Conçues à partir d’une approche rationnelle, nous avons créé de nouvelles sondes membranaires permettant l’imagerie de l’organisation de la membrane plasmique cellulaire. Dans ce travail, nous avons d’abord développé un groupe d’outils, à partir du fluorophore solvatochrome Nile Red et de Black Hole Quencher-2, capable de marquer spécifiquement les domaines ordonnés et désordonnés (radeaux) en les identifiant par leur couleur d’émission. Les études cellulaires, à l’aide de ces sondes, suggèrent que la membrane plasmique est composée de deux phases distinctes. Puis dans le but de créer de nouvelles sondes basées sur Nile Red compatibles avec le sérum et fixables par formaldéhyde/glutaraldéhyde, nous avons modifié la sonde, préalablement développée, NR12S avec un groupement PEG ou amino, respectivement. Etonnamment, la sonde PEGylée est rapidement internalisée dans la cellule et le dérivé animo agrège avec l’agent fixant. D’un autre côté,basée sur Nile Red, nous avons conçu une sonde capable de détecter un récepteur donné et de visualiser son environnement lipidique. Initialement, nous avons obtenu des sondes capables d’allumer leur fluorescence en se liant sur le RCPG à l’ocytocine. Puis, nous avons conjugué NR12Spar l’intermédiaire d’un espaceur PEG(12) au ligand de l’intégrine, RGD. Les résultats préliminaires montrent que la molécule peut se lier à la membrane et détecter l’ordre lipidique, cependant les études cellulaires nécessitent un achèvement. Nous avons aussi travaillé sur des sondes membranaires fluorogéniques (turn-on) pour de l’imagerie multi-couleurs. Basées sur le fluorophore3-méthoxychromone, nous avons obtenu des sondes plus brillantes et plus photostables que la sonde développée originellement à partir de 3-hydroxychromone (F2N12S). Grâce à l’important déplacement de Stokes, elles permettent une imagerie de la membrane cellulaire avec une autofluorescence minimale dans la région spectrale bleue, compatible avec les marqueurs communs verts et rouges. Pour finir, basées sur le fluorophore squaraine, nous avons développé trois nouvelles sondes opérant dans la région rouge lointain, qui est particulièrement intéressante pour l’imagerie in vitro et in vivo. Ces sondes montrent une orientation parallèle avec la membrane lipidique, alors que les expériences cellulaires indiquent que seule la sonde avec deux ancres lipidiques est capable de marquer de façon stable la membrane plasmique. Ces sondes développées ici sont prévues pour être utilisées dans la recherche des radeaux lipidiques aussi bien que pour l’imagerie super-résolution et multi-couleurs de cellules vivantes. / Based on rational molecular design, we design new membrane probes that enable fluorescence imaging of cell plasma membrane organization. In this work, we first synthesized a toolkit, based on solvatochromic Nile Red dye and Black Hole Quencher-2, that can stain specifically ordered and disordered lipid domains (rafts) and identify them by the emission color. Cellular studies with these probes suggested that the plasma membrane is composed of two distinct phases. Then,with the idea to make Nile Red-based probes compatible with serum medium and fixable by formaldehyde/glutaraldehyde, we modified previously developed probe NR12S with PEG and aminogroups, respectively. Surprisingly, the PEGylated probe is quickly internalized inside the cell and the amino-derivative aggregates with the fixing agent. On the other hand, based on Nile Red we designed probes capable to detect a given receptor and visualize its lipid environment. Initially, we obtained probes that can turn-on fluorescence on binding to the oxytocin GPCR receptor. Then, we conjugated NR12S through a PEG(12) spacer to the ligand of intergrin, RGD. The first data show that the molecule can bind to the membrane and detect the lipid order, though cellular studies have to be completed. We also worked on fluorogenic (turn-on) membrane probes for multi-color imaging. Based on blue 3-methoxychromone dyes, we obtained probes that are brighter and more photostable than the originally developed probe based on 3-hydroxychromone (F2N12S). Due to large Stocks shift, they enabled cell membrane imaging with minimal auto-fluorescence in the blue spectral region, compatible with common green and red probes. At the end, based on squaraine fluorophore, we developed three new probes operating in the far red region, which is also very interesting for in vitro and in vivo imaging. These dyes show a parallel orientation with the lipid membrane, while the cellular experiments point out that only the probe with two anchor groups is able to stain stably the plasma membrane. The probes developed here are expected to be used for lipid rafts research as well as for super-resolution and multi-color imaging of living cells.

