La modification des profils spécifiques en acides gras (AG) dans des huiles végétales peut servir à l’amélioration de leur qualité nutritionnelle, mais également à l’émergence d’une industrie biosourcée où les AG peuvent représenter une alternative aux ressources carbonées fossiles. Cependant des difficultés à modifier le profil en AG des huiles végétales, partagées par l’ensemble des équipes de recherche impliquées subsistent. Bien que la biosynthèse des AG est aujourd’hui bien caractérisée chez les plantes, des incertitudes persistent concernant les voies de transfert des AG du pool d’acyl-CoA vers les précurseurs lipidiques, et les formes de transport entre les différents compartiments impliqués dans les synthèses lipidiques. La carnitine est un acteur essentiel du trafic intracellulaire des AG chez l’animal et la levure. La présence avérée chez la plante d’acyl-Carnitines au côté de la carnitine libre, et la mise en évidence d’activités enzymatiques associées, prouvent également le lien entre la carnitine et le métabolisme des AG. Le travail de cette thèse a donc porté sur un approfondissement des connaissances sur le rôle de la carnitine dans le métabolisme lipidique chez Arabidopsis thaliana. A ce titre, nous avons pu montrer par LC-QQQ-MS/MS dans nos extraits végétaux, que l’oléoyl-, la palmitoyl- et la stéaroyl-Carnitine sont les espèces majoritaires et correspondent aux 3 AG (C18:1, C16:0 et C18:0) principalement synthétisés et exportés des plastes, pour alimenter la synthèse lipidique de la voie eucaryotique. De plus, une augmentation significative des teneurs en acyl-Carnitines a été mesurée dans des processus développementaux nécessitant une forte synthèse de glycérolipides, tels que le développement post-Germinatif (2 j post-Imbibition) ou lors de l’organogenèse racinaire, en concomitance avec le niveau d’expression des gènes marqueurs de la synthèse lipidique eucaryotique. D’autre part, la comparaison des teneurs en acyl-Carnitines et en carnitine estérifiée a révélée un résultat inédit montrant qu’une grande fraction de la carnitine est estérifiée à des AG inhabituels ou des acides organiques que nous cherchons actuellement à identifier par LC-QTOF-MS/MS. Ainsi, l’ensemble de nos résultats suggèrent que la carnitine pourrait être impliquée dans le trafic intracellulaire d’AG pour la synthèse de lipides eucaryotiques et de lipides particuliers et/ou dans la prise en charge d’acides organiques encore non identifiés dans les plantes. / Specific modification of fatty acid profiles (FA) in vegetable oils can help to improve their nutritional quality but also to the development of a bio-Based industry where FA may represent an alternative to fossil fuel sources. However problems to modify the FA profile of vegetable oils still remain and are shared by all the teams involved. Although the biosynthesis of AG is now well characterized in plants, uncertainties remain about the tranfert of AG of acyl-CoA pool to lipid precursors and the forms of transport between different compartments involved in lipid synthesis. Carnitine plays an essential role in intracellular trafficking of FA in animals and yeast. The known presence of acyl-Carnitines in plant alongside the free carnitine, and measurement of associatied-Enzymatic activities also show the link between FA metabolism and carnitine. During this thesis we tried to improve our understanding of the role of carnitine in lipid metabolism in Arabidopsis thaliana. We have shown by LC-QQQ-MS / MS in our plant extracts that oleoyl-, palmitoyl- and stearoyl-Carnitine are the predominant species and correspond to the three main AG (C18:1, C16:0 and C18:0) synthesized and exported from the plastids to supply the lipid synthesis of the eukaryotic pathway. Moreover, a significant increase of the levels of acyl-Carnitines were measured in developmental processes requiring high glycerolipid synthesis, such as the post-Germinative growth (2 days post-Imbibition) during root organogenesis, concomitantly with the level of expression of the eukaryotic lipid synthesis marker genes. Furthermore, comparison of the levels of acyl-Carnitine and carnitine ester revealed an unpublished results showing that a large fraction of carnitine is esterified to unusual FA or organic acids that we are currently identifing by LC QTOF-MS/MS. Thus, all of our results suggest that carnitine could be involved in the intracellular traffic of FA for the synthesis of lipids and particular eukaryotic lipids and/or in the transport of yet unidentified organic acids in plants.

