Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2016-08-04T19:10:35Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Luiz de Lima Silva - 2016.pdf: 2502108 bytes, checksum: 9af274c5556e225e1478c978f79254ad (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2016-08-04T19:11:54Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Luiz de Lima Silva - 2016.pdf: 2502108 bytes, checksum: 9af274c5556e225e1478c978f79254ad (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-04T19:11:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Lucas Luiz de Lima Silva - 2016.pdf: 2502108 bytes, checksum: 9af274c5556e225e1478c978f79254ad (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-05-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is a disease caused by Leishmania protozoan, belonging to the subgenus Viannia and Leishmania. In Brazil, the most common and prevalent species is L. (V.) braziliensis. In patients with ATL, it was detected the expression of interleukin 32 (IL-32) in skin or mucosal lesions caused by L. Viannia spp. However, the role of IL-32 on ATL is still unclear. It has been shown that IL-15 induces IL-32 and also IL-15 leads to L. infantum control. This study aimed to investigate the effects of IL-32 and IL-15 in the production of cytokines and microbicidal activity of primary human macrophages infected with L. (V.) braziliensis. For this, human peripheral blood monocytes were derived into macrophages and infected with metacyclic forms of L. (V.) braziliensis; evaluation of the infection index (4 h, phagocytosis, 48 h, microbicidal activity) in the absence or presence of rIL-32, rIL-15 or gamma interferon (rIFN) and lipopolysaccharide (LPS); in culture supernatants, IL-32, tumor necrosis factor (TNF) and IL-10 were measured by enzime-linked immunoassay. The addition of rIL-32 to macrophages did not significantly altered phagocytosis of the parasites or microbicidal activity of macrophages. Classical activation of macrophages with rIFN plus LPS decreased the infection index. rIL-32 em high concentration (200 ng/mL) was able to induce TNF in uninfected or infected macrophages, and IL-10 was not induced. Parasites induced lower amounts of intracellular IL-32 as well as rIFN0.1 ng / ml), but there was a synergism between the activation signals provided by the parasites and rIFN (0.1 ng / ml). In the opposite, rIFN in higher concentration (10 ng/mL) induced higher amounts of IL-32, but its activity was partially inhibited by parasites. The rIL-15 was able to induce IL- 32 and TNF in macrophages, but not IL-10 in both non-infected or infected macrophages. The rIL-15 also decreased phagocytosis of parasites by macrophages and increased the microbicidal activity of these cells. The data suggest that IL-15 induces IL-32 and TNF which can contribute to control of the infection. To evaluate the leishmanicidal mechanism pathways induced by IL-15 and IL-32 can help in the development of new therapies for the control of ATL. / A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infectoparasitária causada por protozários Leishmania, pertencentes aos subgêneros Viannia e Leishmania. No Brasil, a espécies mais comum e prevalente é L. (V.) braziliensis. Em pacientes com LTA, foi detectada a expressão da citocina interleucina 32 (IL-32) nas lesões cutâneas ou mucosas causadas por L. Viannia spp. No entanto, o papel da IL-32 na LTA ainda não foi esclarecido. Foi demonstrado que a IL-15 induz IL-32, além disso a IL-15 leva à morte de L. infantum. O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos da IL-32 e IL-15 na produção de citocinas e na atividade microbicida de macrófagos humanos primários infectados com L. (V.) braziliensis. Para isto, foi realizada a derivação de macrófagos humanos a partir de monócitos do sangue periférico de doadores não infectados e infecção com formas metacíclicas de L. (V.) braziliensis; avaliação do índice de infecção (4 h, fagocitose; 48 h, atividade microbicida), na ausência ou presença de tratamento com rIL-32, rIL-15 ou interferon gama (rIFN) e lipopolissacarídeo (LPS); e avaliação da produção de citocinas IL-32, fator de necrose tumoral (TNF) e IL-10, por ensaio imunoenzimático. A adição de rIL-32 às culturas de macrófagos primários infectados com L. (V.) braziliensis não alterou significantemente a fagocitose ou a atividade microbicida das células. A ativação clássica dos macrófagos