A exposição limitada ao Plasmodium chabaudi induz proeminente imunidade celular, associada à proteção de células T da apoptose. Este estudo tem como objetivo verificar a influência da carga parasitária na geração e manutenção dos linfócitos T e B de memória ao P. chabaudi. Assim, camundongos C57BL/6 foram submetidos à infecção tratada (subpatente) ou não (patente) com cloroquina após a inoculação de 106 eritrócitos parasitados (EP) e analisados nos dias 0, 20, 60, 120 e 200. Com relação à memória de linfócitos T, no dia 20, as freqüências de células CD4+ memória/ativadas e respondedoras aos EP foram significativamente maiores nos animais do grupo subpatente. Os níveis máximos de IgG2a específica foram encontrados no dia 120 em ambos os grupos. O desafio dos animais com 108 EP mostrou que a imunidade protetora declina progressivamente, mas os grupos ainda são capazes de estabelecer resposta secundária eficiente que elimine o parasita. Assim, podemos concluir que a carga parasitária influencia a fase aguda, mas não impede a geração e manutenção das células T e B de memória. / One of the main characteristics of malaria is the intense policlonal activation of splenic T and B lymphocytes induced by the parasite and the consequent elimination, through apoptosis, of part of these cells. However, the limited exposure to the bloodstage malaria seems to induce a prominent cellular immunity, associated with the protection of T lymphocytes from apoptosis. With this in mind, this study aimed to verify the influence of the parasite load in the generation and maintenance of memory T and B cells specific for Plasmodium chabaudi chabaudi AS. In order to evaluate this idea, C57BL/6 mice were infected with 106 parasitized red blood cells (pRBC) and submitted to a patent (untreated) or subpatent infection (controlled with sub-curative doses of chloroquine every time parasitemia reached 1%). Splenocytes from these mice were analyzed at 20, 60, 120 and 200 days after infection, regarding the pRBC-specific T cell proliferation and the expression of surface molecules, as CD4, CD8, CD62L, CD45RB, CD44, CD45R-B220 and IgG. The parasitemia and the splenocyte phenotype were also monitored after the challenge with 108 pRBC. Regarding T cell memory, at day 20 of infection, the frequencies of effector/activated CD4+ T cells (CD62LLOW CD45RBLOW/HIGH) were significantly increased in animals from the patent group, which was strict linked with the highest cellular activation observed in these animals. On the other hand, the total numbers of pRBCproliferating T (CD4+ and CD8+) cells per spleen were approximately 3-fold increased in subpatent animals, indicating that these cells were protected from apoptosis as a result of the limited exposure to the parasite. However, in both groups, these parameters decreased to values similar to those in controls at day 200. The splenocytes from both groups produced Th1 cytokines in response to pRBC in all times of analysis, but at the early phase of infection, Th2 cytokines were also observed, but without differences between the infected groups. Regarding memory B cells, the frequency of sIgG+ cells was increased at day 20 of infection, when 11% and 9% of CD45R+ cells from patent and subpatent animals were positive, respectively. For both groups, specific IgG2a antibodies attained maximum serum levels at day 120, but at day 200, it is possible to observe a significant decrease of these levels only in the serum of patent mice. Moreover, at day 200 of infection, mice of subpatent group showed significantly higher amounts of IgG2a that recognized the intra-erythrocytic forms of the parasite and the surface of infected erythrocytes. Challenge of mice with 108 pRBC showed that protective immunity progressively decline with time and despite the higher levels of specific antibody in subpatent mice, both groups showed similar protection. In experiments of adoptive transference to CD28-/- mice, cells from 200-day infected mice were able to produce specific IgG2a antibodies, in a T CD4+ cell dependent way. In addition, we verified that CD45R+ cells of subpatent mice, when transferred to CD28-/- mice, secreted higher amounts of specific IgG2a and IgG1 antibodies, comparing to cells of patent mice. So, from this work, we can conclude that the parasite load has a great influence in the early immune response to P. chabaudi malaria and it also affects the generation and/or maintenance of memory B cells. Furthermore, according to our data, at least during the analyzed period, the loss of protective immunity against this parasite does not seem to be influenced by the acute-phase parasite load, but it can be a consequence of the progressive decline of T-cell memory response that occurs in patent and subpatent groups with time of infection.

