211 |
Concept-based and relation-based corpus navigation : applications of natural language processing in digital humanities / Navigation en corpus fondée sur les concepts et les relations : applications du traitement automatique des langues aux humanités numériquesRuiz Fabo, Pablo 23 June 2017 (has links)
La recherche en Sciences humaines et sociales repose souvent sur de grandes masses de données textuelles, qu'il serait impossible de lire en détail. Le Traitement automatique des langues (TAL) peut identifier des concepts et des acteurs importants mentionnés dans un corpus, ainsi que les relations entre eux. Ces informations peuvent fournir un aperçu du corpus qui peut être utile pour les experts d'un domaine et les aider à identifier les zones du corpus pertinentes pour leurs questions de recherche. Pour annoter automatiquement des corpus d'intérêt en Humanités numériques, les technologies TAL que nous avons appliquées sont, en premier lieu, le liage d'entités (plus connu sous le nom de Entity Linking), pour identifier les acteurs et concepts du corpus ; deuxièmement, les relations entre les acteurs et les concepts ont été déterminées sur la base d'une chaîne de traitements TAL, qui effectue un étiquetage des rôles sémantiques et des dépendances syntaxiques, entre autres analyses linguistiques. La partie I de la thèse décrit l'état de l'art sur ces technologies, en soulignant en même temps leur emploi en Humanités numériques. Des outils TAL génériques ont été utilisés. Comme l'efficacité des méthodes de TAL dépend du corpus d'application, des développements ont été effectués, décrits dans la partie II, afin de mieux adapter les méthodes d'analyse aux corpus dans nos études de cas. La partie II montre également une évaluation intrinsèque de la technologie développée, avec des résultats satisfaisants. Les technologies ont été appliquées à trois corpus très différents, comme décrit dans la partie III. Tout d'abord, les manuscrits de Jeremy Bentham, un corpus de philosophie politique des 18e et 19e siècles. Deuxièmement, le corpus PoliInformatics, qui contient des matériaux hétérogènes sur la crise financière américaine de 2007--2008. Enfin, le Bulletin des Négociations de la Terre (ENB dans son acronyme anglais), qui couvre des sommets internationaux sur la politique climatique depuis 1995, où des traités comme le Protocole de Kyoto ou les Accords de Paris ont été négociés. Pour chaque corpus, des interfaces de navigation ont été développées. Ces interfaces utilisateur combinent les réseaux, la recherche en texte intégral et la recherche structurée basée sur des annotations TAL. À titre d'exemple, dans l'interface pour le corpus ENB, qui couvre des négociations en politique climatique, des recherches peuvent être effectuées sur la base d'informations relationnelles identifiées dans le corpus: les acteurs de la négociation ayant discuté un sujet concret en exprimant leur soutien ou leur opposition peuvent être recherchés. Le type de la relation entre acteurs et concepts est exploité, au-delà de la simple co-occurrence entre les termes du corpus. Les interfaces ont été évaluées qualitativement avec des experts de domaine, afin d'estimer leur utilité potentielle pour la recherche dans leurs domaines respectifs. Tout d'abord, il a été vérifié si les représentations générées pour le contenu des corpus sont en accord avec les connaissances des experts du domaine, pour déceler des erreurs d'annotation. Ensuite, nous avons essayé de déterminer si les experts pourraient être en mesure d'avoir une meilleure compréhension du corpus grâce à avoir utilisé les applications, par exemple, s'ils ont trouvé de l'évidence nouvelle pour leurs questions de recherche existantes, ou s'ils ont trouvé de nouvelles questions de recherche. On a pu mettre au jour des exemples où un gain de compréhension sur le corpus est observé grâce à l'interface dédiée au Bulletin des Négociations de la Terre, ce qui constitue une bonne validation du travail effectué dans la thèse. En conclusion, les points forts et faiblesses des applications développées ont été soulignés, en indiquant de possibles pistes d'amélioration en tant que travail futur. / Social sciences and Humanities research is often based on large textual corpora, that it would be unfeasible to read in detail. Natural Language Processing (NLP) can identify important concepts and actors mentioned in a corpus, as well as the relations between them. Such information can provide an overview of the corpus useful for domain-experts, and help identify corpus areas relevant for a given research question. To automatically annotate corpora relevant for Digital Humanities (DH), the NLP technologies we applied are, first, Entity Linking, to identify corpus actors and concepts. Second, the relations between actors and concepts were determined based on an NLP pipeline which provides semantic role labeling and syntactic dependencies among other information. Part I outlines the state of the art, paying attention to how the technologies have been applied in DH.Generic NLP tools were used. As the efficacy of NLP methods depends on the corpus, some technological development was undertaken, described in Part II, in order to better adapt to the corpora in our case studies. Part II also shows an intrinsic evaluation of the technology developed, with satisfactory results. The technologies were applied to three very different corpora, as described in Part III. First, the manuscripts of Jeremy Bentham. This is a 18th-19th century corpus in political philosophy. Second, the PoliInformatics corpus, with heterogeneous materials about the American financial crisis of 2007-2008. Finally, the Earth Negotiations Bulletin (ENB), which covers international climate summits since 1995, where treaties like the Kyoto Protocol or the Paris Agreements get negotiated.For each corpus, navigation interfaces were developed. These user interfaces (UI) combine networks, full-text search and structured search based on NLP annotations. As an example, in the ENB corpus interface, which covers climate policy negotiations, searches can be performed based on relational information identified in the corpus: the negotiation actors having discussed a given issue using verbs indicating support or opposition can be searched, as well as all statements where a given actor has expressed support or opposition. Relation information is employed, beyond simple co-occurrence between corpus terms.The UIs were evaluated qualitatively with domain-experts, to assess their potential usefulness for research in the experts' domains. First, we payed attention to whether the corpus representations we created correspond to experts' knowledge of the corpus, as an indication of the sanity of the outputs we produced. Second, we tried to determine whether experts could gain new insight on the corpus by using the applications, e.g. if they found evidence unknown to them or new research ideas. Examples of insight gain were attested with the ENB interface; this constitutes a good validation of the work carried out in the thesis. Overall, the applications' strengths and weaknesses were pointed out, outlining possible improvements as future work.