Contrairement à leurs homologues animales, les cellules végétales sont entourées d’une fine enveloppe de polysaccharides appelée paroi primaire, dont la principale structure portante est un réseau de microfibrilles de cellulose reliées entre elles par des hémicelluloses. L’objectif de ce travail est de mettre au point des capsules biomimétiques de la paroi végétale qui puissent servir de système modèle dans l’étude des propriétés mécaniques de ce matériau naturel. Pour ce faire, des vésicules géantes unilamellaires d’un diamètre moyen de 20 µm ont été utilisées comme support de dépôts couche-par-couche de nanocristaux de cellulose (les sous-éléments des microfibrilles) et de xyloglucane (l’hémicellulose la plus répandue) jusqu’à une dizaine de bicouches, les capsules ainsi obtenues ayant été caractérisées par microscopie confocale. Leur comportement en déformation en réponse à une pression osmotique a pu être observé : leur dégonflement a donné lieu à l’apparition de diverses morphologies dont certaines sont similaires aux formes de coques minces de matériau isotrope dégonflées, tandis que leur comportement en gonflement est comparable à la réponse d’un matériau viscoélastique. Enfin, des expériences de nano-indentation par microscopie à force atomique ont été effectuées pour mesurer la rigidité de la paroi des capsules. Leur module d’Young a pu être déduit des courbes de force-déformation et s’avère être compris entre 6 et 18 MPa, ce qui est du même ordre de grandeur que les valeurs obtenues par des mesures similaires effectuées sur des parois végétales naturelles. / Unlike their animal counterparts, plant cells are surrounded by a thin polysaccharide-rich envelop called the primary wall, in which the main load-bearing structure is a network of cellulose microfibrils tethered by hemicellulose. This work aims at designing plant cell wall mimicking capsules that could be used as a model system in the mechanical characterization of this natural material. To do so, we used giant unilamellar vesicles with an average diameter of 20 µm as a template for the layer-by-layer deposition of cellulose nanocrystals (the microfibrils sub-elements) and xyloglucan (the most common hemicellulose) up to ten bilayers, the resulting capsules being characterized by confocal microscopy. Their deformation behaviour under osmotic stress could be observed : deflation of the capsules led to various morphologies, some of them similar to what is observed for thin deflated shells of isotropic material, while their response to swelling resembled that of a viscoelastic material. Nano-indentation experiments were eventually performed using an atomic force microscope to probe the stiffness of the capsules wall. Their Young’s modulus could be deduced from the force-depth curves and found to be in the 6-18 MPa range, which is in the same order of magnitude of values obtained with similar measurements done on natural plant cell walls.

Le projet concerne des molécules hétérocycliques, de faible poids moléculaire, présentant des activités cytotoxiques comparables à celles des meilleurs anticancéreux actuellement sur le marché. Ces molécules sont originales, protégées par un brevet international et un brevet de sélection déposé en décembre 2014. La synthèse des premières molécules leaders est maîtrisée et l’exemplification de la diversité moléculaire est en cours. Les études menées pour définir leur profil d’activité permettent d’identifier des caractéristiques tout à fait originales. Le projet, en phase de développement préclinique académique, a permis l’identification de composés leaders présentant des potentiels de développement en tant qu’anticancéreux. Le mécanisme exact des molécules développées est encore en cours d’étude et permettra de définir s’il s’agit d’un mode d’action unique ou multiple. Plusieurs têtes de séries ont pu être identifiées avec visiblement des modes d’actions différents. En effet, les composés EAPB0203 et EAPB0503 montrent un effet dose à partir de 1 µM sur la polymérisation de la tubuline mais la molécule EAPB02303, la plus active sur la lignée A375 (CI50 = 10 nM, de dix fois à cent fois plus active que les deux précédentes), ne montre aucune fixation à la tubuline à la dose de 1µM suggérant un mécanisme d’action différent et original. Le sujet de recherche présenté concerne le développement des études précliniques de ces molécules à visée anticancéreuse. Le premier axe de travail a été de mettre au point une formulation galénique de l'EAPB0503 sous forme de nanocapsules lipidiques. Afin d’optimiser la biodisponibilité des composés, sans perdre leur activité intrinsèque, nous avons ensuite réalisé une modulation chimique sur la structure la plus active des Imiqualines : l’EAPB02303. Afin d’améliorer la balance globale hydrophilie/lipophilie (HLB) des composés dérivés de l’EAPB02303, nous avons greffé un résidu acide aminé en position 4. Enfin, la mise au point d’une méthode de dosage de l’EAPB02303 et l’EAPB02302 en milieu plasmatique en vue d’une étude pharmacocinétique a été le dernier axe du travail de thèse. / The project relates to heterocyclic molecules, low molecular weight, having cytotoxic activities similar to those presented by the best anticancer agents currently on the market. These molecules are originals, protected by an international patent and a selection patent filed in December 2014. The synthesis of the first molecules leader is under control and the exemplification of molecular