Uma fração considerável de pacientes com doença de Chagas, decorrente da infecção pelo protozoário Trypanosoma cruzi, desenvolve a cardiopatia crônica, que pode levar a morte. A regulação da resposta imune específica contra o parasita é essencial para controlar a atividade efetora excessiva anti-T. cruzi. Na falta dessa regulação, a resposta imune acaba por induzir lesão dos tecidos. Uma vez que, em hipótese, componentes autoimune participam da cardiopatia chagásica, a regulação da resposta poderia ser necessária para controlar a reatividade contra o próprio. Nesta tese, nós avaliamos o envolvimento das células T reguladoras (TREG) em modelo murino de doença crônica de Chagas. Na fase aguda, período em que ocorre uma forte ativação policlonal de linfócitos, observa-se um pequeno aumento no número de células esplênicas CD4+CD25+FoxP3+ TREG, no entanto, um aumento de maior magnitude ocorre nas células efetoras CD4+CD25+FoxP3-. O tratamento de camundongos na fase aguda da infecção com MoAb anti-CD25 (PC61) resulta em discreta redução no número de células TREG, mas essa não afeta os níveis de parasitemia ou patologia do coração na fase aguda. Na fase crônica, os números de células TREG dos animais crônicos retornam aos mesmos níveis dos observados nos animais não infectados, no entanto, o número de esplenócitos CD4+ está discretamente aumentado. O tratamento de camundongos crônicos com PC61 resulta em uma redução no número de células TCD4+CD25+ e uma tendência à redução no número de células CD4+FoxP3+. Mais importante, a resposta imune anti- T. cruzi, carga parasitária sistêmica e patologia cardíaca não foram consistentemente alteradas nos grupos tratados com PC61 em comparação aos tratados com o controle isotípico ou IgG de rato. O fato do tratamento com MoAb PC61 não modificar a patologia do coração de camundongos crônicos pode ser devido a depleção incompleta das células TREG, ou a um pequeno envolvimento das TREG no controle dos mecanismos efetores anti- T. cruzi. / A large fraction of patients with Chagas disease, an illness due to infection by protozoan Trypanosoma cruzi, develops chronic myocardiopathy that often leads to death. Regulation of parasite-specific immune responses is essential to control excessive anti-T. cruzi effector activity that may result in tissue damage. Moreover, because autoimmunity has been hypothesized to contribute to Chagas myocardiopathy, regulation could be also necessary to control anti-self reactivity. In this paper we evaluated the involvement of TREG in a murine model of chronic T. cruzi infection. In the acute phase, a period when there is strong polyclonal lymphocyte activation, a small increase in the number of CD4+CD25+FoxP3+ spleen cells (TREG) cells is observed, albeit of considerably lower magnitude than that of CD4+CD25+FoxP3- effector cells. Treatment of acutely-infected mice with anti-CD25 (PC61) mAb results in discrete reduction of TREG cell numbers, but it does not affect parasitaemia levels or acute phase heart pathology. At the chronic phase, TREG cells numbers return to numbers of non-infected mice, in spite that the total number of CD4+ splenocytes is discretely increased in chronic mice. Treatment of chronic mice with PC61 results in a reduction in TCD4+CD25+ cell numbers, but in a small, non significant reduction in total CD4+FoxP3+ cells. More important, the anti-T. cruzi immune response, systemic parasite load and heart pathology were not consistently altered in PC61-treated chronic mice compared to mice treated with isotypic control antibodies or normal rat IgG. Failure to modify heart pathology in PC61-treated chronic mice could be due to incomplete TREG depletion or to discrete involvement of TREG in control of the anti-T. cruzi effector mechanisms.

O envelhecimento é marcado por inúmeras alterações fisiológicas, dentre as quais encontramos um aumento da gordura corporal e alterações na resposta do sistema imunológico. Muito se sabe sobre a intrínseca ligação entre o aumento de gordura e as doenças de risco e fica a questão à cerca de sua influência sobre as respostas do sistema imunológico, já que estes dois fatores encontram-se alterados no envelhecimento. Portanto, o propósito deste estudo foi investigar a interação entre a quantidade de gordura corporal e as células do sistema imunológico de ratos envelhecidos. Para isso, num primeiro estudo, foram utilizados ratos ADULTOS e ENVELHECIDOS para a caracterização das alterações encontradas no processo de envelhecimento. Numa segunda etapa, os animais ENVELHECIDOS foram submetidos a dois protocolos de emagrecimento, a restrição calórica a 50%(RC) e o exercício aeróbio (EX) (natação), durante o período de quatro a seis semanas. Assim, foi possível avaliar alguns parâmetros do metabolismo de macrófagos e linfócitos em ratos envelhecidos com diferentes quantidades de gordura corporal. No primeiro estudo, os resultados comprovaram o aumento da gordura bem como algumas alterações no sistema imunológico de ratos envelhecidos, principalmente na capacidade funcional de macrófagos. Quanto ao segundo estudo, os resultados demonstram que ambos os protocolos foram eficientes em diminuir o peso corporal, bem como a gordura, sendo que para a RC os valores alcançados foram mais evidentes. Com relação ao sistema imunológico houve um aumento da resposta fagocitária e de produção de H2O2 por macrófagos e uma alteração da capacidade proliferativa de linfócitos, em ambos os protocolos. / Ageing is marked by several kinds of physiological changes, among then we find an increase of fat mass and a decline in several aspects of the immune system. It is well understood the intrinsical connexion between the increase in body fat and the risk of related diseases and the one question that remains is about the influence over the immune system response, since these two factors are altered on the ageing process. The purpose of this study was to investigate the relationship among fat content and immune cells of the aging rats. For this, in one first study, we used ADULTS and AGEING rats to determine the changes found in the ageing process. In the second time, the AGEING rats were submitted to two protocols for weight loss (slimming), 50% of caloric restriction (CR) and aerobic exercise (swimming) (EX), for four or six weeks. In this way, we can study some parameters of macrophages and lymphocytes metabolism in ageing rats with different body fat content. In the first study, the results confirmed the fat increase as well as some changes in the immune system of the ageing rats, especially in the macrophages functional capabilities. In the second study, the results showed that both protocols decreased body fat and weight, with the best results happening with CR protocol. The immune system had an increase on the phagocytic response and H2O2 production for macrophages and alterations of the proliferative capacities of the lymphocytes, in both protocols.