L’accumulation de cellules spumeuses dans l’intima des artères est le point critique de l’initiation de l’athérosclérose. L’accumulation de cholestérol et l’activation des voies pro-inflammatoires sont responsables de l’acquisition par les macrophages de ce phénotype délétère. Les dérivés oxydés du cholestérol accumulés vont stimuler les récepteurs nucléaires LXR et incidemment l’efflux de cholestérol athéroprotecteur, tandis que la phagocytose de cholestérol cristallisé dans la lésion causera une perturbation du trafic vésiculaire qui activera l’inflammasome NLRP3, verrou de l’inflammation IL-1. Cette étude a pour but de décrypter ces voies dans le macrophage humain. La stimulation de l’efflux de cholestérol par un agoniste LXR dans le macrophage humain m’a est médiée par l’activation transcriptionnelle LXRα-dépendante d’ARL7 - qui permet le transport du cholestérol libre de la membrane des endosomes et lysosomes aux radeaux lipidiques – et du transporteur ABCA1 – l’exportant vers les HDL, lipoprotéines athéroprotectrices. L’activation du complexe multi-protéique NLRP3 dans le macrophage, et la sécrétion des cytokines délétères IL-1β et IL-18, est également réprimée par l’agoniste LXR. L’activation des cathepsines B et L par l’enzyme AEP est aussi nécessaire pour l’activation de NLRP3 par des cristaux. Inactiver l’AEP protège ainsi contre le développement de l’athérosclérose. Ces travaux ont démontré la nécessité des études chez l’humain pour la mise en évidence des mécanismes moléculaires et la nécessité d’intégrer les signalisations lipidiques et inflammatoires étroitement liées dans la cellule spumeuse. / Foam cell accumulation in arterial walls is the critical initiating event of atheroma plaque development. Macrophages acquire this phenotype by cholesterol ester accumulation and pro-inflammatory signaling pathways activation. Oxydized form of cholesterol activates LXR and subsequently atheroprotective cellular cholesterol efflux. In parallel, crystallized cholesterol phagocytosis will impair vesicular traffic, activating NLRP3 and deleterious IL-1 cytokines release. Here we describe further those pathways in human macrophages and to evidence new key factors in atherosclerosis development. First, stimulation of cellular cholesterol efflux to ApoA-I and HDL from human macrophage by LXR agonist is LXRα-dependent. Transcriptional activation of ARL7 increases cholesterol transport from endolysosomal membrane to efflux-prone plasmic membrane pools, lipid rafts. From there, cholesterol will be exported on ApoA-I containing lipoproteins by ABCA1 transporter, whose expression is stimulated by LXRα agonists as well. Cholesterol crystals phagocytose will lead to inflammasome NLRP3 activation, leading to pro-atherogenous IL-1β and IL-18 secretion. We first showed LXR agonist GW3965 role in repressing transcription of NLRP3 partners. Also, we evidenced the importance of cathepsin B and L maturation by asparagin endopeptidase (AEP) in human macrophages, and atheroprotective properties of AEP silencing. Overall, this work demonstrated the necessity of using human models to confirm murine data about molecular mechanisms. Also, it is important to integrate lipid homeostasis and inflammation signaling in foam cells, for there is a strong molecular link between both.

L'Héparane Sulfate (HS), un polysaccharide linéaire, module les activités biologiques de nombreuses protéines. Afin d'élucider les interactions entre l'HS et les protéines, la synthèse chimique d'HS est un outil précieux, mais elle peut être difficile. Notre équipe a montré que des mélanges combinatoires obtenus par auto-assemblage de différentes combinaisons de dérivés disaccharidiques (lactose et lactose persulfaté) sur surfaces planes d'or peuvent reconnaître spécifiquement certaines protéines se liant à l'HS, telles que les isoformes de la chimiokine CXCL12 ou IFNγ. Avec ces dérivés, nous avons réalisé un auto-assemblage sur des nanoparticules d'or. Mais à cause de la toxicité des nanoparticules d'or, nous avons aussi adapté cette méthode à des nanoparticules lipidiques. En utilisant les conditions qui ont déjà été améliorées pendant la synthèse des dérivés lactose et lactose persulfaté, nous avons préparé deux autres dérivés disaccharidiques plus proches de la structure réelle d'HS. Ces nouveaux dérivés sont utilisés pour réaliser des nanoparticules d'or et nanoparticules lipidiques afin de comparer les propriétés avec les lactose et lactose persulfaté. Les tests d'affinité avec différentes protéines sont en cours de réalisation. / Héparan Sulfate (HS) is a linear polysaccharide that modulates the biological activities of numerous proteins. In order to elucidate the interaction between HS and proteins, the synthesis of HS is an invaluable tool, but the synthesis is sometimes difficult. Our group has demonstrated that the combinatorial mixtures obtained by self-assembly of different combinations of disaccharide derivatives (lactose and persulfated lactose) on gold plan surfaces could recognize specifically some HS binding proteins, such as the isoforms of the chemokine CXCL12 or IFNγ. Because of the toxicity of gold nanoparticles, we have also adapted this method to lipid nanoparticles. Using the conditions that have already improved during the synthesis of lactose and persulfated lactose derivatives, we have synthesized two other disaccharide derivatives, which were closer to the real structure of HS. These new derivatives were used to prepare the gold and lipid nanoparticles at the aim of comparing the properties with lactose and persulfated lactose. The tests of affinities with different proteins are in progress.

