A viabilidade econômica da produção de etanol de segunda geração (2G) depende do desenvolvimento de tecnologias eficientes e baratas para a hidrólise da biomassa lignocelulósica. Em particular, o grande consumo de água nas plantas de processamento de biomassa pode inviabilizar o processo. As xilanases são enzimas chave na hidrólise enzimática da xilana para a produção de etanol 2G e atualmente é grande o interesse na identificação de xilanases tolerantes a altas concentrações salinas, bem como aos subprodutos de etapas de pré-tratamento da biomassa, o que permitiria reduzir o volume de água empregado em etapas de lavagem e/ou a substituição da água doce pela água do mar. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram a purificação e caracterização bioquímica e cinética de uma endo-xilanase halotolerante e termoestável produzida por uma linhagem de C. graminicola isolada da floresta Amazônica (Brasil). A enzima pura (Excg1) apresentou massa molecular aparente de 20,0 ± 2,4 kDa em SDS-PAGE e 17,3 ± 1,9 kDa por filtração em gel, sugerindo que a enzima nativa é monomérica. O teor de carboidratos totais de Excg1 foi de 97,0 ± 3,7 % (m/m) e o seu ponto isoelétrico correspondeu a 9,200 ± 0,018. A enzima manteve cerca de 85% da atividade controle na presença de NaCl 0,5 mol/L. Em ausência e presença de NaCl em concentração 0,5 mol/L a temperatura e o pH ótimos de atividade de Excg1 foram 65 ºC e 5,5, respectivamente, enquanto na presença de NaCl 2,5 mol/L o pH ótimo foi alterado para 6,0. Excg1 mostrou-se bastante termoestável a 50ºC, com tempo de meia-vida de 48 h na ausência do substrato. Já na presença de NaCl 2,5 mol/L a termoestabilidade foi substancialmente maior, com atividade residual de 75% após o mesmo intervalo de tempo. Excg1 apresentou excelente estabilidade na faixa de pH de 3,0-10,0 na ausência de sal, mantendo-se também completamente estável entre pH 4,0 e 10,0 na presença de NaCl em concentração 0,5 e 2,5 mol/L. Os parâmetros cinéticos determinados para a hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 na ausência de NaCl foram Vmax= 481,3 ± 34,0 U/mg e KM= 3,7 ± 0,3 mg/mL, resultando em eficiência catalítica (kcat/KM) de 36,9 mL/s.mg. Parâmetros muito similares foram determinados na presença de NaCl 0,5 mol/L, porém em presença do sal em concentração 2,5 mol/L ocorreu diminuição da afinidade aparente pelo substrato e redução da velocidade máxima, resultando em eficiência catalítica 2,3 vezes menor. Já a hidrólise de xilana Birchwood em ausência de sal ocorreu com constante de afinidade aparente similar e eficiência catalítica cerca de 18% maior, se comparada à hidrolise de xilana Beechwood na mesma condição. Excg1 foi tolerante a K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ e Sr2+ em concentração 10 mmol/L, além de Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ em concentração 1 mmol/L. Além disso, Excg1 foi tolerante a diferentes solventes orgânicos e a acetato. A análise dos produtos de hidrólise de xilana Beechwood por Excg1 revelou que os produtos principais formados foram xilobiose e xilotriose com uma ramificação de ácido 4-O-metilglucurônico. A presença de NaCl 0,5 mol/L não afetou este padrão de hidrólise e a enzima mostrou também boa tolerância aos produtos de hidrólise. Em conjunto, as propriedades de Excg1 sugeriram bom potencial de aplicação na sacarificação da biomassa lignocelulósica, particularmente em condições de salinidade elevada e/ou em presença de resíduos de etapas de pré-tratamento, o que é potencialmente interessante para viabilizar economicamente processos de produção de etanol 2G. / The economic viability of the production of second-generation (2G) ethanol depends on the development of efficient and inexpensive technologies for the hydrolysis of lignocellulosic biomass. In particular, the large consumption of water in the biomass processing plants can make the process unfeasible. The xylanases are key enzymes in the enzymatic hydrolysis of xylan aiming the production of 2G ethanol and there is currently great interest in identifying xylanases tolerant to high salt concentrations and to the byproducts from biomass pretreatment steps, allowing the reduction of the volume of water used in washing steps and/or the replacement of fresh water by sea water. In this context, the objectives of this work were the purification and the biochemical and kinetic characterization of a salt-tolerant and thermostable endoxylanase produced by a strain of C. graminicola isolated from the Amazon forest (Brazil). The pure enzyme (Excg1) showed apparent molecular mass of 20.0 ± 2.4 kDa by SDS-PAGE and 17.3 ± 1.9 kDa by gel filtration, suggesting that the native enzyme is monomeric. The total carbohydrate content of Excg1 was 97.0 ± 3.7% (m/m) and its isoelectric point corresponded to 9.200 ± 0.018. The enzyme retained approximately 85% of control activity in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl. In the absence and presence of NaCl at 0.5 mol.L-1 concentration, the optimum reaction temperature and pH of Excg1 were 65 ° C and 5.5, respectively, while in the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the optimum pH was altered to 6.0. Excg1 was highly thermostable at 50 °C, with a half-life of 48 h in the absence of substrate. In the presence of 2.5 mol.L-1 NaCl the thermal stability was greatly increased, and a residual activity of 75% was determined after 48 h at 50 ºC. Excg1 showed excellent stability in the pH range from 3.0 to 10.0 in the absence of salt, and was likewise completely stable at pH 4.0-10.0 in the presence of NaCl at the concentrations 0.5 mol.L-1 and 2.5 mol.L-1. The kinetic parameters for the hydrolysis of Beechwood xylan by Excg1 in the absence of salt were Vmax = 481.3 ± 34.0 U.mg-1 and KM = 3.7 ± 0.3 mg.mL-1, with a catalytic efficiency (kcat/KM) of 36.9 mL.s-1.mg-1. Similar parameters were determined in the presence of 0.5 mol.L-1 NaCl, while in the presence of a higher salt concentration (2.5 mol.L-1) decreases in the apparent affinity for the substrate and in the maximum velocity were observed, resulting in a catalytic efficiency 2.3 fold lower. In comparison with Beechwood xylan, the hydrolysis of Birchwood xylan in the absence of salt occurred with similar apparent affinity and catalytic efficiency about 18% greater. Excg1 was tolerant to 10 mmol.L-1 K+, Na+, Pb2+, Ni2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Co2+, Ca2+ or Sr2+, and also to Cu2+, Al3+, Cr3+ e Fe3+ at 1 mmol.L-1 concentration. Furthermore, the enzyme was tolerant to various organic solvents and acetate. The analysis of Beechwood xylan hydrolysis products by Excg1 revealed that the main products were xylobiose and xylotriose with a 4-O-methylglucuronic acid branch. The presence of 0.5 mol.L-1 NaCl has not affected the hydrolysis pattern and the enzyme showed good tolerance to the hydrolysis products. Altogether, the properties of Excg1 suggested good potential for the saccharification of lignocellulosic biomass, particularly under high salinity conditions and/or in the presence of residues of pre-treatment steps, which is potentially interesting for the economically viable production of 2G ethanol.