|
212 |
Enzymatische Oligomerisierung von Lebensmittelproteinen unter Hochdruck: Reaktionsorte und funktionelle KonsequenzenSchuh, Susanne 14 May 2013 (has links) (PDF)
Untersuchungen zur Reaktion von Proteinen während einer Hochdruckbehandlung (HD) ermöglichen ein besseres Verständnis der Reaktivität und Struktur auf molekularer Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Oligomerisierung von Hühnereiweißlysozym (HEWL) mithilfe der druckstabilen mikrobiellen Transglutaminase (mTGase) unter HD untersucht. Die resultierenden Oligomere wurden anschließend hinsichtlich ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit dem evolutionsbiologisch verwandten Protein, dem α-Lactalbumin durchgeführt. Abschließend erfolgten orientierende Studien zur nicht-enzymatischen Vernetzung von HEWL und ausgewählten Milchproteinen, bei welchen eine kovalente Verknüpfung über vergleichbare Isopeptide nachgewiesen werden konnte.
Kompakte, globuläre Proteine, wie das untersuchte HEWL stellten unter Normaldruck keine Substrate für die mTGase dar. Auch war eine enzymatische Vernetzung nach erfolgter Hochdruckbehandlung aufgrund der Reversibilität der druckinduzierten Auffaltung nicht möglich. So wurde HEWL nur bei simultaner Behandlung mit mTGase und hohem hydrostatischem Druck zu Homooligomeren vernetzt. Neben einem geeigneten Puffersystem wurden der pH-Wert, die Inkubationszeit, die Temperatur, der hydrostatische Druck, die Enzymaktivität der mTGase und die Proteinkonzentration des Lysozyms verändert. Abhängig von den Reaktionsbedingungen wurden Produkte mit stark variierenden Vernetzungsgraden erhalten, wobei eine maximale Oligomerisierung von zirka 75% aus einer 3%igen HEWL-Probe in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 mit 160 U mTGase/g Protein über 30 min, 600 MPa und 40°C erreicht wurde. Zudem erfolgte eine Kategorisierung aller resultierenden Proben anhand ihres mittels Gelelektrophorese bestimmten Vernetzungsgrades in drei Untergruppen: LMW (niedrig vernetzt, 0 - 30%), MMW (mittel vernetzt, 30 - 60%) und HMW (hoch vernetzt, 60 - 100%).
In den so vernetzten Proben wurden das reaktionsspezifisch gebildete Isopeptid N ε (γ L Glutamyl)-L-Lysin (Glu_Lys) nachgewiesen und die beteiligten reaktiven Aminosäuren identifiziert. Die Bestimmung von Glu_Lys, welches für die kovalenten Verknüpfungen verantwortlich ist, erfolgte nach enzymatischer Hydrolyse am Aminosäureanalysator mit Ninhydrin-Nachsäulen-Derivatisierung. Eine erste Abschätzung des Isopeptid¬gehaltes zeigte zudem, dass es bei der Oligomerisierung sowohl zu inter- als auch intra¬molekularer Vernetzung kam. Der minimal notwendige Gehalt an Cross-Link-Aminosäuren, [CLAA]min lag zum Teil um den Faktor zwei unter dem Gehalt des quantifizierten Glu_Lys.
Anschließend konnte nach tryptischem Verdau über die RP-HPLC/ESI-TOF-MS für die gering vernetzten Proben (LMW) genau eine definierte kovalente Verknüpfungsstelle ermittelt werden. Für die MMW- und HMW-Proben wurden fünf bzw. sechs Peptidfragmente detektiert. Bei den LMW-Proben wurde Lys1 mit Gln121 vernetzt. Den höher oligomerisierten Proben konnten die Lysinreste Lys1, Lys13, Lys116 und die Glutaminreste Gln41, Gln57, Gln121 zugeordnet werden. Somit gelang eine erste strukturelle Aufklärung der Vernetzungsprodukte. Der Aufbau der Oligomere läuft demnach zuerst gerichtet und linear ab. Insbesondere bei höheren Temperaturen und Enzymaktivitäten werden jedoch ungeordnete Strukturen gebildet. Die einzelnen Vernetzungsprodukte scheinen aufgrund der Lage der reaktiven Aminosäuren im HEWL-Molekül über mehrere intermolekulare Bindungen eine variierende Struktur auszubilden. Eine Quantifizierung der einzelnen Isopeptide erfolgte nicht, orientierende MS-Untersuchungen lassen aber vermuten, dass auch hier bevorzugte Reaktionsorte existieren.
Die vernetzten Proben wurden nachfolgend über Ammoniumsulfatfällung konzentriert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) fraktioniert. Die Ausbeuten der GPC waren sehr gering. Eine Fraktionierung in einzelne, selektiv verknüpfte Oligomere wurde nicht erreicht. Die enzymatisch oligomerisierten Proben sowie ausgewählte GPC-Fraktionen mit höheren Oligomeren wurden hinsichtlich funktioneller und struktureller Konsequenzen untersucht. Begonnen wurde dabei mit der lytischen Enzymaktivität des HEWL gegen Zellwände des Micrococcus lysodeikticus. Eine abnehmende bzw. verbleibende Lyseaktivität korrelierte mit einer zunehmenden Oberflächen¬hydrophobität der Oligomerengemische. Beide Größen verhielten sich indirekt proportional zueinander. Während der hydrophobe Kern des Moleküls mit steigender Oligomerisierungsrate freigelegt wurde, senkte sich die Lyseaktivität bis auf null ab. Eine räumliche Deformation oder Barriere entstand mutmaßlich im oder in der Nähe des reaktiven Zentrums (Glu35 und Asp52) des Lysozyms, so dass der Enzym-Substrat-Komplex nicht mehr ausgebildet werden konnte.