La composition du lait en acides gras (AG) chez la vache laitière est la résultante du métabolisme lipidique au niveau du rumen et au niveau de la glande mammaire. Dans le cadre du renouvellement des systèmes d’unités d’alimentation INRA, l’objectif de ce travail est de prédire par une approche quantitative utilisant la méta-analyse de bases de données, les flux duodénaux d’AG chez les ruminants, le transfert des AG de l’intestin à la glande mammaire, et les flux d’AG sécrétés dans le lait.Des équations de prédiction des flux duodénaux et absorbés des AG saturés, des AG impairs et ramifiés, et d’un grand nombre d’isomères des AG insaturés ont été obtenues en intégrant les effets de facteurs expérimentaux tels que la nature du fourrage, le pourcentage de concentré, la supplémentation en huiles, graines végétales, et en produits marins, et leurs interactions. Ces équations sont fonction des AG ingérés et des facteurs interférents (mode de conservation et familles botaniques des fourrages, composition du régime alimentaire, caractéristiques des animaux).Pour le transfert des AG du duodénum à la glande mammaire, les équations privilégient comme prédicteur leur flux duodénal respectif, mais utilisent aussi des paramètres digestifs ruminaux (pH, acétate, butyrate) ou des caractéristiques des rations pour les AG impairs et ramifiés, ou les AG synthétisés de novo (C4:0 à C14:0).La validation de ces modèles a été faite à partir d’une base de données externe qui a permis de coupler les deux modèles et d’évaluer leur précision. Finalement, nous proposons des équations de prédiction des AG spécifiques ainsi que des groupes d’AG présentant un intérêt nutritionnel et qui peuvent fournir une approche aux systèmes d'unités d'alimentation pour prédire leurs réponses à différents types de rations. / Milk fatty acids (FA) composition in dairy cows results from lipid metabolism in rumen and mammary gland. In the context of renewing the INRA feed unit system, the objective of this work is to predict, by a quantitative approach using metaanalysis, duodenal flows of FA in ruminants, FA transfer from the intestine to the mammary gland, and the secreted FA flows in the milk. Predictive equations for duodenal and absorbed saturated FA, odd and branched FA, and a large number of unsaturated FA isomers were obtained by integrating the effects of experimental factors such as the nature of the forage, the concentrate percentage, supplementation with oleaginous oils and seeds, and marine products, and their interactions.These equations are function of ingested FA and their interfering factors (forage conservation mode and botanical family, diet composition, animal factors).For the transfer of FA from duodenum to the mammary gland, the equations favor the prediction of their respective duodenal flows, but they also use ruminal digestive parameters (pH, acetate, butyrate) or dietary characteristics for odd and branched FA, or de novo synthesized FA (C4 :0 to C14 :0).Models validation was done with an external database, which allowed coupling the two models and evaluate their accuracy. Finally, we propose predictive equations for specific FA as well as FA groups of nutritional interest that can provide an approach to the INRA feed unit system to predict their milk yield responses according to different types of rations.