Introdução: Hanseníase, doença crônica, incapacitante, causada pelo M.leprae, que afeta a pele e os nervos periféricos. Manifesta-se como doença espectral, que exibe dois polos imunologicamente distintos, denominados hanseníase virchowiana (lepromatous - LL), caracterizada por uma resposta celular ineficiente; e hanseníase tuberculoide (Tuberculoid - TT), com resposta imune celular efetiva. A ativação de células T requer a sinalização através de moléculas coestimulatórias expressas em células apresentadoras de antígeno e seus ligantes nas células T. As células T regulatórias (Treg) exercem importante papel no mecanismo de falha do controle da disseminação antigênica nas formas graves das doenças crônicas granulomatosas, mas seu real papel na hanseníase ainda não foi elucidado. Métodos: Estudamos a expressão das moléculas coestimulatórias e células Treg na resposta imune de pacientes nos diferentes espectros da doença. A expressão de células Treg foi quantificada por citometria de fluxo (CD4+CD25+FoxP3+) nas células mononucleares do sangue periférico de pacientes e controles (16 eram virchowianos, 12 tuberculoides e 6 controles) estimulados in vitro com o antígeno do M. leprae e com o mitógeno phytohemaglutinina, bem como nas lesões de pele por imunohistoquímica. A expressão de moléculas coestimulatorias (CD80, CD86, CD28, CTLA-4, PD-1, ICOS) foi avaliada por citometria de fluxo in vitro, a partir do estimulo de células mononucleares provenientes de 14 pacientes virchowianos, 14 tuberculoides e 10 indivíduos saudáveis expostos ao bacilo. A resposta linfoproliferativa, a produção de citocinas (IL10 e IFN-?) in vitro e a expressão in situ de IL-10, TGF? e CTLA-4 também foram determinadas. Resultados: Nós demonstramos que pacientes virchowianos apresentam deficiência na expressão da molécula CD86 na superfície de monócitos, e isso contribui para uma apresentação antigênica ineficiente, favorecendo o estado de anergia observado nesse grupo de pacientes. Observamos ainda, que o bloqueio da expressão dessa molécula, mas não do CD80 inibe a resposta linfoproliferativa ao M.leprae. Ainda no polo virchowiano anérgico, observamos redução da expressão de moléculas coestimulatórias de sinalização positiva (CD28, CD86) na superfície dos linfócitos. Em contraste, nos pacientes tuberculoides notamos um aumento da expressão de moléculas de sinalização negativa (CTLA-4 e PD-1), que pode representar uma provável modulação da resposta imune exacerbada, regulando dessa forma os efeitos deletérios da hiperreatividade celular. Notavelmente, os contatos também expressão em menor intensidade CD86 e CD28, mas não se observou expressão exacerbada de CTLA-4 ou PD-1, sugerindo que eles provavelmente desenvolvem resposta imune balanceada sem que haja necessidade de sinalização imunossupressora. Observamos ainda, que o antígeno do M.leprae induz uma significativa redução da resposta linfoproliferativa, mas um aumento significativo de células Treg no sangue e na pele dos pacientes virchowianos, quando comparado ao grupo tuberculoide. Em paralelo, notamos o aumento da expressão de moléculas anti-inflamatórias (IL-10 e CTLA-4) nas lesões cutâneas desses pacientes virchowianos. Conclusão: Nossos resultados sugerem que células Treg e moléculas coestimulatórias desempenham papel importante na patogênese da hanseníase, especialmente no polo virchowiano, em que favoreceria a anergia e a multiplicação bacilar / Introduction: Leprosy, caused by the bacillus Mycobacterium leprae, is a chronic, incapacitating disease that affects the peripheral nerves and skin. Leprosy manifests as a spectral disease, exhibiting two polar sides, namely, lepromatous leprosy (LL) characterised by impaired T-cell responses and tuberculoid leprosy in which T-cell responses are strong. Proper T-cell activation requires signalling through costimulatory molecules expressed by antigen presenting cells and their ligands on T-cells. T regulatory cells (Tregs) play an important role in the mechanism of host\'s failure to control pathogen dissemination in severe forms of different chronic granulomatous diseases, but their role in leprosy has not yet been elucidated. The objective of this study was to investigate the influence of costimulatory molecules and Tregs cels on the immune responses of subjects along the leprosy spectrum. Patients and Methods: Tregs were quantified by flow cytometry (CD4+ CD25+ Foxp3+) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of patients (16 lepromatous, 12 tuberculoids and controls (n = 6) stimulated in vitro with a M. leprae antigenic preparation and phytohemagglutinin as well as in skin lesions by immunohistochemistry. The expression of the costimulatory molecules (CD80, CD86, CD28, CTLA-4, PD-1, ICOS) was evaluated in in vitro-stimulated peripheral blood mononuclear cells isolated from 14 lepromatous and 14 tuberculoid patients, and 10 healthy individuals exposed to the bacillus. The lymphoproliferative (LPR), interleukin-10 (IL-10), and interferon-g (IFN-g) responses of the in vitro-stimulated peripheral blood mononuclear cells and the in situ expression of IL-10, transforming growth factor-b (TGF-b), and cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) were also determined. Results: We show that lepromatous patients have defective monocytes\' CD86 expression, likely contributing to the impairment of the antigen presentation process and to their anergy. Accordingly, anti-CD86 blocking monoclonal antibody, but not anti-CD80 antibody, inhibited the lymphoproliferative