A rejeição ao aloenxerto mediada por mecanismos celulares ou humorais representa uma importante complicação no pós-transplante renal. Estudos anteriores demonstraram que o depósito de C4d peritubular é um marcador de rejeição mediada por anticorpos. A técnica padrão ouro para a pesquisa de C4d é a imunofluorescência em criostato. No entanto, o manuseio do material congelado implica em algumas limitações custo-operacionais, particularmente em nosso meio. Nos casos de rejeição mediada por anticorpos é de relevância patogenética a análise da participação de linfócitos B e plasmócitos, pois são as células responsáveis pela produção de anticorpos. Considerando que até o momento o envolvimento de linfócitos B e plasmócitos no processo de rejeição foi pouco investigado, no presente estudo também será analisada a expressão de CD20 e CD138 em biópsias renais, para caracterização destes componentes celulares. Portanto, o objetivo do presente estudo foi analisar a detecção do fragmento C4d por meio de 4 diferentes técnicas, além de analisar o infiltrado de linfócitos B e plasmócitos em biópsias de enxerto renal, correlacionando estes achados com o C4d peritubular. Foram analisadas 107 biópsias de 82 pacientes submetidos a transplante renal. A pesquisa do C4d foi realizada utilizando-se as técnicas de imunofluorescência [IF] (em cortes de criostato e de parafina) e imuno-histoquímica [IH] (em cortes de criostato e de parafina), enquanto que as pesquisas dos linfócitos B e plasmócitos foram realizadas pela técnica de IH em cortes de parafina utilizando-se os anticorpos anti-CD20 e anti-CD138, específicos para linfócitos B e plasmócitos, respectivamente. Com relação à detecção de C4d, as técnicas com maior índice de concordância com a IF-criostato, considerada padrão-ouro, foram IH-criostato (75,6% dos casos apresentaram resultados coincidentes, r=0,72; p<0,0001) e IF-parafina (73%, r=0,59; p=0,0001), enquanto a taxa de concordância na técnica de IH-parafina foi de apenas 51,4% (r=0,35; p=0,03). Analisando a evolução clínica, a sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia foi menor no grupo C4d positivo comparado ao grupo C4d negativo (67% vs 96%, respectivamente, p=0,01). A prevalência de linfócitos B (CD20+) foi de 54% das biópsias de enxerto renal. A análise histológica do infiltrado de linfócitos B revelou 2 padrões distintos de infiltrado: padrão de células isoladas (74%) e padrão nodular (26%). O padrão nodular esteve associado a uma menor sobrevida do enxerto renal em 3 anos pós-biópsia (61% vs 89% no grupo CD20 negativo; p=0,03; e 61% vs 87% no grupo padrão de células isoladas; p=0,03). A prevalência de plasmócitos (CD138+) em biópsias de enxerto renal foi de 59%. O infiltrado plasmocitário não esteve associado a uma pior evolução clínica do transplante. A análise da correlação entre C4d peritubular, linfócitos B e plasmócitos demonstrou que o número de células CD20+ e CD138+ foi significativamente maior nos casos C4d positivos comparados aos casos C4d negativos (CD20+: 155±53 vs 26±7 cels/mm2, respectivamente; p=0,001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cels/mm2, respectivamente; p=0,002). O presente estudo concluiu que o depósito peritubular de C4d e o infiltrado de linfócitos B, em especial o padrão nodular, estão associados a uma evolução clínica desfavorável do transplante renal. Outra conclusão importante é que há uma associação positiva entre os infiltrados de linfócitos B e de plasmócitos com o C4d peritubular, sugerindo um possível papel destas células responsáveis pela produção de anticorpos na ativação do sistema complemento in situ. Finalmente, as técnicas de IH-criostato e IF-parafina podem ser consideradas técnicas alternativas à técnica de IF-criostato para a detecção do C4d / Allograft rejection mediated by cellular or humoral mechanisms represents an important complication after kidney transplantation. Capillary C4d deposition was recognized as a specific and independent prognostic marker of antibody mediated rejection. The gold standard technique for C4d detection is the immunofluorescence in cryostat sections. However, this technique involves some operating and costs limitations, particularly in Brazil. In antibody mediated rejection, the analysis of B lymphocytes and plasma cells is of pathogenetic relevance since these cells are responsible for antibody production. Considering that the involvement of B lymphocytes and plasma cells in the rejection process is not clear, in this study the CD20 and CD138 expression in kidney biopsies will be also analyzed. Therefore, the aim of the present study was to analyze the C4d detection by 4 different techniques and the infiltration of B lymphocytes and plasma cells in renal allograft biopsies, correlating these findings with the capillary C4d deposition. One hundred and seven biopsies of 82 renal transplant patients were analyzed. C4d was evaluated by immunofluorescence (IF) and immunohistochemistry (IHC) techniques in frozen and paraffin sections (obtained from the same patients), whereas B-lymphocytes and plasma cells were evaluated by immunohistochemistry in paraffin sections using specific antibodies anti-B Lymphocytes (CD20) and anti-plasma cells (CD138). Regarding the C4d detection, the techniques with higher concordance rate with frozen-IF, considered the gold standard, were the frozen-IHC technique (85.4% of cases showed coincident results, r=0.72; p<0.0001) and the paraffin-IF technique (73%, r=0.59; p=0.0001), whereas the concordance rate in the paraffin-IHC technique was only 51.4% (r=0.35; p=0.03). The clinical follow up analysis demonstrate that C4d positive group was associated with a poor graft survival at 3 years post-diagnosis (67% vs 96% in C4d negative group; p=0.01). The histological analysis of mature B cells (CD20+) infiltrate showed 2 distinct patterns: scattered cells and clusters. The cluster pattern was associated with poor graft survival at 3 years (61% vs 89% in the CD20 negative group; p=0.03; and 61% vs 87% in the CD20+ scattered pattern group; p=0.03). The plasma cells infiltrate was not associated with a worse clinical transplant outcome. The analysis of the capillary C4d and B lymphocytes correlation demonstrate that the number of CD20+ and CD138+ cells was significantly higher in C4d positive cases (CD20+: 155±53 vs 26±7 cells/mm2, respectively; p=0.001; CD138+: 46±22 vs 4±1 cells/mm2, respectively; p=0.002). This study concluded that C4d capillary and mature B cells (clusters pattern) are associated with worse graft survival. Another important conclusion is a positive association between B lymphocytes (mature B cells and plasma cells) and capillary C4d, suggesting a possible role of these cells, responsible for antibodies production, in the in situ complement system activation. Finally, the frozen-IHC and paraffin-IF techniques may be considered alternative to frozen-IF technique for C4d detection