Les peptides et protéines extracteurs de lipides (PEL) se lient aux membranes lipidiques puis en extraient des lipides en formant de plus petits auto-assemblages, un phénomène qui peut aller jusqu'à la fragmentation des membranes. Dans la nature, cette extraction se produit sur une gamme de cellules et entraîne des conséquences variées, comme la modification de la composition de la membrane et la mort de la cellule. Cette thèse se penche sur l’extraction lipidique, ou fragmentation, induite par le peptide mélittine et la protéine Binder-of-SPerm 1 (BSP1) sur des membranes lipidiques modèles. Pour ce faire, des liposomes de différentes compositions sont préparés et incubés avec la mélittine ou la BSP1. L'association aux membranes est déterminée par la fluorescence intrinsèque des PEL, tandis que l'extraction est caractérisée par une plateforme analytique combinant des tests colorimétriques et des analyses en chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse (LCMS). La mélittine fait partie des peptides antimicrobiens cationiques, un groupe de PEL très répandu chez les organismes vivants. Ces peptides sont intéressants du point du vue médical étant donné leur mode d’action qui vise directement les lipides des membranes. Plusieurs de ceux-ci agissent sur les membranes des bactéries selon le mécanisme dit « en tapis », par lequel ils s’adsorbent à leur surface, forment des pores et ultimement causent leur fragmentation. Dans cette thèse, la mélittine est utilisée comme peptide modèle afin d’étudier le mécanisme par lequel les peptides antimicrobiens cationiques fragmentent les membranes. Les résultats montrent que la fragmentation des membranes de phosphatidylcholines (PC) est réduite par une déméthylation graduelle de leur groupement ammonium. L'analyse du matériel fragmenté révèle que les PC sont préférentiellement extraites des membranes, dû à un enrichissement local en PC autour de la mélittine à l'intérieur de la membrane. De plus, un analogue de la mélittine, dont la majorité des résidus cationiques sont neutralisés, est utilisé pour évaluer le rôle du caractère cationique de la mélittine native. La neutralisation augmente l'affinité du peptide pour les membranes neutres et anioniques, réduit la fragmentation des membranes neutres et augmente la fragmentation des membranes anioniques. Malgré les interactions électrostatiques entre le peptide cationique et les lipides anioniques, aucune spécificité lipidique n'est observée dans l'extraction. La BSP1 est la protéine la plus abondante du liquide séminal bovin et constitue un autre exemple de PEL naturel important. Elle se mélange aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et extrait des lipides de leur membrane, notamment le cholestérol et les phosphatidylcholines. Cette étape cruciale modifie la composition lipidique de la membrane du spermatozoïde, ce qui faciliterait par la suite la fécondation de l’ovule. Cependant, le contact prolongé de la protéine avec les spermatozoïdes endommagerait la semence. Cette thèse cherche donc à approfondir notre compréhension de ce délicat phénomène en étudiant le mécanisme moléculaire par lequel la protéine fragmente les membranes lipidiques. Les résultats des présents travaux permettent de proposer un mécanisme d’extraction lipidique en 3 étapes : 1) L'association à l’interface des membranes; 2) La relocalisation de l’interface vers le cœur lipidique; 3) La fragmentation des membranes. La BSP1 se lie directement à deux PC à l'interface; une quantité suffisante de PC dans les membranes est nécessaire pour permettre l'association et la fragmentation. Cette liaison spécifique ne mène généralement pas à une extraction lipidique sélective. L'impact des insaturations des chaînes lipidiques, de la présence de lysophosphatidylcholines, de phosphatidyléthanolamine, de cholestérol et de lipides anioniques est également évalué. Les présentes observations soulignent la complexe relation entre l'affinité d'un PEL pour une membrane et le niveau de fragmentation qu'il induit. L'importance de la relocalisation des PEL de l'interface vers le cœur hydrophobe des membranes pour permettre leur fragmentation est réitérée. Cette fragmentation semble s'accompagner d'une extraction lipidique préférentielle seulement lorsqu'une séparation de phase est induite au niveau de la membrane, nonobstant les interactions spécifiques PEL-lipide. Les prévalences des structures amphiphiles chez certains PEL, ainsi que de la fragmentation en auto-assemblages discoïdaux sont discutées. Finalement, le rôle des interactions électrostatiques entre les peptides antimicrobiens cationiques et les membranes bactériennes anioniques est nuancé : les résidus chargés diminueraient l'association des peptides aux membranes neutres suite à l'augmentation de leur énergie de solvatation. / Lipid-extracting peptides and proteins (LEPs) bind to lipid membranes, extract lipids in the form of smaller auto-assemblies, and ultimately fragment membranes. In nature, this lipid extraction occurs in many different cell systems and causes various consequences, such as a modification of the membrane lipid composition or the cell death. This thesis focuses on the lipid extraction, or fragmentation, induced by the peptide melittin and the protein Binder-of-SPerm 1 (BSP1) on model lipid membranes. To this end, liposomes of different composition are prepared and incubated with melittin or BSP1. The association to membranes is determined by the LEPs intrinsic fluorescence, while the extraction is characterized by a combination of colorimetric phosphorus assays and liquid chromatography-mass spectrometry analyses (LCMS). Melittin is a cationic antimicrobial peptide, a very common category of LEP found in living organisms. Cationic antimicrobial peptides are interesting to medicine because they directly target membrane lipids. The action of many of these peptides is described by the carpet-like mechanism, by which they adsorb to membrane surface, induce the formation of pores and then cause the fragmentation of the membranes. In this thesis, melittin is used as a model peptide in order to study the mechanism by which cationic antimicrobial peptides fragment lipid membranes. Results show that the phosphocholine (PC) membrane fragmentation is