Este trabalho teve como objetivo principal o aproveitamento dos resíduos agroindustriais provenientes da extração do pigmento de cúrcuma e do óleo de babaçu para elaboração de filmes biodegradáveis. Foram utilizados três diferentes métodos (moagem em meio ácido AS, em meio alcalino KS e em água WS) para isolamento do amido de babaçu e de cúrcuma. Os resíduos e amidos foram caracterizados em composição química, cor, distribuição do tamanho de partícula, difração de raios-X, microscopia eletrônica de varredura, poder de inchamento e solubilidade, espectroscopia de infravermelho, propriedades térmicas, teor de compostos fenólicos e atividade antioxidante. Os métodos AS e KS forneceram materiais com maior grau de pureza, porém menor teor de amilose. Filmes foram elaborados a partir dos amidos de cúrcuma e de babaçu, e também do mesocarpo de babaçu e tiveram suas propriedades mecânicas, funcionais e ativa determinadas. Filmes elaborados com os amidos de babaçu são mais resistentes e rígidos, menos elongáveis, solúveis e permeáveis ao vapor de água que com mesocarpo de babaçu. Filmes de amido de babaçu WS foram mais resistentes e rígidos, menos flexíveis, mais cristalinos, menos solúveis em água e hidrofílicos, com menor capacidade de absorção de água. Filmes de amido de babaçu AS apresentaram maior atividade antioxidante. O efeito de diferentes plastificantes (glicerol, sorbitol, ureia e glicose) nas propriedades dos filmes de amidos de babaçu também foi estudado. Notou-se que as propriedades finais dos filmes dependeu da interação entre os componentes na matriz: plastificante, amido e água. Para o babaçu também se realizou um estudo sobre os efeitos da concentração de sorbitol (Cs) e da temperatura de aquecimento (Ta) nas propriedades dos filmes através de um planejamento experimental 22 utilizando a metodologia de superfície de resposta e análise de multiresposta para avaliação dos resultados. As regiões sugeridas para se obter filmes com melhores propriedades foram: 26 a 30 g de sorbitol/100 g de amido acompanhado de temperatura de aquecimento de 78 a 80 °C. Para a cúrcuma, apesar do processo de isolamento do amido obter altos teores deste carboidrato (~80%), o material se apresenta bem compactado devido ao processamento industrial com presença de aquecimento. Assim, filmes elaborados com amidos de cúrcuma exigiram 4 h de aquecimento para o seu processamento. Filmes de amido de cúrcuma WS apresentaram maior flexibilidade, menor xxv resistência e rigidez, maior solubilidade e molhabilidade e os filmes de amido de cúrcuma AS, maior atividade antioxidante. Foram elaboradas também blendas com os diferentes amidos de cúrcuma com fécula de mandioca em diferentes proporções (30:70, 50:50 e 70:30). As blendas possibilitaram a elaboração de materiais com menor tempo de preparo (1 h). A adição de fécula de mandioca nas blendas diminuiu a resistência mecânica e rigidez, mas aumentou a elongação, solubilidade e permeabilidade ao vapor de água enquanto que a adição de amido de cúrcuma proporcionou aumento da atividade antioxidante nestes materiais. Também fora realizado tratamentos (mecânicos/químicos) do resíduo de cúrcuma com o objetivo de tornar este material com melhor capacidade filmogênica. Estes tratamentos permitiram melhor incorporação do material lignocelulósico à matriz do filme e liberação do amido, além de ter promovido oxidação do amido causando a formação de novos grupamentos (carboxílicos e carbonílicos), o que permitiu obter filmes com melhores propriedades que os elaborados com amido de cúrcuma / The main objective of this work was the use of agroindustrial residues from the extraction of turmeric pigment and babassu oil for the preparation of biodegradable films. Three different methods (steeping in acid media - AS, in alkaline media - KS and in water - WS) were used to isolate babassu and turmeric starch. The residues and starches were characterized in centesimal composition, color, particle size distribution, X-ray diffraction, scanning electron microscopy, swelling power and solubility, infra-red spectroscopy, thermal properties, phenolic compounds content and antioxidant activity. The AS and KS methods provided materials with higher purity but less amylose content. Films were made from the turmeric and babassu starches, and also from the babassu mesocarp and had it mechanical, functional and active properties determined. Films made from babassu starches are more resistant and rigid, less flexible, soluble and permeable to water vapor than with babassu mesocarp. WS babassu starch films were more resistant and rigid, less flexible, more crystalline, less water soluble and hydrophilic, with less water absorption capacity. AS babassu starch films showed the highest antioxidant activity. The effect of different plasticizers (glycerol, sorbitol, urea and glucose) on the properties of babassu starch films was also studied. It was noted that the final properties of the films depended on the interaction between the components in the matrix: plasticizer, starch and water. A study on the effects of sorbitol concentration (Cs) and heating temperature (Ta) on the properties of the films was also carried out for the babassu through an experimental design 22 using the response surface methodology and multi-response analysis for evaluation of the results. The regions suggested to obtain films with better properties were: 26 to 30 g of sorbitol / 100 g of starch accompanied by a heating temperature of 78 to 80 °C. For turmeric, although the starch isolation process obtained high levels of this carbohydrate (~ 80%), the material presents well compacted due to industrial processing with presence of heating. Thus, films made with turmeric starches required 4 h of heating for processing. Turmeric WS starch films showed greater flexibility, lower strength and stiffness, higher solubility and wettability and the films of turmeric starch AS, higher antioxidant activity. Blends with the different turmeric starches with cassava starch in different proportions (30:70, 50:50 and 70:30) were also prepared. The blends made possible the preparation of materials with less preparation time (1 h). The addition of cassava starch to the blends decreased xxvii mechanical rigid and mechanical resistance, but increased elongation, solubility and water vapor permeability while the addition of turmeric starch provided increased antioxidant activity in these materials. It was done also treatments (mechanical / chemical) in the turmeric residue to have this material with better filmogenic capacity. These treatments allowed better incorporation of the lignocellulosic material to the matrix of the film and release of the starch, besides promoting oxidation of the starch causing the formation of new groups (carboxylic and carbonylic), which allowed to obtain films with better properties than those elaborated with starch of turmeric

Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-03-05T19:50:05Z No. of bitstreams: 2 Debora_Dudek2017.pdf: 1099947 bytes, checksum: eb7356b2bdfdfe7d3d4da8e48d12d05c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-05T19:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Debora_Dudek2017.pdf: 1099947 bytes, checksum: eb7356b2bdfdfe7d3d4da8e48d12d05c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-07 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Second generation bioethanol employs lignocellulosic materials in its preparation. One of the steps for these materials degradation utilizes cellulases produced by microorganisms. Among these, Trichoderma reesei fungus is one of the main cellulases producers used in industry. This fungus genetic modification can lead to enzimes production optimization, reducing cost and improving biofuels manufacture. Thus, the present work objective was delete the sequence encoding zinc fingers motifs of cellulase ACE1repressor transcription factor from T. reesei RUT-C30 fungus, seeking enzymatic production optimization. In primers construction for amplification ACE1 regions 5’ and 3' and the hph selection marker, which confers hygromycin B resistance, Joint Genome Institute - JGI site and the BioEdit ® program were used. The deletion cassette with pRS426 vector construction was mediated by Saccharomyces cerevisiae SC9721 yeast. After the cassette