O transplante renal é atualmente o tratamento de escolha para pacientes com doença renal crônica em estágio 5, devido aos seus melhores resultados na morbimortalidade e melhor qualidade de vida dos pacientes, quando comparado com o tratamento dialítico. No entanto, apesar desses resultados positivos, a sobrevida dos enxertos renais em longo prazo não se modificou. As principais causas de falências tardias do transplante renal são as alterações crônicas do enxerto, caracterizadas por componentes de rejeição crônica e efeitos nefrotóxicos relacionados aos inibidores da calcineurina. O desenvolvimento de estratégias visando modular o sistema imunológico, interferindo no balanço entre mecanismos efetores e reguladores, capazes de induzir a aceitação do órgão (tolerância) seria a melhor alternativa para este cenário. No entanto, os mecanismos imunológicos envolvidos no processo da imunorregulação são pouco compreendidos, o que dificulta a identificação de casos tolerantes e a definição de estratégias para a sua modulação. Dentre as possíveis moléculas envolvidas no processo de imunomodulação, destacam-se a Forkhead Box P3 (FOXp3), marcador de células reguladoras e a enzima indoleamina 2,3 dioxigenase (IDO), reconhecida recentemente como tendo função central na tolerância materno-fetal. No presente estudo, foram utilizadas técnicas de imunohistoquímica para identificar linfócitos T efetores (CD3+), FOXp3 e IDO em biópsias de aloenxerto renal e correlacionar sua expressão com a evolução clínica do enxerto 12 meses após a biópsia. A relação entre células reguladoras e efetoras foi avaliada pelas relações FOXp3/CD3 e IDO/CD3. Devido à limitação do reconhecimento e do diagnóstico de casos de tolerância, só foi possível analisar a expressão destes marcadores em 1 único caso de paciente tolerante. Por outro lado, o estudo do perfil da expressão destes marcadores em outras situações clínicas deve contribuir para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos. Neste contexto, no presente estudo foram analisadas 63 biópsias de enxerto renal em diferentes situações clínicas: enxerto Sem Rejeição (SemRA; n=13), Rejeição Aguda (RA; n=21) e lesões crônicas (LC; n=29) além de 1 caso de paciente com diagnóstico clínico de tolerância operacional (Tolerante; n=1). Este paciente evoluiu com disfunção do enxerto, reiniciou terapia dialítica com a descontinuação do tratamento imunossupressor e após 2 anos em programa de hemodiálise, recuperou a função do enxerto, sendo, então, submetido a biópsia do enxerto renal. As biópsias incluídas foram subdivididas de acordo com a Classificação de Banff-09. As rejeições agudas mediadas por linfócitos T foram classificadas em RA-Banff I (n=15) e RA-Banff II (n=6). Os casos com Lesões Crônicas também foram subdivididos de acordo com a Classificação de Banff-09 em Fibrose intersticial/Atrofia tubular (FIAT; n=15) e Rejeição Crônica Ativa (RCA; n=14). RESULTADOS: analisado isoladamente, o caso Tolerante apresentou um número expressivo de células CD3+ (814 cel/mm2) e FOXp3+ (100,9 cel/mm2), assim como elevada relação FOXp3/CD3 (12,4x102).No entanto, apresentou uma baixa expressão de IDO (0,41% área marcada).Nos casos do grupo RA o número de células CD3+. foi significativamente maior que em LC e SemRA (973±127 cel/mm2; 242±43 cel/mm2 e 0,7 ± 0,4 cel/mm2, respectivamente; p<0,001 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Células CD3+ foram detectadas em todos os compartimentos estudados: interstício, túbulos, vasos, e glomérulos no grupo RA e no grupo LC. Comparando os grupos, houve predomínio de células CD3+ no interstício (p<0,0001) do grupo RA. Na subanálise segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos de RA na análise de células CD3+ por compartimentos. Por outro lado, na análise do grupo LC, no subgrupo RCA foram detectadas significativamente mais células CD3+ que em FIAT no interstício (322±66 cel/mm2 vs 145±32 cel/mm2; p<0,05) e nos túbulos (30,7±10 cel/mm2 vs 6±2 cel/mm2; p<0,05). O número de células FOXp3+ foi significativamente maior nos casos do grupo RA (43±10 cel/mm2) comparado com LC e SemRA (20±4 cel/mm2 e 0,1±0,1 cel/mm2, respectivamente; p<0,05 vs LC e p<0,0001 vs SemRA). Na distribuição por compartimentos, tanto em RA quanto em LC houve a predominância de células FOXp3+ no interstício, porém não houve diferença estatística entre os 2 grupos. Na análise de células FOXp3+ por compartimentos do grupo LC segundo a Classificação de Banff-09, não houve diferença entres os subgrupos. A relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior no grupo LC que no RA (17±5 vs 5±1; p<0,05). Na análise do grupo LC, a relação FOXp3/CD3 foi significativamente maior em FIAT que em RCA (25±8 vs 8±2; p<0,05). A análise da expressão de IDO não revelou diferença na comparação dos grupos SemRA, RA e LC. Não houve diferença também na expressão de IDO, tanto entre os grupos Banff I e Banff II, quanto entre os grupos FIAT e RCA. A relação IDO/CD3, foi significativamente maior no grupo LC do que no grupo RA (18±6 vs 3±1; p<0,05). Apesar da presença de células FOXp3+ ter sido maior nos casos com diagnóstico de rejeição aguda como descrito na literatura, não houve correlação da sua expressão com uma maior função do enxerto na análise de 12 meses após a biópsia, nem com a sobrevida do enxerto em 12 meses. Nos casos com diagnóstico de lesões crônicas, a maior relação FOXp3/CD3 se correlacionou negativamente com a função do enxerto 12 meses após a biópsia. A expressão de IDO também não se correlacionou com uma melhor função, nem com a sobrevida do enxerto na análise em 12 meses após a biópsia. A análise dos resultados apresentados sugere o envolvimento dos marcadores estudados na resposta inflamatória ocasionada pelo aloreconhecimento, uma vez que estão presentes em cenários imunológicos distintos, aparentemente, mediando o dano tecidual no microambiente do aloenxerto. No entanto, não há dados o suficiente para apontar para um papel das células FOXp3+ e da IDO no desenvolvimento de tolerância ao aloenxerto no presente estudo. Concluindo, ainda não está claro o quanto a presença de Tregs e IDO limitam os processos de rejeição/cronificação ou participam desses processos, sendo sua presença ainda controversa / Currently, kidney transplantation is choice therapy for patients with chronic kidney disease in stage 5, due to their good results in morbidity and improved quality of life compared with dialysis treatment. However, despite these positive results, renal grafts survival in the long term has not changed. The major cause of failures in long-term in kidney transplant are chronic graft changes, characterized by chronic rejection and components related to the nephrotoxic effects of calcineurin inhibitors. The development of strategies to modulate the