic hospitals of Marseille, Montpellier and Nice from 1997 to 2009, 10 cases were revealed mainly in immunocompromised patients. To understand the role of parasite in clinical expression, nine strains isolated from asymptomatic carriers were genotyped using microsatellite. The nine strains have few polymorphisms and seven of them are identical with a unique genotype. In addition, those strains are very different from strains of HIV-positive subjects. If the strains genetic appears to have a role in the clinical expression of the disease, the environment in which individuals live in endemic areas is associated with an excess of risk to develop visceral leishmaniasis. While in Marseille, cases of visceral leishmaniasis occur in an urban environment, they take place in Nice in a rural environment, as it is classically described. To investigate differences between parasite strains form Nice and Marseille studies with microsatellites are ongoing.

Le botulisme est une maladie nerveuse, commune à l’homme et aux animaux, due à l’action de la toxine botulique produite par Clostridium botulinum. Il existe 8 types de toxines dénommées A à H. Les bactéries capables de produire cette toxine se différencient en six groupe sur la base de leurs caractéristiques phénotypiques et biologiques. Les souches de C. botulinum responsables du botulisme humain appartiennent aux groupes I et II selon qu’elles soient protéolytiques ou non. Elles produisent les toxines A, B, E et F, ainsi que le nouveau type H récemment découvert. C. butyricum et C. baratii sont également capables de produire les toxines botuliques de type F et E et appartiennent au groupe V et VI. C. argentinense appartient au groupe IV et est capable de synthétiser la toxine de type G. Elle a été soupçonnée d’être impliquée dans des cas de botulisme infantile en Argentine. Les souches de C. botulinum responsables du botulisme animal appartiennent au groupe III (C. novyi sensu lato) et produisent les toxines C, D et leurs formes mosaïques C/D et D/C. La toxine botulique est le poison le plus puissant connu à ce jour. La dose létale nécessaire pour tuer une personne en bonne santé par intoxication alimentaire est de 70 µg seulement. C’est pourquoi cette toxine a fait l’objet d’études particulièrement approfondies, notamment celles impliquées dans des cas de botulisme humain. Elle peut également être utilisée pour le traitement de certaine pathologie ou la chirurgie esthétique (Botox). Malheureusement, elle peut également être utilisée à mauvais escient, en tant qu’arme de guerre ou à des fins de bioterrorisme. C’est pourquoi l’emploi de la toxine botulique ou de sa bactérie productrice fait l’objet d’une législation particulièrement stricte. Mon projet de doctorat s’est organisé autour de plusieurs projets de recherche visant à développer des méthodes de détection et de typage de du germe et de sa toxine (projets Européens BIOTRACER et AniBioThreat ; projets NRBC-bio ; LNR botulisme aviaire en France). Lors de mes recherches j’ai concentré mon travail sur le développement de méthodes capable de suivre et remonter à la source d’une contamination, qu’elle soit délibérée, accidentelle ou naturelle. Afin d’y parvenir j’ai investigué les gènes des flagellines de C. botulinum groupe I à III, responsables du botulisme humain et animal. L’analyse des gènes flaA et flaB a mis en évidence 5 groupes majeurs et 15 sous-groupes, certain étant spécifiques de régions géographiques. FlaB s’est montré spécifique de C. botulinum type E. Les gènes flagellines fliC, spécifiques à C. botulinum du groupe III, se divisent 5 groupes, avec fliC-I et fliC-IV associés aux types mosaïques C/D et D/C. J’ai étudié la prévalence des souches productrices de toxine de type mosaïques chez les volailles et les bovins. Les résultats montrent que les types C/D et D/C sont majoritaires en Europe. Enfin, j’ai séquencé 17 génomes provenant de souches responsables de botulisme animal en France (14 types C/D et 3 types D/C). Leur analyse montre que ces souches sont très proche génétiquement, entre elles et avec les souches Européennes. Grâce à ces données j’ai mis en évidence un large contenu extra chromosomique dans les souches C/D, qui peut être utilisé pour créer une carte d’identité génétique. D’autre part, l’étude des séquences Crisps à des fins de typage ne s’est pas avérée suffisamment résolutive, du fait de système Crispr-Cas déficient chez les souches C/D. Enfin, un très haut degré de discrimination a été atteint par typage SNP, qui a