response to Mycobacterium leprae. Consistent with the lepromatous pole anergy, there was reduced T-cells\' expression of the positive signaling costimulatory molecules CD28 and CD86 in these patients. Tuberculoid patients, on the other hand, had increased expression of the negative signaling CTLA-4 and PD-1 molecules, probably representing a means of modulating exacerbated immune response and avoiding immunopathology. Interestingly, contacts exhibited proper CD86 and CD28 expression, but not exacerbated CD152 and PD-1 expression, suggesting that they tend to develop a balanced immunity without requiring immunosuppressive costimulatory signaling. We also observed that M. leprae antigens induced significantly lower lymphoproliferation but significantly higher Treg numbers in lepromatous than tuberculoid patients and contacts. Mitogen-induced lymphoproliferation and Treg frequencies were not significantly different between the three groups. Tregs were also more frequent in situ in multibacillary patients, and this was paralleled by increased expression of the anti-inflammatory molecules IL-10 and CTLA-4, but not TGF. Conclusion: Our results suggest that Tregs and costimuatory molecules play a major role in the pathogenesis of leprosy, especially the lepromatous pole, in which they would act to favor the anergy and the unrestricted multiplication of the bacilli

INTRODUÇÃO: Líquen plano (LP) é uma doença mucocutânea de natureza inflamatória crônica de etiologia ainda desconhecida. Alterações na resposta imune inata, como aos padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) podem levar à inflamação crônica e contribuir com a patogênese do LP. OBJETIVO: Avaliar o efeito da ativação via o DAMP S100A8 e o receptor Toll-like 4 (TLR-4) em células Natural killer (NK) e TCD8 citotóxicas e suas subpopulações de memória/efetoras em pacientes com LP. MÉTODOS: Foram selecionados 25 pacientes com LP (22 mulheres, 3 homens) com idade média de 43,46 anos ± 8,46 e um grupo controle com 25 indivíduos (22 mulheres, 3 homens) com idade média de 42 anos ± 5,5. A determinação transcricional e da expressão por imunohistoquimica dos DAMPs S100A8, HMGB-1 e de TLR-4 e RAGE foi realizada em biópsias de lesões cutâneas de indivíduos com LP, e os níveis séricos de S100A8, HMGB-1, MICA e MICB foram determinados por ELISA. As células mononucleares (CMNs) de sangue periférico foram avaliadas por citometria de fluxo quanto a frequência de TNF, IL-1beta e o marcador de desgranulação CD107a em células TCD8+ e células NK CD56+ e suas subpopulações. A avaliação da via de sinalização de TLR em células TCD8+ purificadas e ativadas com S100A8 foi analisada por PCR array e a determinação da expressão de mRNA dos componentes do inflamassoma em células TCD8+ ativadas com S100A8 por PCR em tempo real. RESULTADOS: Foi evidenciado nos indivíduos com LP elevada expressão da proteína S100A8 nas lesões cutâneas e de HMGB-1, TLR-4 e RAGE na derme, em paralelo ao aumento da expressão de mRNAs para S100A8 e S100A9 e diminuição de RAGE. Além disto, uma elevação dos níveis séricos do dímero S100A8/A9 foi detectada nos pacientes comparados aos controles, ao contrário do DAMP HMGB-1 que mostrou níveis similares em ambos os grupos. A influência do S100A8 em células TCD8+ e células NK, foi analisada em CMNs pela ativação com o lipopolissacáride e a proteína recombinante S100A8, ambos ligantes de TLR-4. Nos indivíduos com LP foi detectado aumento da resposta citotóxica de linfócitos TCD8+ e células NK CD56bright pela expressão do marcador de desgranulação CD107a por citometria de fluxo. A proteína S100A8 foi capaz de induzir a expressão de genes pró-inflamatórios como IL-1beta, TNF e IL-6 em células TCD8+ de pacientes com LP em contraste com os indivíduos saudáveis que mostraram expressão IL-10 e IFN tipo I. As células TCD8+ de indivíduos com LP ativadas ou não com S100A8 expressam transcritos de NLRP1, NLRP3 e AIM-2 e produzem IL-1beta em níveis similares a controles saudáveis. Além disso, células TCD8+ ativadas com S100A8 mostraram aumento de expressão TLR3, TLR5, TLR7 e TLR8 na doença comparada às biopsias de controles. O aumento da resposta TCD8+ citotóxica foi principalmente mediado pelo subtipo de memória efetora (TEM, CCR7- CD45RA-). Elevação basal da expressão do receptor ativador NKG2D e inibidor NKG2A foi observado em células NK CD56dim nos indivíduos com LP e um nível similar do ligante solúvel MICB em ambos os grupos. CONCLUSÃO: Estes resultados evidenciam que componentes da imunidade inata, como a proteína S100A8 pode contribuir na manutenção do perfil inflamatório do LP / BACKGROUND: Lichen planus (LP) is a mucocutaneous inflammatory chronic disease of unknown etiology. Alterations in the innate immune response such as the pathogen-associated molecular pattern (PAMPs) and damage-associated molecular pattern (DAMPs) can lead to chronic inflammation and contribute to the pathogenesis of LP. OBJECTIVE: Evaluate the effect of the activation trough the DAMP S100A8 and the Toll-like receptor 4 (TLR-4) on the Natural killer cells (NK) and cytotoxic TCD8 cells and their memory / effector subsets in LP disease. METHODS: We selected 25 patients with LP (22 women, 3 men) with a mean age of 43.46 years ± 8.46 and a control group of 25 subjects (22 women, 3 men) with a mean age of 42 ± 5, 5. The transcriptional determination and protein expression by immunohistochemistry of DAMPs, S100A8 and HMGB-1 as well as TLR-4 and RAGE was performed on biopsies of skin lesions from patients with LP, and serum levels of S100A8, HMGB-1, MICA and MICB were determined by ELISA. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were assessed by flow cytometry to evaluate the frequency of TNF, IL-1beta and the degranulation marker CD107a in CD8+ T cells and CD56 + NK cells and their subsets. The evaluation of the TLR signaling pathway in purified CD8 + T cells activated with S100A8 were analyzed by PCR array and the determination of mRNA expression of inflammasome components on CD8 + T cells activated by S100A8 was measured by real time PCR. RESULTS: It was shown in the LP individuals an increased expression of the S100A8 protein in the cutaneous lesions and HMGB-1, TLR-4 and RAGE in the dermis, in parallel to increased level of mRNAs for S100A8 and S100A9 and decreased expression of RAGE. Moerover, increased serum levels of the dimer S100A8 / A9 was detected in patients compared to controls, in contrast to DAMP HMGB1 that revealed similar levels in both groups. The influence of S100A8 in CD8 + T cells and NK cells, was analyzed in PBMC activating with lipopolysaccharide and recombinant protein S100A8, both ligands of TLR-4. It was detected in LP individuals, an increased cytotoxic response of CD8+ T lymphocytes and CD56bright NK cells trough CD107a degranulation marker expression. The S100A8 protein was able to induce the pro-inflammatory genes expressions such as IL-1beta, TNF and IL-6 in CD8 + T cells of LP patients in contrast to healthy subjects who promoted IL-10 expression and type I IFN. CD8 + T cells of LP individuals activated or not with S100A8 are able to express NLRP1, NLRP3 and AIM-2 and IL-1beta production at similar levels to healthy controls. Moreover, CD8 + T cells activated with S100A8 showed increased expression of TLR3, TLR5, TLR7 and TLR8 in LP compared to biopsies from healthy controls. The increased CD8 + T cells cytotoxic response was mediated by the subtype of effector memory (TEM CD45RA- CCR7). The increased baseline expression of activating receptor NKG2D and the inhibitory NKG2A in the NK CD56dim cells in LP individulas, and the similar level of MICB soluble in both groups. CONCLUSION: These results shows that innate immunity components, such as S100A8 protein may contribute to the maintenance of LP inflammatory profile

INTRODUÇÃO: O diagnóstico diferencial dos processos linfoproliferativos cutâneos de célula B permanece um desafio para patologistas, dermatologistas, hematologistas e oncologistas, apesar dos recentes avanços imunoistoquímicos e moleculares. OBJETIVO: Este trabalho avaliou o auxílio diagnóstico e as limitações da pesquisa da clonalidade utilizando a biologia molecular nos linfomas primários cutâneos de célula B e pseudolinfomas de células B, assim como a relevância da análise dos dados em conjunto com informações clínicas, histológicas e imunoistoquímicas. MÉTODOS: O estudo incluiu 31 casos de processos linfoproliferativos cutâneos de célula B classificados à histologia e imunoistoquímica como 14 linfomas, 6 pseudolinfomas e 11 casos inconclusivos. A pesquisa da clonalidade foi realizada em todos os casos por meio da pesquisa do rearranjo dos genes da cadeia leve kappa e pesada utilizando o método de PCR. RESULTADOS: Os resultados confirmaram monoclonalidade em 61,5% dos linfomas. Em adição, o método evidenciou monoclonalidade em 20% dos casos inconclusivos à avaliação histológica e imunoistoquímica. A pesquisa do rearranjo dos genes de cadeia leve kappa resultou mais contributiva em relação à pesquisa do rearranjo dos genes da cadeia pesada. CONCLUSÕES: Estes resultados demonstraram a utilidade do método no auxilio diagnóstico dos linfomas cutâneos. A maior contribuição no estudo da clonalidade dos processos linfoproliferativos cutâneos de células B, através da pesquisa do rearranjo dos genes de cadeia leve kappa em associação com a pesquisa do rearranjo dos genes de cadeia pesada, sugeriu a necessidade da utilização conjunta das duas técnicas para maior acurácia diagnóstica nestes casos. / INTRODUCTION: The differential diagnosis of the lymphoproliferative B-cell infiltrates remains an important challenge for pathologists, dermatologists, hematologists and oncologists, despite the recent advances in immunohistochemical and molecular techniques. OBJECTIVES: This study has evaluated the diagnostic aid and the limitations of the clonality analysis using molecular biology in cutaneous B-cell lymphomas and pseudolymphomas, as well as the relevance of this analysis when combined with clinical, histological and immunohistochemical data. METHODS: The study covered 31 cases of cutaneous lymphoproliferative B-cell infiltrates classified by histological and immunohistochemical characteristics as 14 lymphomas, 6 pseudolymphomas and 11 non-conclusive cases. The clonality analysis was performed in all cases using PCR to detect the pattern of immunoglobulin light kappa and heavy chains gene rearrangements. RESULTS: The results have confirmed monoclonality in 61,5% of lymphomas. In addition, the method showed monoclonality in 20% of the cases previously classified as a non-conclusive through histological and immunohistochemical evaluation. CONCLUSION: These results highlight the importance of the PCR clonality analysis as an ancillary diagnostic tool in cutaneous lymphoma. The research of the immunoglobulin light kappa gene rearrangement was more efficient resulting in a higher rate of monoclonality detection when compared to the heavy chain analysis. Nevertheless, the use of both protocols improves the sensitivity of the method.