reduced by a gradual demethylation of the ammonium group. Analysis of the fragmented material reveals that PC are preferentially extracted from membranes, due to a local enrichment in PC near melittin in the membrane. Furthermore, a melittin analogue, for which a majority of its cationic residues were neutralized, is used to investigate the role of the cationic character of native melittin. The neutralization increases the peptide affinity for neutral and anionic membranes, reduces fragmentation of neutral membranes and increases fragmentation of anionic membranes. Despite electrostatic interactions between the cationic peptide and the anionic lipids, no lipid specificity is observed in the extraction. BSP1 is the most abundant protein of the bovine seminal plasma and constitutes another example of important LEP found in nature. Upon ejaculation, it mixes with spermatozoa and extracts membrane lipids, such as cholesterol and phosphatidylcholines. This crucial process modulates the lipid composition of sperm membranes, which would then facilitate egg fertilization. However, a prolonged contact between the protein and spermatozoa could damage the semen. This thesis is looking to deepen our understanding of this delicate phenomenon by studying the molecular mechanism by which this protein fragments lipid membranes. Results of the present work suggest a 3-step mechanism for the extraction: 1) Association to membrane interface; 2) Relocation towards the lipid core; 3) Fragmentation of membranes. BSP1 binds directly to two interfacial PC; a sufficient quantity of PC in membranes is necessary for protein association and fragmentation. This specific binding generally does not lead to specificity in the lipid extraction. The impact of unsaturation of the lipid chains, of the presence of lysophosphatidylcholines, of phosphatidylethanolamines, of cholesterol and of anionic lipids is also studied. The present observations underline the complex relationship between a LEP affinity for membranes and the level of fragmentation it induces. The importance of LEP relocation, from the interface to the hydrophobic core of the membranes, for fragmentation is reiterated. This fragmentation seems to be lipid specific only when a phase separation of the lipids occurs in the membrane, notwithstanding specific LEP-lipid interactions. The prevalence of amphipathic structures in certain LEPs, as well as of the auto-assembled discoidal structures resulting from fragmentation is discussed. Finally, the role of electrostatic interactions between cationic antimicrobial peptides and anionic bacterial membranes is detailed: charged residues lower peptide association to neutral membrane due to an increase of their free energy of solvation.

Les protéines membranaires intégrales jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité cellulaire (transports d’ions et de nutriments, transduction de signal, interaction cellule-cellule). Afin de les étudier, ces protéines doivent être produites in vitro. La production classique de ces protéines membranaires intégrales dans des microorganismes présente de nombreuses difficultés liées à leur structure complexe mais aussi à des problèmes de toxicité, empêchant la production de nombre d’entre elles. En outre, pour être produites efficacement, ces protéines ont besoin d’un environnement amphiphile. Dans cette thèse, afin de pallier à ces difficultés, nous avons d’une part utilisé un système d’expression protéique acellulaire, non affecté par la physiologie des cellules vivantes. En outre, nous avons choisi de les intégrer dans des bicouches lipidiques planes reconstituées artificiellement. Dans une première partie, nous avons mis au point l’intégration d’une protéine membranaire intégrale formant un pore, l’alpha hémolysine, dans une bicouche lipidique supportée. Certaines protéines nécessitant un espace plus important de part etd’autre de la membrane, nous avons, dans une seconde partie, développé une bicouche lipidique espacée et ancrée par fusion de liposomes sur des surfaces d’or. Nous démontrons qu’il est possible d’y incorporer des protéines membranaires de type Aquaporine Z sous certaines conditions. Dans une troisième partie, dédiée à la formation de membranes biomimétiques utilisant des molécules lipidiques provenant d’Escherichia coli, nous montrons que la modification de la composition membranaire ne semble pas avoir d’incidence sur l’incorporation de protéines. Enfin, dans une dernière partie, nous avons réalisé des premiers essais d’insertion de protéines membranaires, de type alpha hémolysine, dans des bicouches suspendues afin de montrer que ces protéines produites par le système d’expression acellulaire sont fonctionnelles. / Integral membrane proteins play an essential role in the cell integrity preservation (transport of nutrients and ions, signal transduction, cell-cell interaction). In order to study these proteins, they have to be produced in vitro. Classical production of integral membrane proteins in microorganisms present many difficulties associated with their complex structure and also toxicity problems, preventing production of many of them. Moreover, to be efficiently produced, these proteins require an amphiphilic environment. In order to overcome these difficulties, we used a cell-free protein expression system, unaffected by the physiology ofliving cells. In addition, we chose to integrate them into artificial planar lipid bilayers. In a first part, we have developed the integration of an integral membrane protein forming a pore, the alpha hemolysin, in a supported lipid bilayer. Some proteins require more space on each side of the membrane, therefore in a second part, we have developed a tethered lipid bilayer membrane by liposome fusion on gold surfaces. We demonstrate that it is possible to incorporate membrane protein Aquaporin Z under certain conditions. The third part is dedicated to the formation of biomimetic membranes using lipid molecules from Escherichiacoli, we show that the membrane composition do not affect the protein incorporation. Finally, we have tested alpha hemolysin membrane proteins insertion in suspended lipid bilayers membranes to show that these proteins produced by the cell-free expression system are functional.