com rIFN e LPS resultou em uma diminuição do índice de infecção. A rIL-32 em elevada concentração foi capaz de induzir TNF nos macrófagos não infectados ou infectados pelos parasitos L. (V.) braziliensis, sendo que não foi induzida produção de IL- 10. Os parasitos L. (V.) braziliensis induziram baixas quantidades de IL-32 intracelular, assim como rIFN0,1 ng/mL), porém houve sinergismo entre os sinais de ativação fornecidos pelos parasitos e os do rIFN (0,1 ng/mL). O rIFN em uma concentração mais elevada (10 ng/mL) induziu maiores quantidades de IL-32, porém esta indução foi parcialmente inibida pela infecção com os parasitos. A rIL-15 foi capaz de induzir IL-32 nos macrófagos e, além disso, induziu TNF e não induziu a produção de IL-10, tanto nos macrófagos infectados quanto não infectados. A rIL-15 também diminuiu a fagocitose dos parasitos pelos macrófagos e aumentou a atividade microbicida destes. Os dados sugerem que a IL-15 induz IL-32 e TNF que podem contribuir para o controle da infecção. Avaliar as vias de ativação de mecanismos leishmanicidas induzidos pelas IL- 15 e IL-32 podem auxiliar no desenvolvimento de novas terapias para o controle da LTA.

Chronic wounds are a major healthcare problem worldwide which mainly a ects geriatric population and patients with limited mobility. In tropical countries, Cutaneous Leishmaniasis (CL) is also a cause for chronic wounds, being endemic in 75% of Peru . In this context, the assessment of these type of wounds represents a big challenge due to the limited access to specialized medical resources. This work aims to develop a video-based method to compute the 3D point cloud of skin wounds which could provide accurate metrics for medical assessment despite of the location of the patient. Recently, CL specialists have used metrics as volume in clinical assessment with promising results. The acquisition protocol is prompt to be user friendly and feasible in remote locations; the video is taken using a commercial hand-held video camera without a rig or special illumination. The algorithm follows the Structure from Motion methodology: FAST feature detector, pyramidal optical flow and Jacob’s method for missing points estimation. The results show good performance in terms of accuracy and repeatability of the point cloud computation, less than 0.6 mm and 0.21 mm respectively. However, experiments suggest that the volume computation technique does not adapt well to the proposed method output and requires a deeper analysis. The method has been entirely implemented using open source libraries. / Tesis

[ES] La cristalografía de rayos X es una potente técnica para la resolución de la estructura atómica de macromoléculas. La información generada, tiene gran impacto sobre diferentes campos relacionados con la investigación básica y aplicada, como son la biomedicina y diseño de fármacos, al igual que en el desarrollo de aplicaciones nanotecnológicas y biotecnológicas. Esta Tesis se centra en determinadas problemáticas actuales y en las proteínas involucradas en las mismas (TryR, eEF1A2 y CBDP35), siendo éstas sujeto de desarrollo biotecnológico en los campos de la biomedicina, farmacia y de la industria alimentaria, en el que la cristalografía de rayos X juega un papel crucial para dilucidar sus estructuras atómicas y funciones. En consideración a la biomedicina y diseño de fármacos, hemos resuelto la estructura de la Tripanotión reductasa (TryR) de Leishmania infantum en complejo con potentes inhibidores de su actividad oxidorreductasa, con potencial de desarrollo como fármacos. Así, se ha caracterizado la unión y mecanismo de acción de éstos inhibidores. TryR es una reconocida diana farmacológica para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, la Tripanosomiasis Humana Africana y la leishmaniosis, ya que desempeña un papel crucial y esencial en el metabolismo redox de los parásitos de la familia Trypanosomatidae. Además, se han analizado los parámetros de cristalización y difracción de novedosos inhibidores de la dimerización de TryR, cuyo diseño racional se basa en la unión a la interfaz de dimerización de la misma. La oncoproteína eEF1A2, involucrada en múltiples funciones celulares y sujeto de numerosas modificaciones post-traduccionales, se une al fármaco anticancerígeno plitidepsina. La cristalografía de rayos X, combinada con experimentos de espectrometría de masas, se han