Nutrient sensing neurons are unique in coupling changes in the concentration of nutrients to changes in neuronal activity. These neurons typically exist in regions of the brain where the blood brain barrier is fenestrated, such as the arcuate nucleus of the hypothalamus. Glucose and leucine are nutrients known to be sensed by neurons in this brain region, but the mechanisms by which they are sensed, and cells that sense them require further study. Using calcium imaging of adult neuron cultures from the mouse mediobasal hypothalamus, I demonstrated that leucine bidirectionally regulates neuronal activity in a neurochemically heterogeneous population of neurons, including AgRP/NPY and POMC neurons. Using pharmacological tools, I demonstrated, unexpectedly, that this acute sensing is independent of mTOR and leucine metabolism, known pathways involved in leucine sensing in vivo. Leucine sensing is LAT1 independent. The response principally relies on calcium entry into the cell across the plasma membrane, but IP3 sensitive calcium stores play a role in neurons inhibited by leucine. Using phosphoTRAP and single cell RNA sequencing, I aimed to identify a molecular marker for leucine sensing cells to allow their manipulation in vivo. PhosphoTRAP, and subsequent pharmacological studies identified a T Type calcium channel may be a marker for leucine sensing cells. AgRP neurons are essential for feeding, and also play roles in controlling glucose homeostasis. Using chemogenetics to selectively activate these neurons, I demonstrated, in contrast to a similar, recently published study, that blood glucose concentrations did not rise upon activation of these neurons. A subpopulation of AgRP neurons express glucokinase, and some AgRP neurons are glucose inhibited, but the role of glucokinase in these neurons has not been characterised. Our lab generated an AgRP neuron specific glucokinase knock out mouse line. Preliminary results suggest 18 – 25 week old female AgRP glucokinase knock out mice may have altered glucose tolerance, but conclusions can only be drawn once further mice have been phenotyped, and the success of the glucokinase knock out from AgRP neurons has been confirmed.

As Stanniocalcinas (STC1 e STC2) são hormônios glicoproteicos originalmente encontrados em peixes teleósteos. Em mamíferos, esses hormônios são expressos em uma variedade de tecidos e estão envolvidos em processos como o transporte de cálcio e fosfato pelos rins e intestino, a carcinogênese, a reprodução e o crescimento. Recentemente, foram encontrados efeitos da STC1 e da STC2 no metabolismo intermediário. Sítios de ligação para a STC1 já foram identificados na membrana mitocondrial e resultados preliminares do nosso laboratório demonstraram que a STC1 possui um efeito inibitório sobre a gliconeogênese renal e tanto a STC1 quanto a STC2 diminuem a incorporação de 14C-glicose em 14CO2 no fígado e no músculo gastrocnêmio, respectivamente, de ratos. No entanto, o papel desses hormônios no metabolismo de aminoácidos permanece desconhecido. No presente trabalho, as ações da STC1 e da STC2 foram avaliadas no fígado e no músculo gastrocnêmio excisados de ratos machos (Rattus norvegicus, n=48 animais) de 300±50g, alimentados ad libitum. Os resultados obtidos mostram que a STC1, no fígado, diminuiu a captação do ácido 2-(metilamino)isobutírico, aumentou a atividade da bomba Na+/K+-ATPase, diminuiu a atividade da enzima malato desidrogenase mitocondrial e estimulou a síntese de glicogênio a partir da alanina. A STC2, no fígado, diminuiu a atividade da enzima malato desidrogenase mitocondrial, estimulou a síntese de proteínas a partir de leucina, e estimulou a síntese de glicogênio a partir de alanina. Já, no músculo, a STC2 estimulou a oxidação de leucina e a incorporação desse aminoácido em proteínas. Esses resultados confirmam a existência de ações das STC1 e STC2 no metabolismo de aminoácidos e sugerem, com exceção da ação da STC2 sobre a enzima malato desidrogenase, um papel anabólico para a STC2 em ambos os tecidos. A mesma afirmação não pode ser feita para a STC1, que apresentou efeitos antagônicos no tecido hepático. Por fim, o trabalho mostrou que as ações da STC1 e da STC2 sobre as vias metabólicas dos aminoácidos ocorrem com a utilização de doses muito baixas desses hormônios. / Stanniocalcins (STC) are glycoprotein hormones that were first discovered in teleostean fishes. In mammals, these hormones are expressed in a variety of tissues. Besides its role on the calcium and phosphate transport by the kidneys and intestine, they are involved in processes such as carcinogenesis, reproduction and growth. Recently it has been shown that STC1 and STC2 affect the control of intermediary metabolism. Binding sites for STC1 have been already identified in the mitochondrial membrane. Preliminary results of our laboratory showed that STC1 has an inhibitory effect on renal gluconeogenesis in rats and both STC1 and STC2 decrease the 14C-glicose incorporation into 14CO2 in the liver and the gastrocnemius muscle, respectively. Despite these evidences that STC1 and STC2 have a role in the control of glucose and lipids metabolism, the function of these hormones in amino acids metabolism remains unknown. In the present study, the STC1 and STC2 actions were evaluated in livers and gastrocnemius muscles excised from male rats (Rattus norvegicus, n=48 animals). The rats weighted 300±50g and were fed ad libitum. The results show that STC1 decreased 2-(metilamine)isobutyric acid uptake, increased Na+/K+-ATPase activity, decreased mitochondrial malate dehydrogenase activity and stimulated glycogen synthesis from alanine. All actions of STC1 were shown in the hepatic tissue and this hormone did not affect any parameter in muscular tissue. In the liver, STC2, decreased the mitochondrial malate dehydrogenase activity, stimulated protein synthesis from leucine and stimulated glycogen synthesis from alanine. In muscle, STC2 stimulated leucine incorporation into CO2 and proteins. These results confirm the regulatory role of STC1 and STC2 on amino acid metabolism in muscle and liver of rats. They suggest, with exception to the STC2 action into the hepatic malate dehydrogenase, an anabolic role for STC2 in both tissues. However this cannot be stated for STC1, which show antagonistic effects in the hepatic tissue. Lastly, another important finding of this study is that STC1 and STC2 actions on amino acid metabolism occur with low hormone concentrations.