INTRODUÇÃO: Estudos experimentais suportam a evidência de leucopenia persistente desencadeada pela morte encefálica (ME). OBJETIVO: Esse estudo teve como objetivo investigar o comportamento leucocitário na medula óssea e no sangue após a morte encefálica em ratos. MÉTODOS: A morte encefálica foi induzida através da inserção e insuflação rápida de um cateter no espaço intracraniano. Ratos falso-operados (FO) foram apenas trepanados. Decorridas seis horas, as células da medula óssea, coletadas da cavidade femural, foram utilizadas para as contagens total e diferencial e analisadas por citometria de fluxo para a caracterização das subpopulações linfocitárias, a expressão de moléculas de adesão granulocíticas e apoptose/necrose (método de Anexina V/Iodeto de Propídio (PI)). RESULTADOS: Ratos com ME apresentaram uma redução de 30% no número de células da medula óssea devido à redução de linfócitos (40%) e células segmentadas (45%). As subpopulações de linfócitos na medula óssea foram semelhantes nos animais ME e FO (CD3, p=0,1; CD4, p=0,4; CD3/CD4, p=0,4; CD5, p=0,4, CD3/CD5, p=0,2; CD8, p=0,8). A expressão de L-selectina e beta2-Integrinas nos granulócitos também não diferiram entre os grupos (CD11a, p=0,9; CD11b/c, p=0,7; CD62L, p=0,1). Não existem diferenças nas porcentagens de apoptose e de necrose (Anexina V, p=0,73; PI, p=0,21; Anexina V/PI, p=0,29). CONCLUSÃO: Os dados sugerem que a redução na mobilização de células da medula óssea para o sangue, desencadeada pela morte encefálica, não se relaciona a alterações de subpopulações de linfócitos, expressão de moléculas de adesão granulocíticas, ou apoptose e necrose / INTRODUCTION: Experimental findings support the evidence of a persistent leucopenia triggered by brain death (BD). AIMS: This study aimed to investigate leukocyte behavior in bone marrow and blood after BD in rats. METHODS: BD was induced by quickly inflation of an intracranial balloon catheter. Sham operated (SH) rats were trepanned only. Six hours thereafter bone marrow cells harvested from the femoral cavity were used for total and differential counts, and analyzed by flow cytometry to characterize lymphocyte subsets, granulocyte adhesion molecules expression, and apoptosis/necrosis (annexin V/propidium iodide (PI) protocol). RESULTS: BD rats exhibited a 30% reduction in bone marrow cells due to a reduction in lymphocytes (40%) and segmented cells (45%). Bone marrow lymphocyte subsets were similar in BD and SH rats (CD3, p=0.1; CD4, p=0.4; CD3/CD4, p=0.4; CD5, p=0.4, CD3/CD5, p=0.2; CD8, p=0.8). Expression of L-selectin and ?2-integrins on granulocytes did not differ (CD11a, p=0.9; CD11b/c, p=0.7; CD62L, p=0.1). There were no differences in the percentage of apoptosis and necrosis (Annexin V, p=0.73; PI, p=0.21; Annexin V/PI, p=0.29). CONCLUSIONS: Data presented suggest that the down-regulation of the bone marrow triggered by BD is not related to changes in lymphocyte subsets, granulocyte adhesion molecules expression, or apoptosis and necrosis

A epidemia causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) é a mais importante das ultimas décadas. A despeito dos avanços no conhecimento da patogenia do vírus e da resposta imune à infecção, até o momento não existe uma vacina eficaz contra a aquisição do HIV. Diversas linhas de evidência indicam que anticorpos neutralizantes ou ligadores, linfócitos T CD4+ e T CD8+ desempenham um papel importante na imunidade contra o HIV. Os anticorpos que são capazes de neutralizar o HIV são direcionados principalmente à glicoproteína do envelope do vírus (env), mas os candidatos vacinais baseados na proteína de envelope gp120 monomérica testados até hoje falharam em induzir proteção nos ensaios de eficácia. Avanços no entendimento da estrutura e função da glicoproteína env tem facilitado o desenvolvimento de uma nova geração de imunógenos baseada em trímeros mais estáveis e solúveis da glicoproteína gp140. Em uma formulação vacinal além da escolha do antígeno, os adjuvantes desempenham um papel fundamental. Os adjuvantes são conhecidos por aumentar a imunogenicidade das vacinas, e nos últimos anos vários compostos, incluindo agonistas de receptores do tipo Toll (TLR) e NOD (NLR) têm demonstrado eficácia em ensaios clínicos. Em estudos prévios, nosso grupo demonstrou que a imunização de camundongos com uma vacina de DNA codificando 18 epítopos para linfócitos T CD4+ do HIV-1 (HIVBr18), foi capaz de induzir resposta específica e ampla de linfócitos T CD4+ e T CD8+. Devido ao importante papel do efeito auxiliar de linfócitos T CD4+ na resposta humoral nas imunizações assistidas por diversos adjuvantes, o objetivo central do trabalho foi verificar se a imunização inicial com a vacina de DNA HIVBr18 seria capaz de aumentar a magnitude/qualidade de resposta imune humoral e celular induzida pelo trímero de gp140 na presença de diferentes adjuvantes. Para tal, camundongos BALB/c foram imunizados inicialmente com a vacina HIVBr18 ou com o vetor vazio e posteriormente com a proteína gp140 na presença dos adjuvantes: completo de Freund (ACF), poly IC, CpG ODN 1826, Monofosforil lipídeo A (MPL), Muramildipeptídeo (MDP), Imiquimod (R837), e Resiquimod (R848). Observamos que a imunização inicial com HIVBr18 foi capaz de fornecer um auxílio cognato para a proliferação específica de linfócitos T CD4+ e T CD8+ e também para a produção da citocina IFNy. A análise da xx resposta humoral mostrou que a imunização inicial com a vacina HIVBr18, foi capaz de influenciar a produção das subclasses de imunoglobulinas, independente do adjuvante testado. No presente trabalho, também analisamos a influência dos adjuvantes na imunogenicidade da gp140. Os animais que receberam os adjuvantes MPL, poly IC e CpG ODN 1826 apresentaram títulos de anticorpos estatisticamente superiores quando comparados aos animais que receberam os adjuvantes Alum, MDP, R837 e R848. Observamos que os animais imunizados com a gp140 na presença dos diferentes adjuvantes desenvolveram células B do centro germinativo e células TCD4+ auxiliar foliculares. Estes resultados nos permitem concluir que a imunização inicial com HIVBr18 é capaz de alterar a qualidade da resposta humoral e celular gp140- específica. Assim, essa formulação poderia ser utilizada para auxiliar e/ou direcionar a resposta imune induzida por outros imunógenos como por exemplo o trímero de gp140. Podemos concluir também que diferentes formulações de adjuvantes que se