permis de distinguer jusqu’à l’origine de chaque souche. L’ensemble de ces résultats est développé dans le présent manuscrit / Clostridium botulinum is the etiologic agent of botulism, a deadly paralytic disease that can affects both human and animals. Different bacteria, producing neurotoxins type A to H, are responsible for the disease. They are separated into different groups (I to VI) on the basis of their phenotypical and biological characteristics. Human botulism is mainly due to Groups I and II producing neurotoxins A, B, E and F, with type H recently discovered. Also C. butyricum and C. baratii species (Groups V and VI), producing toxins type F and E respectively, are scarcely reported. C. argentinense Group IV, producing toxin type G, which has been suspected to be associated with infant botulism in Argentina. Animal botulism is mainly due to Group III, which is constituted by C. novyi sensu lato species. They produce toxin types C, D and their mosaic variants. Botulinum neurotoxins are the most powerful toxin known to date with as little as 70 µg enough to kill a person by food poisoning. Therefore, it received a great deal of attention. Botulinum neurotoxins have been deeply studied, especially human related toxins compared to animal. The toxins found to be useful for medical or cosmetic (Botox) treatments, but it was also used as a biological warfare agent, and for bioterrorism. Its extreme potency is equal to its dangerousness. Therefore, governments show concerns of its potential misuse as a bioterrorism weapon; research programs are funded to study and raise awareness about both the toxins and the producing organisms. My PhD work was structured by the different projects I was involved in, which were related to C. botulinum detection and typing, like BIOTRACER and AniBioThreat European projects, the French national CBRN program, or the NRL for avian botulism. The main transversal objective I followed lead me to develop new methods to trace back the origin of C. botulinum contamination, in case of a deliberate, accidental or naturally occurring botulism outbreak. I investigated flagellin genes as potential genetic targets for typing C. botulinum Group I-II and III, responsible for human and animal botulism respectively. Flagellin genes flaA and flaB showed the investigated C. botulinum Group I and II strains to cluster into 5 major groups and up to 15 subgroups, some being specific for certain geographical areas, and flaB being specific to C. botulinum type E. Flagellin fliC gene investigated in C. botulinum Group III showed to cluster into five groups, with fliC-I and fliC-IV associated to type C/D and D/C respectively, being not discriminative enough to differentiate highly genetically related strains. I also studied the prevalence of mosaic toxin genes in C. botulinum Group III in animal botulism, mainly in poultry and bovine. The results brought out the mosaic toxin types C/D and D/C to be predominant in the samples investigated throughout Europe. Finally, I explored the full genome sequences of 14 types C/D and 3 types D/C C. botulinum Group III strains, mainly originating from French avian and bovine botulism outbreaks. Analyses of their genome sequences showed them to be closely related to other European strains from Group III. While studying their genetic content, I was able to point out that the extrachromosomal elements of strains type C/D could be used to generate a genetic ID card. Investigation of Crispr typing method showed to be irrelevant for type C/D, due to a deficient Crispr-Cas mechanism, but deserve more investigation for type D/C. The highest level of discrimination was achieved while using SNP core phylogeny, which allowed distinguishing up to the strain level. Here are the results I’m going to develop in this manuscript

Pour l’amélioration de la lutte contre la tuberculose à Madagascar, nous avons décidé de mener des études sur l’analyse de la diversité et la distribution des génotypes de BK y circulant au cours du temps et dans l’espace afin de connaitre le mode de transmission de la TB et les sources potentielles de la TB malgache. Plus spécifiquement il s’agit premièrement, d’étudier la diversité génétique et la distribution des génotypes des BK dans le pays pour évaluer le niveau de transmission de la maladie et d’essayer de retracer les sources potentielles d’importation de la TB malgache ; deuxièmement, étudier la diversité de la souche endémique de Madagascar, le SIT109, afin de voir le niveau de