utilizado como herramientas para identificar nuevas modificaciones post-traduccionales y características estructurales en eEF1A2:GDP. Una modificación única, la adición de etanolamina fosfoglicerol (EPG) a aminoácidos conservados (Glu301 y Glu374 en mamíferos), se ha observado aquí por primera vez. El análisis estructural de estos hallazgos facilita la comprensión de las múltiples funciones y regulaciones de eEF1A2. La adquisición de una muestra conformacionalmente homogénea de eEF1A2:GTP, necesaria para la unión a la plitidepsina, ha sido evaluada en ensayos de cristalización del complejo terciario de eEF1A2: GTP: plitidepsina. Con respecto al dominio de unión a la pared celular de la endolisina PlyP35 codificada por el fago P35 de Listeria monocytogenes (CBDP35), hemos resuelto la estructura cristalina de CBDP35 en un complejo con ácido teicoico natural de L. monocytogenes serovar 1/2a. Esta estructura es el primer módulo de unión a la pared celular en complejo con ácidos teicoicos jamás dilucidado. El análisis estructural reveló los principales determinantes para la unión de la pared celular bacteriana, en particular, el mecanismo molecular del reconocimiento de N-acetil-d-glucosamina, una decoración de carácter glicosídico en ácidos teicoicos de serovares patógenos de L. monocytogenes. Estos hallazgos arrojan luz sobre el desarrollo biotecnológico de nuevas herramientas en la industria alimentaria y las terapias derivadas de fagos para detectar y tratar infecciones bacterianas. / [CA] La cristal·lografia de raig X és una potent tècnica per a la resolució de l'estructura atòmica de macromolècules. La informació generada té gran impacte sobre diferents camps relacionats amb la investigació bàsica i aplicada, com són la biomedicina i disseny de fàrmacs, igual que en el desenvolupament d'aplicacions nanotecnológiques i biotecnològiques. Aquesta Tesi es centra en determinades problemàtiques actuals i en les proteïnes involucrades en les mateixes (TryR, eEF1A2 i CBDP35), sent estes subjecte de desenvolupament biotecnològic en els camps de la biomedicina, farmàcia i de la indústria alimentària, en el que la cristal·lografia de raig X juga un paper crucial per a dilucidar les seues estructures atòmiques i funcions. En consideració a la biomedicina i disseny de fàrmacs, hem resolt l'estructura de la Tripanotión reductasa (TryR) de Leishmania infantum en complex amb potents inhibidors de la seua activitat oxidorreductasa, amb potencial de desenrotllament com a fàrmacs. Així, s'ha caracteritzat la unió i mecanisme d'acció d'estos inhibidors. TryR és una reconeguda diana farmacològica per al tractament de la malaltia de Chagas, la Tripanosomiasi Humana Africana i la leishmaniosi, ja que exerceix un paper crucial i essencial en el metabolisme redox dels paràsits de la família Trypanosomatidae. A més, s'han analitzat els paràmetres de cristal·lització i difracció de nous inhibidors de la dimerizació de TryR, el disseny racional dels quals es basa en la unió a la interfície de dimerización de la mateixa. L'oncoproteína eEF1A2, involucrada en múltiples funcions cel·lulars i subjecte de nombroses modificacions posttraduccionals, s'unieix al fàrmac anticancerigen plitidepsina. La cristal·lografia de raig X, combinada amb experiments d'espectrometria de masses, s'han utilitzat com a ferramentes per a identificar noves modificacions posttraduccionals i característiques estructurals en eEF1A2:GDP. Una modificació única, l'addició d'etanolamina fosfoglicerol (EPG) a aminoàcids conservats (Glu301 i Glu374 en mamífers), s'ha observat ací per primera vegada. L'anàlisi estructural d'estes troballes facilita la comprensió de les múltiples funcions i regulacions d'eEF1A2. L'adquisició d'una mostra conformacionalmente homogènia d'eEF1A2:GTP, necessària per a la unió a la plitidepsina, ha sigut avaluada en assajos de cristal·lització del complex terciari d'eEF1A2: GTP: plitidepsina. Respecte al domini d'unió a la paret cel·lular de l'endolisina PlyP35 codificada pel fago P35 de Listeria monocytogenes (CBDP35), hem resolt l'estructura cristal·lina de CBDP35 en un complex amb àcid teicoico natural de L. monocytogenes serovar 1/2a. Esta estructura és el primer mòdul d'unió a la paret cel·lular en complex amb àcids teicoicos mai dilucidat. L'anàlisi estructural va revelar els principals determinants per a la unió de la paret cel·lular bacteriana, en