O músculo estriado esquelético é uma entidade extremamente versátil, capaz de alterar seus padrões e características fenotípicas sob diversas condições, tais como, atividade neuromuscular, estimulação elétrica, idade, atividade hormonal e exercício físico. Sabe-se também que o balanço entre estímulos atróficos e hipertróficos controlam diretamente a massa muscular do indivíduo e estas variações implicam diretamente não apenas sobre o volume muscular, mas também conteúdo de proteínas e produção de força. Neste sentido, a atrofia muscular (perda de massa muscular) é caracterizada tanto pela diminuição na área de secção transversa das fibras musculares, como também pelo decréscimo no conteúdo de proteínas miofibrilares e consequente redução do volume muscular. Esta atrofia muscular pode ocorrer sob diversas condições clinicas e/ou patológicas, acarretando na diminuição ou perda da massa magra levando à uma consequente diminuição da atividade física, da qualidade de vida e inclusive pior resposta ao tratamento, ocasionando consequentemente aumento da mortalidade. Fica claro desta maneira, que, os métodos que visam a prevenção ou tratamento à atrofia muscular tem importante relevância clínica em muitos grupos de pacientes, além de ser um importante fator contribuinte na qualidade de vida e autonomia destes indivíduos. Com isso o estudo de determinados tratamentos que combatam a atrofia muscular torna-se de vital importância, dentre os quais, vem ganhando destaque o &#x3B2;Hidroxi &#x3B2;Metilbutirato (HMB). Deste modo teve-se como objetivo neste trabalho verificar a efetividade do HMB em prevenir a atrofia muscular induzida por dexametasona (DEXA). Para isto, foram utilizados 32 animais da linhagem Wistar com idade de 60 dias, distribuídos nos seguintes grupos: Grupo Experimental Placebo (GEP), n=8, tratados por 10 dias consecutivos com gavagem e injeção intraperitoneal, ambas contendo apenas solução salina; Grupo Experimental Dexametasona (GED), n=8, tratados por 10 dias consecutivos com gavagem contendo solução salina e injeção intraperitoneal contendo dexametasona; Grupo Experimental HMB (GEH), n=8, tratados por 10 dias consecutivos com gavagem contendo HMB e injeção intraperitoneal contendo solução salina; e Grupo Experimental Dexametasona + HMB (GEDH), n=8, tratados por 10 dias consecutivos com gavagem contendo HMB e injeção intraperitoneal contendo DEXA. Os animais foram acondicionados em caixas coletivas com 4 animais por caixa, com comida e agua à vontade em sala climatizada com temperatura de 22o e respeitando o ciclo de 12 horas claro/escuro. Finalizados os dez dias de tratamento, os animais foram eutanasiados para a coleta do material. Após as análises, as médias dos grupos para peso corpóreo dos animais, peso muscular e os valores da morfometria foram todos submetidos ao teste One-Way ANOVA, seguidos do Teste de Tukey, sendo o valor considerado estatisticamente significante de p<0,05. Ao final pôde-se concluir que, no delineamento experimental aqui aplicado, o HMB não foi capaz de atenuar ou prevenir a perda de peso corporal induzida pela DEXA, sendo que o efeito anticatabólico esperado pelo HMB não repercutiu no musculo EDL, contudo foi capaz de prevenir a atrofia no musculo sóleo. / The skeletal muscle is an extremely versatile entity, able to change their patterns and phenotypic characteristics under various conditions such as neuromuscular activity, electrical stimulation, age, hormonal activity and exercise. It is also known that the balance between atrophic and hypertrophic stimuli directly control the muscle mass of the individual and these changes directly affect not only on muscle volume, but also protein content and production strength. In this sense, muscle atrophy (loss of muscle mass) characterized by both, the decrease in cross-sectional area of muscle fibers, but also by decreasing the content of myofibrillar proteins and consequent reduction in muscle volume. This muscle atrophy may occur in various pathological conditions, resulting in decrease or loss of lean body mass leading to a consequent reduction in physical function, quality of life and even worse response to treatment, thus leading to increased mortality. It is clear in that way that the methods aimed at preventing or treating muscle atrophy has important clinical relevance in many groups of patients, as well as being a major contributing factor in the quality of life and autonomy of individuals. Thus, the study of certain treatments that combat muscle atrophy become of vital importance, among which highlight is winning the &#x3B2;-hydroxy-&#x3B2;-methylbutyrate (HMB). Thus, it is aimed in this study to assess the effectiveness of HMB to prevent muscle atrophy induced by dexamethasone (DEXA). For this, we used 32 Wistar animals aged 60 days, distributed in the following groups: experimental group Placebo (GEP), n = 8, treated for 10 consecutive days with gavage and intraperitoneal injection, both containing only saline. Experimental group Dexamethasone (GED), n = 8, treated for 10 consecutive days with gavage containing saline and intraperitoneal injection containing