transmission d’une souche à l’intérieur de l’île ainsi que son niveau d’évolution ; et troisièmement, identifier les zones de transmission de la TB par combinaison d’analyse spatiale et de génotypage en commençant par une étude pilote dans la capitale.Pour réaliser cela, 1014 souches représentatives de Madagascar isolés de 2005 à 2007 ont été typés par le spoligotypage. Les génotypes définis ont servi pour l’estimation de la transmission de la TB et l’identification des sources potentielles de la TB ; ensuite, 156 BK endémiques de Madagascar portant l’identité SIT109 ont été typés par la méthode des MIRU-VNTR (« Mycobacterial Interspersed Repetitive Units – Variable Number of Tandem Repeat ») afin d’étudier leur diversité, leur niveau d’évolution et le niveau de distribution de la TB au niveau d’une seule souche et enfin, 523 patients ont été recrutés à Antananarivo en 2013 afin de typer par le spoligotypage leur BK, d’identifier à partir de leur génotype ceux qui sont potentiellement associés à des cas de transmission récente et d’analyser leur clusterisation spatiale par la méthode de Kulldorff.Les résultats nous ont montré une grande diversité génétique des BK circulant dans le pays avec une prédomination de deux lignées de BK qui sont les souches « East african Indian » et « Tuscan » ; une distribution particulière des BK dans la capitale par rapport aux autres provinces ; des similitudes particulières des BK circulant avec des pays comme les USA, la France, l’Italie, le Danemark, l’Arabie Saoudite ou encore le Pays Bas ; une grande diversité des souches SIT109 ainsi que leur distribution dans tout le pays ; ainsi que quatre clusters spatiaux de cas de TB associé à la transmission récente dans la capitale.Cette étude nous a permis de déterminer que la transmission de la TB à Madagascar est toujours très active et se fait à très grande échelle, une petite part de la TB à Madagascar a pu être importée par les populations d’origines mais la majorité des cas actuels provient d’importation assez récente de BK de plusieurs régions du monde. Douze Fokontany de la capitale correspondent à des zones à risque de transmission de la TB et méritent une attention particulière aux responsables de la lutte contre la TB à Madagascar et enfin la méthode combinant génotypage et analyse spatiale permet la détection de ces zones à risque et pourrait servir pour le « Programme National de Lutte contre la Tuberculose » d’outil d’aide à la décision pour les stratégies de lutte contre la TB dans tout Madagascar. / For improving the fight against tuberculosis in Madagascar, we decided to conduct studies on the analysis of the diversity and spatio-temporally distribution of BK genotypes circulating in Madagascar for analyzing the TB transmission mode and the potential origins of Malagasy TB. More specifically, It is to study the genetic diversity and distribution of genotypes of M. tuberculosis strains in the country to assess the transmission level of the disease and to identify the potential sources of Malagasy TB; secondly, to study the diversity of the endemic strain of Madagascar, SIT109, in order to assess the transmission level of the strain inside the island and its level of evolution; and third, to identify TB transmission areas by combining spatial analysis and genotyping, starting with a pilot study in the capital.To achieve this, 1014 BK representative of Madagascar isolated in 2005 to 2007 were typed by the spoligotyping. Defined genotypes were used to estimate the TB transmission level and the identification of potential sources of malagasy TB; after, 156 endemic BK from Madagascar bearing the identity SIT109 were typed by the MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units – Variable Interspersed Repeatitive Units) method to study their diversity, their evolution level and the level of TB transmission at a single strain; and finally, 523 patients were recruited in Antananarivo in 2013 in order to type by spoligotyping their BK, to identify from their genotype those that are potentially associated with recent transmission cases and to analyze their spatial clustering by the Kulldorff method.The results showed a high genetic diversity of BK circulating in the country with a predominance of two strains, “East African Indian and “Tuscan”; a particular distribution of BK genotypes in the capital compared to the other provinces and particular similarities of the BK circulating with countries such as the USA, France, Italy, Denmark, Saudi Arabia or the