Die Untersuchung der Veränderung sekundärer und tertiärer Strukturbestandteilte erfolgte mithilfe der Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie. Gleichwohl für die Tertiärstruktur keine großen Veränderungen aufgezeigt wurden, ist für die Sekundärstruktur mit zunehmendem Vernetzungsgrad eine Abnahme der α-Helices und eine Zunahme von ungeordneten und β Faltblatt-Bereichen detektiert worden. Es konnte daher die unter Hochdruck bekannte Auffaltung des HEWL über die enzymatische Vernetzung derart stabilisiert werden, dass eine vollständige Rückfaltung nicht mehr gegeben war.
Das Fibrillierungsverhalten der oligomerisierten Proben im Sauren im Vergleich zum unbehandelten HEWL stellte eine weitere Charakterisierungsmöglichkeit dar. Die Analyse der inkubierten Proben erfolgte mithilfe dreier photometrischer Methoden (Umsetzung mit den Reagenzien 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure, Kongorot oder Thioflavin T). Die fibrillierten Proben wurden zudem transmissionselektronenmikroskopisch (TEM) untersucht. Mit zunehmender Vernetzung war dabei eine abnehmende Fibrillierungsneigung zu beobachten, welche gut strukturell zu erklären ist, da die zusätzlichen, kovalenten Isopeptidbindungen die Proteinmoleküle gegen eine saure Auffaltung stabilisieren. Eine Auffaltung ist jedoch die Grundvoraussetzung für eine Assoziation und Bildung in-vitro-induzierter, amyloider Strukturen.
Ferner wurde das antimikrobielle Verhalten der Präparate gegen grampositive und -negative Mikroorganismen getestet. Unbehandeltes Lysozym zeigt grundsätzlich gegenüber grampositiven Mikroorganismen eine gute antimikrobielle Aktivität. Eingesetzt wurden der Agardiffusions- und der bakterielle Hemmtest (Trübungsassay). Hierbei zeigten alle geprüften Proben keine Wirkung gegenüber gramnegativen Bakterien. Die antimikrobielle Wirkung gegenüber den grampositiven Mikroorganismen variierte stark. Das Phänomen der erhöhten Sensibilität gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen im niederkonzentrierten Bereich wurde für Bacillus subtilis (grampositiv) und die mittel- bzw. hochvernetzten Proben im Vergleich zu unbehandelten HEWL (je 0,00625% Probe, w/v) reproduzierbar nachgewiesen.
Auf die umfassende Charakterisierung der enzymatisch vernetzten HEWL-Proben folgten orientierende Vergleichsstudien mit dem evolutionsbiologisch verwandten α Lactalbumin (α-LA). Die enzymatische Oligomerisierung konnte für das Molkenprotein dabei im Gegensatz zum HEWL bereits unter Atmosphärendruck erzielt werden. Die Vernetzungsraten betrugen, unabhängig von den untersuchten Rahmenparametern aber abhängig vom Calciumgehalt, zirka 35% (mit Ca) bis 72% (ohne Ca). Das α-LA als Calcium-bindendes Protein wurde somit durch die Abwesenheit des Metallions derart destabilisiert, dass es für die mTGase besser umsetzbar wurde. Die im Vergleich zum Lysozym vermehrt enthaltenen potentiell reaktiven Aminosäuren (doppelt so viel Lys und Gln) trugen ebenfalls zu einer stärkeren Oligomerisierung bei.
Abschließend erfolgten Studien zu nicht-enzymatischen, vakuuminduzierten Kondensations-reaktionen. Dabei wurde trockenes HEWL im Vakuum thermisch induziert vernetzt. Die Methode ist in der Literatur als Zero-Length-Cross-Linking (ZLCL) beschrieben. Die Untersuchung der Parameter Vakuum, Temperatur, pH-Wert und Zyklenzahl erfolgte an dem globulären Protein. Dieses konnte unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zum Di- und Trimer vernetzt werden. Weitere Milchproteinproben (ein Molkenproteinisolat und β-Casein) wurden nur exemplarisch unter Standardbedingungen untersucht. Hierbei wurde das Molkenproteinisolat deutlich besser als HEWL und das β-Casein bei 85°C über je 24 h und Einsatz von Vakuum am stärksten oligomerisiert. Die gute Umsetzung des β-Caseins ist dabei auf die fehlende Tertiär- und Sekundärstruktur zurückzuführen. Zum Teil entstanden auch Casein-Polymere, welche nicht mehr elektrophoresegängig waren. Die beteiligten Isopeptide wurden analog zu den enzymatisch vernetzten Proben über die Aminosäureanalytik nachgewiesen. Es konnte das Isopeptid N-ε-(β-Aspartyl-)Lysin (Asp_Lys) neben Lysinoalanin (LAL), aber kein Glu_Lys in HEWL nachgewiesen werden. Beide Isopeptide (Asp_Lys und Glu_Lys) sowie LAL sind dagegen im β Casein gebildet worden. Der Einfluss struktureller Gegebenheiten auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine konnte folglich eindeutig belegt werden.
|
213 |
Sobre um Sistema do tipo Schrödinger-PoissonBatista, Alex de Moura 26 April 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2015-05-15T11:46:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1
arquivototal.pdf: 695566 bytes, checksum: 26f7afc275ad83fa634352b9d522415e (MD5)
Previous issue date: 2012-04-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In this dissertation, we study the existence of two types of non-negative weak solutions
for a class of problems of Schrodinger-Poisson type. This kind of problem models, for
example, several physical phenomena in quantum mechanics. Initially, by minimization
arguments, Splitting Lemma and the Variational Principle of Ekeland we find a weak
solution that minimizes the minimum energy level associated to the variety of Nehari
N. This is the so-called ground state solution. Afterwards we will find, by using the
Linking Theorem, a strictly positive weak solution which is not a ground state solution:
the so-called bound state solution. / Nesta dissertação, estudaremos a existência de dois tipos de soluções fracas não
negativas para uma classe de problemas do tipo Schrödinger-Poisson, os quais modelam
fenômenos físicos, por exemplo, em Mecânica Quântica. Inicialmente, encontraremos
através de argumentos de minimização, do Lema Splitting e do Princípio Variacional de
Ekeland, uma solução fraca que minimiza o nível de energia mínima associado a variedade
de Nehari N. Tal solução é denominada do tipo ground state. Em seguida, encontraremos
através do Teorema de Linking, uma solução fraca estritamente positiva que não é do tipo
ground state. Tal solução é denominada do tipo bound state.