diversity is underway. Studies to define their activity profile allow to identify quite original features. The project, in its academic preclinical development phase, enabled the identification of leader’s compounds with potential for development as anticancer. The exact mechanism of the molecules developed is still under study and will determine whether there is a single or multiple mode of action. Several series leads were identified with apparently different modes of action. Indeed, compounds EAPB0203 and EAPB0503 show a dose effect from 1 µM on tubulin polymerization but compound EAPB02303, the more active on A375 cell line (IC50 = 10 nM, ten times to hundred times more active than the preceding two), shows no binding to tubulin at a dose of 1 µM suggesting a different and original mechanism of action. The research topic presented concerns the preclinical development of these anticancer molecules. The first line of work was to develop a galenic formulation of EAPB0503 in the form of lipid nanocapsules. To optimize the bioavailability of the compounds, without losing their intrinsic activity, we achieved chemical modulation on the most active structure Imiqualines: EAPB02303. To improve the overall balance hydrophilic / lipophilic (HLB) of compounds derived from EAPB02303, we considered grafting amino acids on position 4. Finally, the development of a method for assaying EAPB02303 and EAPB02302 in plasma for a pharmacokinetic study has been the final focus of the thesis work.

Les vaccins représentent l’un des progrès majeurs de l’Histoire pour la santé publique, concrétisant notamment l’éradication de la variole en 1980. Les vaccins historiques, à base de pathogènes entiers atténués ou inactivés et donc très immunogènes ont été progressivement remplacés par des vaccins à sous-unités, beaucoup plus sûrs mais en contrepartie moins immunogènes. Des adjuvants tels que des vecteurs et des molécules immunostimulantes ont donc été incorporés dans les formulations vaccinales dans le but de générer des réponses immunitaires de grande amplitude. Cependant, les principaux adjuvants actuellement autorisés chez l’homme induisent exclusivement une réponse immunitaire humorale, à savoir la production d’anticorps permettant de neutraliser les pathogènes extracellulaires. Or, certains pathogènes comme le VIH requièrent une immunité cellulaire, indispensable à l’élimination du virus persistant dans les cellules infectées. Dans ce contexte, les adjuvants de vaccin sont en plein essor dans le but d’identifier de nouveaux candidats plus performants et sûrs. Nous décrivons ici la démarche suivie afin de proposer un vecteur lipidique nanoparticulaire (LNP), dont la stabilité, l’innocuité et la versatilité en font un outil idéal pour la délivrance d’antigènes. Nous avons dans un premier temps réalisé la preuve de concept sur la base de l’antigène modèle ovalbumine, dont la délivrance aux cellules immunitaires a permis d’augmenter significativement la réponse humorale in vivo chez la souris. D’autre part, l’induction d’une réponse cellulaire a été observée par la double délivrance de l’antigène et d’un immunostimulant. Plusieurs combinaisons et stratégies de vectorisations ont été évaluées, dans le but d’identifier la formulation la plus performante en vue d’une étude de protection anti-tumorale. Finalement, nous avons appliqué ces technologies au cas concret du VIH avec l’antigène de capside p24, ce qui s’est conclu par une étude d’immunogénicité chez le primate non-humain. L’ensemble de ces résultats met en lumière la versatilité des LNP et leur capacité à induire des réponses immunitaires de grande magnitude, à médiation humorale et cellulaire. / The development of vaccines was one of the major health advances of the last century, with the success of smallpox eradication in 1980. Historical vaccines, based on attenuated or killed pathogens thus strongly immunogenic were finally replaced by subunit candidates, much safer but also poorly immunogenic. Therefore, adjuvants such as vectors and immunostimulants were incorporated in vaccine formulations in order to generate immune responses of high magnitude. However, actual adjuvants authorized in human vaccines only trigger humoral immune responses, with the production of antibodies which neutralize extracellular pathogens. Yet, some pathogens such as HIV require the induction of a cell-mediated immunity, necessary to eliminate viral reservoirs in infected cells. In this context, new adjuvant systems are being developed in order to identify the most efficient and safe candidates. Here we describe the approach followed to prepare a stable, safe and versatile vector consisting in lipid nanoparticles (LNP), for the delivery of antigens. We first report the proof of concept of antigen delivery based on the model ovalbumin, leading to the significant enhancement of humoral responses in vivo in mice. Thereafter, we focused on the induction of cell-mediated immune responses through the vectorization of both antigens and immunostimulants. Several combinations and vectorization strategies were assessed in the aim to identify the best prototype for a study of protection against tumor challenge. Finally, we applied these systems to HIV and its capsid antigen p24, which allowed us to conduct an immunogenicity study on a non-human primate model. Altogether, these results highlight the versatility of LNP and their ability to induce potent humoral and cell-mediated immune responses.