dexamethasone. Experimental group HMB (GEH), n = 8, treated for 10 consecutive days with gavage containing HMB and intraperitoneal injection containing saline solution and Experimental Group Dexamethasone + HMB (GEDH), n = 8, treated for 10 consecutive days with gavage containing HMB and intraperitoneal injection containing DEXA. The animals were placed in collective boxes with 4 animals per cage with food and water at will in a room with 22o temperature and respecting the light / dark 12-hour cycle. Completed the ten days of treatment, the animals were euthanized to collect the material. After the analysis, the mean body weight to groups of animals, muscle weight and values of morphometry were all subjected to one-way ANOVA followed by Tukey test, with the amount considered statistically significant at p <0.05. At the end, it could be concluded that the experimental design applied here, the HMB was not able to mitigate or prevent the loss of body weight induced by DEXA, and the anti-catabolic effect expected by HMB not reflected in the EDL muscle, but was able to prevent atrophy in the soleus muscle.

Alterações na musculatura esquelética (ME) como atrofia contribuem para intolerância aos esforços físicos e pior prognóstico na Insuficiência Cardíaca (IC). O treinamento físico é uma conduta capaz de atenuar esses efeitos na ME. Estratégias capazes de otimizar os efeitos do TF como a suplementação com aminoácidos são potencialmente terapêuticas. Assim, investigamos os efeitos da suplementação com leucina associada ou não ao treinamento físico aeróbico na função e morfologia da musculatura esquelética em camundongos com IC induzida por hiperatividade simpática. O TF consistiu de 4 semanas em esteira, com sessões de 60 min baseados na maxima fase estável de lactato (6 dias/sem) e administração de leucina (1.35g/kg) ou placebo (água destilada) via intra-gástrica. Os animais foram divididos em 5 grupos: controle sem IC (WT) e 4 grupos de camundongos knockout para receptores 2a e 2c adrenérgicos, divididos em sedentários recebendo placebo (KO) ou leucina (KOL); treinado+placebo (KOT) ou treinado+leucina (KOLT). Foram analisados tolerância ao esforço (teste máximo em esteira rolante), área de secção transversa (AST) por histoquímica para miosina ATPase, desempenho motor por teste de deambulação, grip e rotarod, expressão protéica por western blot. A suplementação com leucina isoladamente não demonstrou qualquer efeito na função muscular nem fenótipo das fibras. O TF melhorou à intolerância ao exercício, aumentou a área de secção transversa (AST) em fibras tipo I no músculo soleo e tipo IIA, IIB no músculo plantar, além de melhorar o desempenho motor. A suplementação com leucina associada ao TF otimizou a tolerância aos esforços, a AST nas fibras IIA e IIB e a função muscular. Em experimento à parte, após jejum de 18 horas, observamos que a resposta à leucina em estimular a via da mTOR estava atenuada nos animais KO, mas o TF restaurou essa resposta (diminuiu a razão p-AMPK:AMPK, e aumentou p-4EBP1: 4EBP1 e p-p70s6K:p70s6K). Essa reversão da resistência anabólica à leucina pelo TF não estava associada aos efeitos relacionados à homeostase de glicose, nem função renal, embora o TF tenha melhorado (reduziu proteinúria). Não houve efeitos deletérios da leucina nos parâmetros relacionados à homeostase de glicose, nem aos parâmetros renais. Os resultados sugerem que a suplementação com leucina potencializa os efeitos do treinamento físico aerobico por melhorar a tolerância ao exercício, preservar a massa em fibras de características predominantemente glicolíticas e prevenir queda no desempenho motor. O TF previniu a resistência anabólica à leucina no músculo esquelético dos animais com IC / Changes in skeletal muscle such as atrophy contribute to intolerance to physical exertion and worse prognosis in heart failure (HF). The exercise training (ET) will mitigate these effects in ME. Strategies to optimize and/ or mimic the effects of ET as the amino acid supplements are potentially therapeutic. Thus, we investigated the effects of leucine supplementation associated with ET on function and morphology of skeletal muscle in a genetic model of sympathetic hyperactivity-induced heart failure in mice, and whether these effects were associated with activation of mTOR pathway. Treatment consisted of 4-wk of ET on a motor treadmill, wich consisted in sessions of 60 min based on maximum lactate steady state (6d/wk), and administration of leucine (1.35g/kg) or placebo (distilled water) intragastrically. We established five groups: a control without heart failure (WT) and four groups of mice lacking both 2A and 2C adrenergic receptor subtypes, which were randomly divided into sedentary receiving placebo (KO) or Leucine (KOLT); trained receiving placebo (KOT) or trained receiving leucine (KOLT). It was analyzed exercise capacity by graded treadmill exercise protocol performed until exhaustion, cross-sectional area (CSA) by histochemical myosin ATPase, motor performance by ambulation, grip e rotarod tests, protein expression levels by western blot. The leucine supplementation alone showed no effect