|
214 |
LOX and LOX-Like Proteins as Potential Therapeutic Target for Atrial FibrillationAl-u'datt, Doa'a 01 1900 (has links)
No description available.
|
215 |
Enzymatische Oligomerisierung von Lebensmittelproteinen unter Hochdruck: Reaktionsorte und funktionelle KonsequenzenSchuh, Susanne 25 April 2013 (has links)
Untersuchungen zur Reaktion von Proteinen während einer Hochdruckbehandlung (HD) ermöglichen ein besseres Verständnis der Reaktivität und Struktur auf molekularer Ebene. In der vorliegenden Arbeit wurde die enzymatische Oligomerisierung von Hühnereiweißlysozym (HEWL) mithilfe der druckstabilen mikrobiellen Transglutaminase (mTGase) unter HD untersucht. Die resultierenden Oligomere wurden anschließend hinsichtlich ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften charakterisiert. Vergleichende Untersuchungen wurden mit dem evolutionsbiologisch verwandten Protein, dem α-Lactalbumin durchgeführt. Abschließend erfolgten orientierende Studien zur nicht-enzymatischen Vernetzung von HEWL und ausgewählten Milchproteinen, bei welchen eine kovalente Verknüpfung über vergleichbare Isopeptide nachgewiesen werden konnte.
Kompakte, globuläre Proteine, wie das untersuchte HEWL stellten unter Normaldruck keine Substrate für die mTGase dar. Auch war eine enzymatische Vernetzung nach erfolgter Hochdruckbehandlung aufgrund der Reversibilität der druckinduzierten Auffaltung nicht möglich. So wurde HEWL nur bei simultaner Behandlung mit mTGase und hohem hydrostatischem Druck zu Homooligomeren vernetzt. Neben einem geeigneten Puffersystem wurden der pH-Wert, die Inkubationszeit, die Temperatur, der hydrostatische Druck, die Enzymaktivität der mTGase und die Proteinkonzentration des Lysozyms verändert. Abhängig von den Reaktionsbedingungen wurden Produkte mit stark variierenden Vernetzungsgraden erhalten, wobei eine maximale Oligomerisierung von zirka 75% aus einer 3%igen HEWL-Probe in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 mit 160 U mTGase/g Protein über 30 min, 600 MPa und 40°C erreicht wurde. Zudem erfolgte eine Kategorisierung aller resultierenden Proben anhand ihres mittels Gelelektrophorese bestimmten Vernetzungsgrades in drei Untergruppen: LMW (niedrig vernetzt, 0 - 30%), MMW (mittel vernetzt, 30 - 60%) und HMW (hoch vernetzt, 60 - 100%).
In den so vernetzten Proben wurden das reaktionsspezifisch gebildete Isopeptid N ε (γ L Glutamyl)-L-Lysin (Glu_Lys) nachgewiesen und die beteiligten reaktiven Aminosäuren identifiziert. Die Bestimmung von Glu_Lys, welches für die kovalenten Verknüpfungen verantwortlich ist, erfolgte nach enzymatischer Hydrolyse am Aminosäureanalysator mit Ninhydrin-Nachsäulen-Derivatisierung. Eine erste Abschätzung des Isopeptid¬gehaltes zeigte zudem, dass es bei der Oligomerisierung sowohl zu inter- als auch intra¬molekularer Vernetzung kam. Der minimal notwendige Gehalt an Cross-Link-Aminosäuren, [CLAA]min lag zum Teil um den Faktor zwei unter dem Gehalt des quantifizierten Glu_Lys.
Anschließend konnte nach tryptischem Verdau über die RP-HPLC/ESI-TOF-MS für die gering vernetzten Proben (LMW) genau eine definierte kovalente Verknüpfungsstelle ermittelt werden. Für die MMW- und HMW-Proben wurden fünf bzw. sechs Peptidfragmente detektiert. Bei den LMW-Proben wurde Lys1 mit Gln121 vernetzt. Den höher oligomerisierten Proben konnten die Lysinreste Lys1, Lys13, Lys116 und die Glutaminreste Gln41, Gln57, Gln121 zugeordnet werden. Somit gelang eine erste strukturelle Aufklärung der Vernetzungsprodukte. Der Aufbau der Oligomere läuft demnach zuerst gerichtet und linear ab. Insbesondere bei höheren Temperaturen und Enzymaktivitäten werden jedoch ungeordnete Strukturen gebildet. Die einzelnen Vernetzungsprodukte scheinen aufgrund der Lage der reaktiven Aminosäuren im HEWL-Molekül über mehrere intermolekulare Bindungen eine variierende Struktur auszubilden. Eine Quantifizierung der einzelnen Isopeptide erfolgte nicht, orientierende MS-Untersuchungen lassen aber vermuten, dass auch hier bevorzugte Reaktionsorte existieren.
Die vernetzten Proben wurden nachfolgend über Ammoniumsulfatfällung konzentriert und mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) fraktioniert. Die Ausbeuten der GPC waren sehr gering. Eine Fraktionierung in einzelne, selektiv verknüpfte Oligomere wurde nicht erreicht. Die enzymatisch oligomerisierten Proben sowie ausgewählte GPC-Fraktionen mit höheren Oligomeren wurden hinsichtlich funktioneller und struktureller Konsequenzen untersucht. Begonnen wurde dabei mit der lytischen Enzymaktivität des HEWL gegen Zellwände des Micrococcus lysodeikticus. Eine abnehmende bzw. verbleibende Lyseaktivität korrelierte mit einer zunehmenden Oberflächen¬hydrophobität der Oligomerengemische. Beide Größen verhielten sich indirekt proportional zueinander. Während der hydrophobe Kern des Moleküls mit steigender Oligomerisierungsrate freigelegt wurde, senkte sich die Lyseaktivität bis auf null ab. Eine räumliche Deformation oder Barriere entstand mutmaßlich im oder in der Nähe des reaktiven Zentrums (Glu35 und Asp52) des Lysozyms, so dass der Enzym-Substrat-Komplex nicht mehr ausgebildet werden konnte.