immune system interfering with the balance between regulatory and effector mechanisms, capable of inducing organ acceptance (tolerance), would be the excellent alternative in this scenario. However, the immunological mechanisms involved in the immunoregulation are poorly understood, hindering to identify cases tolerant as well as developing strategies for their modulation. Within the possible molecules involved in immunomodulation, stand out the Forkhead Box P3 (FOXp3), a marker of regulatory cells, and the enzyme indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO), recently recognized by their role in maternal-fetal tolerance. In this present study, we used immunohistochemical techniques to identify T lymphocytes (CD3+), FOXp3 and IDO in renal allograft biopsies and to correlate its expression with graft function 12 months after the biopsy procedure. The relationship between regulatory and effector cells was analysed by FOXp3/CD3 and IDO/CD3 ratios. Due to limited recognition and diagnosis of tolerance cases, only was possible to analyze the expression of these markers in one single case of tolerant patient. On the other hand, the study of the expression of these markers in other clinical situations, should contribute to a better understanding of the mechanisms involved. In this context, the present study analyzed 63 renal allograft biopsies in different clinical situations: no graft rejection (NR, n = 13), acute rejection (AR, n = 21) and chronic injury (CI, n = 29). In addition, one patient with clinical operational tolerance diagnosis (tolerant, n = 1) was analyzed. This patient developed graft dysfunction, restarted dialysis discontinuation of immunosuppressive treatment. After 2 years on dialysis therapy, recovered graft function and then was submitted to renal allograft biopsy. The biopsies included in this study were subdivided according to the Banff-09 classification. The acute rejection mediated by T lymphocytes was classified in Banff I (n = 15) and Banff II (n = 6). Cases that showed chronic injury were also subdivided according to the Banff-09 classification in Interstitial Fibrosis/Tubular Atrophy (IFTA, n = 15) and Chronic Rejection (CR, n = 14). Results: Analyzed separately, the tolerant case showed an expressive number of CD3+ cells (814 cells/mm2) and FOXp3+ cells (100.9 cells/mm2). Also, expressive FOXp3/CD3+ ratio (12,4x102) and low IDO expression (0.41% area).In AR group the number of CD3+ cells was significantly higher compared with CI and NR groups (973 ± 127 cells/mm2; 242 ± 43 cells/mm2 and 0.7 ± 0.4, cells/mm2, respectively; p<0.001 vs CI and p <0.0001 vs NR). In AR and CI groups CD3+ cells were detected in all compartments studied: interstitium, tubules, vessels and glomeruli. Comparing the groups, there was a predominance of CD3+ cells in the interstitium (p<0.0001) of AR group. No difference was observed between Banff I and Banff II subgroups analysis of CD3+ in the compartments. On the other hand, in the CR subgroup analysis was detected in significantly higher of CD3+ cells in the interstitium compared with IFTA (322 ± 66 cells/mm2 vs. 145 ± 32 cells/mm2, p<0.05) and in tubules (30,7±10 cells/mm2 vs. 6±2 cells/mm2, respectively; p<0.05). The number of FOXp3+ cells was significantly higher in the AR group (43±10 cells/mm2) compared with CI and NR (20±4 cells/mm2 and 0.1±0.1 cells/mm2, respectively; p<0,05 vs CI and p<0,0001 vs NR). The distribution of compartments, both AR and in CI predominated FOXp3+ cells in the interstitium, but there was no statistical difference between the 2 groups. In the FOXp3+ cells analysis, CI do not showed difference between subgroups in the compartments. The relationship FOXp3/CD3 was significantly higher in AR group compared in the CI group (17 ± 5 vs. 5 ± 1; p<0.05). In the CI group analysis, FOXp3/CD3 ratio was significantly higher in IFTA compared with CR (25±8 vs 8±2; p<0.05). IDO expression analysis shows no difference when compared NR, AR and CI groups. No difference in IDO expression analysis in Banff I compared with Banff II, and IFTA compared with CR was observed. The relationship of IDO/CD3, was significantly higher in the CI group when compared with AR group (18±6 vs 3±1, p<0.05). Despite the presence of FOXp3+ cells was higher in cases with a diagnosis of acute rejection as described in the literature, there was no correlation of its expression with improved graft function in the 12 months analysis after the biopsy procedure, as well as with graft survival in 12 months. In cases with a diagnosis of chronic injuries, FOXp3/CD3 ratio was negatively correlated with graft function 12 months after the biopsy procedure. The analysis of these results led us to speculate about the involvement of these markers in the inflammatory response, mediating the tissue damage in the microenvironment of the graft, once it is immunological distinct scenarios, however, in this study, there is no enough data to point to a role in development of tolerance. In conclusion, it is unclear how the presence of Tregs and IDO limit the allograft rejection/chronicity or participate in this process, and their presence is still controversial

Orientadores: Alessandro dos Santos Farias, Leonilda Maria Barbosa dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T01:58:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pradella_Fernando_M.pdf: 4468527 bytes, checksum: 63d6760bd0ea06c5fcab94d1421da291 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: José Francisco Comenalli Marques Júnior / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T08:08:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_MaraCabral_M.pdf: 399240 bytes, checksum: bb189c0420b266a0b620156bd10cd435 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: INTRODUÇÃO: A ILD vem sendo utilizada como opção terapêutica para recaída de neoplasias hematológicas após transplante alogênico. Contudo, este procedimento não é isento de riscos e sua indicação deve ser criteriosa. Neste trabalho avaliamos a ILD quanto à eficácia da coleta; efeitos adversos para os doadores e pacientes e efeitos quanto à remissão da doença, redução de recaída e mortalidade. MÉTODOS: Foi realizado estudo retrospectivo dos pacientes (n=40) que receberam ILD, no Hemocentro da UNICAMP, de março 1995 a janeiro 2008, e dos respectivos doadores (n=40). As características dos pacientes, complicações e sobrevida foram comparadas a um grupo de pacientes (n=264) que realizou transplante alogênico e não recebeu ILD. RESULTADOS: As 54 coletas de linfócitos analisadas atingiram o alvo estabelecido de '10 POT. 7' CD3+/Kg receptor, sem nenhuma reação grave para os doadores. Não observamos diferença estatística na mortalidade (p= 0,85) ou incidência de DECHa (p=0,231) entre os grupos de pacientes. No entanto, as causas de óbito foram diferentes (p<0,001), com maior