Les plaquettes sont des cellules sanguines anucléées impliquées dans les phénomènes d'hémostase et de thrombose. La majorité des fonctions plaquettaires dépend de leur membrane cellulaire, qui contient de nombreux microdomaines lipidiques ordonnés appelés radeaux lipidiques. Ces microdomaines jouent un rôle central dans toutes les phases de l'hémostase médiées par les plaquettes. Les radeaux lipidiques sont essentiels pour le fonctionnement des récepteurs responsables de l'activation des plaquettes et de la transduction du signal. Le rôle des plaquettes dans la thrombose artérielle est crucial et explique l'intérêt continu de la recherche dans la thérapie antiplaquettaire. Dans ce contexte, nous avons cherché à étudier les radeaux lipidiques comme lieu d'assemblage principal des récepteurs membranaires. Nous avons également cherché à identifier des protéines impliquées dans la fonction des plaquettes, en vue de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous avons utilisé des analyses lipidomiques et protéomiques ainsi que des analyses d'immunoblotting pour identifier les radeaux lipidiques de la membrane des plaquettes et étudier leur organisation dans les plaquettes non stimulées, stimulées et traitées par des antiagrégants plaquettaires. Des détergents, l'ultracentrifugation et les gradients de sucrase ont été utilisés principalement pour le fractionnement de la membrane et l'isolement des radeaux lipidiques. Les principaux résultats de notre travail sont: 1) Élaboration d'une méthodologie pour l'étude des radeaux lipidiques des plaquettes ; 2) Présentation d'un profil global de la composition lipidique et protéique des radeaux lipidiques ; 3) Démonstration de l'impact de l'activation plaquettaire et des antiagrégants plaquettaires sur la réorganisation des radeaux lipidiques ; Et 4) Proposition de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles par protéomique et identification de réseau interactif de protéines autour notamment du facteur XIII (FXIII) et de la phosphoprotéine stimulée par vasodilatateur (V ASP). Nos résultats montrent que les radeaux lipidiques peuvent potentiellement être considérés comme nouvelles cibles thérapeutiques pour la découverte de nouveaux antiagrégants plaquettaires. Les études "Omics" sont importantes pour élargir nos connaissances dans ce domaine / Latelets are blood ce lis at the crossroads of both haemostasis and thrombosis. The majority of platelet functions depend on their membrane, which contains numerous, ordered lipid microdomains named lipid rafts. These microdomains play a pivotai role in all phases of platelet­mediated haemostasis. Lipid rafts are a prerequisite for the functioning of receptors in charge of platelet activation and signal transduction. The role of platelets in thrombotic diseases is crucial, and underpins the continue research interest in antiplatelet therapy. ln this context, we aimed to study the lipid rafts of platelet membranes as the principal assembly place of known receptors, and likely also other, unknown elements that participate in the thrombotic function of platelets, with a view to proposing new therapeutic targets. We used lipidomics and proteomics as well as immunoblot analysis to identify lipid rafts and investigate the organization of lipid rafts in resting, stimulated and antiplatelet-treated platelets. Detergents, ultracentrifugation and sucrose gradients were used mainly for membrane fractionatio and isolation of lipid rafts. The main findings of our work are: 1) Development of a framework or guidelines for platelet lipid raft investigation; 2) Presentation of a global profile of the lipid and protein composition of plate let lipid rafts; 3) Demonstration of the impact of activators and inhibitors on the reorganization of platelet lipid rafts; and 4) Suggestion for potential new therapeutic targets by proteomics analysis through interactive network analyzing of coagulation factor XIII (FXIII) and Vasodilator-Stimulated Phosphoprotein (VASP). Our results show that lipid rafts have potential as new therapeutic targets in pharmacological research in antiplatelets. "Omics" studies are important to expand our knowledge in this field

Les flavonoïdes sont des pigments d’origine naturelle conférant leurs couleurs aux fleurs et aux fruits, identifiés dans plus de quatre milles espèces. Les flavonoïdes sont classés selon leur structure chimique de base formée par deux cycles aromatiques reliés par trois carbones : C6-C3-C6, chaîne souvent fermée en un hétérocycle oxygéné hexa- ou pentagonal. Les flavonoïdes présentent des activités physiologiques qui leurs permettent d’être utilisés comme médicaments notamment pour leur pouvoir à piéger les radicaux libres. Les activités de flavonoïdes ont fait l’objet de nombreux articles de revue. Parmi les flavonoïdes, la quercétine est la molécule la plus distribuée dans la nature qui présente la meilleure activité anti radicalaire et aussi antiinflammatoire comparativement aux autres molécules de la même famille. En général, les