Die Untersuchung der Veränderung sekundärer und tertiärer Strukturbestandteilte erfolgte mithilfe der Zirkular-Dichroismus-Spektroskopie. Gleichwohl für die Tertiärstruktur keine großen Veränderungen aufgezeigt wurden, ist für die Sekundärstruktur mit zunehmendem Vernetzungsgrad eine Abnahme der α-Helices und eine Zunahme von ungeordneten und β Faltblatt-Bereichen detektiert worden. Es konnte daher die unter Hochdruck bekannte Auffaltung des HEWL über die enzymatische Vernetzung derart stabilisiert werden, dass eine vollständige Rückfaltung nicht mehr gegeben war.
Das Fibrillierungsverhalten der oligomerisierten Proben im Sauren im Vergleich zum unbehandelten HEWL stellte eine weitere Charakterisierungsmöglichkeit dar. Die Analyse der inkubierten Proben erfolgte mithilfe dreier photometrischer Methoden (Umsetzung mit den Reagenzien 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure, Kongorot oder Thioflavin T). Die fibrillierten Proben wurden zudem transmissionselektronenmikroskopisch (TEM) untersucht. Mit zunehmender Vernetzung war dabei eine abnehmende Fibrillierungsneigung zu beobachten, welche gut strukturell zu erklären ist, da die zusätzlichen, kovalenten Isopeptidbindungen die Proteinmoleküle gegen eine saure Auffaltung stabilisieren. Eine Auffaltung ist jedoch die Grundvoraussetzung für eine Assoziation und Bildung in-vitro-induzierter, amyloider Strukturen.
Ferner wurde das antimikrobielle Verhalten der Präparate gegen grampositive und -negative Mikroorganismen getestet. Unbehandeltes Lysozym zeigt grundsätzlich gegenüber grampositiven Mikroorganismen eine gute antimikrobielle Aktivität. Eingesetzt wurden der Agardiffusions- und der bakterielle Hemmtest (Trübungsassay). Hierbei zeigten alle geprüften Proben keine Wirkung gegenüber gramnegativen Bakterien. Die antimikrobielle Wirkung gegenüber den grampositiven Mikroorganismen variierte stark. Das Phänomen der erhöhten Sensibilität gegenüber ausgewählten Bakterienstämmen im niederkonzentrierten Bereich wurde für Bacillus subtilis (grampositiv) und die mittel- bzw. hochvernetzten Proben im Vergleich zu unbehandelten HEWL (je 0,00625% Probe, w/v) reproduzierbar nachgewiesen.
Auf die umfassende Charakterisierung der enzymatisch vernetzten HEWL-Proben folgten orientierende Vergleichsstudien mit dem evolutionsbiologisch verwandten α Lactalbumin (α-LA). Die enzymatische Oligomerisierung konnte für das Molkenprotein dabei im Gegensatz zum HEWL bereits unter Atmosphärendruck erzielt werden. Die Vernetzungsraten betrugen, unabhängig von den untersuchten Rahmenparametern aber abhängig vom Calciumgehalt, zirka 35% (mit Ca) bis 72% (ohne Ca). Das α-LA als Calcium-bindendes Protein wurde somit durch die Abwesenheit des Metallions derart destabilisiert, dass es für die mTGase besser umsetzbar wurde. Die im Vergleich zum Lysozym vermehrt enthaltenen potentiell reaktiven Aminosäuren (doppelt so viel Lys und Gln) trugen ebenfalls zu einer stärkeren Oligomerisierung bei.
Abschließend erfolgten Studien zu nicht-enzymatischen, vakuuminduzierten Kondensations-reaktionen. Dabei wurde trockenes HEWL im Vakuum thermisch induziert vernetzt. Die Methode ist in der Literatur als Zero-Length-Cross-Linking (ZLCL) beschrieben. Die Untersuchung der Parameter Vakuum, Temperatur, pH-Wert und Zyklenzahl erfolgte an dem globulären Protein. Dieses konnte unter nicht denaturierenden Bedingungen bis zum Di- und Trimer vernetzt werden. Weitere Milchproteinproben (ein Molkenproteinisolat und β-Casein) wurden nur exemplarisch unter Standardbedingungen untersucht. Hierbei wurde das Molkenproteinisolat deutlich besser als HEWL und das β-Casein bei 85°C über je 24 h und Einsatz von Vakuum am stärksten oligomerisiert. Die gute Umsetzung des β-Caseins ist dabei auf die fehlende Tertiär- und Sekundärstruktur zurückzuführen. Zum Teil entstanden auch Casein-Polymere, welche nicht mehr elektrophoresegängig waren. Die beteiligten Isopeptide wurden analog zu den enzymatisch vernetzten Proben über die Aminosäureanalytik nachgewiesen. Es konnte das Isopeptid N-ε-(β-Aspartyl-)Lysin (Asp_Lys) neben Lysinoalanin (LAL), aber kein Glu_Lys in HEWL nachgewiesen werden. Beide Isopeptide (Asp_Lys und Glu_Lys) sowie LAL sind dagegen im β Casein gebildet worden. Der Einfluss struktureller Gegebenheiten auf die Reaktionsfähigkeit der Proteine konnte folglich eindeutig belegt werden.:Abbildungsverzeichnis V
Tabellenverzeichnis VIII
Abkürzungsverzeichnis XI
1 Einleitung und Zielstellung 1
2 Theoretische Grundlagen 3
2.1 Lysozym 3
2.1.1 Wirkmechanismen des Lysozyms 4
2.1.2 Anwendungsmöglichkeiten von Lysozym 7
2.1.3 Modifizierung des Lysozyms 8
2.1.3.1 Fibrillen und amyloide Strukturen von HEWL 9
2.1.3.2 Neue biologische Funktionen durch Konformationsänderung 13
2.1.4 Evolutionäre Entwicklung und Verwandtschaft zu α-Lactalbumin 14
2.2 Die enzymatische Vernetzung 15
2.2.1 Mikrobielle Transglutaminase 15
2.2.1.1 TGase katalysierte Reaktionen und Reaktionsmechanismus 17
2.2.1.2 Analytische Aspekte 19
2.2.1.3 Einsatz in der Lebensmittelindustrie 19
2.3 Nicht-enzymatische Vernetzung 21
2.3.1 Thermisch induzierte Vernetzung 21
2.3.2 In-Vacuo Zero-Length Cross-Linking 23
2.3.3 Anwendungsmöglichkeiten nicht-enzymatisch vernetzter Proteine 23
2.4 Wirkung hoher hydrostatischer Drücke auf Proteine 24
2.4.1 Wirkung von Hochdruck auf Hühnereiweiß-Lysozym 26