on muscle function or the phenotype of the fibers, but associated to ET improved CSA in IIA and IIB fibers in plantaris muscle, and motor performance, at a rate greater than improve in KOT. In separate experiments, after 18 hours fasting, we observed that the response to leucine stimulate mTOR pathway was attenuated in KO, but the ET restored this response (decreased the ratio p-AMPK, AMPK, and increased p-4EBP1 : p-p70S6K and 4EBP1, p70S6K). This reversal of anabolic resistance to leucine by ET was not associated with the effects related to glucose homeostasis or renal function, although the ET has improved (reduced proteinuria). There were no deleterious effects of leucine on the parameters related to glucose homeostasis or renal parameters. The results suggest that leucine supplementation enhances the effects of exercise training to improve exercise tolerance, preserve mass of fibers with characteristics predominantly glycolytic and prevent worsening of motor performance. The ET prevents an anabolic resistance to leucine in muscle of HF animals

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T11:23:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Filiputti_Eliane_D.pdf: 3662221 bytes, checksum: e40ea0446558f8556a8352fd8c98a5fc (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Suspeita-se que a desnutrição intra-uterina e pós-natal produzam mudanças morfológicas e funcionais no pâncreas endócrino e em tecidos periféricos, que se traduzem em insulinopenia e resistência à insulina. Baseado nessas complicações avaliou-se neste trabalho a regulação da secreção de insulina em ilhotas de Langerhans de ratos e camundongos submetidos à restrição protéica e suplementados com leucina. A suplementação com leucina não modificou hábitos alimentares, ingestão hídrica e o peso corpóreo dos animais em estudo, mas alterou parâmetros bioquímicos importantes como glicose (G), ácidos graxos (AGL) em animais desnutridos. A fosforilação do receptor de insulina (IR) e de seu substrato (IRS-l) foi modificada em fígado e músculo levando a uma melhoria na homeostasia glicêmica em ratos desnutridos, a metabolismo de glicose em ilhotas de ratos controle e desnutridos teve redução após suplementação, a potencial de membrana das células B foi restaurado, o movimento de cálcio citoplasmático e a secreção de insulina estimulada por G e leucina apresentaram aumentados em ilhotas de ratos e camundongos desnutridos. Alterações ocorreram também no perfil eletroforético de proteínas citoplasmáticas após suplementação com leucina em ilhotas de ratos. Expressão gênica e protéica de proteínas chaves na cascata de sinalização de insulina como IR, IRS-l, PI3K, mTaR e S6K-l se alteraram em resposta à suplementação com leucina em ilhotas de ratos desnutridos, favorecendo vias de crescimento, em especial o aumento da PI3K a qual resultou em aumento de sua atividade em ilhotas de ratos controle e desnutridos. Por fim, podemos concluir que a suplementação com leucina promoveu modulação da sensibilidade periférica em fígado e músculo de maneira tecido específica. Isto confere uma regulação da homeostase glicêmica de maneira distinta entre animais controle e desnutridos suplementados. Além disso, direcionam para que os sinais metabólicos produzidos pela leucina devam promover seus efeitos, em ilhotas de Langerhans, via dois sensores: a GDH que controla a glutaminólise, e por outro lado está a PI3K que deve exercer seu papel, ativando vis envolvidas com a síntese protéica através da mTOR. Estes dois sensores devem atuar sinergicamente participando do rearranjo da concentração citosólica dos íons cálcio, principalmente em ilhotas de animais desnutridos que foram suplementados com leucina / Abstract: We think that intra-uterine mal nutrition and after birth produce morphological and changes in endocrine pancreas and in peripheric tissue that translate insulinopenia and insulin resistance. Based on these complications we have evaluated in this work the insulin secretion regulation in Langerhans islets from rats and mice fed a low protein diet and supplemented with leucine. The leucine supplementation hasn't changed the diet in the hybrid ingest and body weight but has changed important biochemistry standards as glucose (G) and FFA in malnutrition animals. The insulin receptor phosphorilation and its substract have been changed in liver and musc1e leading to an increase in glicemic homeostase in malnutrition rats. The glucose metabolism in control and malnutrition rats' islets had one reduction after supplementation. B cells potential membranes were restored; the citoplasmatic ca1cium movement and insulin secretion were stimulated by glucose and leucine. They have showed an increased in islets of control and malnourished rats and mice islets. Some alterations have also occurred in the citoplasmatic protein eletrophoretic profile after leucine supplementation in rats islets. The genetic and protein expression from key enzymes in the insulin cascade signalization as: IR; IRS-l; PI3K; mTOR and S6K-l have altered in leucine supplementation answer in malnutrition islets rats favoring growth pathways