construction, T. reesei RUT-C30 transformation was made by protoplast and this transformation confirmation was effected by part of the hph using hphNestF and hphNestR amplification primers. After transformation with mutants obtained, endoglucanase, exoglucanase and total cellulase activity was quantified with carboxymethylcellulose substrates (CMC), microcrystalline cellulose (Avicel®) and Whatman paper filter (PF), respectively. The enzymatic production and biomass hydrolysis efficiency were performed comparing RUT-C30 strain for mutants. After deletion cassette construction, a 3501 bp fragment amplification confirmed the cassette formation. Posteriorly, RUT-C30 strain transformation, a 989 bp amplification was observed, confirming the 3 mutants target sequence deletion. With cellulase activity assay, 3 transformed strain showed higher enzymatic production when compared to RUT-C30 strain. In this comparison, a significant statistical difference was observed of RUT-C30Δace1-1 strain with Avicel® and PF (p <0.001) CMC (p <0.01), RUT-C30Δace1-2 strain with CMC (p<0,01) e PF (p<0,05), and RUT-C30Δace1-3 strain with Avicel (p<0,001), CMC and PF (p<0,01). The mutants also showed greater efficiency in biomass hydrolysis, with release sugar increase between 21 and 42%. Based on this study, mutants are promising for most efficient and viable ethanol production. Nevertheless, additional tests must be carried out to better understand these fungi applicability in the industrial level. / O bioetanol de segunda geração emprega materiais lignocelulósicos na sua elaboração. Uma das etapas para a degradação destes materiais utiliza celulases produzidas por microrganismos. Dentre estes, o fungo Trichoderma reesei é um dos principais produtores de celulases utilizadas na indústria. A modificação genética deste fungo pode levar à otimização da produção de suas enzimas, diminuindo o custo e melhorando a fabricação de biocombustíveis. Desta forma, o objetivo do trabalho foi deletar a região dos motivos dedos de zinco no gene que codifica o fator de transcrição repressor de celulase ACE1 do fungo T. reesei RUT-C30, buscando a otimização na produção enzimática. Na construção dos primers para amplificação das regiões 5’ e 3’ de ace1 e do marcador de seleção hph, que confere resistência à higromicina B, utilizou-se o site Joint Genome Institute – JGI e o programa BioEdit®. A construção do cassete de deleção com o vetor pRS426 foi mediado pela levedura Saccharomyces cerevisiae SC9721. Posteriormente, a construção do cassete, a transformação de T. reesei RUT-C30 foi realizada através de protoplasto e a confirmação desta transformação foi efetuada por amplificação de parte do hph utilizando os primers hphNestF e hphNestR. Após a transformação, com os mutantes obtidos, a atividade de endoglucanase, exoglucanase e celulase total foi quantificada com os substratos carboximetilcelulose (CMC), celulose microcristalina (Avicel®) e papel de filtro Whatman (PF), respectivamente. A produção enzimática e a eficiência na hidrólise da biomassa foram realizadas comparando-se a linhagem RUT-C30 aos mutantes. Após a construção do cassete de deleção, a amplificação de um fragmento de 3501 pb confirmou a formação do cassete. E, posteriormente à transformação da linhagem RUT-C30, o amplificado de 989 pb foi observado, confirmando a deleção da sequência alvo em 3 mutantes. Com o ensaio de atividade de celulases, as 3 linhagens transformadas mostraram maior produção enzimática quando comparadas à linhagem RUT-C30. Nessa comparação, foi observada diferença estatística significativa da linhagem RUT-C30Δace1-1 com Avicel® e PF (p<0,001), da linhagem RUTC30Δace1- 2 com CMC (p<0,01) e PF (p<0,05) e da linhagem RUT-C30Δace1-3 com Avicel (p<0,001), CMC e PF (p<0,01). Os mutantes também apresentaram maior eficiência na hidrólise da biomassa, com aumento na liberação de açúcar entre 21 e 42%. Com base nos dados deste estudo, os mutantes apresentam-se promissores para a produção mais eficiente e viável de etanol. Apesar disso, testes adicionais devem ser realizados para melhor entendimento da aplicabilidade destes fungos a nível industrial.

Global climate change and volatility of petroleum price have driven the necessity to reduce fossil fuel utilization and replace it by renewable energy. Bioethanol production in the United States and Brazil from cornstarch and sugarcane, respectively, is already established. However, the bioethanol industry appears unsustainable in view of the potential stress that its production places on food commodities. In contrast, second-generation biofuels produced from cheap and abundant lignocellulosic biomass, has been viewed as one plausible solution to this \"food versus fuel\" problem. Sugarcane bagasse is an abundant source of lignocellulosic biomass in Brazil and is generally recognized as a very promising feedstock for lignocellulosic ethanol production. Nevertheless, inhibitors such as furfural, 5-hydroxymethyl furfural (HMF) and carboxylic acids are formed during an acid thermochemical pretreatment of lignocellulosic biomass, which has a negative effect on the fermentative microorganisms - Saccharomyces cerevisiae. Second-generation (2G) ethanol in Brazil has the possibility to use a novel substrate, prepared as a blend of sugarcane bagasse hydrolysate and cane molasses. Molasses supplements the nutritional deficiencies of bagasse hydrolysate, contributing with minerals, amino acids and vitamins. However, molasses also contains additional inhibitors, such as HMF, sulfite, and toxic concentration of some minerals (K, Ca), which affect S. cerevisiae fermentation performance. The goal of this work was to generate tolerant derivatives of S. cerevisiae industrial strains that are able to cope with inhibitors present in bagasse hydrolysate and molasses, by means of sexual hybridization and adaptive evolution, which can be used for 2G-ethanol production. The industrial strains PE-2, CAT-1 and SA-1 were sporulated, and haploids were irradiated by ultraviolet (UV) light in order to increase genetic and phenotypic diversity. After direct mating and screening in molasses and hydrolysate media, 234 hybrid strains were selected for further study. In parallel, mass matings (intra and interlines) of PE-2, CAT-1 and SA-1 from non-irradiated haploids were performed and the generated strains were subjected to adaptive evolution for about 100 generations. The 120 strains derived from mass mating and adaptive evolution were then screened for growth in molasses-hydrolysate media. Six isolates showed good fermentation properties compared to the reference strains, showing that hybridization and adaptive evolution of Brazilian industrial yeast strains was a good strategy to develop new tolerant strains for 2G-ethanol production. To better utilize all the sugars present in bagasse hydrolysate, a cassette containing the three genes responsible for xylose fermentation (xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulose kinase) was integrated into the genome of a haploid derivative (272-1a) of one of the six selected hybrids (272), which had the highest tolerance to Miscanthus x giganteus hydrolysate. Fermentation studies demonstrated that this engineered strain was able to metabolize xylose into ethanol. Finally, the haploid 272-1a was analyzed by quantitative trait loci (QTL) mapping to identify the genetic basis of hydrolysate tolerance. Although the causative gene(s) were not identified in this work, a number of QTL peaks were identified that will serve as the starting point for future fine-mapping studies. / Mudança climática global e a volatilidade do preço do petróleo tem impulsionado a necessidade de redução e substituição de combustíveis fósseis por energias renováveis. A produção de bioetanol nos Estados Unidos e no Brasil a partir de milho e cana-de-açúcar, respectivamente, está estabelecida. Todavia, a produção de bioetanol mostra-se insustentável, pelo fato da utilização de produtos alimentares para tal produção. Em contrapartida, biocombustíveis produzidos a partir de resíduos lignocelulósicos têm sido vistos como uma solução plausível para o problema \"alimento versus combustível\". No Brasil, o bagaço de cana é uma fonte disponível de biomassa lignocelulósica. No entanto, inibidores como furfural, 5-hidroximetil-furfural (HMF) e ácidos