Netherlands; a high variety of SIT109 strains and their distribution throughout the country; as well as four TB cases associated with recent transmission spatial clusters in the capital.This study allowed us to determine that the TB transmission in Madagascar is still very active and it is done on a very large scale, a small part of TB in Madagascar could be imported by the origin populations but the majority of cases is due to relatively recent importations of BK from several regions of the world. Twelve Fokontany in the capital corresponds to TB high risk transmission areas and need special attention to those responsible for the control of TB in Madagascar and finally the method combining genotyping and spatial analysis allows the detection of these high risk areas and could be used for the “Programme National de Lutte contre la TB” as a decision tool for orientation of the TB fight strategies throughout Madagascar

Cette thèse traite de l'application de l'outil moléculaire pour la gestion, la conservation et la compréhension de la biologie et du comportement des espèces animales. Nous avons étudié l'ours brun (Ursus arctos) en tant qu'espèce modèle et la population d'ours bruns de Scandinavie en tant que cas d'étude. La première partie de cette thèse est une partie méthodologique, dans laquelle nous avons développé des aspects techniques en biologie moléculaire et en analyse de parenté. La seconde partie concerne l'application de ces outils moléculaires pour estimer les tailles de population et comprendre les systèmes d'appariement.<br /> Les méthodes non invasives sont de plus en plus utilisées en génétique des populations car elles ne nécessitent pas la manipulation ni le dérangement de l'animal étudié et sont particulièrement recommendabls pour l'étude des populations en danger d'extinction. Cependant, l'ADN extrait de ce type d'échantillons, tels que poils ou fèces, est en général dégradé et/ou en faible quantité, ce qui peut conduire à des erreurs de génotypage. Dans le but d'accroître la qualité et quantité de l'extrait d'ADN, nous avons mis au point une métode PCR (polymerase chain reaction) en deux étapes (“multiplex pre-amplification”). Cette méthode a été testée sur différentes espèces et, en comparaison avec une approche PCR conventionnelle, a permis d'améliorer l'amplification d'ADN et de diminuer le taux d'erreur. Pour amplifier plus spécifiquement l'ADN à partir d'échantillons non invasifs d'ours brun, nous avons également défini de nouvelles amorces microsatellites ainsi qu'un marqueur de sexe spécifique, et combiné une PCR en nid avec la méthode “multiplex pre-amplification”. Ces nouvelles approches peuvent être transposées à d'autres espèces pour lesquelles les méthodes conventionnelles ne sont pas appropriées à cause d'une faible quantité/qualité d'ADN. <br />Les erreurs de génotypage sont un sujet « tabou » dans les études de génétique des populations, malgré leur incidence dans la plupart des jeux de données et le biais qu'elles peuvent causer dans l'interprétation des résultats. Nous avons considéré quatre cas d'étude représentant une large variété d'investigations en génétique des populations, pour détecter les erreurs de génotypage et identifier leurs causes. Dans ces jeux de données, le taux d'erreur estimé variait de 0.8% à 2.6% , selon l'organisme étudié et le marqueur utilisé. Les sources d'erreur principales étaient les pertes d'allèles pour les microsatellites et les différences d'intensité de pics pour les AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), ainsi que des erreurs d'origine humaine dans les deux cas. Nous présentons des suggestions pour limiter et quantifier les erreurs de génotypage à chaque étape du processus et recommandons le report systématique du taux d'erreur dans les études de génétique des populations. <br />Les analyses de parenté basées sur les génotypes multilocus sont largement utilisées pour estimer les succès reproducteurs, les appariements et la fitness dans les populations naturelles. Les approches proposées sont basées sur des estimations du maximum de vraisemblance ou des inférences Bayésiennes et restent en général assez théoriques et difficiles à appliquer pour les biologistes. Il existe un réel manque de logiciels capables de considérer plusieurs générations d'individus et permettant la détermination des deux parents sans hypothèse à priori. Le logiciel PARENTE, que nous avons développé, détermine les maternités, paternités ou les deux parents simultanément, basé sur