2.4.2 Wirkung von Hochdruck auf die mikrobielle Transglutaminase 27
3 Experimenteller Teil 29
3.1 Chemikalien, Materialien, Geräte und Software 29
3.1.1 Chemikalien 29
3.1.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien 31
3.1.3 Untersuchungsmaterialien 33
3.1.4 Software 33
3.2 Erzeugung modifizierter Proteine 34
3.2.1 Enzymatische Vernetzung von Proteinen 34
3.2.1.1 Erzeugung von Protein-Oligomeren unter Hochdruck 34
3.2.1.2 Reinigung mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) 35
3.2.1.3 Konzentrierung durch Ammoniumsulfatfällung 35
3.2.2 Thermisches und Vakuum-induziertes Zero-length Cross-linking 36
3.3 Erzeugung von HEWL-Fibrillen 38
3.4 Isolierung von α-Lactalbumin 38
3.5 Dialyse der Proteinlösungen 39
3.6 Aktivität der Transglutaminase 39
3.7 Analytische Verfahren zur Strukturuntersuchung und Charakterisierung der Proteinproben 41
3.7.1 Restwasserbestimmung mittels Karl-Fischer-Titration 41
3.7.2 Proteinbestimmung mittels Lowry 42
3.7.3 Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 44
3.7.4 Aminosäureanalytik (ASA) 47
3.7.4.1 Saure Hydrolyse 49
3.7.4.2 Enzymatische Hydrolyse 49
3.7.5 Hochdruckflüssigchromatographie mit anschließender Massenspektroskopie (RP-HPLC/ESI-TOF-MS) 51
3.7.5.1 Probenvorbereitung - Tryptischer Verdau 51
3.7.5.2 RP-HPLC/ESI-TOF-MS-Messung 51
3.7.6 Aktivitätsbestimmung für HEWL und HEWL-haltige Proben 52
3.7.6.1 Klassische Methode - Trübungsassay 52
3.7.6.2 Modifizierte Methode der Aktivitätsermittlung mit Blue-ML 53
3.7.7 Methode zur Oberflächenhydrophobitätsermittlung 54
3.7.8 Bestimmung der Sekundär- und Tertiärstruktur mittels Zirkulardichroismus Spektroskopie (CD-Spektroskopie) 56
3.7.9 Charakterisierung der HEWL-Fibrillen 57
3.7.9.1 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure-Assay (ANS-Assay) 57
3.7.9.2 Kongorot-Assay 58
3.7.9.3 Thioflavin-T-Assay 59
3.7.9.4 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 61
3.7.10 Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit 62
3.7.10.1 Agardiffusionstest 62
3.7.10.2 Bakterieller Hemmtest 63
4 Ergebnisse und Diskussion 64
4.1 Enzymatische Vernetzung von HEWL mittels mTGase und Einfluss verschiedener Reaktionsparameter 64
4.1.1 Geeignete Puffersysteme und pH-Werte 67
4.1.2 Einfluss variierender Inkubationsdauer und unterschiedlicher Drücke 68
4.1.3 Einfluss der Lysozymkonzentration 70
4.1.4 Einfluss der mTGase-Aktivität 71
4.1.5 Temperatur 73
4.1.6 Optimierte Parameter für den höchstmöglichen Vernetzungsgrad 74
4.2 Analytik der Isopeptide 76
4.2.1 Identifizierung des N-ε-(γ-L-Glutamyl)-L-Lysin-Isopeptids (Glu_Lys) 76
4.2.2 Beurteilung einer intra- und intermolekularen Vernetzung 79
4.2.3 Lokalisierung der reaktiven Lysin- und Glutaminreste mittels HPLC/MS 80
4.2.4 Strukturvorschlag 88
4.3 Isolierung und Konzentrierung enzymatisch vernetzter Lysozym-Oligomere 89
4.3.1 Ammoniumsulfatfällung 89
4.3.2 Ergebnisse der Gelpermeationschromatographie 91
4.4 Funktionelle Charakterisierung der LMW-, MMW- und HMW-Proben des HEWL 96
4.4.1 Vergleichende Untersuchungen der verbleibenden Enzymaktivität 97
4.4.2 Beurteilung der Oberflächenhydrophobität 100
4.4.3 Veränderung der Sekundär- und Tertiärstruktur 104
4.4.4 Fibrillbildung und -eigenschaften von HEWL 109
4.4.4.1 Etablierung der Charakterisierungmethoden für HEWL-Fibrillen 110
4.4.4.2 Fibrillinduktion an HEWL-Präparaten ausgewählter Vernetzungsgrade 118
4.4.5 Antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen 126
4.5 Vergleichende Untersuchungen an dem strukturanalogen Protein α-Lactalbumin 137
4.6 Orientierende Untersuchungen zur nicht-enzymatischen In-Vakuo-Thermo-Vernetzung von HEWL und ausgesuchten Proteinen 142
4.6.1 Einfluss verschiedener Reaktionsparameter auf die Vernetzung von HEWL 143
4.6.2 Identifizierung der gebildeten Isopeptide 145
4.6.3 Vergleich der nicht-enzymatischen und enzymatischen Vernetzung von HEWL 146
4.6.4 Vergleich der In-Vakuo-Thermo-Vernetzung an HEWL mit β-Casein und erste Untersuchungen an einem Molkenproteinisolat 149
4.7 Fazit der Untersuchungen zur enzymatischen und der nicht-enzymatischen Vernetzung verschiedener Proteine 152
5 Zusammenfassung 154
6 Literaturverzeichnis 157
Veröffentlichungen 172
Danksagung 173
Versicherung 174
|
216 |
DEVELOPMENT OF NOVEL CHEMICAL TOOLS FOR PROTEASOME BIOLOGY & A NEW APPROACH TO 1-AZASPIROCYCLIC RING SYSTEMKumar, Lalit 01 January 2012 (has links)
The proteasome, a multiprotease complex, is clinically validated as an anticancer target by the FDA approval of bortezomib and carfilzomib for the treatment of multiple myeloma. The emergence of resistance to proteasome inhibitors however remains a major clinical challenge. Recently, distinct types of proteasomes termed ‘intermediate proteasomes’, which contain unconventional mixtures of catalytic subunits, have been implicated with drug resistance of tumor cells. In elucidating the role of intermediate proteasomes in drug resistance, a crucial step is to unequivocally determine the subunit composition of intermediate proteasomes in cells. With this in mind, the goal of the studies reported in this dissertation is to develop novel chemical tools which can facilitate the investigation of intermediate proteasomes via two complementary approaches: a FRET-based approach and a bifunctional cross-linking approach.