mortalidade por doença no grupo em estudo e por outras causas no grupo comparativo. A incidência de DECHc e remissão completa foram maiores no grupo comparativo (p<0,001), enquanto o tempo para o óbito foi maior no grupo em estudo (p=0,009). CONCLUSÕES: A coleta de linfócitos foi eficaz e segura para o doador. Para os pacientes a DECH se sobressaiu como efeito adverso, sem aumento após a ILD. Não foi observado aumento na remissão da doença ou queda na mortalidade após a ILD, contudo, o tempo para o óbito foi maior. Outros fatores e a heterogeneidade das amostras podem ter contribuído para os resultados encontrados / Abstract: BACKGROUND: Donor lymphocyte infusion (DLI) has been used as a therapeutic option for hematological recurrences after allogeneic transplantation. However, this procedure is not devoid of risks and its indication must be precise. In this article we assess DLI regarding collection efficacy; adverse effects in donors and patients and its impact on disease remission, recurrence induction and mortality. METHODS: A retrospective study of patients (n=40) who received DLI and their respective donors was performed at Hemocentro, UNICAMP, between March 1995 and January 2008. Patient characteristics, complications and survival were compared to a comparative group (n=264) consisting of patients who underwent allogeneic transplantation, but did not receive DLI. RESULTS: All the 54 lymphocyte collection procedures reviewed reached the set target of '10 POT. 7' CD3+/Kg receptor, with no serious adverse reactions to the donors. We did not observe statistical difference in mortality (p=0.85) nor in the incidence of acute GVHD (p=0.231) between the two patient groups. However, causes of death were statistically different (p<0.001), with a higher disease-related mortality rate in the study group and for other causes in the comparative group. Chronic GVHD incidence and complete remission were higher in the comparative group (p<0.001), while the overall survival was longer in the study group (p=0.008). CONCLUSIONS: Lymphocyte collection was efficient and safe to the donor. As for patients, GHVD was the most important side effect but did not have a higher incidence after DLI. We did not observe an increase in disease remission or decrease in mortality rate after DLI; however, overall survival was longer. Other factors and the sample heterogeneity might have contributed to the results observed / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica

Orientadores: Marcos Tadeu Nolasco da Silva, Maria Marluce dos Santos Vilela / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:56:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_JosianeFrancisca_M.pdf: 1674494 bytes, checksum: 65421fb00fd3ba43536a3c494f244ecd (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: INTRODUÇÃO: A adoção da Terapia Antirretroviral Combinada (TARC), proporcionou uma dramática melhora na sobrevida, na qualidade de vida e no controle clínico da infecção por HIV em pediatria. Em consequência do controle efetivo da replicação viral, observa-se reconstituição do sistema imune, que contribui para a redução da incidência dos quadros infecciosos. Neste contexto, a determinação da reconstituição imune em estudos observacionais pode fornecer marcadores para a avaliação da resposta à TARC. OBJETIVOS: Determinar a prevalência de recuperação imunológica associada à introdução da TARC em uma população pediátrica acompanhada em serviço de referência, bem como fatores associados à obtenção desta meta. MÉTODO: Estudo observacional, analítico, do tipo coorte histórico. Em 127 pacientes em TARC pelo período mínimo de 1 ano, avaliou-se a reconstituição imune, caracterizada por uma porcentagem de linfócitos T CD4+ 'maior ou igual' 25% ou valor absoluto considerado normal para a idade. RESULTADOS: Dos 127 pacientes avaliados, 117 (92,12%) obtiveram reconstituição ou preservação imune. Nos indivíduos com reconstituição ou preservação imune, a idade ao início da TARC foi significativamente inferior (p = 0,007), e os escores-z de peso e IMC foram significativamente superiores (p = 0,028 e 0,032, respectivamente). Em relação às categorias clínicas, observou-se uma proporção significativamente superior de indivíduos nas categorias N, A e B no grupo com reconstituição ou preservação imune (p = 0,05). As porcentagens de linfócitos T CD4+ e a relação CD4 / CD8, bem como a proporção de indivíduos nas categorias imunológicas 1 e 2, foram superiores no grupo com reconstituição ou preservação imune (p = 0,019, 0,018 e 0,005, respectivamente). CONCLUSÃO: Pudemos observar que, em crianças e adolescentes infectados por HIV em TARC, a reconstituição ou preservação imune estiveram associadas a uma idade mais jovem e à maior preservação imunológica e clínica ao início da terapia / Abstract: INTRODUCTION: The adoption of Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART) provided a dramatic improvement in survival, quality of life and clinical management of HIV infection in children. As a result the effective control of viral replication, it is observed immune reconstitution, which contributes to reducing the incidence of infectious. In this context, the determination of immune reconstitution in observational studies can provide markers for assessing response to HAART. Objective: To determine the prevalence of immune recovery or preservation associated with the introduction of HAART in a pediatric population followed in a reference service, as well as factors associated with the attainment of this goal. Methods: Observational study, analytic, historical cohort. In 127 patients on HAART for at least one year, we evaluated the immune reconstitution or preservation, characterized by a of CD4+ cell percentage 'more or equal' 25% or absolute values considered normal for their age. Results: Of the 127 patients evaluated, 117 (92.12%) had immune reconstitution or preservation. In individuals with immune reconstitution or preservation, the age at first HAART was significantly lower (p = 0.007), and weight and BMI z-scores for age were significantly higher (p = 0.028 and 0.032, respectively). With respect to clinical categories, there was a significantly higher proportion of individuals in N, A and B categories in the immune reconstitution or preservation group (p = 0.05). The CD4+ cell percentages and CD4/CD8 ratios and the proportion of individuals in immunological categories 1 and 2, were higher in the group with immune reconstitution or preservation (p = 0.019, 0.018 and 0.005, respectively). Conclusion: In our cohort of HIV-infected children and adolescents, on HAART, the preservation of immunocompetence or immune reconstitution were associated to an earlier age and better immune and clinical preservation at the beginning of therapy / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestra em Saúde da Criança e do Adolescente