la compatibilité des génotypes multilocus (marqueurs diploïdes codominants) et des dates de naissance et de mort des individus (si disponibles). Ce logiciel calcule également la probabilité de parenté à partir des fréquences alléliques, du taux d'échantillonnage de la population et du taux d'erreur de génotypage. <br />Les estimations de taille de population sont essentielles pour la bonne gestion et conservation des espèces. Cependant, de manière générale, peu d'études évaluent la précision des estimations obtenues. Nous avons, dans un premier temps, comparé quatre estimateurs de taille de population, basés sur des méthodes génétiques non invasives. Deux méthodes utilisaient des indices de raréfaction et deux étaient basées sur des estimateurs de capture-marquage-recapture (CMR). Au total, 1904 fèces d'ours bruns ont été collectés sur deux années consécutives sur le terrain (49 000-km2 en Suède centrale). Les estimations variaient de 378 à 572 ours en 2001 et de 273 à 433 ours en 2002, selon l‘estimateur utilisé. La détermination d'une taille de population minimale obtenue à partir de données de radio-télémétrie nous a permis de conclure que l'estimation donnée par une des méthodes de CMR était la plus précise. Cet estimateur incluait une hétérogénéité et une variation temporelle dans les probabilités de détection, ce qui paraissait réaliste dans notre échantillonnage. Deuxièmement, nous avons évalué la fiabilité de trois méthodes de terrain traditionnelles en comparaison avec la méthode génétique la plus performante, dans une aire d'étude plus réduite (7 328-km2). Les trois méthodes de terrain tendaient à sous-estimer la taille de population ; la méthode génétique paraissait être la plus exacte. Nous avons conclu qu'environ 550 (482-648) ours étaient présents dans l'aire de 49 000-km2 et 223 (188-282) ours étaient présents dans l'aire de 7 328-km2. Nous suggérons que la population d'ours a atteint une densité de saturation dans l'aire centrale et disperse à présent sur les bords de cette aire centrale. Une analyse en termes de coûts/bénéfices a démontré que la méthode génétique était moins onéreuse que la méthode de terrain la plus fiable. De plus, elle est préférable d'un point de vue éthique. En conclusion, nous recommandons l'utilisation de méthodes génétiques basées sur un principe de CMR, pour estimer les tailles de population sur de larges aires. Nous insistons sur l'importance d'un effort d'échantillonnage adéquat et, en cas d'échantillonnage biaisé, nous conseillons le calibrage avec des estimations indépendantes, si possible. Nous recommandons La collecte d'un nombre d'échantillons supérieur de 2,5 à 3 fois le nombre « présumé » d'animaux. Ces études ont également confirmé que la gestion actuelle de la population d'ours a été bénéfique et que cette population est actuellement dans un bon statut de conservation.<br />La connaissance des systèmes d'appariement est importante dans la compréhension de la sélection naturelle. Nous avons étudié deux aspects majeurs du système d'appariement de l'ours brun : les stratégies d'appariement employées par les deux sexes en relation avec l'infanticide sexuellement sélectionné (SSI) et la sélection du partenaire par la femelle. L'infanticide, le meurtre de jeunes non sevrés, peut être considéré comme sexuellement sélectionné si les trois conditions suivantes sont réunies : i) l'infanticide réduit le délai du prochain oestrus de la femelle ; ii) le mâle commettant l'infanticide n'est pas le père des jeunes tués ; iii) le mâle commettant l'infanticide produit la portée suivante de la femelle. Nous avons documenté huit cas d'infanticide sur le terrain. A partir d'observations et d'échantillons collectés sur sites, nous avons vérifié que les trois conditions pour le SSI étaient vérifiées. Cela suggère que le SSI pourrait être une stratégie adaptative pour le mâle chez ce carnivore non social. Contrairement aux espèces sociales où les mâles immigrants tuent les jeunes, la plupart des mâles commettant l'infanticide étaient résidents chez les ours scandinaves. Ceci implique qu'ils sont capables de différencier leurs propres jeunes des jeunes non apparentés, probablement en reconnaissant les femelles avec lesquelles ils se sont accouplés l'année précédente. De plus, nous avons démontré génétiquement un minimum de 14.5% de paternités multiples (28% pour les portées de 3 jeunes ou plus). La promiscuité des femelles, dans le but de confondre les paternités, pourrait donc être une contre-stratégie adaptative