particular, el mecanisme molecular del reconeixement de N-acetil-d-glucosamina, una decoració de caràcter glicosídico en àcids teicoicos de serovares patògens de L. monocytogenes. Estes troballes fan llum sobre el desenrotllament biotecnològic de noves ferramentes en la indústria alimentària i les teràpies derivades de fagos per a detectar i tractar infeccions bacterianes. / [EN] X-ray crystallography is a powerful technique for atomic structure resolution of macromolecules. The information generated impacts different fields involving basic and applied research on biomedicine and drug design and the development of nanotechnology and biotechnological applications. This dissertation focuses on current problematics and the target proteins involved (TryR, eEF1A2 and CBDP35) that are in sight for biotechnological development in the biomedical, pharmaceutical and food industry fields, in which X-ray crystallography plays a crucial role in the elucidation of their atomic structures and functions. Attaining to biomedical and drug design problematics, we have solved the structure of Leishmania infantum TryR in complex with potent oxidoreductase inhibitors prone to further development as anti-trypanosomal drugs, thereby characterizing their binding and mechanism of action. This protein is a long recognized drug target for the treatment of Chagas disease, Human African Trypanosomiasis and leishmaniasis, as it plays a crucial and essential role in the redox-metabolism of the Trypanosomatidae parasites. Moreover, the crystallization and diffraction parameters of novel TryR dimerization disruptors have been assayed for inhibitors which have been rationally designed to bind the dimerization interface of TryR. The "moonlighting" oncoprotein eEF1A2 is known to be highly post-translationally modified and to bind the anticancer drug plitidepsin. X-ray crystallography, combined with mass-spectrometry experiments, have been used as tools to identify novel post-translational modifications and structural features in eEF1A2:GDP. A unique modification, namely the addition of ethanolamine phosphoglycerol (EPG) to conserved glutamic residues (Glu301 and Glu374 in mammals), has been here observed for the first time. Structural analysis of these findings facilitate the understanding of eEF1A2's multiple functions and regulations. The acquirement of a conformationally homogenous eEF1A2:GTP sample, necessary for plitidepsin binding, has been has been assayed for eEF1A2:GTP:plitidepsin complex crystallization. Regarding the cell wall binding domain of Listeria monocytogenes phage-encoded endolysin PlyP35 (CBDP35), we have solved the crystal structure of CBDP35 in complex with natural Listeria serovar 1/2a teichoic acid. This structure is the first cell wall binding module in complex with teichoic acids ever elucidated. Structural analysis revealed the main determinants for bacterial cell-wall binding, in particular, the molecular mechanism of N-acetyl-d-glucosamine recognition, a glycosidic moiety in teichoic acids of pathogenic serovars of L. monocytogenes. These findings shed light upon the biotechnological development of new tools in the food industry and phage-derived therapies to detect and treat bacterial infections. / Agradecer al Ministerio de Educación, Cultura y Deporte por haberme proporcionado el contrato FPU (FPU14/03190) que me ha permitido desarrollar esta Tesis Doctoral en el Instituto de Química-Física “Rocasolano” del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IQFR-CSIC), así como la financiación otorgada para poder realizar mi estancia predoctoral en el laboratorio del Prof. Hammershmidt, en Greifswald, Alemania (EST17/00751). / Carriles Linares, AÁ. (2019). STRUCTURAL BIOMEDICINE: CHARACTERIZATION OF THE STRUCTURAL BASIS IN PROTEIN-DRUG RECOGNITION IN DIFFERENT HUMAN DISEASES [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/130844