Les canaux ioniques sont des protéines membranaires permettant le transport ionique au travers des membranes biologiques. Du fait de leur omniprésence dans l'organisme, ils représentent une classe de cibles thérapeutiques encore actuellement peu exploitée du fait de limitations expérimentales dans leur étude. La mesure électrique de l'activité des canaux ioniques au sein de bicouches biomimétiques reconstituées in vitro permettrait de répondre à ces limitations. Cependant, il n'existe actuellement pas de système satisfaisant au cahier des charges complet pour de telles analyses : stabilité et pureté de la bicouche, faible niveau de bruit, insertion rapide des canaux ioniques, intégration dans un dispositif fluidique, possibilité de mener une caractérisation optique simultanée. L'objectif de ces travaux de thèse était d'évaluer dans quelle mesure l'utilisation d'un substrat SOI (Silicon On Insulator) comprenant des nanopores pourrait permettre de répondre à tous ces critères. Des nanopores de diamètre compris entre 10 nm et 160 nm ont été réalisés à partir d'un substrat SOI. Une cellule fluidique transparente est utilisée pour l'adressage fluidique. Cette cellule permet d'autre part la double caractérisation électrique et optique. Les propriétés électriques en milieu liquide du dispositif ont été étudiées et permettent de dégager des perspectives d'amélioration. La double caractérisation électrique et optique est démontrée au moyen d'expériences de capture de nanoparticules fluorescentes sur les nanopores. Enfin, des premiers résultats prometteurs d'obtention d'une bicouche lipidique suspendue sont présentés. / Ion channels are membrane proteins responsible for ion transport across biological membranes. Due to their ubiquity, they are promising drug targets but are not yet fully exploited as such due to experimental restrictions in their study. Electrical measurement of ion channels activity within in vitro artificial lipid bilayers would enable to overcome these restrictions. However, there is not yet a system satisfying all the requirements for ion channels studies: stability and purity of the lipid bilayer, low noise level, fast insertion of ion channels, fluidic integration, ability to perform simultaneous optical characterization. The aim of this phD was to assess in which extent the use of an SOI (Silicon On Insulator) substrate bearing nanopores could satisfy all these requirements. 10 nm to 160 nm diameter nanopores were fabricated in an SOI substrate and characterized. A transparent fluidic cell was used for fluidic addressing. This transparent cell allows combined electrical and optical characterization. Electrical properties of the device in aqueous environment were studied, allowing to bring out improvement prospects. The combined electrical and optical characterization was demonstrated with fluorescent nanoparticle trapping experiments on the nanopores. Finally, promising results about the formation of a free-standing lipid bilayer are presented.