carboxílicos formados durante o prétratamento ácido da biomassa lignocelulósica, têm efeito negativo sobre os microorganismos fermentadores - Saccharomyces cerevisiae. No Brasil, o etanol de segunda-geração (2G) tem possibilidade de utilizar um novo substrato, preparado a partir da mistura de melaço e hidrolisado de bagaço. O melaço será um adjuvante para suprir a deficiência nutricional do hidrolisado, contribuindo com minerais, aminoácidos e vitaminas. Por outro lado, o melaço apresenta alguns inibidores, como HMF, sulfito, e concentração tóxica de alguns minerais, como potássio (K) e cálcio (Ca), que afetam o crescimento e desempenho fermentativo de S. cerevisiae. O objetivo deste trabalho foi gerar descendentes tolerantes de linhagens industriais de S. cerevisiae, capazes de lidar com inibidores presentes no melaço e no hidrolisado de bagaço, por meio de hibridação e evolução adaptativa, para produção do etanol 2G. As linhagens industriais PE-2, CAT-1 e SA-1 foram esporuladas, seus haplóides foram irradiados por luz ultravioleta (UV), objetivando o aumento da diversidade genética e fenotípica das linhagens. Após cruzamento direcionado, 234 híbridos foram selecionados pelo crescimento (DO570nm) em meios de melaço e hidrolisado. Em paralelo, cruzamentos massais (intra e interlinhagens) de haplóides não-irradiados de PE-2, CAT-1 e SA-1 foram realizados e submetidos a evolução adaptativa por cerca de 100 gerações. As 120 estirpes de cruzamentos massais seguidos de evolução adaptativa foram selecionadas pelo crescimento em meios de melaço e hidrolisado. Seis isolados apresentaram boas características fermentativas em comparação às cepas referências, mostrando que hibridação e evolução adaptativa de linhagens de leveduras industriais brasileiras são boas estratégias para desenvolver novas linhagens para produção do etanol-2G. Para uma melhor utilização dos açúcares do hidrolisado, a cassete contendo os três genes responsáveis pela fermentação de xilose (xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase) foi integrada no genoma do haplóide segregante (272-1a) de uma das seis estirpes selecionadas (272), que apresentou a maior tolerância em hidrolisado de Miscanthus x giganteus. Estudos de fermentação mostraram que a estirpe foi capaz de metabolizar a xilose em etanol. Por fim, o haploide 272-1a foi analisado por quantitative trait loci (QTL) afim de identificar a base genética da tolerância ao hidrolisado. Apesar, do(s) gene(s) causativos não terem sido identificados nesse trabalho, os picos do mapa de QTL identificados servirão como ponto de partida para futuro mapeamento.

A busca por soluções sustentáveis, levando a um processo energético mais eficiente induziu a novas tecnologias e esforços estão sendo realizados para viabilizar o etanol de segunda geração, com o aproveitamento da biomassa celulolítica como substrato para a fermentação alcoólica. Contudo, durante a hidrólise do bagaço, muitos compostos tóxicos à levedura são formados como o furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético, e compostos fenólicos com efeitos depressivos sobre a fermentação. A adição de melaço no hidrolisado de bagaço poderia permitir uma fermentação com maior teor alcoólico, contribuindo para um balanço energético favorável da destilação, além de propiciar nutrientes minerais e orgânicos para a levedura. Tais nutrientes poderiam permitir um processo fermentativo com reciclo de células de leveduras aproveitando assim uma estrutura e conhecimentos já existentes na destilaria de etanol de primeira geração. O reciclo de células permitiria fermentações rápidas, porém impõe repetidas condições estressantes, o que torna um grande desafio a obtenção de linhagens com o perfil de tolerância desejado. Assim este trabalho se propôs a selecionar linhagens de Saccharomyces cerevisiae com múltiplas tolerâncias em relação aos inibidores tanto presentes no hidrolisado como no melaço. Para tal, foram impostas condições estressantes sobre culturas da linhagem SA-1 e de leveduras isoladas de destilarias brasileiras durante cerca de 62 gerações, forçando uma evolução adaptativa ou mesmo um enriquecimento/seleção de indivíduos mais tolerantes. Paralelamente a biodiversidade de linhagens isoladas de destilarias foi avaliada quanto aos atributos de tolerância aos compostos tóxicos presentes no hidrolisado do bagaço. As linhagens com maiores desempenhos foram avaliadas em fermentações com reuso de células empregando-se substrato constituído de hidrolisado e melaço, sendo que 4 linhagens se mostraram superiores às linhagens referenciais. Destas, dois isolados (242 e 408) foram esporulados e os conjuntos dos haploides foram empregados em cruzamentos massais. Simultaneamente, 273 haploides isolados das linhagens 242 e 408 foram avaliados quanto ao crescimento (DO600nm) em substrato constituído por hidrolisado e melaço, sendo que 32 foram selecionados. Após a tipificação segundo o \"mating type\" os mesmos foram utilizados em cruzamentos direcionados mediante micromanipulação, resultando em 35 cruzamentos. Cinco híbridos de cada cruzamento direcionado foram resgatados (155 isolados), que juntamente com 80 isolados oriundos do cruzamento massal, foram novamente avaliados quanto ao crescimento (DO600nm) e a seguir em fermentações com reciclo de células. Cinco linhagens se destacaram como superiores aos parentais, demonstrando que mediante o protocolo empregado foi possível incrementar o perfil de tolerância de Saccharomyces cerevisiae para suportar os estresses impostos por um substrato para produção do etanol de segunda geração. / The search for sustainable solutions to improve process efficiency has promoted the development of new technologies, and the use of cellulolytic biomass as the substrate for fermentation has emerged as a promising second-generation ethanol production strategy. However, the hydrolysis of this material results in the formation of toxic compounds to yeast such as furfural, hydroxymethylfurfural, acetic acid and phenolic compounds, with deleterious effects on fermentation. Addition of molasses in the bagasse hydrolysate could allow fermentation with higher alcohol content contributing to a favorable energy balance in the distillation, as well as providing minerals and organic nutrients for the yeast. These nutrients could allow a fermentative process with yeast cell recycle, utilizing the structure and knowledge already existing in first generation process. The cell recycle enables a rapid fermentation, but imposes repeated stress conditions, making it challenging to obtain strains with the desired tolerance profile. The purpose of this study was to select Saccharomyces cerevisiae strains with multiple tolerances to inhibitors present in the hydrolysate and molasses. Stressful conditions were imposed on cultures of SA-1 strain and indigenous strains from Brazilian distilleries for around 62 generations, forcing an adaptive evolution or even an enrichment / selection of more tolerant individuals. In parallel, the biodiversity of the strains from Brazilian distilleries were evaluated with respect to their tolerance to the toxic compounds present in bagasse hydrolysate. The strains that showed higher performance were assessed in fermentations with cell reuse employing substrate composed by hydrolyzate and molasses. Four of the analyzed strains exhibited better performance than the reference strain. Of these, two isolates (242 and 408) were sporulated and the haploids were subjected to mass mating. Simultaneously, 273 haploids rescued from the strains 242 and 408 were evaluated for growth (OD 600 nm) in the substrate consisting of hydrolysate and molasses, and among them 32 were selected. After the characterization according to the \"mating type\", the haploids were utilized in direct mating induced by micromanipulation, totaling 35 crossings. Five hybrids from each direct mating were rescued (totaling 155 isolates), which together with 80 isolated from the mass mating, were evaluated for growth (OD 600 nm) and then in fermentation with cell recycle. 5 strains have excelled as superiors to the reference strain showing that by the protocol employed was possible to increase profile of tolerance of Saccharomyces cerevisiae to resist pressures imposed by a substrate for second-generation ethanol production.