A atividade de cisteíno proteases (CP) tem sido relacionada a diferentes patologias, como no caso da leishmaniose, doença de Chagas de alguns tipos de câncer. Devido a homologia entre as cisteíno proteases presentes em altos níveis nesses sistemas celulares, foi investigada aqui a importância dessas enzimas para o desenvolvimento e estabelecimento dessas doenças a partir da atividade biológica in vitro de novos inibidores reversíveis de cisteíno proteases. De maneira geral, as substâncias apresentaram relevante atividade inibitória de cisteíno proteases expressas pelos diferentes sistemas celulares, com máximo de inibição de 42% para o Neq0554 em relação à atividade de CP expressas por Leishmania spp. e 76% em relação a atividade de CP expressas por células de câncer de pâncreas. Diferentes níveis de atividade biológica foram observados entre os sistemas celulares, porém todos apresentaram supressão em relação aos parâmetros citostáticos após a inibição da atividade de CP. Quando testados em Leishmania spp. o crescimento celular foi suprimido em pelo menos 67%, com máximo de inibição de 95% para o Neq0551 a 10 μM. Da mesma maneira, em células de câncer de pâncreas, alterações no ciclo celular e supressão dos processos de migração e formação de colônias foram os resultados mais evidentes, comretenção de 50% da capacidade de formação de colônias das células Mia-Paca2 pelo Neq0554 a 10 μM. Já em relação aos protozoários da capa Y de Trypanosoma cruzi os inibidores testados apresentaram interessante seletividade contra os parasitos, em relação à célula hospedeira LLC-MK2, além de promoverem a supressão de cerca de 80% do processo de invasão celular in vitro quando a célula hospedeira foi previamente tratada com 10 μM do inibidor Neq0662 por 2 h antes do processo de infecção. Por fim, a encapsulação do Neq0554 em apoferritina promoveu um incremento na atividade anticancerígena para células de câncer de pâncreas, com IC50 de 79 μM contra > 200 μM em relação às células de fibroblasto, aumentando sua seletividade. De maneira geral, os resultados corroboram a hipótese de a inibição de cisteíno proteases nos sistemas celulares é eficiente para promover efeitos citostáticos, podendo ser utilizada com controle e supressão do desenvolvimento das patologias. Além disso, a atividade de CP nas células de protozoários e câncer de pâncreas apresentou perfil semelhante de ação, no qual inibidores de CP não promoveram a morte em nível significativo das células, mas ressaltaram os efeitos citostáticos em relação ao crescimento celular. / Cysteine proteases (CP) activity has been related to different pathologies, such as leishmaniasis, Chagas disease and some types of cancer. Due to the homology between cysteine proteases expressed by these cellular systems, it was investigated here the importance of these enzymes for the development and establishment of these diseases based on the in vitro biological activity of novel reversible cysteine protease inhibitors. In general, the inhibitor showed a significant inhibitory activity of cysteine proteases expressed by the different cellular systems, with a maximum inhibition of 42% for Neq0554 concerning the CP activity expressed by Leishmania spp. and 76% to CP activity expressed by pancreatic cancer cells. Different profiles of biological activity were observed between the cellular systems, but all substances had significant CP activity suppression, in cytostatic levels after the inhibition of CPA. When the inhibitors were tested against Leishmania spp., the cell growth was suppressed by at least 67%, with maximum inhibition of 95% for Neq0551 at 10 μM. Similarly in pancreatic cancer cells, changes in the cell cycle profile were the most evident results, as well as the suppression of migration and colony formation ability, with 50% retention of the colony development of Mia-Paca2 cells by Neq0554 at 10 μM. In contrast, to protozoa from Trypanosoma cruzi Y strain, the inhibitors tested showed an interesting selectivity against the parasites concerning the host cell LLC-MK2, also promoting the in vitro cell invasion suppression in about 80% when the host cell was pre-treated with Neq0662 10 μM for 2 h. Finally, the encapsulation of Neq0554 promoted an increase in its anticancer activity against pancreatic cancer cells, with IC50 of 79 μM alongside > 200 μM to fibroblast cells, besides increasing its selectivity. In general, the results corroborate the hypothesis that the inhibition of cysteine proteases in the cellular systems is efficient to promote cytostatic effects, being an interesting tool to be used as control and development suppression of some pathologies. Also, CP activity in protozoa cells and pancreatic cancer showed a similar profile of action, in which cysteine protease inhibitors did not promote death at a significant level for the cells, but emphasized cytostatic effects about cell growth.