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) représente actuellement la principale cause de cécité dans les pays industrialisés. Les traitements disponibles ne concernent qu’une partie des cas (DMLA néovasculaire) et n’évitent pas toujours le développement de déficiences visuelles sévères. L’identification de facteurs modifiables, tels que la nutrition, pourrait représenter des moyens de prévention permettant de diminuer la fréquence de cette maladie handicapante dans nos populations. L’objectif de la thèse était d’étudier d’un point de vue épidémiologique, la relation entre nutrition et DMLA chez les 963 sujets de l’étude Aliénor (Antioxydants Lipides Essentiels Nutrition et maladies OculaiRes), âgés de 73 ans et plus, avec un intérêt particulier pour les lipides. La relation entre les lipides et la DMLA repose principalement sur la potentielle implication du métabolisme lipidique dans la physiopathologie de la DMLA, ainsi que sur le triple rôle structurel, fonctionnel et protecteur des acides gras polyinsaturés (AGPI) n-3 au sein de la rétine. Dans un premier temps, nous avons mis en évidence une diminution du risque de DMLA chez les sujets ayant des apports alimentaires élevés en AGPI n-3. L’estimation des apports alimentaires étant sujette à de nombreuses imperfections (déclaration des sujets, biais de mémorisation, imprécisions des tables de composition alimentaire…), nous avons ensuite utilisé un biomarqueur du statut en AGPI n-3 afin de s’affranchir de ces limites. Ce travail nous a permis de mettre en évidence une diminution du risque de DMLA prévalente et incidente chez les sujets ayant des niveaux plasmatiques élevés d’AGPI n-3. Enfin, nous avons étudié les relations de certains gènes impliqués dans le métabolisme lipidique avec DMLA, les niveaux de lipides sanguins et de xanthophylles. Il ressort que les sujets TT pour le polymorphisme du gène LIPC (rs493258) présentaient un risque diminué de DMLA ainsi que des niveaux plasmatiques de zéaxanthine plus élevés. Ces travaux viennent compléter et enrichir la littérature à ce sujet et apportent des arguments nouveaux quant au rôle des AGPI n-3 dans la rétine ; ils pourront également servir de support en matière de recommandations nutritionnelles et de prévention de la DMLA. Nos travaux sur l’implication des gènes du métabolisme des lipides soulèvent de nouvelles questions quant aux mécanismes impliqués dans cette pathologie et pourraient suggérer de nouvelles pistes de recherche thérapeutiques et préventives. / Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in industrialized countries. Current treatments are limited to the neovascular form of the disease only and do not always prevent the development of severe visual impairment. The identification of modifiable risk factors, such as nutrition, may lead to preventive strategies, which may have the potential to reduce the impact and burden of AMD on the global aging population. The objective of the thesis was to study the association between nutrition and AMD in the 963 subjects, aged 73 years or older, from the Alienor Study, with a particular emphasis on lipids. The relationship between lipids and AMD is primarily based on the potential involvement of lipid metabolism in the pathogenesis of AMD and on the structural, functional and protective roles of omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) in the retina. First, we showed that high intakes of omega 3 PUFAs were associated with a decreased risk for AMD. Estimation of dietary intakes being affected by many imperfections (bias in reporting, memory bias, inaccuracies from food composition tables...); we used an omega 3 PUFAs biomarker in order to overcome these limitations. This second work showed that high plasma levels of omega 3 PUFAs were associated with a decreased risk for prevalent and incident AMD. Finally, we studied the associations of genes involved in lipid metabolism with AMD, plasma lipids and xanthophylls. It appears that subjects bearing TT genotype for LIPC gene had a decreased risk of AMD and higher plasma levels of zeaxanthin. These results provide new arguments about the role of omega-3 PUFAs in the retina. They can also provide support and recommendations for prevention of AMD. This work on genes involved in lipid metabolism suggest new questions about mechanisms involved in AMD and may suggest new way of research in treatment and prevention.