encontram em ensaios clínicos como poly IC, CpG ODN e MPL podem ser capazes de induzir um resposta imune humoral e celular tão ou mais potente que aquela induzida pelo ACF / The epidemic caused by the human immunodeficiency virus (HIV) is the most important in the last decades. Despite advances in the knowledge about virus pathogenesis and immune response to infection, until now there is not an effective vaccine against HIV acquisition. Several evidences indicate that neutralizing or binding antibodies, CD4+ and CD8+ T lymphocytes play an important role in immunity against HIV. The antibodies that are able to neutralize HIV are primarily directed against the virus envelope glycoprotein (env), but the vaccine candidates based on monomeric gp120 envelope protein tested so far failed to induce protection in efficacy trials. Advances in understanding the structure and function of the env glycoprotein have facilitated the development of a new generation of immunogens based on trimers, a more stable and soluble form of gp140 glycoprotein. In a vaccine formulation, in addition to the antigen, adjuvants play a pivotal role. Adjuvants are known to increase the immunogenicity of vaccines and, in the last years, several compounds, including agonists of Toll-like receptors (TLR) and NOD (NLR), have presented efficacy in clinical trials. In previous work, our group demonstrated that immunization of mice with a DNA vaccine (HIVBr18) encoding 18 CD4+ T cells epitopes from HIV-1 was able to induce a broad CD4+ T and CD8+ T cells specific response.. Given the important role of CD4+ T cells in the humoral response after adjuvant-assisted immunization, the aim of the study was to verify whether an initial immunization with the DNA vaccine HIVBr18 could increase the magnitude/quality of humoral and cellular immune response induced by gp140 trimer in the presence of different adjuvants. Therefore, BALB/c mice were initially immunized with the vaccine HIVBr18 or empty vector and then with gp140 in the presence of the following adjuvants: Freund\'s complete (CFA), poly IC, CpG ODN 1826, monophosphoryl lipid A (MPL), Muramyl dipeptide (MDP), Imiquimod (R837), and Resiquimod (R848). We observed that initial immunization with HIVBr18 was able to provide cognate help for specific CD4+ and CD8+ T cells proliferation and also for IFN-y production. Analysis of humoral response showed that initial immunization with the HIVBr18 vaccine was able to alter the production of immunoglobulin subclasses independent of the adjuvant tested. This work also analyzed the influence of adjuvants on the immunogenicity of gp140. Mice that received the adjuvant MPL, poly IC and CpG ODN 1826 presented higher antibody titers when compared to animals that received Alum, MDP, R837 and R848. We observed that mice immunized with gp140 in the presence of all adjuvants tested developed germinal center B cells and follicular helper T cells (TFH). We conclude that initial immunization with HIVBr18 is able to alter the quality of specific humoral and cellular immune responses.. Therefore, this formulation could be used in combination with other immunogens, such as gp140, to help/redirect the immune response. We also conclude that the adjuvants that are in clinical trials such as poly IC, MPL and CpG ODN 1826 may be able to induce stronger humoral and cellular response than CFA

A síndrome de Rubinstein-Taybi (RTS, OMIM 180849) é uma doença autossômica dominante caracterizada por dismorfismos craniofaciais típicos, polegares e háluces alargados, infecções respiratórias recidivantes, retardo mental e de crescimento. RTS está associada com mutação no gene CREBBP. Na avaliação da imunocompetência de 17 portadores de RTS, observaram-se algumas alterações na resposta imune inata e adaptativa: leucocitose persistente, neutrófilos com desgranulopoiese, elevada concentração sérica de IgM e IgG1, produção normal de anticorpos contra antígenos protéicos e anti-polissacarídeos, elevados valores absolutos de células B totais, B \"naive\", B de memória, subpopulação B1 e de linfócitos B com IgM de membrana, e elevado percentual de apoptose de linfócitos B. DTH negativo para três antígenos e baixa resposta linfoproliferativa para antígenos protéicos. Diante do exposto, concluímos que os pacientes RTS apresentam alterações em vários mecanismos da resposta imune e principalmente, na imunidade humoral. Portanto, com este trabalho foi possível identificar as principais alterações imunológicas destes pacientes, e com isso, caracterizar quais os defeitos da resposta imune que pode estar associada com gene CREBBP. / Rubinstein-Taybi syndrome (RTS, OMIM 180849) is a dominant Mendelian disorder characterized by craniofacial dysmorphisms, broad thumbs and toes, mental retardation and growth and recurrent respiratory infections. RTS is classically associated with CREBBP gene mutations, but recently, p300 gene mutations were reported in three individuals. In imunonocompetence investigation of a group of 17 patient of the RTS, we found that the patients really show alterations in more than one arm of the immune response. The main alterations were found in: a) innate immunity, patients have defects in the distribution of the granules citoplasmatic and partial absence of F-actin filament part of its polymorphonuclear cells. In addition, some patients had decreased phagocytic activity, b) humoral immunity: elevated serum IgM antibodies and IgG1 subclass, normal production of antibodies for protein antigens and antipolysaccharide, high absolute values of B cell total, B \"naive\", B memory, subpopulation B1 and B lymphocytes with the membrane IgM, and high percentage of apoptosis of B lymphocytes; c) cellular immunity: delayed hypersensitivity skin tests negative for three antigens and low lymphoproliferative response to protein antigens. Values reduced percentage of CD45RA+ , CD45RO+ T cells and high doublepositive CD45RA+/CD45RO +) T cell. Ahead of the severe recurrent respiratory infections that affect the patients with RTS, and of the evaluation of immunocompetence of these patients, we find that they have several alterations in mechanisms of immune response and mainly in humoral immunity. Therefore, with this study was to identify the major immunological alterations of these patients, and with this, which characterize the main defects of the immune response of the patients RTS that can is associated with gene CREBBP.