Orientador: Roberto Wagner Lourenço / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:21:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cossermelli-Andrade_JoseSantos_M.pdf: 6138556 bytes, checksum: b9e43c01ffa57c722a27a0392730f32f (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A LTA é uma doença amplamente distribuída no território brasileiro, de transmissão essencialmente focal. A sua dinâmica se diferencia entre os locais de ocorrência em função das variáveis relacionadas aos parasitas, aos vetores, aos ecossistemas e aos processos sociais de ocupação do solo e contato com a natureza. Este estudo se propôs a analisar a distribuição espacial da Leishmaniose Tegumentar Americana em alguns municípios pertencentes a Bacia do Rio Capivari, estado de São Paulo, de 1992 a 2004. Foi examinada a associação da doença com os aspectos ambientais e de composição da paisagem, sua proximidade com fragmentos de vegetação, matas ciliares, corpos d'água por meio de técnicas de geoprocessamento e de Sensoriamento Remoto. Os casos de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) analisados neste estudo foram notificados pelos serviços de vigilância epidemiológica dos municípios componentes da região de estudo. Foi utilizado imagens do sensor LANDSAT TM 5 para obter uma classificação do uso da terra para identificação de categorias pertencentes à conectividade da paisagem e também procedimentos de mapeamento para a identificação das áreas com maior concentração de casos de LTA na região de estudo durante o período estudado. Ao longo do período estudado os casos de LTA concentraram-se em grande parte ao longo do curso do Rio Capivari e do Rio Jundiaí, dos seus afluentes e dos fragmentos florestais que acompanham esta hidrografia, sugerindo fazer parte de um padrão de distribuição espacial influenciado por contextos sócio-ambientais semelhantes. Pode-se ainda constatar que muitos casos apresentaram como locais prováveis de infecção as proximidades dos, os rios e as bordas dos fragmentos florestais. Os resultados obtidos podem contribuir no entendimento da variação espacial das ocorrências da LTA através de métodos de geoprocessamento e Sensoriamento Remoto / Abstract: The Cutaneous Leishmaniasis has been reported in Brazil since the early nineteenth century, wounding and damaging thousand of people every year. After 2003 the disease has become endemic on all States of the country. Due it's different forms of epidemiological patters - including several species of host and vector -, the disease has been widespread throughout the national territory likely endemic disease circuits. The aim of this study is to contribute for a better understanding of the incidence of Cutaneous Leishmaniasis and it's spatial distribution characteristics on the endemic area of Capivari River basin, São Paulo State, Brazil. Epidemiological studies in which spatial distribution and geographic information systems have grown in Brazil, mainly by the public health services. Although the government and universities efforts to improve access to satellite images and spatial technology, still have serious limitations on epidemiological surveillance services. A retrospective ecological design study was carried out, recovering CL data from the epidemiological surveillance services during 1992 to 2004, resulting in a UTM Datum data base file for every year and each municipalities, assessing the landscape categories of interest on the study area. Cutenous Leishmaniasis cases has been found alongside Capivari River and Jundiai River as well from their riparian forests. An assesment study was carried out to establish distance patterns between CT cases and nearest rivers and vegetation. This work also brings the urgency of reduce the underreport of CL cases and the improvement in the surveillance health services / Mestrado / Epidemiologia / Mestre em Saude Coletiva