pour éviter le SSI. D'autre part, nous avons évalué sur quels critères les femelles ours bruns sélectionnaient leur partenaire reproductif. Nous avons émis l'hypothèse que les femelles pourraient faire face à un dilemme: soit choisir un partenaire de bonne qualité d'un point de vue phénotypique, comme suggéré par les théories de choix du partenaire, soit s'accoupler avec des mâles susceptibles de commettre l'infanticide l'année suivante, c'est à dire les plus proches géographiquement. Nous avons conclu que les femelles sélectionnaient significativement les mâles les plus proches mais aussi les plus hétérozygotes, les plus gros et les plus âgés. Nous suggérons que les femelles ours s'accouplent avec les mâles les plus proches comme contre-stratégie au SSI et exercent un choix post-copulatoire du partenaire reproducteur, basé sur des critères morphologiques tels qu'une large taille corporelle, ou sur des critères de statut de dominance, reflétant la qualité génétique du mâle.

Connaitre et appréhender les mécanismes de la diversification des espèces est important pour la gestion des écosystèmes, la prévision des impacts des changements climatiques et la compréhension de la biodiversité actuelle et passée. Le but de cette thèse est de comprendre et de déceler les mécanismes génétiques à l’origine de la diversification des espèces en présence de flux de gènes. Cette thèse se focalise sur le modèle biologique Symphonia globulifera, qui compte deux écotypes : le S.globulifera spécialiste de la terra firme et le S.sp1, spécialiste des bas-fonds. Ces deux écotypes montrent une faible différenciation génétique, malgré la présence de deux phénotypes différents.Une première étape a été de mettre en évidence la présence d’une adaptation locale au sein de cette espèce, par le biais d’une expérimentation de jardins de transplantation réciproques, permettant d’expliquer la répartition des écotypes dans leur habitat naturel. Ensuite, dans le but d’identifier les mécanismes sous-jacent à cette adaptation locale, j’ai testé l’hypothèse que la méthylation des gènes pourrait être une marque de l’épigénétique contribuant à la divergence des écotypes, par l’utilisation d’enzyme sensibles à la méthylation dans un protocole de génotypage AFLP. Enfin, un séquençage haut-débit du transcriptome des écotypes en jardins de transplantation réciproques m’a permis de mettre en évidence une expression différentielle des gènes entre les écotypes, qui pourrait expliquer les différences phénotypiques observées entre les écotypes malgré une faible différentiation génétique. Ces travaux de thèse s’appuie, ainsi, sur des données de traits phénotypiques, de génotypage AFLP et de séquençage à haut débit du transcriptome pour montrer la valeur importante de la régulation des gènes dans la divergence des écotypes adaptés localement, et un faible rôle de la méthylation de l’ADN dans l’établissement cette adaptation locale. / Understanding of the mechanisms driving diversification of species is a significant way to improve the management of ecosystems, predict the impacts of climate change and understand the actual and past biodiversity level. The aim of this thesis is to understand and comprehend genetic mechanisms behind the diversification of species in the presence of gene flow. This thesis is focused on the biological model Symphonia globulifera, which presents two ecotypes: the S.globulifera, specialist of seasonally flooded lowlands and S.sp1, specialist of terra firme. These two ecotypes show low genetic differentiation, despite the presence of two apparent phenotypes. A first part of this thesis was to test the presence of local adaptation of this using reciprocal transplant experiment gardens, allowing the understanding of the ecotypes distributions in their natural habitats. Then, this local adaptation in the presence of gene flow, directed me to the regulation of gene methylation in order to see the role this brand of epigenetics can have in the divergence of the ecotypes. In a third part of the thesis, new generation sequencing of the transcriptome ecotypes in reciprocal gardens transplantations allowed me to show the evidence of gene regulation to differentiate the ecotypes. This work thesis is based on phenotype records data, AFLP genotyping and high-throughput sequencing of the transcriptome, in order to show the important value of gene regulation in the divergence of the locally adapted ecotypes, and a weak role of DNA methylation in the establishment of local adaptation.