O vírus Epstein-Barr infecta aproximadamente 95% da população mundial adulta, estabelecendo uma infecção latente e assintomática. Porém, é um vírus associado à neoplasias malignas, tais como carcinomas de nasofaringe, linfomas de Hodgkin, alguns casos de carcinomas gástrico, linfomas T e NK, dentre outras. O EBV também está implicado em doenças não neoplásicas como a leucoplasia pilosa. O fenômeno de imunotolerância está ligado ao potencial de infecção e oncogênico do EBV. Células dendríticas imaturas e linfócitos T reguladores são importantes nesse contexto. Em situações neoplásicas, esse mecanismo impede o reconhecimento e a destruição de células tumorais. O objetivo desse trabalho foi estudar em quatro diferentes situações de infecção pelo EBV, a saber, amigdalite crônica, linfomas de Hodgkin, leucoplasia pilosa e carcinomas de nasofaringe, a presença de células dendríticas imaturas e linfócitos T reguladores, e também o papel da citocina MIP3 no recrutamento dessas células. Foram utilizadas as técnicas de hibridização in situ para detecção do EBV e imunoistoquímica para detecção das células dendríticas, linfócitos T reg e para análise da expressão de MIP3. Em todos os casos de linfoma de Hodgkin, amigdalites e carcinomas de nasofaringe EBV+ observou-se uma forte concentração de células dendríticas imaturas e linfócitos T reg. A expressão de MIP3 mostrou-se intensa nas neoplasias EBV positivas e fraca nos casos de amigdalite crônica. Não foi observada expressão de MIP3 nos casos de leucoplasia pilosa. A concentração de células dendríticas imaturas e linfócitos T reg está intimamente ligada à presença de céulas EBV+ e pela expressão de MIP3 nos linfomas de Hodgkin associados ao EBV e carcinomas de nasofaringe, criando assim um micro-ambiente de imunossupressão nessas lesões. / The Epstein-Barr virus infects approximately 95% of adult world-wilde population, establishing a latent and asymptomatic infection. However it is related to malignant neoplasia, such as nasopharynx carcinomas, Hodgkin disease, some gastric carcinomas, T/NK lymphomas among others. EBV is also implicated in non-neoplasic disease such as hairy leukoplakia. This phenomenon is associated with the EBV infectious and oncogenic potential. Immature dendritic cells and T reg cells are important in this context. In neoplasic situations, this mechanism obstructs recognition and destruction of tumoral cells. The aim of this work was study, in four different situations of EBV infection, to knowledge, chronic tonsillitis, Hodgkins disease, hairy leukoplakia and nasopharynx carcinoma, the presence of immature dendritic cells and T reg cells, and also the role of cytokine MIP3 in the recruitment of these cells. In situ hybridization was performed for EBV detection and immunohistochemistry for dendritic cells and T reg cells detection and also for expression evaluation of MIP3 cytokine. In all the cases of Hodgkins disease, tonsillitis and nasopharynx carcinoma EBV+, a strong concentration of immature dendritic cells and T reg lymphocytes was observed. The MIP3 expression was more intense on EBV positive neoplasia and weak in cases of chronic tonsillitis. No MIP3 expression was observed in hairy leukoplakia. The concentration of immature dendritic cell and T reg lymphocyte is intimately connected with the presence of EBV positive-cells and MIP3 expression in Hodgkin disease associated to EBV and nasopharynx carcinoma, creating a microenvironment of immunosuppression in these neoplasias.

Durante uma infecção o número de linfócitos T aumenta dramaticamente. A fase de expansão clonal é seguida pela redução do nível de células T ativadas que depende, em parte, de um processo de morte celular induzida por ativação (AICD). Nosso grupo mostrou que APCs quando são estimuladas com LPS, um agonista de TLR4, produzem PGE2, que inibe a AICD de linfócitos T CD4+ através da supressão da expressão de CD95L (Weinlich et al, 2008). Porém, os efeitos da estimulação direta de TLR nos linfócitos T sobre o processo de AICD foram pouco elucidados. Sendo assim, o projeto tem como objetivo verificar se a estimulação dos diversos TLRs com seus agonistas é capaz de modular a AICD de hibridomas de linfócito T DO11.10. Inicialmente, demonstramos que este hibridoma expressa os TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 e 11. Dentre todos os agonistas utilizados somente o Imiquimod, um agonista de TLR7, reduziu a morte celular quando adicionado durante a indução de AICD. O efeito protetor desse agonista foi através da inibição da expressão de CD95L, tanto no nível de mRNA quanto protéico. / During an infection the number of T lymphocytes increases dramatically. The clonal expansion phase is followed by reducing the level of activated T cells that depends, in part, a process of cell death induced by activation (AICD). Our group showed that when APCs are stimulated with LPS, a TLR4 agonist, produce PGE2, which inhibits the AICD of CD4 + T cells by suppressing the expression of CD95L (Weinlich et al, 2008). However, the effects of direct stimulation of TLR on T cells on the process of AICD were little explained. Therefore, the project aims to determine whether the stimulation of different TLRs to their agonist is able to modulate AICD of T lymphocyte hybridoma DO11.10. Initially, we demonstrated that this hybridoma expresses TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 and 11. Among all agonists used only imiquimod, a TLR7 agonist, reduced cell death when added during the induction of AICD. The protective effect of this agonist was by inhibiting the expression of CD95L, both at the mRNA and protein.