flavonoïdes et la quercétine en particulier présentent une solubilité très limitée dans l’eau, cette limitation réduit leur absorption/pénétration et donc leur efficacité. En partant de l’idée que la peau est le l’organe le plus grand du corps humain et aussi l’organe le plus exposé au stress oxydant lié aux radiations UV et aux produits corrosifs et irritants, la quercétine est donc une molécule antioxydante de choix pour être appliquée sur la peau. Le premier objectif de thèse a été de développer plusieurs formulations nanométriques de quercétine afin d'augmenter sa solubilité dans l’eau et améliorer ses propriétés physico chimiques. Le deuxième objectif sera de comparer ces formulations en termes de capacité de chargement de quercétine, de toxicité vis à vis des cellules HaCaT (kératinocytes) THP-1 (monocytes) et Vero (épithéliale), et enfin le maintien de l’activité de la quercétine sur les cellules in vitro, pour mettre in fine en évidence une augmentation de la pénétration cutanée la quercétine in vivo.Dans ce projet, trois approches de formulations nanométriques (smartCrystals®, nanocapsules lipidiques et liposomes) ont été testées pour améliorer la solubilité de la quercétine. Les formulations sont optimisées en termes de procédé de préparation (transposition industrielle) et de composition des excipients pour augmenter la quantité de quercétine formulée. Les formulations ont été caractérisées sur plusieurs paramètres : taille, PDI, taux de chargement en quercétine, état cristallin et cinétique de libération de quercétine in vitro. Ensuite, les formulations ont été comparées entre elles sur les cellules HaCaT et THP-1 avec détermination de leur toxicité et activité protectrice. Enfin, deux formulations (quercétine smartCrystals® avec le TPGS et quercétine LNC 20) ont été sélectionnées et comparées in vivo pour évaluer l’amélioration de la pénétration cutanée de quercétine. Ce projet propose une solution pour formuler la quercétine d’une façon pertinente et efficace qui pourra être extrapolée au niveau industriel pour des applications cutanées de molécules peu solubles dont l'efficacité est limitée par leur faible pénétration cutanée. / Flavonoids are plants pigments. Flavonoids can be observed by the naked eye as they form the amazing colors of flower petals. Flavonoids are classified on the basis of their chemical structure composed of two aromatic cycles connected by three carbons: C6-C3-C6, chains are closed in hexa- or pentagonal oxygenated heterocyclic ring. Flavonoids present interesting physiological activates that permit their usefulness as medicaments, especially for their free radical scavenging ability. Indeed, flavonoids activates were the object of numerous review articles.Among flavonoids, quercetin is the molecule the most distributed in nature that presents the strongest antioxidant and antiinflammatory activities in comparison to other molecules of this family. In general flavonoids and specially quercetin present poor water solubility, thus limiting their absorption/penetration and as a result their efficiency.Starting for the idea that the skin is the largest organ of the human body and the organ, which the most exposed to oxidative stress due to UV irradiation or other corrosive and irritating chemicals. Quercetin is a candidate for skin supplementation with exogenous antioxidant. The first objective of the thesis is to develop several formulations at the nanometric range for quercetin, in order to increase its water solubility and to enhance its physicochemical properties. The second objective is to compare these formulations in terms of quercetin loading capacity, cellular toxicity of quercetin and its formulations on HaCaT cells (keratinocytes), THP-1 cells (monocytes) and Vero cells (epithelial). Then, the protective activity of quercetin in vitro on cells to finally put in evidence the increase of quercetin in vivo skin penetration in formulations.In this project, three nanoformulations approaches (smartCrystals®, lipid nanocapsules and liposomes) were tested for the increase of quercetin water solubility. The formulations were optimized for scale up to industrial scale at the level of preparation method, also in the excipients compositions for higher affinity to quercetin. The formulations were characterized in terms of particle size, PDI, quercetin loading, crystallinity evaluation and quercetin in vitro release profile. Then, formulations were compared in interaction with HaCaT and THP-1 cells for their cellular toxicity and protective activity. Finally, two formulations (quercetin smartCrystals® with TPGS and quercetin lipid nanocapsules 20) were selected and compared for the enhancement of the in vivo skin penetration of quercetin.This project propose a solution for the successful formulation of quercetin enabling its efficient skin delivery. This project can be extrapolated to industrial level for quercetin and other poorly water soluble molecules that present limited efficiency due to their low skin penetration capacity.