No campo da pesquisa em etanol de segunda geração (lignocelulósico), o Brasil mostra-se como um ator em potencial para a transformação e difusão da ciência em tecnologia. A produção em escala comercial - em especial na fronteira da inovação em etanol lignocelulósico e dos novos produtos oriundos desta conversão - requer alta tecnologia para o desenvolvimento de produtos e processos, matéria-prima disponível e viável, além de um ambiente institucional favorável. Esses fatores colocam o setor sucroenergético brasileiro em posição de destaque e justificam a questão central desta tese que é analisar - sob a perspectiva dos avanços científicos nacionais para o etanol de segunda geração e de seu potencial inovativo - o grau de desenvolvimento do Sistema Nacional de Inovação (SNI) com base na articulação existente entre as pesquisas realizadas por brasileiros em comparação com as realizadas por outros países e em específico os Estados Unidos. A abordagem teóricoconceitual e metodológica estrutura-se nos conceitos da economia evolucionista, subjacentes à formação de Redes de Inovação. Há robustas evidências que mostram que a colaboração científica em redes correlaciona-se positivamente com a difusão do conhecimento científico. As patentes ao assimilarem o conhecimento científico disponível permitem criar novos padrões tecnológicos, novos produtos e processos. Mas também, podem direcionar o fluxo de conhecimento criando uma trajetória tecnológica, ou seja, o caminho realizado para chegar-se em determinada patente. O conhecimento acumulado em determinada patente é representado pelas patentes que a originaram e que envolve diversos setores e atividades. Assim as Redes de Inovação na ótica evolucionista podem ser consideradas indicadores de inovação de determinada atividade ou produto, proxy, para o grau de desenvolvimento de um SNI. Neste cenário, são utilizados dois procedimentos metodológicos complementares, que permitem entender a dinâmica da produção científica e da inovação: a) Redes de Inovação em publicações para a colaboração científica entre países, instituições, KeyWord Plus e citações; e b) Redes de Inovação em patentes para as áreas de aplicação através do IPC8. Portanto, na ótica do desenvolvimento de um SNI, contam principalmente: o grau de colaboração científica, relevância e inserção. Apesar do SNI em etanol de segunda geração possuir elementos necessários para a transformação da ciência em tecnologia, observou-se baixo grau de desenvolvimento em reflexo às seguintes características: a) um baixo grau de colaboração científica internacional em comparação com os Estados Unidos e o Mundo; b) os esforços gerados não estão alinhados com o gargalo tecnológico do etanol de segunda geração; c) há apenas uma instituição representativa no cenário internacional, d) existe uma relação fraca entre universidade-governo-empresa; e) o potencial de difusão do conhecimento não é explorado, seja na forma de publicações científicas quanto na forma de patentes. Conclui-se que o SNI em etanol de segunda geração no Brasil está desenvolvendose, mas com baixa articulação com pesquisadores internacionais, além de uma baixa interação universidade-governo-empresa. Os esforços indicam que o Brasil irá especializar-se na fermentação, processo em que já possui conhecimento acumulado. / In the research area of second generation ethanol (lignocellulosic), Brazil has been shown as a potential actor for changing and spreading the science through technologies. The commercial scale of production - especially in the innovation frontier in lignocellulosic ethanol and new products from this conversion - requires high technology for products and processes development, available and feasible raw materials, plus a favorable institutional environment. These factors place the Brazilian sugarcane industry in a prominent position and justify the central question of this thesis which is to analyze - from the perspective of national scientific advances in second generation ethanol and its innovative potential - the development degree of a National Innovation System (NIS) based on the articulation between researches conducted by Brazilians in the comparison to researches made by other countries, specific by the United States. The theoretical-conceptual and methodological framework is based on evolutionary economics concepts, underlying the Innovation Networks formation. There is a robust evidence that shows the scientific collaboration though networks are positively correlated with the spread of scientific knowledge. Patents in the process of assimilating available scientific knowledge allow to create new technological standards, new products and processes. But also can direct the knowledge flow by creating a technological path, in other words, the path taken to arrive in certain patent. The accumulated knowledge in a particular patent is represented by patents which have originated and that involving different sectors and activities. Thus the Innovation Networks in an evolutionary perspective can be considered as measures of the innovation of a particular activity or product, indeed a proxy for the development degree of the NIS. In this scenario, it was used two complementary methodological procedures, which allow to understand the dynamics of scientific production and innovation: a) Innovation Networks in publications for the scientific collaboration between countries, institutions, KeyWord Plus and citations and b) Innovation Networks in patents for some application areas using IPC8 class. Therefore, in the sight of development of NIS rely mainly: the scientific collaboration degree, relevance and insertion. Despite the NIS in second generation ethanol has necessary elements to change the science and technology, it was observed a low development degree which reflects the following characteristics: a) low degree of international scientific collaboration in comparison with the United States and World; b) efforts generated are not aligned with the technological bottleneck in second generation ethanol; c) only one representative institution in the international scenario; d) weak relationship between university-government-enterprise, e) potential of conversion of knowledge is not exploited, either in the form of scientific publications and in the form of patents. It was concluded that the NIS on second generation ethanol in Brazil is developing, but with low articulation with international researchers, besides a low university-government-enterprise interaction. Efforts indicate that Brazil will specialize in the fermentation, process that has already accumulated knowledge.