specially PI3K increase which resulted in an increasement of control and malnutrition rats islets activity. In the end we can conc1ude that the leucine supplementation has promoted peripheric sensibilization in liver and muscle in specific tissue manner. This confirms one glicemic homeostase regulation in distinct manner among control and malnutrition both supplemented animals. Furthermore they lead the metabolic signals produced by leucine should promote their effects in Langerhans islets throw sensor ways: GDH which controls glutaminolisis and on the otherhand is PI3K that should do its role activating growth pathways throw mTOR. These two sensors should work in synergism participating in citosolic concentration changes of ca1cium ions mainly in malnutrition animals' islets, which were supplemented. / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Cristina Gomes Marcondes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:32:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Salomao_EmilianneMiguel_D.pdf: 2085353 bytes, checksum: b304c86280f34965140b320d344cce46 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A intensa mobilização de substratos dos tecidos da carcaça do hospedeiro, em função do crescimento neoplásico, promove no organismo o estado caracterizado como caquexia. Presente na maioria dos pacientes com câncer, a caquexia promove intensa perda involuntária de peso decorrente, preferencialmente, da depleção da proteína muscular em função do aumento da degradação e/ou da diminuição da síntese protéica, culminando na redução da qualidade e expectativa de vida. Sabendo-se que a leucina (BCAA) é utilizada como fonte energética pelo músculo esquelético, podendo ser transaminada e oxidada para produzir acetil-CoA, caracterizada, também, como precursora da gliconeogênese, a partir da sua degradação e formação de alanina no músculo e age, principalmente, como sinalizadora celular e que o exercício físico promove aumento do consumo de glicose, diminuindo assim os níveis de glicose e insulina circulantes, conseqüentemente, reduzindo a oferta desse substrato às células tumorais. Temos por principal interesse minimizar as alterações metabólicas do tecido hospedeiro frente ao crescimento do carcinossarcoma de Walker associado ao exercício físico aeróbio de intensidade leve a moderada e suplementação nutricional de leucina, avaliando o metabolismo protéico, através de analise do processo de síntese e catabolismo protéico, e o metabolismo glicídico, analisando-se a via glicolítica e receptor de glicose muscular, bem como a concentração sérica de citocinas, em ratos Wistar. Desse modo nossos resultados verificamos: 1) Diminuição do ganho de peso corpóreo após o implante tumoral. 2) Diminuição da síntese e aumento da degradação protéica muscular acompanhada com menor conteúdo de proteína e expressão de miosina. 3) Consequente, aumento da expressão das subunidades ubiquitina-proteossomo. 4) Aumento das citocinas pró-inflamatórias. 5) Redução da concentração sérica de glicose, insulina e aumento de glucagon. 6) Redução da expressão gênica do transportador de glicose muscular, Glut-4. 7) Diminuição do diâmetro da fibra muscular esquelética. Já a suplementação nutricional com leucina e/ou exercício físico, a longo prazo, promove nos animais com tumor: 1) Melhora no ganho de peso corpóreo, com redução do peso tumoral em alguns grupos. 2) Diminui a degradação muscular esquelética, associada a maior expressão de miosina muscular. 3) Melhora a concentração de citocinas próinflamatórias. 4) Melhora a expressão gênica de transportador de glicose muscular, Glut- 4. 5) Melhora, também, o diâmetro da fibra muscular / Abstract: The intense nutrients mobilization of host tissues, due to neoplastic growth, leads to host cachexia state. Most cancer patients have cachexia, which is characterized by involuntary weight loss through increase in protein muscle depletion and decrease in protein synthesis process. In these cases, there is reduction in quality and life expectancy. Leucine (BCAA) is used as an energy source by skeletal muscle, precursor of gluconeogenesis or acts as cell signaling and physical exercise promotes increased consumption of glucose, reducing the levels of circulating glucose and insulin, providing less supply of substrate to tumour. In this work, our main interests were to minimize the metabolic alterations in tumor-bearing host associated with nutritional supplementation of leucine and moderate aerobic exercise during Walker 256 tumour growth and whether this association could avoid or protect muscular depletion, analyzing protein metabolism through protein synthesis and catabolism process, and muscle carbohydrate metabolism through analysis of glucose metabolism, by evaluating glycolytic pathway and muscle glucose receptor in rats. Thus our results found: 1) Decrease in body weight gain after tumor implantation. 2) Decreased synthesis and increased muscle protein degradation accompanied with lower protein content and expression of myosin. 3) Accordingly, increased expression of ubiquitin-subunits proteosome. 4) Increase of pro-inflammatory cytokines. 