Le cerveau est très riche en acide docosahexaénoique (DHA, acide gras polyinsaturé (AGPI) n-3) et en acide arachidonique (AGPI n-6) qui sont de puissants immunomodulateurs. Ils pourraient être impliqués dans le contrôle de la neuroinflammation via leur conversion en dérivés lipidiques bioactifs. Dans ce contexte, notre objectif était de définir le rôle des médiateurs lipidiques dérivés des AGPI n-3 possédant des propriétés anti-inflammatoires et pro-résolutives dans la régulation de l’inflammation au niveau du cerveau. Nous avons d’abord caractérisé l’impact d’une modulation nutritionnelle en AGPI n-3 sur la composition lipidique cérébrale. Dans un modèle d’inflammation cérébrale, la consommation d’AGPI n-3 induit 1) une augmentation des métabolites lipidiques dérivés des AGPI n-3, 2) une diminution des métabolites lipidiques dérivés des AGPI n-6, et 3) une diminution de l’inflammation dans l’hippocampe. De plus, un apport en AGPI n-3 au cours de la période périnatale n’affecte pas la composition lipidique des cellules immunitaires du cerveau, les cellules microgliales. Ensuite, nous avons choisi une approche thérapeutique afin de démontrer in vitro dans un modèle de cellules microgliales que la RvD1, dérivée du DHA, en se fixant à son récepteur ALX/Fpr2, atténue l’inflammation via la régulation de la voie NFκB et de microARN. In vivo, l’injection i.c.v. de la RvD1 et du DHA atténue l’inflammation dans l’hippocampe par des processus différents. Les dérivés lipidiques bioactifs issus des AGPI n-3 pourraient être les médiateurs par lesquels les AGPI n-3 exercent leur effet bénéfique sur la régulation de l’inflammation au niveau du cerveau, la RvD1 étant fortement impliquée. / The brain is highly enriched in docosahexaenoic acid (DHA, n-3 polyunsaturated fatty acid, PUFA) and in arachidonic acid (n-6 PUFA) that are strong immunomodulators. They could be involved in the regulation of neuroinflammation through their conversion into bioactive lipid derivatives. Then, our objective was to define the role of n-3 PUFA derived lipid mediators that have anti-inflammatory and pro-resolutive properties in the regulation of brain inflammation. First, we characterized the impact of dietary n-3 PUFA modulation on brain lipid composition. In a central inflammatory model, n-3 PUFA intake induced 1) an increase in n-3 PUFA-derived lipid mediators, 2) a decrease in n-6 PUFA-derived lipid mediators, and 3) a decrease in inflammation in the hippocampus. Moreover, n-3 PUFA intake during the perinatal period did not affect lipid composition of brain immune microglial cells. Then, we chose a therapeutic approach to demonstrate in vitro in microglial cells that RvD1 derived from DHA, through the binding on its receptor ALX-Fpr2, attenuated inflammation via the regulation of NFκB pathway and microRNA expressions. In vivo, intracerebral injection of RvD1 and DHA reduced inflammation in the hippocampus by different pathways. Thus, the bioactive lipid derivatives from n-3 PUFA could be the mediators by which n-3 PUFA exert their beneficial effects on neuroinflammation, RvD1 playing a crucial role in this regulation.