O desenvolvimento de alternativas aos combustíveis fósseis como fonte de energia é uma prioridade global. A biomassa celulósica representa uma alternativa para satisfazer a procura de bicombustíveis renováveis. O bagaço de cana-de-açúcar é um abundante subproduto proveniente da produção atual de etanol no Brasil. Tal subproduto pode ser hidrolisado a fim de se obter açúcares fermentáveis para a produção do etanol de segunda-geração. Porém, no processo de pré-tratamento são gerados diversos inibidores como ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural que causam efeitos adversos para a levedura no processo de fermentação alcoólica. A adição de melaço ao hidrolisado é uma forma de diminuir os efeitos dos inibidores no metabolismo das leveduras e também permite uma fermentação com maior teor alcoólico contribuindo para um balanço energético favorável da destilação, contribui também com o fornecimento de nutrientes minerais e orgânicos necessários a levedura para um processo empregando reciclo de células. Assim, objetivou-se selecionar linhagens de Saccharomyces cerevisiae com melhores características de multitolerância ao hidrolisado a partir de cruzamento direcionado e cruzamento massal seguido de evolução adaptativa. Para tal, linhagens S. cerevisiae industriais CAT-1, BG-1, PE-2 e SA-1 foram esporuladas e mediante micromanipulação foram obtidos 604 haploides, que foram avaliados quanto ao crescimento (DO570nm) em substrato constituído por hidrolisado e melaço. Os haploides selecionados (25) tiveram o \"mating type\" determinado permitindo a realização de 51 cruzamentos direcionados, gerando 398 zigotos, que foram igualmente avaliados para o crescimento no meio seletivo. Paralelamente, foram realizados cruzamentos massais, resultando em 7 diferentes populações, as quais foram submetidas à evolução adaptativa por 25 gerações, sendo que os isolados selecionados de cada cruzamento foram avaliados em fermentação com reciclo de células. Quatro linhagens se destacaram como superiores aos parentais, evidenciando que a estratégia utilizada permitiu a obtenção de linhagens de S. cerevisiae com maior tolerância aos estresses impostos por um substrato para produção do etanol de segunda geração. / The development of alternatives to fossil fuels as a source of energy is a global priority. Cellulosic biomass is an alternative to meet the demand for renewable biofuels. The sugarcane bagasse, an abundant byproduct generated from ethanol production in Brazil, can be hydrolysed to obtain fermentable sugars to produce second-generation ethanol. However, inhibitors produced in the pre-treatment process such as acetic acid, furfural and hydroxymethylfurfural, cause adverse effects to the yeast in the fermentation process. Addition of molasses in the bagasse hydrolyzate is one way to reduce the effects of inhibitors in the metabolism of yeast and also could allow fermentation with higher alcohol content contributing to a favorable energy balance in the distillation, as well as providing minerals and organic nutrients for the yeast. The main goal of this study was to select strains of Saccharomyces cerevisiae with better features of multi-tolerance to the bagasse hydrolyzate by directed crossing and mass mating followed by adaptive evolution. For that S. cerevisiae lineages CAT-1, BG-1, PE-2 e SA-1 were sporulated and 604 haploid cultures were obtained by micromanipulation and evaluated for growth (OD 570nm) in the substrate consisting of hydrolyzate and molasses. Selected haploids (25) were identified regarding their \"mating type\" (a and &alpha;) and used in. 51 directed crossings generating 398 zygotes, which were rescued by micromanipulation and also evaluated for growth in the same selective medium. Mass mating were performed with 7 different haploid populations from the parental strains, followed by an adaptive evolution for 25 generations. The selected zygotes were then subjected to fermentation trails with cell recycling, resulting in 4 strains with superior traits when compared with the parentals, allowing to conclude that the used strategy was successful in obtaining hybrids of Saccharomyces cerevisiae with increased profile of tolerance towards a substrate for second-generation ethanol production.

Global climate change and volatility of petroleum price have driven the necessity to reduce fossil fuel utilization and replace it by renewable energy. Bioethanol production in the United States and Brazil from cornstarch and sugarcane, respectively, is already established. However, the bioethanol industry appears unsustainable in view of the potential stress that its production places on food commodities. In contrast, second-generation biofuels produced from cheap and abundant lignocellulosic biomass, has been viewed as one plausible solution to this \"food versus fuel\" problem. Sugarcane bagasse is an abundant source of lignocellulosic biomass in Brazil and is generally recognized as a very promising feedstock for lignocellulosic ethanol production. Nevertheless, inhibitors such as furfural, 5-hydroxymethyl furfural (HMF) and carboxylic acids are formed during an acid thermochemical pretreatment of lignocellulosic biomass, which has a negative effect on the fermentative microorganisms - Saccharomyces cerevisiae. Second-generation (2G) ethanol in Brazil has the possibility to use a novel substrate, prepared as a blend of sugarcane bagasse hydrolysate and cane molasses. Molasses supplements the nutritional deficiencies of bagasse hydrolysate, contributing with minerals, amino acids and vitamins. However, molasses also contains additional inhibitors, such as HMF, sulfite, and toxic concentration of some minerals (K, Ca), which affect S. cerevisiae fermentation performance. The goal of this work was to generate tolerant derivatives of S. cerevisiae industrial strains that are able to cope with inhibitors present in bagasse hydrolysate and molasses, by means of sexual hybridization and adaptive evolution, which can be used for 2G-ethanol production. The industrial strains PE-2, CAT-1 and SA-1 were sporulated, and haploids were irradiated by ultraviolet (UV) light in order to increase genetic and phenotypic diversity. After direct mating and screening in molasses and hydrolysate media, 234 hybrid strains were selected for further study. In parallel, mass matings (intra and interlines) of PE-2, CAT-1 and SA-1 from non-irradiated haploids were performed and the generated strains were subjected to adaptive evolution for about 100 generations. The 120 strains derived from mass mating and adaptive evolution were then screened for growth in molasses-hydrolysate media. Six isolates showed good fermentation properties compared to the reference strains, showing that hybridization and adaptive evolution of Brazilian industrial yeast strains was a good strategy to develop new tolerant strains for 2G-ethanol production. To better utilize all the sugars present in bagasse hydrolysate, a cassette containing the three genes responsible for xylose fermentation (xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylulose kinase) was integrated into the genome of a haploid derivative (272-1a) of one of the six selected hybrids (272), which had the highest tolerance to Miscanthus x giganteus hydrolysate. Fermentation studies demonstrated that this engineered strain was able to metabolize xylose into ethanol. Finally, the haploid 272-1a was analyzed by quantitative trait loci (QTL) mapping to identify the genetic basis of hydrolysate tolerance. Although the causative gene(s) were not identified in this work, a number of QTL peaks were identified that will serve as the starting point for future fine-mapping studies. / Mudança climática global e a volatilidade do preço do petróleo tem impulsionado a necessidade de redução e substituição de combustíveis fósseis por energias renováveis. A produção de bioetanol nos Estados Unidos e no Brasil a partir de milho e cana-de-açúcar, respectivamente, está estabelecida. Todavia, a produção de bioetanol mostra-se insustentável, pelo fato da utilização de produtos alimentares para tal produção. Em contrapartida, biocombustíveis produzidos a partir de resíduos lignocelulósicos têm sido vistos como uma solução plausível para o problema \"alimento versus combustível\". No Brasil, o bagaço de cana é uma fonte disponível de biomassa lignocelulósica. No