5) Reduction of serum glucose, insulin and glucagon increase. 6) Reduction of gene expression of muscle glucose transporter, Glut-4. 7) Decrease in diameter of skeletal muscle fibers. Since dietary supplementation with leucine and / or exercise in the long run, promote the animals with tumor: 1) Improvement in body weight gain, reducing the tumor burden in some groups. 2) Decrease in skeletal muscle degradation, associated with increased expression of muscle myosin. 3) Improve the concentration of pro-inflammatory cytokines. 4) Improve the gene expression of muscle glucose transporter, Glut-4. 5) It also improves the diameter of muscle fiber / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:09:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amaral_AndressaGodoy_M.pdf: 1309340 bytes, checksum: bcfd538431ee4e55300f80aa0acafa62 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Restrição protéica pós-desmame induz redução na liberação de insulina, resultado de alterações morfo-fisiológicas nas ilhotas de Langerhans. Leucina, aminoácido chave de nosso estudo, exerce uma modulação importante no processo de secreção de insulina e síntese protéica. Camundongos swiss com 21 dias receberam dieta normoprotéica ¿ 17% (C) ou hipoprotéica ¿ 6% (D) por 60 dias. Em seguida, os grupos foram redivididos e receberam leucina 1,5% (Leu) na água de beber por 30 dias (CL e DL). Caracterizamos o modelo de restrição protéica através da avaliação de parâmetros bioquímicos plasmáticos e de teste de tolerância à glicose e à insulina. Avaliamos nas ilhotas desses animais a secreção de insulina frente a diferentes secretagogos, a expressão de proteínas chaves envolvidas no processo de regulação da secreção de insulina, a sobrevivência celular e as oscilações citoplasmáticas de cálcio. Os animais desnutridos se mostraram mais sensíveis à insulina e com melhor captação periférica de glicose, sendo que a Leu não influenciou neste parâmetro. Frente aos estímulos testados: glicose, carbacol, leucina e KIC, as ilhotas dos animais D secretam significativamente menos insulina quando comparados com C e com exceção do KIC, a Leu influenciou na secreção de insulina principalmente no grupo DL. A expressão das proteínas: M3, PKC, PKA, canal de cálcio, AKT e p-AKT se mostraram diminuídas nos animais D e a Leu aumentou os níveis de expressão principalmente no DL. Avaliamos também a viabilidade celular das ilhotas e não houve diferença entre os grupos, observamos apenas uma tendência de diminuição no D. Por fim, verificamos que a restrição protéica modificou o padrão oscilatório de cálcio das ilhotas frente à glicose e carbacol, produzindo ondas rápidas com baixa amplitude e alta frequência. A Leu teve efeito contrário, produzindo ondas lentas com alta amplitude e baixa frequência, sugerindo maior mobilização de cálcio e secreção de insulina nos animais tratados. Concluímos que a restrição proteíca durante os estágios iniciais de vida induz diversas alterações nas ilhotas de camundongos que causam comprometimento de processos essenciais como secreção de insulina e síntese protéica. A Leu restaura parcial ou totalmente a secreção de insulina prejudicada nos animais desnutridos, pois proporciona maior aporte energético para a célula e mais importante, nossos resultados mostraram que a Leu estimula a síntese protéica e restaura os níveis de expressão de proteínas chaves do processo de secreção de insulina nas ilhotas dos animais desnutridos, explicando a melhora na secreção de insulina encontrada nos animais DL / Abstract: Protein restriction after weaning induce reduced insulin release, as a result of morpho-physiologic alterations in the islets of Langerhans. Leucine, the aminoacid investigated in our study, modulates insulin secretion process as well as protein synthesis. Twenty-one days-old Swiss mice received normoproteic ¿ 17% (C) or hipoproteic diet ¿ 6% (D) for 60 days. Then, the groups were further divided and part of the animals received leucine 1.5% (Leu) into the drinking water for 30 days (CL and DL). This model of protein restriction was characterized through plasmatic biochemistry analysis and glucose and insulin tolerance tests. Islets were evaluated for insulin secretion stimulated by different secretagogues, expression of proteins involved in the process of insulin secretion regulation, cellular survival and citoplasmatic calcium oscillations. The malnourished animals (D and DL) were more sensitive to insulin and had improved peripheral glucose uptake, with no Leu influence. In response to: glucose, carbachol, leucine and KIC, the islets of the D group secreted less insulin compared to the C group and, except for KIC, Leu influenced insulin secretion, mainly in the DL group. The expression of the proteins: M3, PKC, PKA, calcium channel, AKT and p-AKT were reduced in the D animals and Leu increased the expression of these proteins mainly in the DL animals. We have also evaluated the cellular viability of the islets, and no difference among the groups was observed. Finally, we observed that the protein restriction modulates the calcium oscillations in response to stimulation