Ce travail de thèse s’intéresse à l’introduction de méthodologies électrochimiques dans la problématique de la caractérisation du transport de peptides pénétrants (CPPs) à travers des membranes phospholipidiques. Malgré leur charge électrique globalement positive, ces peptides sont en effet capables de traverser les bicouches lipidiques de cellules réelles ou artificielles (liposomes) et il n’existe pas à ce jour de mécanisme d’internalisation universellement admis. Dans ce contexte, nous avons dans un premier temps développé des méthodologies visant à détecter des peptides pénétrants marqués par des sondes rédox en optimisant les conditions de volume et de confinement à l’électrode. Parallèlement, nous avons tenté d’observer le passage transmembranaire de ces peptides en utilisant un dispositif dérivé du patch-clamp, dans lequel un morceau (patch)de membrane lipidique est excisé d’une vésicule géante et le suivi du passage assuré par une détection ampérométrique sur ultramicro-électrode à proximité de la membrane. La sensibilité de la technique ampérométrique et le flux de CPP s’avérant faibles, nous nous sommes tournés vers une stratégie associant fluorescence (pour la sensibilité) et commande électrochimique (pour l’extinction de la fluorescence). Dans la mesure où les phospholipides constituent la barrière dynamique à travers laquelle doivent passer les CPPs, nous avons d’abord étudié l’extinction électrochimique de phospholipides marqués par une sonde à la fois rédox et fluorescente, le NBD. Observée sur des vésicules géantes au microscope confocale, la réduction électrochimique a permis l’extinction sélective des phospholipides situés sur le feuillet externe de la vésicule, un résultat que ne permettent ni la réduction par des agents chimiques (dithionite), ni les techniques de « photobleaching ». Cette propriété a été confirmée cette fois-ci pour des CPPs marqués par le NBD qui ont été mis à incuber en présence de vésicules géantes et pour lesquels un essai préliminaire semble confirmer une extinction de fluorescence essentiellement pour les peptides associés au feuillet externe de la vésicule. / This PhD work was aimed at introducing electrochemical strategies in the general topic devoted to the characterization of the passage of cell penetrating peptides (CPPs) across phospholipidic membranes. Although positively charged, CPPs are prone to cross lipidic bilayers of real and artificial cells (liposomes) and there is no commonly admitted internalization mechanism so far. Therefore, we first developed electrochemical setups aimed at improving the amperometric detection of redox-taggedCPPs, through optimization of volume and confinement. Additionally, we have made attempts to use patch-clamp inspired setups to monitor the passage of CPPs across a membrane patched from a giant vesicle using ultramicro-electrodes in the close vicinity of the patched membrane. Since the amperometric technique displayed poor sensibility and the flux of CPP was too narrow, we changed our strategy for a methodology coupling fluorescence (for the sensitivity) and an electrochemical command (to achieve fluorescence extinction). Considering that phospholipids are forefront actors of CPP internalization, we first focused on the electrochemical quenching of phospholipids tagged with a probe displaying both redox and fluorescent properties (NBD). Observed on giant unilamellar vesicles (GUVs) with confocal microscopy, the electrochemical reduction of the NBD probe led to the selective extinction of the phospholipids located on the outer leaflet of the vesicle, a selectivity which is not observed using chemical quenchers such as dithionite or photobleaching methods. That property was extended to NBD-tagged CPPs, previously incubated with unlabeled Guvs and that preliminary experiment confirmed that the electrochemical extinction mostly concerned peptides associated to the outer leaflet of the liposome.

Une des clés pour comprendre les mécanismes d’action biologiques des molécules naturelles et thérapeutiques est leur faculté à incorporer ou traverser les membranes lipidiques. Parce que les méthodes expérimentales sont parfois couteuses et répondent partiellement aux questions posés par les interactions composé-membrane, la modélisation moléculaire est devenue une sérieuse alternative. Les simulations de dynamique moléculaire ont ouvert de nombreuses perspectives ces dernières années en offrant la possibilité de décrire ces interactions intermoléculaires au niveau atomique. À l’aide de ces simulations, nous avons évalué la capacité de plusieurs composés (polyphénols, vitamines E et C, plantazolicine et carprofènes) à s’incorporer dans les membranes. Ces molécules ont été choisies pour leurs activités biologiques diverses, à savoir (i) activité antioxydante, précisément inhibition de la peroxydation lipidique, (ii) activité antibiotique et possibilité de former un pore transmembranaire, et (iii) inhibition d’enzymes impliquées dans la maladie d’Alzheimer. Leurs positions et orientations ainsi que leur capacité à s’accumuler ou à traverser les membranes ont été évaluées pour comprendre leurs mécanismes d’action.Dans le but d’utiliser les simulations de dynamique moléculaire en drug design, l’accent a été mis sur la précision des calculs, qui dépend de la qualité sous-jacente du modèle utilisé. En corrélant données expérimentales et théoriques, la méthodologie de nos modèles a été systématiquement revisitée. Le choix du champ de force, les paramètres des composés étudiés ainsi que la composition de la membrane sont en particulier apparus comme d’importants facteurs dans la description des interactions entre les molécules naturelles et thérapeutiques et les membranes. Des mélanges de lipides contenant du cholestérol ont notamment été utilisés et ont montré un impact significatif sur les résultats obtenus. / One of the key lockers to understand mechanisms of biological action of drugs and natural compounds is their capacity to incorporate/cross lipid bilayer membranes. In the light of demanding experimental techniques, in silico molecular modelling has become a powerful alternative to tackle these issues. In the past few years, molecular dynamics (MD) has opened many perspectives, providing an atomistic description of the related intermolecular interactions. Using MD simulations, we have explored the capacity of several compounds (polyphenols, vitamins E and C, plantazolicin, carprofens) to incorporate lipid bilayer membranes. The different compounds were chosen according to their different biological functions, namely (i) antioxidant activity against lipid peroxidation, (ii) antimicrobial activity with the possibility of trans-membrane pore formation, and (iii) inhibition of enzymes involved in Alzheimer’s disease. In order to rationalize their mechanisms of action, their position and orientation in membranes as well as their capacity to accumulate or permeate lipid bilayers were assessed. Having in mind a predictive purpose in drug design for MD simulations, the accuracy of the results relies on the quality of the in silico membrane models. By ensuring relationships between experimental and theoretical data, methodological improvements have been proposed. In particular, force field selection, xenobiotic parameterization and bilayer constitution emerged as crucial factors to appropriately depict drug-membrane interactions. For the latter issue, lipid mixtures e.g., including cholesterol have been developed.