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Além disso, como os animais velhos apresentam menor declínio funcional em células T de imunidade adaptativa, testamos a hipótese de que camundongos AE velhos ao serem infectados pelo vírus da dengue apresentariam maior taxa de mortalidade do que animais AP pareados por idade, e isso estaria associado à maior hiperplasia dos linfócitos T. Para testar essas hipóteses implantamos regime de inoculações múltiplas em animais adultos de 9 e 18 meses de idade. Dois regimes de inoculação foram testados: inoculações múltiplas de homogeneizado cerebral infectado por um único sorotipo (IUS) ou inoculações alternadas daquele homogeneizado e de anticorpo heterólogo (ICAH). Em ambos os casos foram feitas inoculações múltiplas intraperitoneais encontrando-se diferenças significativas no curso temporal da doença nos animais submetidos a um ou outro regime de inoculação. Comparado ao grupo ICAH para o qual detectou-se diferenças significativas entre os grupos AE e AP (Kaplan-Meyer log-rank test, p = 0,0025), não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos experimentais AP e AE submetidos ao regime IUS (Kaplan-Meyer log-rank test, p = 0,089). As curvas de sobrevivência dos grupos AE e AP sob o regime ICAH foram estendidas após a injeção de glicocorticoides reduzindo-se os sintomas e o número de mortes e esse efeito foi maior no grupo AE do que no AP (Kaplan-Meyer log-rank test, p = 0,0162). No regime ICAH, o grupo AE mostrou sinais clínicos mais intensos do que o AP e isso incluiu dispneia, tremor, postura encurvada, imobilidade, paralisia pré-terminal, choque e eventual morte. Comparado ao grupo AP, o grupo AE independentemente da idade apresentou maior mortalidade e sinais clínicos mais intensos. Esses sinais clínicos mais intensos nos animais do ambiente enriquecido submetidos ao regime ICAH foram associados à maior hiperplasia de linfócitos T no baço e maior infiltração dessas células no fígado, pulmões e rins. Embora a hiperplasia linfocítica e a infiltração tenham se mostrado mais intensas nos animais velhos do que nos jovens, a imunomarcação para os antígenos virais nos mesmos órgãos foi maior nos jovens do que nos velhos. A presença do vírus nos diferentes órgãos alvo foi confirmada por PCR em tempo real. Tomados em conjunto os resultados sugerem que o ambiente enriquecido exacerba a resposta inflamatória subsequente à infecção por dengue acentuada por anticorpo heterólogo, e isso está associado à sintomas clínicos mais intensos, maior taxa de mortalidade e ao aumento da expansão de células T. Os ensaios comportamentais e histopatológicos do presente trabalho permitiram testar e validar novo modelo murino imunocompetente para estudos em dengue permitindo testar numerosas hipóteses oriundas de estudos epidemiológicos e in vitro. / Because the enriched environment (EE) increases the activity of T cells, contribute to the immunopathogenesis of dengue virus infections (VDEN) we hypothesized that animals maintained in an enriched environment (AE) compared with animals from impoverished environment of standard laboratory cages (IE), would develop more severe forms of the disease. Because older animals have less functional decline in adaptive immunity T cells, we tested the hypothesis that AE old mice would show higher number of deaths and more intense clinical signs than age-matched IE animals, and this would be associated with greater expansion of T lymphocytes. To test these hypotheses we established scheme of multiple inoculations in adult animals of 9 and 18 months of age. Two regimens of inoculation were tested: multiple injections of single serotype (VDEN3 genotype III) infected brain homogenate (SS) or alternatively multiple injections with that infected brain homogenate followed 24h later by inoculation of heterologous antibody (SSHA). In both cases multiple i.p. inoculations were done. It was found significant differences in the temporal progression of the disease in the animals submitted to one or another scheme of inoculation: SSHA group (Kaplan -Meier log-rank test, p = 0.0025); IUS (Kaplan -Meier log-rank test, p = 0.089). The survival curves of AE and AP under SSHA regime were extended after a single injection of glucocorticoids, reducing the symptoms and the number of deaths, and these effects were greater in the EE group than in the IE (Kaplan-Meier log-rank test, p = 0.0162). In SSHA scheme, EE group showed clinical signs more intense than the AP and those included dyspnea, tremor, hunched posture, immobility, pre-terminal paralysis, shock and eventual death. Compared to the IE group, the AE group regardless of age showed higher mortality and more severe clinical signs. These more severe clinical signs in EE animals under SSHA regime were associated with increased hyperplasia of T lymphocytes in the spleen and increased infiltration of these cells in the liver, lungs and kidneys. Although lymphocytic hyperplasia and infiltration have been more intense in older than in younger animals, immunostaining for viral antigens in target organs was higher in young than in the aged mice. The presence of the virus in various infected organs were confirmed by real time PCR. Taken together the results suggest that the enriched environment life style exacerbates the subsequent inflammatory response to infection, and that is associated with more severe clinical symptoms, higher mortality and increased T cell expansion. Behavioral and histopathological data validate a new immunocompetent murine model for studies on dengue disease allowing in vivo tests of a number of hypothesis raised by epidemiological and in vitro studies.