Idealizou-se o presente ensaio com o objetivo de padronizar o perfil hematológico, bioquímico, eletroforético (proteinograma sérico) e quantificação das células linfocitárias CD4, CD5, CD8 por citometria de fluxo de cães da raça Golden Retrivier normais (grupos GR) e de cães distróficos (grupos GRMD). Para tanto, considerou-se a divisão dos grupos de acordo com a idade dos animais, desde o nascimento até a idade adulta, compondo assim seis grupos, sendo eles GR I, II, III e GRMD I, II, III. No presente projeto realizamos os estudos eletroforéticos de cães pertencentes a todos os grupos, estudos hematológicos e bioquímicos dos cães pertencentes aos grupos GR II, III, GRMD II e III, imunofenotipagem linfocitária dos grupos GR III e GRMD III. Os resultados eritroleucométricos e trombométricos obtidos para os cães pertencentes aos grupos GR II e GR III apresentaram valores médios dentro normalidade. Com relação aos cães pertencentes aos grupos GRMD III, observamos que o eritrograma se encontra dentro dos valores de referência. Contudo, considerando o leucograma, os valores médios (3,79/ mm3) referentes à mensuração de basófilos apresentaram-se acima dos valores de normalidade, variando de 0 a 159/mm3. Ademais, considerando os valores máximos, alguns animais pertencentes ao grupo em questão, apresentaram leucocitose com neutrofilia sem desvio à esquerda, além de trombocitose, monocitose e linfopenia, no momento das coletas. As dosagens bioquímicas séricas de todos os cães afetados apresentaram valores médios acima dos valores de normalidade para a dosagem de AST, ALT e CK. Para o estudo das proteínas séricas, a técnica SDS-PAGE permitiu o fracionamento de vinte e três proteínas, cujos pesos moleculares variaram de 16.000 a 260.000 daltons em todos os grupos estudados. Destas, foi possível identificar nominalmente doze frações protéicas: IgA (PM 142.000 Da), proteína C-reativa (PM122.000 Da), ceruloplasmina (PM 110.000 Da), fosforilase (PM 95.000 Da), transferrina (PM 82.000 Da), hemopexina (PM 78.000 Da), albumina (PM 66.000 Da), alfa1 antitripsina (PM 62.000 Da), IgG de cadeia pesada (PM 55.000 Da), haptoglobina (PM 45.000 Da), glicoproteína ácida (PM 40.000 Da) e IgG de cadeia leve (PM 23.000 Da). As demais proteínas foram identificadas pelos respectivos pesos moleculares. Não foi possível identificar nominalmente as frações protéicas de pesos moleculares 260.000 Da, 230.000 Da, 180.000 Da, 165.000 Da, 158.000 Da, 91.000 Da, 35.000 Da, 30.000 Da, 28.000 Da e 16.000 Da. Dentre essas proteínas foi possível observar que a proteína de peso molecular 91.000 Da foi encontrada apenas nos grupos GR I e GRMD I não sendo identificada nos outros grupos estudados. Considerando as alterações encontradas com relação às proteínas de fase aguda, evidenciamos as respostas de fase aguda frente às lesões musculares que ocorrem progressivamente em cães distróficos, principalmente em animais distróficos jovens, podendo inferir que os mesmos apresentaram alterações protéicas perante a injúria tecidual como é relatado em vários processos inflamatórios relacionados com outras patologias. Da mesma forma, os animais afetados pela distrofia, possuem alterações imunoglobulínicas quando comparados a animais normais. Com relação a imunofenotipagem linfocitária foi confeccionado um histograma das populações de linfócitos CD4+, CD5+ e CD8+ a partir da região do gate de linfócitos. Todos os animais afetados pela distrofia apresentaram porcentagem significativamente maior com relação à população linfocitária CD4+ e CD5+ quando comparados aos cães normais. Desta forma, podemos inferir que o processo progressivo da distrofia, esta relacionado com alterações nas populações celulares que compõe o sistema imune dos pacientes, pois devido a ausência de distrofina o músculo fica mais susceptível á lesões, sendo que na sua ocorrência, há liberação de citocinas que estimulam as células hepáticas a secretarem as proteínas de fase aguda e a promoverem uma co-estimulação de linfócitos T. Assim, podemos sugerir que os resultados encontrados em nosso trabalho são conseqüências da resposta inflamatória gerada pela lesão muscular. Esperamos com esse estudo, fornecer mais informações sobre a fisiopatogenia da doença, bem como promover um maior entendimento sobre a avaliação imunológica e resposta inflamatória neste modelo de estudo. Ademais, que os valores de base encontrados possam auxiliar na avaliação de possíveis reações nos testes pré-clínicos, facilitando assim, o entendimento das reações benéficas ou adversas para validar e explicar o mecanismo de ação de uma terapia celular, gênica ou mesmo medicamentosa / Devised to test this in order to standardize the hematological, biochemical, electrophoretic (Serum protein) and quantification of CD4 lymphocyte cells, CD5, CD8 by flow cytometry of Golden Retriever dogs normal (group GR) and dogs dystrophic (GRMD groups). To this end, we considered the division of groups according to age of animals, from birth to adulthood, thus composing six groups, as Gr I, II, III and GRMD I, II, III. In this project we performed electrophoretic studies of dogs belonging to all groups, haematological and biochemical studies of dogs belonging to the groups GR II, III, II and III GRMD, lymphocyte immunophenotyping in groups III and GR GRMD III. The results obtained for trombometric, erythometric and dogs belonging to the groups and GR II GR III showed mean values within normal limits. With respect to dogs belonging to groups III GRMD, we observed that the erythrocyte is within the reference values. However, considering the WBC, the mean (3.79 / mm3) relating to the measurement of basophils were above normal values, ranging from 0 to 159/mm3. Moreover, considering the maximum, some animals belonging to the group in question had leukocytosis with neutrophilia without left shift, and thrombocytosis, monocytosis and lymphopenia at the time of collection. The biochemical serum of all affected dogs had mean values above the normal range for the determination of AST, ALT and CK. For the study of proteins, SDS-PAGE technique allowed the fractionation of twenty-three proteins whose molecular weights ranged from 16,000 to 260,000 daltons in all groups. These could be identified by name twelve fractions: IgA (PM 142,000 Da), C-reactive protein (PM122.000 Da), ceruloplasmin (PM 110,000 Da), phosphorylase (95,000 Da PM), transferrin (82,000 Da PM), hemopexin (PM 78 000 Da), albumin (66,000 Da PM), alpha1 antitrypsin (PM 62,000 Da), IgG heavy chain (55,000 Da PM), haptoglobin (PM 45,000 Da), glycoprotein (PM 40,000 Da) and IgG light chain (PM 23 000 Da). The other proteins were identified by their molecular weights. We could not identify by name the protein fractions of molecular weight 260,000 Da, 230,000 Da, 180,000 Da, 165,000 Da, 158,000 Da, 