Le glioblastome est la forme la plus commune et la plus mortelle de tumeur cérébrale chez l’adulte. La prise en charge thérapeutique conventionnelle de ce cancer consiste en une exérèse chirurgicale de la tumeur suivie d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par témozolomide (Temodal®). En dépit de ces traitements pourtant agressifs, la plupart des patients rechutent et leur survie n’excède généralement pas 15 mois. Plusieurs études ont été menées afin de comprendre les mécanismes qui conduisent à une résistance de la tumeur vis-à-vis de ces traitements et récemment, un contingent cellulaire appelé cellule souche de gliome(CSG) a été mis en évidence. L’objectif de cette thèse a été de développer un nanovecteur capable de cibler ces CSGs afin de concentrer l’efficacité de la radiothérapie au niveau des cellules radiorésistantes et notamment des cellules CXCR4-positives impliquées dans la prolifération, la migration cellulaire et la résistance à l’apoptose. Pour cela, nous avons développé des nanocapsules lipidiques (LNC) contenant du rhénium-188 (188Re), un émetteur bêta -, et fonctionnalisées au moyen d’un anticorps bloquant(12G5) dirigé contre le récepteur à chimiokine CXCR4. L’efficacité de cet objet a été testée dans un modèle orthotopique de glioblastome humain chez la souris et nous avons montré que les souris traitées avec cesLNC-188Re couplées au 12G5 présentent les meilleures médianes de survie. En parallèle de ce travail, nous avons conçu un autre nanovecteur contenant de la rapamycine, un inhibiteur de la voie PI3K/Akt/mTOR impliquée dans la radiorésistance et seulement soluble dans des solvants organiques. L’efficacité de ce vecteur à rendre la rapamycine biodisponible au niveau cellulaire et à bloquer la voie mTOR a été validée in vitro. Son activité antitumorale propre et son rôle en tant que radiosensibilisant ont de plus été caractérisés en amont d’investigations précliniques. En conclusion, cette thèse a permis de développer un outil de radiothérapie interne dans le cadre d’une thérapie ciblée dans le glioblastome. Nous avons pour la première fois montré que des LNC188Re couplées à un anticorps présentent un intérêt dans le traitement du glioblastome. / Glioblastoma is the most common and deadly primarily brain tumor in adult. Conventional therapy consists on a surgical resection of the tumor followed by radiotherapy and radiotherapy. Despite this treatments, most patients rescue. These recurrences have recently been assign to radio-chemotherapeutic resistant cell contingents called glioblastoma stem-cells (GSCs). The aim of this thesis was to develop nanovector targeting these GSCsCXCR4 positives cells implicated in proliferation, cell migration and apoptose resistance. Then, we have developed lipid nanocapsules(LNC) loaded with rhenium-188 (188Re), a beta-emitter, and functionalized with a blocking antibody (12G5) directed to CXCR4. Nanovector efficiency was evaluated in an orthotopic human glioblastoma mice model and we showed that 12G5-LNC188Re treated mice had the best median survival. Concurrently of this study, we have developed another nanovector loaded with rapamycin, an inhibitor of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway implicated in radioresistance and only soluble in organics solvants. Efficiency of this new nanovector to improve rapamycine bioavaibility and to block mTOR phosphorylation was assessed in vitro. Its own antitumor activity and its role as radiosensitizer have been evaluated in up-stream of preclinical studies.To conclude, this thesis allowed the development of a new tool forvectorized internal radiotherapy in glioblastoma. We have shown for the first time that LNC-188Re functionalized with a blockin antibody present an interest in glioblastoma therapy.