of glucose and carbachol resulting in high-frequency and low-amplitude oscillations. Leu had the opposite effect resulting in high-amplitude and low-frequency oscillations, which suggests bigger ion traffic and insulin secretion. We concluded that protein restriction during the early stages of life cause alterations in mice islets of Langerhans that compromise essential process such as insulin secretion and protein synthesis. Leu recovers partial or completely insulin secretion in the malnourished animals by increasing cells energy stocks and most importantly, our results showed that Leu stimulates protein synthesis and restores the expression of key proteins in the process of insulin secretion in the islets of malnourished animals, explaining the improvement in insulin secretion found in the DL animals / Mestrado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

A suplementação com leucina pode ser uma forma de terapia importante para a regeneração do tecido muscular lesado, pois modula vias intracelulares reguladoras da massa muscular. Neste estudo, ratos Wistar tiveram os músculos soleus e TA da pata esquerda submetidos à criolesão. Os animais foram divididos em controle e suplementados com leucina (1,35 g/kg por dia), a qual teve início três dias antes da criolesão e prosseguiu por um, três, 10 e 21 dias. A leucina aumentou a AST das fibras no soleus e reduziu o processo inflamatório e a fibrose em ambos, além de reduzir a ativação de elementos da via TGF-&beta;/Smad. A leucina também aumentou o número de células satélites em proliferação no soleus e acelerou a conversão das isoformas de MyHC em ambos, tendo aumentado a taxa de síntese proteica no TA. Entretanto, não houve elevação na expressão de elementos da via PI3K/Akt/mTOR. Observou-se redução da ativação de FoXO3a e do acúmulo de proteínas ubiquitinadas no soleus, além de maior atividade do proteassomo 26S. A leucina também atenuou o prejuízo funcional em ambos. / Leucine supplementation can be an important therapy for the regeneration of injured skeletal muscle tissue, for modulating intracellular pathways regulating muscle mass. In this study, rats had their soleus and TA muscles of the left hind limb damaged. The animals were divided into control and supplemented with leucine groups (1.35 g / kg per day), which started three days before damage and continued for 1, 3, 10 and 21 days. Leucine increased myofiber CSA in soleus and reduced inflammation and fibrosis on both, and reduced the activation of TGF-&beta;/Smad signaling pathways. Leucine also increased the number of proliferating satellite cells in the soleus, accelerated the conversion between MyHC isoforms, and in rate of protein synthesis in the TA. However, no elevation on PI3K/Akt/mTOR signalling pathway was observed. There was a reduction on FoXO3a activation and ubiquitinated proteins accumulation in the soleus and an increase in the 26S proteasome activity. Leucine also attenuated the functional impairment on both muscles.

Investigar os efeitos do consumo de leucina sobre a adiposidade e a funcionalidade do tecido adiposo branco em ratos alimentados com dietas controle ou hiperlipídicas (HL). Ratos obesos foram submetidos a 6 semanas de suplementação com leucina. Ao final, podemos observar que a leucina exerceu efeitos distintos, dependente da condição metabólica em vários parâmetros relacionacidos como a adiposidade. Estas respostas foram pronunciadas no grupo de animais alimentados com dieta HL e suplementados com leucina, principalmente pela maior massa adiposa em diferentes coxins adiposos, maior hipertrofia de adipócitos da região subcutânea (SC), incremento na síntese de novo de ácidos graxos em adipócitos SC, bem como, aumento na incorporação de ácidos graxos em adipócitos SC. Além disso, observamos efeitos da leucina sobre a expressão gênica de PPAR<font face=\"symbol\">g, GPAT, FABP e PEPCK no tecido adiposo SC. Assim, foi demonstrado que a leucina quando utilzada em modelo de obesidade e resistência à insulina acaba favorecendo maior incremento da massa de gordura SC via PPAR<font face=\"symbol\">g. / Investigate the effects of leucine consumption on adiposity and functionality of white adipose tissue in rats fed with control or hyperlipidic (HL) diets. After obesity characterization, animals were submitted to 6 weeks of leucine supplementation. At the end, we could observe that leucine exerted distinct effects, depending on the metabolic condition in several parameters related to adiposity. These responses were more pronounced in animalsfed with HL diet and supplemented with leucine, mainly due to higher adipose mass in different fat pads, larger adipocytes in subcutaneous fat (SC), increase of de novo fatty acids synthesis, as well as, an increase in fatty acids incorporation in SC adipocytes. Furthermore, we observed effects of leucine supplementation on PPAR<font face=\"symbol\">g, GPAT, FABP and PEPCK gene expression in SC fat. Thus, it was demonstrated that leucine supplementation, when used in an obesity and insulin resistance model, favors the increase of adipose mass in SC fat via PPAR<font face=\"symbol\">g.