Chapter 2 describes the structure-based design, synthesis, and characterization of a peptide epoxyketone-based fluorescent probe, named as LKS01-B650, which selectively targets the immunoproteasome subunit β5i/LMP7. In addition to its utility in determining the identity of intermediate proteasomes as FRET-based probe, this imaging agent may also serve as a valuable tool in visualizing the immunoproteasome in living cells.
Chapter 3 describes the design and synthesis of various epoxyketone-based bifunctional agents. The ability of these bifunctional agents to cross-link different catalytic subunits within a proteasome complex is shown by mobility shift assays.These bifunctional agents may provide important information in determining the subunit composition of proteasomes.
Chapter 4 describes a systematic study of the relationship between the proteasome inhibitor structure and the inhibitory activity against critical subunits of the proteasome. Given the reported role of β5i/LMP7 in autoimmune diseases, this study may provide useful insights in developing therapeutic agents for autoimmune diseases as well as other diseases.
Chapter 5 describes a separate study which is not related to proteasome biology. A concise approach to synthesize 1-azaspirocyclic ring systems is developed by utilizing a novel semi-pinacol/Beckmann rearrangement. Additionally, an environmentally benign, microwave-assisted, and solvent-free self-condensation of carbonyl compounds is reported.
|
217 |
Organizacijos vidinės komunikacijos procesai žinių vadybos kontekste / Internal organizational communication processes in the context of knowledge managementNavickaitė, Jovita 18 February 2011 (has links)
Magistro darbe analizuojamos organizacijos vidinės komunikacijos ir žinių vadybos koncepcijos, norint numatyti, ar, siekiant didesnio organizacijos konkurencingumo ir veiklos efektyvumo, vidinės komunikacijos procesai organizacijoje gali būti papildyti žinių vadybos elementais, teorinėje dalyje minėtos koncepcijos yra sugretinamos. Taigi tyrimas yra skirtas teoriniam vidinės komunikacijos ir žinių vadybos koncepcijų susiejimo galimybių numatymui bei praktinio sinerginio šių procesų taikymo organizacijoje įvertinimui, kurio centre - efektyvūs, racionalūs ir organizacijos žinių kūrimui, kaupimui bei sklaidai palankūs vidinės komunikacijos procesai. Atliktais tyrimais siekiama patvirtinti arba paneigti hipotezę, jog organizacijos vidinės komunikacijos ir žinių vadybos procesai gali būti susieti, tačiau gali kilti problemų, susijusių su organizacijos specifika ar veikla.
Šio darbo empirinis tyrimas yra grindžiamas bendrovės „Mars Lietuva“ atvejo analize. Pirmojoje empirinio tyrimo dalyje buvo atlikti du pusiau struktūruoti interviu su bendrovės „Mars Lietuva“ vadovybe (generaline direktore ir vidinės komunikacijos koordinatore), antrojoje – vykdyta kiekybinė anketinė skyrių, labiausiai susijusių su žinių vadybos procesais, darbuotojų apklausa.
Atlikus tyrimą darbo pradžioje iškelta hipotezė pasitvirtino. Remiantis atlikta mokslinės literatūros ir empirinio tyrimo duomenų analize, buvo nustatyta, jog teorinės ir praktinės vidinės komunikacijos ir žinių vadybos procesų susiejimo... [toliau žr. visą tekstą] / The work analyzes the concepts of internal organizational communication and knowledge management, in order to identify whether internal communication processes in an organization may be complemented with knowledge management principles so to increase organization’s competitiveness and efficiency. Theoretical part compares the two concepts. The research part of the thesis is aimed to identify the theoretical potential of linking internal communication and knowledge management concepts, as well as to evaluate the practical synergistic implementation of these processes in an organization. The carried out research aims to confirm or deny the hypothesis that the processes of internal organizational communication and knowledge management can be linked; however, the issues, related to type and activity of an organization, may arise.
The empirical study of the work is based on a case study of the company Mars Lietuva. The first part of the empirical study presents two semi-structured interviews with the management of Mars Lietuva – managing director and the coordinator of internal communication. The second part presents the results of a quantitative questionnaire given to the employees of those departments, which are mostly related to knowledge management processes.