entanto, inibidores como furfural, 5-hidroximetil-furfural (HMF) e ácidos carboxílicos formados durante o prétratamento ácido da biomassa lignocelulósica, têm efeito negativo sobre os microorganismos fermentadores - Saccharomyces cerevisiae. No Brasil, o etanol de segunda-geração (2G) tem possibilidade de utilizar um novo substrato, preparado a partir da mistura de melaço e hidrolisado de bagaço. O melaço será um adjuvante para suprir a deficiência nutricional do hidrolisado, contribuindo com minerais, aminoácidos e vitaminas. Por outro lado, o melaço apresenta alguns inibidores, como HMF, sulfito, e concentração tóxica de alguns minerais, como potássio (K) e cálcio (Ca), que afetam o crescimento e desempenho fermentativo de S. cerevisiae. O objetivo deste trabalho foi gerar descendentes tolerantes de linhagens industriais de S. cerevisiae, capazes de lidar com inibidores presentes no melaço e no hidrolisado de bagaço, por meio de hibridação e evolução adaptativa, para produção do etanol 2G. As linhagens industriais PE-2, CAT-1 e SA-1 foram esporuladas, seus haplóides foram irradiados por luz ultravioleta (UV), objetivando o aumento da diversidade genética e fenotípica das linhagens. Após cruzamento direcionado, 234 híbridos foram selecionados pelo crescimento (DO570nm) em meios de melaço e hidrolisado. Em paralelo, cruzamentos massais (intra e interlinhagens) de haplóides não-irradiados de PE-2, CAT-1 e SA-1 foram realizados e submetidos a evolução adaptativa por cerca de 100 gerações. As 120 estirpes de cruzamentos massais seguidos de evolução adaptativa foram selecionadas pelo crescimento em meios de melaço e hidrolisado. Seis isolados apresentaram boas características fermentativas em comparação às cepas referências, mostrando que hibridação e evolução adaptativa de linhagens de leveduras industriais brasileiras são boas estratégias para desenvolver novas linhagens para produção do etanol-2G. Para uma melhor utilização dos açúcares do hidrolisado, a cassete contendo os três genes responsáveis pela fermentação de xilose (xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase) foi integrada no genoma do haplóide segregante (272-1a) de uma das seis estirpes selecionadas (272), que apresentou a maior tolerância em hidrolisado de Miscanthus x giganteus. Estudos de fermentação mostraram que a estirpe foi capaz de metabolizar a xilose em etanol. Por fim, o haploide 272-1a foi analisado por quantitative trait loci (QTL) afim de identificar a base genética da tolerância ao hidrolisado. Apesar, do(s) gene(s) causativos não terem sido identificados nesse trabalho, os picos do mapa de QTL identificados servirão como ponto de partida para futuro mapeamento.

A busca por soluções sustentáveis, levando a um processo energético mais eficiente induziu a novas tecnologias e esforços estão sendo realizados para viabilizar o etanol de segunda geração, com o aproveitamento da biomassa celulolítica como substrato para a fermentação alcoólica. Contudo, durante a hidrólise do bagaço, muitos compostos tóxicos à levedura são formados como o furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético, e compostos fenólicos com efeitos depressivos sobre a fermentação. A adição de melaço no hidrolisado de bagaço poderia permitir uma fermentação com maior teor alcoólico, contribuindo para um balanço energético favorável da destilação, além de propiciar nutrientes minerais e orgânicos para a levedura. Tais nutrientes poderiam permitir um processo fermentativo com reciclo de células de leveduras aproveitando assim uma estrutura e conhecimentos já existentes na destilaria de etanol de primeira geração. O reciclo de células permitiria fermentações rápidas, porém impõe repetidas condições estressantes, o que torna um grande desafio a obtenção de linhagens com o perfil de tolerância desejado. Assim este trabalho se propôs a selecionar linhagens de Saccharomyces cerevisiae com múltiplas tolerâncias em relação aos inibidores tanto presentes no hidrolisado como no melaço. Para tal, foram impostas condições estressantes sobre culturas da linhagem SA-1 e de leveduras isoladas de destilarias brasileiras durante cerca de 62 gerações, forçando uma evolução adaptativa ou mesmo um enriquecimento/seleção de indivíduos mais tolerantes. Paralelamente a biodiversidade de linhagens isoladas de destilarias foi avaliada quanto aos atributos de tolerância aos compostos tóxicos presentes no hidrolisado do bagaço. As linhagens com maiores desempenhos foram avaliadas em fermentações com reuso de células empregando-se substrato constituído de hidrolisado e melaço, sendo que 4 linhagens se mostraram superiores às linhagens referenciais. Destas, dois isolados (242 e 408) foram esporulados e os conjuntos dos haploides foram empregados em cruzamentos massais. Simultaneamente, 273 haploides isolados das linhagens 242 e 408 foram avaliados quanto ao crescimento (DO600nm) em substrato constituído por hidrolisado e melaço, sendo que 32 foram selecionados. Após a tipificação segundo o \"mating type\" os mesmos foram utilizados em cruzamentos direcionados mediante micromanipulação, resultando em 35 cruzamentos. Cinco híbridos de cada cruzamento direcionado foram resgatados (155 isolados), que juntamente com 80 isolados oriundos do cruzamento massal, foram novamente avaliados quanto ao crescimento (DO600nm) e a seguir em fermentações com reciclo de células. Cinco linhagens se destacaram como superiores aos parentais, demonstrando que mediante o protocolo empregado foi possível incrementar o perfil de tolerância de Saccharomyces cerevisiae para suportar os estresses impostos por um substrato para produção do etanol de segunda geração. / The search for sustainable solutions to improve process efficiency has promoted the development of new technologies, and the use of cellulolytic biomass as the substrate for fermentation has emerged as a promising second-generation ethanol production strategy. However, the hydrolysis of this material results in the formation of toxic compounds to yeast such as furfural, hydroxymethylfurfural, acetic acid and phenolic compounds, with deleterious effects on fermentation. Addition of molasses in the bagasse hydrolysate could allow fermentation with higher alcohol content contributing to a favorable energy balance in the distillation, as well as providing minerals and organic nutrients for the yeast. These nutrients could allow a fermentative process with yeast cell recycle, utilizing the structure and knowledge already existing in first generation process. The cell recycle enables a rapid fermentation, but imposes repeated stress conditions, making it challenging to obtain strains with the desired tolerance profile. The purpose of this study was to select Saccharomyces cerevisiae strains with multiple tolerances to inhibitors present in the hydrolysate and molasses. Stressful conditions were imposed on cultures of SA-1 strain and indigenous strains from Brazilian distilleries for around 62 generations, forcing an adaptive evolution or even an enrichment / selection of more tolerant individuals. In parallel, the biodiversity of the strains from Brazilian distilleries were evaluated with respect to their tolerance to the toxic compounds present in bagasse hydrolysate. The strains that showed higher performance were assessed in fermentations with cell reuse employing substrate composed by hydrolyzate and molasses. Four of the analyzed strains exhibited better performance than the reference strain. Of these, two isolates (242 and 408) were sporulated and the haploids were subjected to mass mating. Simultaneously, 273 haploids rescued from the strains 242 and 408 were evaluated for growth (OD 600 nm) in the substrate consisting of hydrolysate and molasses, and among them 32 were selected. After the characterization according to the \"mating type\", the haploids were utilized in direct mating induced by micromanipulation, totaling 35 crossings. Five hybrids from each direct mating were rescued (totaling 155 isolates), which together with 80 isolated from the mass mating, were evaluated for growth (OD 600 nm) and then in fermentation with cell recycle. 5 strains have excelled as superiors to the reference strain showing that by the protocol employed was possible to increase profile of tolerance of Saccharomyces cerevisiae to resist pressures imposed by a substrate for second-generation ethanol production.