Neste trabalho, avaliamos os efeitos da suplementação crônica de leucina e do treinamento de força sobre a miopatia diabética. 40 ratos machos da linhagem Wistar Hannover foram distribuídos em 5 grupos: controle, não diabético (C), diabético não tratado (D), diabético treinado (DT), diabético suplementado com leucina e treinado (DLT). O início das intervenções ocorreu na 4ª semana de vida dos animais, e perdurou por 8 semanas. Foram avaliados: massa corporal, consumo de ração e água, concentrações sanguíneas de glicose, insulina e perfil lipídico; capacidade funcional muscular voluntária através de testes de força de preensão e de ambulação; conteúdo intracelular de proteínas relacionadas à via anabólica mTOR e p70S6K, totais e fosforiladas, no músculo extensor longo dos dedos. Os ratos diabéticos não tratados (grupo D) apresentaram hiperglicemia e hipoinsulinemia moderada, menor massa corporal, maior consumo de ração e água, menor peso absoluto dos músculos extensor longo dos dedos e gastrocnêmio, menor força de preensão, menor capacidade de ambulação e menor atividade das proteínas mTOR e p70S6K comparado ao grupo C, o que caracteriza o quadro de miopatia diabética. O peso relativo do músculo gastrocnêmico (peso absoluto/100g de peso do animal) foi maior nos grupos DT e DLT comparado com o grupo D, e maior no grupo DLT comparado com o grupo DL (p < 0,05). Não houve diferença estatística entre os grupos DL e D sobre os pesos relativos dos músculos, ou seja, a suplementação crônica de leucina não afetou este parâmetro nos ratos diabéticos. Interessantemente, houve diferença estatística entre os grupos DL e D sobre a força muscular (p < 0,05), sem haver diferença entre grupos DL e C quanto à glicemia; ou seja, a dieta suplementada com leucina foi capaz de controlar a glicemia e atenuar a perda de força muscular. O treinamento de força também controlou a glicemia, recuperou a força muscular e melhorou a capacidade de ambulação, bem como a regulação da via mTOR-p70S6K. A fosforilação da via mTOR-p70S6K foi maior nos grupos DT e DLT comparado com o grupo D (p < 0,05), e sem diferença entre estes grupos treinados e o grupo C, sugerindo que o treinamento de força combinado com a suplementação de leucina recuperou a atividade da via do mTOR-p70S6K nos animais diabéticos, que pode refletir em maior síntese proteica muscular. O colesterol total do grupo D foi maior comparado com o do grupo C; e nos grupos diabéticos treinados (DT e DLT), este parâmetro foi menor do que no grupo D (p < 0,05). Adicionalmente, o HDL-c aumentou nos grupos treinados (DT e DLT) quando comparado com o grupo D, mas não alterou no grupo que recebeu apenas a suplementação de leucina (grupo DL). Portanto, neste estudo, a suplementação crônica de leucina por si só normalizou a glicemia e melhorou a força muscular dos animais diabéticos. Além disso, o treinamento de força foi responsável pelo maior aumento de força e da massa muscular, bem como pela normalização da glicemia, pela elevação da concentração de HDL-c e pela redução do colesterol total dos animais diabéticos e ambas foram capaz de recuperar a via mTOR-p70S6K. / In this study, we evaluated the effects of chronic supplementation with leucine and resistance training on diabetic myopathy. 40 Wistar Hannover rats were divided into 5 groups: control, non-diabetic (C), untreated diabetic (D), trained diabetic (DT), diabetic supplemented with leucine and trained (DLT). The beginning of the interventions occurred in the 4th week of life of the animals, and lasted for 8 weeks. Were evaluated: body weight, food and water intake, blood concentrations of glucose, insulin and lipid profile; voluntary muscle functional capacity through grip strength and ambulation test; intracellular content of proteins related to the anabolic mTOR and p70S6K pathway, total and phosphorylated in the extensor digitorum longus muscle. Diabetics untreated mice (group D) had hyperglycemia and moderate hypoinsulinemia, lower body mass, food and water intake, reduced absolute weights of the muscles of the long extensor digitorum, and gastrocnemius, the lower grip strength, lower ambulation capacity and lower activity of mTOR and p70S6K protein compared the C group, featuring diabetic myopathy. The relative weight of the gastrocnemius muscle (absolute weight / 100g of body weight) was greater in DT and DLT groups compared with group D, and higher in the DLT group compared to the DL group (P < 0.05). No statistical difference between the DL and D groups on the relative weights of the muscles, that is, chronic supplementation of leucine did not affect this parameter in diabetic rats. Interestingly, there was statistical difference between the DL and D groups on muscle strength (P < 0.05), with no difference between groups DL and C on the blood glucose; that is, the diet supplemented with leucine was able to control glycemia and avoid loss of muscle strength of diabetic animals. Resistance training also controlled glycemia, recovered muscle strength and improved the capacity of ambulation of diabetic animals and the regulation of the mTOR-p70S6K pathway. The phosphorylation of mTOR-p70S6K pathway was higher only in the DT and DLT groups compared with the D group (P < 0.05), and no difference between the DT and C groups, suggesting that the training recovered muscle mass in diabetic animals. Total cholesterol was greater in Group D compared to the group C; and trained diabetic groups (DLT and DT), this parameter was lower than that of the D group (P < 0.05). In addition, HDL-C increased in trained groups (DT and DLT) as compared to group D, but had no effect the group that received only leucine supplementation (DL group). Therefore, in this study, chronic supplementation of leucine alone normalized glucose and improved muscle strength of diabetic animals. In addition, resistance training was responsible for the largest increase in strength and muscle mass, as well as the normalization of glucose, elevated concentrations of HDL-C and reduction in total cholesterol of animals diabetics and both were able to recover mTOR- p70S6K pathway.