La leishmaniose viscérale (LV) est la forme la plus sévère de la leishmaniose humaine. Elle est transmise par la piqûre d'un phlébme. La leishmaniose viscérale est mortelle en l'absence de traitement. Les options thérapeutiques courantes contre la leishmaniose viscérale sont limitées. En région méditerranéenne, la LV est due à Leishmania infantum, zoonose dont le chien est le principal réservoir. A côté de quelques cas d'infection systémique, un nombre important d'humains porteurs asymptomatiques a été mis en evidence. En première partie, nous avons étudié l'intérêt du MultiLocus Microsatellite Genotyping (MLMT) pour l'identification des souches de Leishmania du sud de la France. Par MLMT nous avons étudié la variabilité génétique de différentes souches et recherché une association avec les différentes formes cliniques, la résistance aux médicaments et les phénomènes de rechutes. Nous avons observé une hétérogénéité génétique entre les différentes souches de L. infantum MON-1. Si l'association de certains génotypes avec les différentes expressions cliniques de la leishmaniose n'a pu être démontrée, nous avons par contre observé une répartition préférentielle géographique de certains génotypes. En deuxième partie, nous avons mis au point un protocole expérimental destiné au criblage de nouveaux agents anti-Leishmania infantum ayant pour cible la machinerie cellulaire mise en route par la cellule hôte pour l'élimination du parasite intracellulaire. Nos résultats ont montré que les altérations du système de trafic intracellulaire de la cellule-hôte induites par certains composés étaient corrélées à la mort du parasite et à son élimination. / Visceral leishmaniasis (VL) is the most severe form of Human Leishmaniases, which occurs when protozoan parasites Leishmania donovani or L. infantum, given by phlebotomine sandfly bites. The disease is fatal when untreated. Current treatment options against VL are very limited with few drug molecules, often expensive, not always safe and able to induce resistance phenomenon.In this report, we have characterized on one hand, different genetic variants of Leishmania infantum strains isolated in different geographical areas from southern France and on the other hand have identified new potential anti-Leishmania infantum compounds and characterized their molecular mechanism of action.In the first part, we studied the interest of Multilocus Microsatellite Genotyping (MLMT) for the identification of Leishmania strains from southern France. By genotyping technique MLMT, we studied the genetic variability of different strains and sought an association with different clinical forms of leishmaniasis, resistance to drugs and relapse. We observed genetic heterogeneity among different strains of L. infantum-MON-1. we observed a preferential geographic distribution of certain genotypes.In the second part, we have developed an experimental protocol for the screening of new anti-Leishmania infantum compounds that target the host cell machinery responsible for the intracellular parasite killing, we studied the different steps of endocytic pathways potentially targeted by these compounds. Our results showed that with some compounds, modifications of the intracellular trafficking of the host cell were correlated with parasite death and its elimination.