Made available in DSpace on 2017-07-10T19:25:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Danielle.pdf: 2045477 bytes, checksum: e87013d4e9e85c9f4d8686bbb3c0dd6e (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / The researches on second generation ethanol, produced by agroindustrial wastes, have demanded special attention as a possible solution that can contribute to energy sustainability. Such production is based on lignocellulosic fiber conversion (cellulose and hemicellulose), which generates fermentable sugars that are biotransformed in bioethanol after some specific pretreatment and hydrolysis. The industries of extracting oil from sunflower seeds have also generated lignocellulosic residues known as sunflower cake and bran. They can be sources for recycling and profitable alternatives on converting biotechnological products with some trading interest. Thus, this trial aimed at evaluating ethanol production from cellulose and hemicellulose fractions of cake and bran, from the processing of sunflower seeds (Hellianhus annuus). After the description concerning contents of cellulose, hemicellulose and lignin, the residues were submitted to a mild acid hydrolysis with sulfuric acid, whose concentration of H2SO4 varied in 1, 2, 4 and 6% v/v, while times of hydrolysis in autoclave were (20, 40 and 60 minutes). After choosing the best of sunflower residue and treatment to obtain a hemicellulosic hydrolysate with high content of xylose and low content of inhibiting compounds, the detoxified hydrolyzate was fermented by the yeast Pichia stipitis ATCC 58376 at 30 °C with some stirring variations (100, 150 and 200 rpm). In order to obtain ethanol from cellulosic fraction, the remaining solid biomass from acid hydrolysis treatment was delignified at 1% NaOH and submitted to simultaneous saccharification and fermentation process (SSF) by yeast Kluyveromyces marxianus ATCC 36907, at 38 °C and 150 rpm. The enzymes concentrations varied at 10, 15 and 20 FPU/g of Cellulase complex NS22086 and 1/3, 1.5/3 and 2/3 of &#946;-glucosidase in relation to NS22118 cellulase, both ones from "Novozymes Cellulosic Ethanol Enzyme Kit ". Regarding chemical composition, the cake has shown the following answers: 27.5, 33.16 and 32.18% of cellulose, hemicellulose and lignin, respectively, while for bran, the answers were: 32.93, 30.90 and 26.62% cellulose, hemicellulose and lignin, respectively. Treatment of sunflower bran with 6% H2SO4 and 20 minutes of hydrolysis resulted in a hemicellulosic hydrolysate with high concentrations of sugars (24.88 g/L xylose, 22.33 g/L glucose, 8.9 g/L arabinose and lower amounts of toxic compounds (1.59 g/L phenol, 1.93 g/L acetic acid, 0.0182 g/L furfural and 0.0514 g/L hydroxymethylfurfural). The stirring influenced the process of ethanol production by P. stipitis in hemicellulosic hydrolyzate, whose best results (ethanol 8.8 g/L, yield 0.23 g/g and productivity 0.12 g/Lh) were with 200 rpm stirring. In relation to the SSF process, the best conditions for ethanol production were 20 FPU/g cellulase and 15 CBU &#946;-glucosidase. This resulted in 27.88 g/L ethanol, 0.35 g/g yield and 0.38 g/Lh productivity. In the same condition, the best efficiency of enzymatic conversion (EEC) was 21.95%. These are promising results since sunflower bran is available to produce second generation ethanol from both xylose and cellulose / Pesquisas sobre o etanol de segunda geração, produzido a partir dos resíduos agroindustriais, têm recebido atenção especial como possível solução para contribuir na sustentabilidade energética. Tal obtenção consiste na conversão das fibras lignocelulósicas (celulose e hemicelulose) que, após passarem por pré-tratamento específico e hidrólise, originam açúcares fermentescíveis, que são biotransformados a etanol de segunda geração. Por sua vez, o setor de extração de óleo, a partir da semente de girassol, gera resíduos lignocelulósicos, conhecidos como torta e farelo de girassol, que podem ser fontes para a reciclagem e alternativa de lucro a partir da conversão biotecnológica em produtos de interesse comercial. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de etanol a partir das frações hemicelulósica e celulósica da torta ou farelo, provenientes do processamento das sementes de girassol (Hellianhus annuus). Após a caracterização da quantidade de celulose, hemicelulose e lignina dos resíduos, os mesmos foram submetidos à hidrólise ácida branda com ácido sulfúrico, com variações na concentração de H2SO4 (1; 2; 4; 6 % v/v) e tempo de hidrólise em autoclave (20, 40 e 60 minutos). Após a escolha do farelo de girassol como melhor resíduo e do melhor tratamento para obtenção do hidrolisado hemicelulósico com alto teor de xilose e baixo teor de compostos inibidores, o hidrolisado foi destoxificado e fermentado pela levedura Pichia stipitis ATCC 58376 a 30 oC com variações na agitação (100, 150 e 200 rpm). Para obtenção do etanol proveniente da fração celulósica, a biomassa sólida restante do tratamento de hidrólise ácida foi deslignificada com 1% NaOH e submetida ao processo de sacarificação simultânea à fermentação (SSF) pela levedura Kluyveromyces marxianus ATCC 36907 a 38 oC, 150 rpm, com variações na concentração das enzimas (10; 15 e 20 FPU/g de Cellulase complex NS22086 e 1/3; 1,5/3 e 2/3 de &#946; - glicosidase NS22118 em relação à celulase), ambas do Novozymes Cellulosic Ethanol Enzyme Kit. A torta apresentou 27,5; 33,16 e 32,18% de celulose, hemicelulose e lignina respectivamente, enquanto o farelo apresentou 32,93; 30,90 e 26,62% celulose, hemicelulose e lignina, respectivamente. O tratamento do farelo de girassol com 6% de H2SO4 e 20 minutos de hidrólise resultou em um hidrolisado hemicelulósico com elevadas concentrações de açúcares (24,88 g/L xilose; 22,33 g/L glicose e 8,9 g/L arabinose) e menores quantidades de compostos tóxicos (1,59 g/L fenóis; 1,93 g/L ácido acético, 0,0182 g/L furfural e 0,0514 g/L hidroximetilfurfural). A agitação influenciou no processo de produção de etanol por P. stipitis no hidrolisado hemicelulósico, cujos melhores resultados (etanol 8,8 g/L; rendimento 0,23 g/g e produtividade 0,12 g/L.h) foram encontrados com a agitação de 200 rpm. No processo SSF, as melhores condições para produção de etanol foram 20 FPU/g de celulase e 15 CBU &#946;-glicosidase, resultando em 27,88 g/L etanol, rendimento 0,35 g/g e produtividade 0,38 g/L.h. Nessa mesma condição, foi verificada a melhor porcentagem na eficiência de conversão enzimática - ECC (21,95%). Os resultados são promissores e demonstram que o farelo de girassol é adequado para a produção de etanol de segunda geração tanto a partir da hemicelulose como de celulose