91,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 28,000 Da and 16,000 Da. Among these proteins was observed that the protein molecular weight of 91,000 Da was found only in groups GR I and GRMD I was not identified in other groups. Considering the changes found with relation to acute phase proteins, we noted the acute phase response in the face of muscle injuries that occur gradually in dystrophic dogs, especially in young dystrophic animals, which may infer that they had abnormal protein before tissue injury as reported in many inflammatory-related pathologies. Likewise, animals affected by muscular dystrophy, alterations immunoglobulin when compared to normal animals. With respect to lymphocyte immunophenotyping was made a histogram of the populations of CD4, CD5 and CD8 from the region of the gate of lymphocytes. All animals affected by muscular dystrophy showed significantly higher percentage with respect to CD4 and CD5 lymphocyte population compared to normal dogs. Thus, we can infer that the process of progressive muscular dystrophy, is associated with changes in cell populations that make up the immune system of patients, because due to the absence of dystrophin, the muscle is more susceptible to damage, and its occurrence , a release of cytokines that stimulate liver cells to secrete acute phase proteins and promote a co-stimulation of T lymphocytes Thus, we suggest that the findings in our study are consequences of the inflammatory response generated by muscle injury.We hope that this study, provide more information about the pathophysiolgy of the disease, and promote a greater understanding of the immune and inflammatory responde assessment in this study model. Moreover, the base values found could help in assessing possible responses in preclinical testing, aiding the understanding of the beneficial or adverse reactions to validate and explain the mechanism of action of a cell therapy, gene or drug treatments

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by hyperglycemia due defective or deficient response to insulin secretion. Type 2 diabetes mellitus (Type 2 DM) is therefore associated with a general activation of the innate immune system, in which there is a chronic, cytokine-mediated state of low-grade inflammation. Dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) is a cell-surface protease that bind with Adenosine deaminase (ADA) and both enzymes act in the lymphocytes proliferation and citokyne production. Vitis vinifera is a plant that has been studied due its pharmacology effects including the hypoglycemic properties. Thus, the aim of this study is to evaluate some inflammatory biomarkers, the ADA and DPP-IV activities in type 2 DM and investigate the effects of aqueous grape seed extract from Vitis vinifera (cv. Merlot) (GSE) in the ADA and DPP-IV activities in lymphocytes submitted to different glucose concentrations, in vitro. In the manuscript I, in lymphocytes, we observed a decrease in CD26 expression, an increase in ADA and n-acetil-β-d-glucosaminidase (NAG) activities in type 2 DM patients when compared to controls, while the gamma-glutamyl tranferase (GGT) and DPP-IV activities did not show differences between the groups. Moreover, the NAG activity demonstrated a positive correlation with ADA activity and a negative, with CD26 expression. GGT activity was positively correlated with waist circumference and body mass index (BMI), in type 2 DM. In the manuscript II, we observed we observed an increase in ADA activity when lymphocytes were exposure to the high concentration (100mM) of glucose and GSE prevented this increase in ADA activity. In serum, in the manuscript I, we showed an increase in ADA activity and in C reactive protein (CRP) levels in type 2 DM. Furthermore, the levels of CRP in diabetics were positively correlated with waist circumference and BMI. The GGT and DPP-IV activities did not show alterations between the groups, but in type 2 DM the DPP-IV activity was positively correlated with glicated hemoglobin. We concluded that, glucose might stimulated the ADA activity in the same time that it cause decrease in CD26 expression, in lymphocytes. Moreover, GSE prevents the ADA activation in presence of glucose possible due its hypoglycemic properties. / O diabetes melito (DM) é uma desordem metabólica caracterizada por hiperglicemia em virtude de resposta defeituosa ou deficiente à secreção de insulina. O DM tipo 2 (DM 2) está associado com a ativação do sistema imune, no qual há uma inflamação de baixo grau mediada por citocinas. A dipeptidil peptidase IV (DPP-IV, CD26) é uma protease multifuncional e na superfície celular ela encontra-se ligada a adenosina deaminase (ADA). Ambas estão envolvidas na proliferação de linfócitos e na produção de citocinas inflamatórias. A Vitis vinifera é uma planta que tem sido estudada devido suas propriedades farmacológicas, dentre essas, por apresentar efeitos hipoglicêmiantes. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar biomarcadores inflamatórios, a atividade da ADA e da DPP-IV em pacientes com DM 2, e verificar o efeito do extrato aquoso de sementes de Vitis vinifera (cv. Merlot) sobre a atividade da ADA e da DPP-IV em linfócitos expostos a diferentes concentrações de glicose, in vitro. Em linfócitos, no manuscrito I observamos uma diminuição na expressão do CD26, um aumento na atividade da ADA e da n-acetil-β-d-glicosaminidase (NAG) em pacientes com DM 2 em relação aos controles, enquanto que a atividade da gamaglutamil transferase (GGT) e da DPP-IV não se alterou. Também, a atividade da NAG linfocitária em pacientes com DM 2 mostrou-se positivamente relacionada com a atividade da ADA e negativamente com a expressão do CD26 e a atividade da GGT mostrou-se positivamente relacionada à circunferência abdominal e ao IMC. Já no manuscrito II, observamos um aumento na atividade da ADA quando os linfócitos forma expostos a 100mM de glicose e este aumento foi atenuado quando, expostos a glicose e extrato aquoso de sementes de Vitis vinifera. Em soro, no manuscrito I, observamos um aumento na atividade da ADA e também nos níveis de proteína C reativa (PCR) em pacientes com DM 2. Além disso, os níveis de PCR em diabéticos mostraram-se positivamente correlacionados com a circunferência abdominal e o índice de massa corporal (IMC) desses pacientes. A atividade da GGT e da DPP-IV não mostraram diferenças entre os grupos. No entanto, a atividade da DPP-IV sérica mostrou-se correlacionada com os níveis de hemoglobina glicada nos pacientes com DM 2. Conclui-se que, a glicose possa estimular a atividade da ADA ao mesmo tempo em que provoca uma redução da expressão do CD26 em linfócitos. Além disso, o extrato aquoso de sementes de Vitis vinifera é capaz de impedir a ativação da atividade da ADA em presença de glicose possivelmente devido suas propriedades hipoglicemiantes.