Research results confirmed the hypothesis of the thesis. The analysis of scientific literature and empirical research data showed that theoretical and practical potential to link internal communication and knowledge... [to full text]
|
218 |
Výzkum Struktury β-N-Acetylhexosaminidasy z Penicillium oxalicum. / Investigation of the β-N-Acetylhexosaminidase Stucture from Penicillium oxalicum.Krunclová, Tereza January 2012 (has links)
in English β-N-Acetylhexosaminidase (EC 3.2.1.52) is exoglycosidase, which exhibits the unique properties in the filamentous fungi. Enzyme from these organisms are dimeric, inducible and secreted extracelluary. It is expresed as preproprotein, consists of a signal sequence, a large propeptid and a catalytic subunit. Although the enzyme is widely distributed, its structure differs in varies organisms. Bacteria have only monomeric hexosaminidase. Human enzymes are dimeric as well as fungal, but only hexosaminidase from filamentous fungi have the catalytic subunit noncovalently associated with the propeptide. Propeptide is a essential for the enzyme activity. It exists a homologues model of the catalytic subunit of β-N-acetylhexosaminidase from Penicillium oxalicum, but the structure of the propeptide has not yet been solved. The first part of this diploma thesis deals with the optimization of production and purification conditions. The second part deals with structural studies of β-N-acetylhexosaminidases from the filamentous fungi Penicillium oxalicum CCF 3438. These studies were carried out using chemical cross-linking and high resolution mass spectrometry. The combination of these methods revealed region of the noncovalent interaction of the catalytic subunit with the propeptide.
|
219 |
Systematic analysis of host-cell interactions during human cytomegalovirus infectionChiweshe, Stephen Masaka January 2017 (has links)
Viruses are obligate intracellular pathogens. Therefore, their successful replication, at every stage from attachment to assembly and egress, is dependent on host cell functions. The host cell in turn engages mechanisms to counteract virus replication. As a result, viruses have evolved mechanisms to evade these counteracting measures as well as ways to reshape the cellular environment into one that’s favourable for successful replication. Systematic studies offer a platform for unravelling virus-cell interactions and in particular can address three important aspects 1) increase our understanding of basic biology of the virus, 2) identify and characterise novel cellular functions 3) provide important leads for novel targets for antiviral therapy. In this study, I investigated two aspects of virus host interaction; the role of microRNAs (miRNAs) in virus infection and the role of interferon inducible genes in virus infection. Human cytomegalovirus (HCMV) is a β herpes virus that infects humans. HCMV maintains a persistent lifelong infection in the host involving a cycle of latency and reactivation. Infection of healthy individuals with HCMV results in relatively minor symptoms. In contrast, infection of individuals with a compromised immune system, as in the case of organ transplant recipients and AIDS patients, can cause significant morbidity and mortality. In common with other herpes viruses, HCMV expresses multiple small regulatory RNAs called miRNAs. HCMV encodes at least 14 miRNAs. Identifying the targets of these miRNAs will help us understand their functional importance during infection. Recently, a biochemical technique called Cross-Linking, Ligation and Sequencing of Hybrids (CLASH), was developed by Tollervey and colleagues, representing the most advanced systematic technique for the identification of miRNA targets. We adapted this approach to identify high confidence miRNA targets during HCMV infection. However, the protocol was sub-optimal and presented us with technical challenges. Although high quality data sets were not generated, the work was crucial for the establishment of the system which is now generating promising data. Virus-cell interactions can also be elucidated by probing for host factors that are important for virus replication. Type I interferon is a highly effective inhibitor of HCMV replication. Treatment of cells with interferon results in up regulation of multiple effectors known as interferon stimulated genes (ISGs). How these genes block HCMV replication is poorly understood. A library of more than 380 ISG expressing lentiviruses was screened to determine the effects of individual ISGs on HCMV replication. The screen was performed in primary human fibroblast cells and a glioblastoma cell line called U373s. Multiple inhibitory ISGs were identified including well characterised ISGs such as cGAS, STAT2, NOD2, DDX60 and HPSE as well as novel candidates TXNIP, ELF1, FAM46C, MT1H and CHMP5. Five ISGs were identified as HCMV replication enhancers including previously published ISGs BST2 and IFITM1 and novel enhancers ODC1, BCL3 and IL28RA. siRNA screens against top hits demonstrated that STAT2, CPT1A and cGAS are dominant inhibitory factors during HCMV infection and knockdown of these genes can partially rescue HCMV replication following interferon treatment. Finally, using a corresponding rhesus ISG library we show that rhesus SAMHD1 effectively inhibits HCMV replication while human SAMHD1 has no effect, suggesting that HCMV expresses a species-specific inhibitor of SAMHD1. This study defines interferon stimulated pathways important for HCMV replication and identifies multiple novel host factors that both restrict and enhance HCMV replication. These studies demonstrate the effectiveness of using systematic approaches for the identification of novel host virus interactions.
|
220 |
The Robustness of Rasch True Score Preequating to Violations of Model Assumptions Under Equivalent and Nonequivalent PopulationsGianopulos, Garron 22 October 2008 (has links)
This study examined the feasibility of using Rasch true score preequating under violated model assumptions and nonequivalent populations. Dichotomous item responses were simulated using a compensatory two dimensional (2D) three parameter logistic (3PL) Item Response Theory (IRT) model. The Rasch model was used to calibrate difficulty parameters using two methods: Fixed Parameter Calibration (FPC) and separate calibration with the Stocking and Lord linking (SCSL) method. A criterion equating function was defined by equating true scores calculated with the generated 2D 3PL IRT item and ability parameters, using random groups equipercentile equating. True score preequating to FPC and SCSL calibrated item banks was compared to identity and Levine's linear true score equating, in terms of equating bias and bootstrap standard errors of equating (SEE) (Kolen & Brennan, 2004). Results showed preequating was robust to simulated 2D 3PL data and to nonequivalent item discriminations, however, true score equating was not robust to guessing and to the interaction of guessing and nonequivalent item discriminations. Equating bias due to guessing was most marked at the low end of the score scale. Equating an easier new form to a more difficult base form produced negative bias. Nonequivalent item discriminations interacted with guessing to magnify the bias and to extend the range of the bias toward the middle of the score distribution. Very easy forms relative to the ability of the examinees also produced substantial error at the low end of the score scale. Accumulating item parameter error in the item bank increased the SEE across five forms. Rasch true score preequating produced less equating error than Levine's true score linear equating in all simulated conditions. FPC with Bigsteps performed as well as separate calibration with the Stocking and Lord linking method. These results support earlier findings, suggesting that Rasch true score preequating can be used in the presence of guessing if accuracy is required near the mean of the score distribution, but not if accuracy is required with very low or high scores.
|
Page generated in 0.0716 seconds