Après le génome, le nouveau défi est celui du protéome. Nous avons progressé vers la mise au point de la séparation électrophorétique des protéines membranaires dans un milieu qui leur conviendrait, type bicouche lipidique supportée. La grandeur principale, mesurée par FRAPP, a été le coefficient de diffusion de lipides ainsi que des protéines. L'étude du comportement de la bicouche supportée a permis de mettre en évidence, pour certains supports et dans certaines conditions de température, la formation d'une phase ondulée (ou ripple) malgré la proximité du support. La diminution de la portée des interactions coulombiennes par adjonction de sel se traduit par une augmentation de plusieurs ordres de grandeur du coefficient de diffusion, approchant au final le comportement d'une bicouche libre, tout en conservant les étapes caractéristiques de la transition gel/fluide. L'ordre de grandeur de ces énergies d'interactions a été estimé à partir des courbes D= f(T) et validé par une étude préliminaire originale de DSC sur des bicouches lipidiques supportées. L'α-Hémolysine s'insère spontanément sous forme d'un pore heptamérique dans nos bicouches supportées et diffuse librement. En l'incubant en phase mixte (zones gel+ zones fluide), nous observons la formation de complexes de protéines. La dépendance du coefficient de diffusion avec la taille de l'objet est en 1/R2, R étant le rayon équivalent de la partie insérée de l'objet. L'application d'un champ électrique montre un transport électrophorétique dont la direction et l'importance sont modulées par la charge de l'objet. La mobilité électrophorétique varie également en 1/R2. / After the genome, the new challenge is the proteome. We have progressed toward electrophoretic separation of membrane proteins in a medium that they love, a supported lipid bilayer. The main parameter, measured by FRAPP, was the diffusion coefficient of different objects (lipids, proteins). Studying bilayer behaviour has showed that, on particular supports and in a given temperature range, ripple phase can exist, despite the proximity of the support. Adding salt decreases coulombic interactions which turns to increase the diffusion coefficient over several orders of magnitude, reaching the value for a free-standing bilayer in the fluid phase, meanwhile the main characteristic steps of the global gel/fluid transition are still observed. Estimation of the value of the interaction energy has been made and compared to results of a preliminary DSC study. α-Hémolysin self-inserts spontaneously as an heptameric pore in supported bilayers and diffuses freely. Incubating in a gel/fluid mixture leads to protein complex formation. Diffusion varies with size as 1/R2, R being the equivalent radius of the inserted part of the object. Applying an electric field results in an electrophoretic motion where direction and magnitude are modulated by the charge of the object. Electrophoretic mobility varies also as 1/R2. Size dependence, magnitude of mobilities and a simple building protocol allow to hope carrying out soon a real electrophoretic separation of a protein mixture.

Dans les conditions naturelles, les plantes sont soumises à des conditions environnementales très variées qui peuvent conduire à un excès d'énergie dans les chloroplastes, résultant en une production d'espèces réactives de l'oxygène (ERA). Pour faire face à ces ERA, les plantes ont développé différents mécanismes de protection, comme des alkénal réductases, des peroxyrédoxines et des lipocalines. Le travail présenté dans cette thèse a pour but de caractériser et de déterminer leur importance dans la protection des contre les stress oxydants. Une analyse préliminaire de mutants d'Arabidopsis a mis en évidence le rôle important des peroxyrédoxines à 2 cystéines et des lipocalines dans la tolérance au stress photooxydant. Cette thèse s'est surtout concentrée sur les lipocalines. Deux lipocalines ont été récemment identifiées chez les plantes, TIL (lipocaline thermoinduite) et CHL (chloroplastique), toutes les deux induites par des conditions de stress. Chez Arabidopsis, chaque lipocaline semble être spécialisée dans la réponse à des conditions différentes: chaleur (AtTIL) et fortes lumières (AtCHL). Le double mutant AtCHL KO × AtTIL KO est plus sensible à la chaleur et la forte lumière que les simples mutants. La mutation de AtCHL a augmenté fortement la photosensibilité de mutants (vte1, npq1) affectés dans des mécanismes de protection des lipides (tocopherols, zéaxanthine), confirmant ainsi le rôle des lipocalines dans la protection contre la peroxydation lipidique. Les résultats obtenus dans cette thèse montrent que les lipocalines AtTIL and AtCHL ont des fonctions redondantes dans la protection des lipides qui sont essentielles à la résistance des plantes au stress. / Under field conditions, plants are exposed to various environmental conditions that can lead to an excess of energy in the chloroplasts, resulting in the production of toxic reactive oxygen species (ROS). To cope with the harmful effects of ROS, plants have developed various protection mechanisms, such as alkenal-reductases, peroxiredoxins and lipocalins. The work performed in this thesis aimed at understanding their importance in the protection against lipid peroxidation. A first screening of Arabidopsis mutants lacking one of those mechanisms brought into light that 2-Cys PRX and lipocalins are important for the tolerance against photooxidative stress. This thesis is focused mainly on lipocalins, a group of proteins recognized as carriers of small lipophilic molecules. However, two true lipocalins have been recently identified in plants, the temperature-induced lipocalin (TIL) and the chloroplastic lipocalin (CHL), their expression beeing induced by various abiotic stresses. Each lipocalin appeared to be specialized in the responses to specific stress conditions in Arabidopsis, with AtTIL and AtCHL playing a protective role against heat and high light, respectively. The double mutant AtCHL KO × AtTIL KO deficient in both lipocalins was more sensitive to temperature, drought and light stresses than the single mutants. Seeds of the AtCHL KO × AtTIL KO double mutant were very sensitive to natural and artificial aging, and again this phenomenon was associated with the oxidation of polyunsaturated lipids. The results obtained in this thesis show that AtTIL and AtCHL have overlapping functions in lipid protection which are essential for stress resistance and survival.