Une méthode de réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (t-PCR), permettant de déterminer dès 12 semaines d'aménorrhée (SA) le statut RhD dun foetus à partir d'ADN libre dans le plasma maternel, a été mise au point dans notre laboratoire. Cette technique est appliquée en routine clinique depuis novembre 2002 aux patientes RhD négatif dans le cadre de leur suivi immuno-hématologique. Ce développement ainsi quune première évaluation portant sur 218 grossesses et 223 nouveau-nés ont été rapportés dans un travail original publié dans le J Gynecol Obstet Biol Reprod en 2005 (Minon et al. 2005). La qualité de la prédiction du statut RhD ftal a permis d'envisager l'extension du génotypage à toute patiente RhD négatif. En parallèle, différentes PCR conventionnelles ont été développées pour rechercher les gènes RHD silencieux. Lexistence de variants non fonctionnels du gène RHD - principalement trouvés dans les populations africaine et asiatique - a conduit à amplifier des segments spécifiques du gène RHD fonctionnel (séquences des exons 4 et 5) en plus dune séquence de lexon 10, afin déviter les faux positifs. Toutefois, un résultat faux positif inhabituel, lié en fait à la présence d'un greffon rénal chez l'une de nos patientes, a fait l'objet d'une publication dans Transfusion en 2006 (Minon et al. 2006). La place du génotypage foetal RHD a été réfléchie dans un contexte plus général de prise en charge et de prévention de l'alloimmunisation foeto-maternelle anti-D. Cette réflexion a permis de définir de nouvelles stratégies qui ont été décrites dans la Revue Médicale de Liège en 2006 (Minon et al. 2006). Une synthèse de notre activité tant régionale que nationale entre 2002 et 2006 a été récemment publiée dans Transfusion en 2008 (Minon et al. 2008). Elle reprend l'étude de 563 patientes et de leurs 581 nouveau-nés. Notre expérience dans les grossesses gémellaires y est rapportée. Les pièges (faux positifs et négatifs) de la technique sont abordés et des moyens de prévention pour les éviter sont proposés. Elle a été loccasion dune discussion assez exhaustive sur le génotypage RHD foetal à partir du sang maternel. La faible expression de l'antigène D chez certaines mamans pose un double problème: le premier est lié à la présence d'un gène RHD maternel "intact" qui invalide la recherche du gène RHD foetal dans le plasma. Le second est lié à la confusion induite dans lesprit de l'obstétricien par la présence d'un gène RHD maternel « normal » mais associé à une expression faible de l'antigène D, la patiente étant par ailleurs connue sérologiquement D négative. Sur ce sujet déjà épineux viennent se greffer les particularités des variants D partiels. Une nouvelle stratégie a été définie afin d'orienter l'obstétricien dans le suivi immuno-hématologique et la prophylaxie par anti-D des patientes présentant un D variant (D faible et/ou D partiel). Cette nouvelle approche concerne aussi la politique transfusionnelle à adopter en matière de sang D phéno-compatible. Cette discussion fait partie intégrante de notre sujet et reprendra notre expérience reposant maintenant sur plus de 700 déterminations de RHD ftal réalisées depuis 2007. L'extension du génotypage RHD à toutes les patientes RhD négatif encourage nos équipes à réaliser de manière systématique une prévention par immunoglobulines anti-D à 28 semaines daménorrhée (SA) chez les patientes Rh D négatif dont le foetus est RHD positif. L'introduction de cette prophylaxie modifie le suivi immuno-hématologique obstétrical traditionnel et fait l'objet d'une publication sous presse dans Acta Clinica Belgica (Minon et al. 2008). En corollaire de notre travail, nous avons démontré la fiabilité de la prédiction du sexe foetal par la recherche du gène SRY utilisé comme contrôle interne de la présence de DNA foetal dans le plasma maternel lorsque le foetus est de sexe masculin.