Escorpiões da família Buthidae estão envolvidos na maioria dos envenenamentos em todo o mundo. Tityus é um dos gêneros dessa família, sendo Tityus serrulatus a espécie mais perigosa, por estar envolvida em envenenamentos graves, nos quais as vítimas são crianças, podendo levar a óbito. As manifestações da picada incluem dor local, hipersensibilidade, hipertensão, manifestações cardiovasculares e edema pulmonar. A peçonha do T. serrulatus contem, entre outros componentes, várias toxinas que atuam em canais de K+, Na+ e Ca2+ e que são responsáveis pelos efeitos tóxicos do veneno. Estudos recentes mostraram que a peçonha de T. serrulatus pode ativar macrófagos que são críticos na resposta imune e desempenham papel fundamental na resposta humoral e celular. Entretanto, pouco se conhece sobre os efeitos diretos dessas peçonhas sobre linfócitos humanos. Considerando que a modulação de funções celulares como proliferação, ativação e produção de citocinas pode desempenhar papel importante em envenenamentos, o presente estudo propôs: a) avaliar o efeito citotóxico do veneno bruto de Tityus serrulatus (VTs) sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); b) analisar o efeito do VTs sobre a modulação da expressão de marcadores fenotípicos (CD3, CD4, CD8 e CD19) e de marcadores de ativação celular, incluindo CD69, CD25 e HLA-DR em células T e B; c) avaliar o efeito do VTs sobre a proliferação de linfócitos T; d) avaliar a capacidade do VTs em modular a produção de citocinas pelas PBMC. Ensaios de citotoxicidade foram realizados pela técnica do MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) e mostraram que as concentrações de 500, 1000 e 2000 ?g/mL do VTs apresentaram citotoxicidade baixa a moderada para PBMC (12,7, 22,2 e 23,7% de redução na viabilidade celular, respectivamente). Concentrações de 25, 50 e 100 ?g/mL não foram citotóxicas. Com base nesses ensaios, estas ultimas concentrações foram utilizadas nos ensaios subsequentes. A citometria de fluxo foi empregada para avaliação da proliferação celular, da expressão de marcadores fenotípicos e de ativação celular, bem como para a quantificação de citocinas nos sobrenadantes de culturas celulares. As concentrações utilizadas não induziram alterações significativas nas subpopulações de linfócitos e não modificaram a expressão de marcadores de ativação em linfócitos T CD4+, CD8+ e B, após 24h de cultivo. O ensaio de proliferação celular, utilizando marcação concomitante com diacetato carboxifluoresceína succinimidyl ester (CFSE) e anticorpos monoclonais contra marcadores fenotípicos e marcadores de ativação celular, permitiu que se avaliasse não só a proliferação, mas a discriminação das diferentes subpopulações celulares e o estado de ativação das mesmas após 96h de cultivo. Os resultados sugerem que o VTs inibe a proliferação de linfócitos estimulados com fitohemaglutinina (PHA), e em especial a porcentagem de linfócitos T CD8+CD25+ (linfócitos T citotóxicos ativados). O VTs não foi capaz de induzir proliferação celular. Em contraste, o VTs quando adicionado isoladamente à cultura de PBMC, nas concentrações de 50 e 100 ?g/mL, induziu a produção de IL-6 (p<0,05 e p<0,01, respectivamente), uma citocina pró-inflamatória que desempenha papeis importantes nas respostas imunes ii inata e adaptativa. A secreção aumentada de IL-6, portanto, não está vinculada a aumento na proliferação celular. A presença do VTs concomitantemente à PHA apresentou tendência para inibição da produção de citocinas por células estimuladas com a PHA, como IL-10, TNF e IFN-gama. Os resultados sugerem que o VTs é uma fonte potencial de substâncias com ações imunomoduladoras sobre linfócitos T humanos e estimulam novas investigações para o esclarecimento dos mecanismos de ação envolvidos, incluindo estudos que considerem a participação dos canais iônicos de linfócitos T nos fenômenos observados. Essas investigações, juntamente com a identificação dos componentes da peçonha, responsável pela atividades observadas, poderão contribuir para a descoberta de ferramentas para estudo dos mecanismos fisiopatológicos do envenenamento, bem como para a descoberta de novas alternativas de tratamento para doenças mediadas pelo sistema imune. / Scorpions of the Buthidae family are involved in most envenomations worldwide. Tityus is one of the genera of this family, being Tityus serrulatus the most dangerous species, because it is involved in severe envenomation, in which the victims are children and it can lead to death. The manifestations of scorpion sting are classified from mild to severe and its clinical signs include local pain, hypersensitivity, hypertension, cardiovascular manifestations and pulmonary edema. T. serrulatus venom contains, among other components, various toxins that act on K+, Na+ and Ca2+ channels, and are responsible for the toxic effects of the venom Recent studies showed that the venom of T. serrulatus (VTs) can activate macrophages that are critical to immune response and play a key role in the humoral and cellular response. However, little is known about the direct effects of these venoms on human lymphocytes. Considering that the modulation of cellular functions such as proliferation and induction of citokines production may play an important role in envenomation, the study proposed: a) to evaluate the cytotoxic effects of crude venom on peripheral blood mononuclear cells, b) to examine the effect of VTs on the modulation of expression of phenotypic markers (CD3, CD4, CD8 and CD19) and markers of cellular activation, including CD69, CD25 and HLA-DR on T and B cells c) to evaluate the VTs effect on the proliferation of T lymphocytes d) to evaluate the ability of VTs to modulate cytokine production by PBMC. Cytotoxicity assays were performed by the technique of MTT (3 - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide) and showed that VTs concentrations of 500, 1000 and 2000 ?g/mL showed low to moderate cytotoxicity to PBMC (12.7, 22.2 and 23.7% reduction in cell viability, respectively). Concentrations of 25, 50 e 100 ?g/mL were not cytotoxic. Based on these tests, these concentrations were used in subsequent trials. Flow cytometry was used to assess cell proliferation, expression of phenotypic markers and cell activation, as well as for the quantification of cytokines in supernatants of cell cultures. The concentrations used did not induce significant changes in subpopulations of lymphocytes and did not modify the expression of activation markers on CD4+, CD8+ and B cells, after 24 hours of culture. The cellular proliferation assay, using simultaneously diacetate carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) and monoclonal antibodies against phenotypic markers and cell activation markers, allowed the evaluation not only of proliferation, but the discrimination of different cell subpopulations and activation state of the same after 96h of culture. The results suggest that VTs inhibits the proliferation of lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin (PHA), and in particular the percentage of T lymphocytes CD8+ CD25+ (activated cytotoxic T lymphocytes). The VTs were not able to induce cell proliferation. In contrast, the VTs when added alone to the culture of PBMC at concentrations of 50 and 100 ?g/mL induced production of IL-6 (p <0.05 and p <0.01, respectively), a proinflammatory cytokine that plays important roles in innate and adaptive immune responses. The increased secretion of IL-6, therefore, is not linked to increased cell proliferation. The presence of VTs concurrently with PHA tended to inhibit cytokine production by cells stimulated with PHA, as IL-10, TNF and iv IFN-gamma.The results suggest that the VTs is a potential source of substances with immunomodulatory actions on human T lymphocytes and stimulate further research to elucidate the mechanisms of action involved, including studies to consider the participation of ion channels of T lymphocytes in the phenomena observed. These investigations, along with the identification of the components of the venom responsible for the observed activities may contribute to the discovery of tools to study the pathophysiological mechanisms involved in the envenomation as well as for the discovery of new treatment alternatives for diseases mediated by the immune system.