Pour une application optimale des nanovecteurs comme système de délivrance de médicaments, il est nécessaire de caractériser pleinement leur intégrité, et leurs propriétés d’encapsulation et de libération de leur contenue. Mon projet de doctorat consiste à développer des méthodes basées sur la fluorescence pour caractériser l'intégrité de ces nanovecteurs lipidiques et la libération des molécules actives in vitro et in vivo. Premièrement, en utilisant le FRET entre deux fluorochromes infrarouges spécialement conçus, l'intégrité des nanovecteurs lipidiques dans le sang et la tumeur cible a été évaluée et quantifiée par imagerie ratiométrique dans le proche infrarouge chez les souris vivantes. Deuxièmement, nous avons développé un test rapide et simple basé sur la FCS pour la quantification in situ de la libération du contenu des différents nanovecteurs. Troisièmement, en utilisant le blanchiment du Nil Rouge par le dithionite de sodium, nous avons établi une approche originale pour étudier l'état physique des nanovecteurs et le niveau d'encapsulation des fluorochromes. En conclusion, nous avons montré que les nanovecteurs lipidiques encapsulant des fluorochromes apparaissent comme un outil prospectif pour la libération contrôlée par la lumière de molécules actives in vitro et in vivo. / For effective application of nanocarriers as drug delivery system, it is necessary to fully characterize their integrity, encapsulation, and release properties. The aim of my PhD project is to develop fluorescence-based methods for characterizing integrity of lipid nanocarriers and the release of active molecules in vitr o and in vivo. First, using FRET between specially designed near-infrared dyes the integrity of lipid nanocarriers in bloodstream and tumor was assessed and quantified by near-infrared ratiometric imaging in living mice. Second, we have developed fast and simple FCS-based assay for in situ quantification of release from different NCs. Third, using Nile Red bleaching by sodium dithionite, we established an original approach to study the physical state of the nanocarriers and the level of dye encapsulation. Finally, we showed that dye-loaded lipid nanocarriers appear as a prospective tool for light-controlled release of active molecules in vitro and in vivo.

Ces travaux de thèse ont porté sur le développement de formulations innovantes et nanoparticulaire, destinées à améliorer la prise en charge des patients atteints de leucémie aigüe myéloïdes (LAM). Cette amélioration de la qualité de vie peut passer par le développement d’une formulation orale de décitabine.Trois stratégies de formulations différentes ont été développées : deux formulations de nanocapsules lipides (LNCs) avec encapsulation ou de décitabine, ou d’une prodrogue de décitabine (décitabine(C12)2) . La troisième stratégie a été le développement de particules de type liposomal, dans lesquelles la décitabine a été encapsulée. Après avoir été caractérisée sur des critères physicochimiques, chacune des stratégies basées sur les LNCs a été évaluée par des essais in vitro pour évaluer la perméabilité intestinale de la décitabine lorsqu’elle a été encapsulée. Une des stratégies a permis d’accroitre la perméabilité, in vitro, de la décitabine. L’activité sur la prolifération cellulaire a ensuite été évaluée sur des cellules humaines de LAM. Il a été démontré que l’encapsulation dans les LNCs améliore l’activité de la décitabine et de la décitabine (C12)2. Après l’ensemble de ces essais, en vue d’évaluer le potentiel avantages de ces formulations pour augmenter la demi-vie plasmatique de la décitabine, leurs stabilités dans du plasma humain a été évaluée. La décitabine (C12)2 libre et encapsulée permettent de limiter la dégradation rapide de la décitabine. Finalement, une étude de pharmacocinétique a été mise en place. L’encapsulation de la décitabine, en synthétisant au préalable une prodrogue permet d’augmenter les concentrations maximales atteintes. / The aim of this phD work was to develop nanoparticle formulations to improve patients’quality of life in case of acute myeloid leukemia (AML). These formulations could, for example, allow an oral administration of decitabine. Three different formulations were developed: two were based on lipid nanocapsules (LNCs) with an encapsulation of decitabine or a decitabine prodrug (decitabine(C12)2). The third strategy was aliposomal formulation with a decitabine encapsulation. After being characterized on physico-chemical parameters, in vitro intestinal permeability studies were performed on LNCs strategies. One strategy was able to enhance decitabine permeability. Cell proliferation studies performed on human AMLcell lines showed that encapsulations into LNCs improve decitabine and decitabine(C12)2 activities. In order to evaluate the potential of these formulations to enhance decitabine plasma half-life, their stabilities in human plasma were then assayed. Free decitabine(C12)2 or encapsulated into LNCs has been shown to limit the rapid decitabine degradation. Finally, pharmacokinetic studies were performed. Decitabine encapsulation into LNCs with a previous decitabine prodrug synthesis was able to increase maximal plasma concentrations.

Les vésicules sont des bicouches lipidiques refermées sur elles même, séparant ainsi un volume intérieur du milieu extérieur. Elles sont donc utilisées dans de nombreuses applications nécessitant l'encapsulation d'une substance mais également pour la construction d'objets biomimétiques. Une nouvelle méthode simple, appelée continuous Droplet Interface Crossing Encapsulation (cDICE), a été développée pour la fabrication de vésicules de taille et de contenu finement contrôlés. Ainsi, des vésicules dans la gamme de taille 5-70 μm de diamètre et encapsulant des solutions aussi variées que des colloïdes micrométriques, protéines, cellules, solutions visqueuses (40 mPas) ou solutions salines (>300 mosm), sont produites de façon continue et à fréquence élevée (∼ 150 Hz). Des vésicules " drépanocytaires " ont également pu être produites grace à cette méthode. La drépanocytose ou anémie falciforme est une maladie génétique dont la principale conséquence est la vaso-occlusion de la circulation sanguine. La conception de canaux microfluidiques se rapprochant au mieux des conditions physiologiques (vitesse d'écoulement, concentration d'oxygène, hématocrite...) de la microcirculation a permis une approche biomimétique de la vaso-occlusion, mettant en évidence l'importance de paramètres physiques tels que la géométrie de l'écoulement, le taux d'oxygène, la présence de globules blancs et l'hémoglobine libre en solution sur la formation d'agrégats cellulaires qui pourraient jouer un rôle dans la vaso-occlusion.

Cette thèse a porté sur le développement pour la biologie de la microscopie par génération de troisième harmonique (THG), qui permet la visualisation sans marquage de cellules et de tissus avec une résolution sub-micrométrique. Son application en biologie était jusqu'à présent limitée par le manque d'études du mode de création du signal dans l'échantillon, des sources de contrastes biologiques endogènes ainsi que de la phototoxicité induite. Le travail présenté ici a essentiellement porté sur ces trois questions. Nous avons d'abord étudié théoriquement et expérimentalement l'influence de la structure de l'échantillon et de la focalisation du faisceau excitateur sur le signal THG. Nous avons montré que l'imagerie THG agit sur l'échantillon comme un filtre passe! -bande pour les fréquences spatiales et qu'ajuster la focalisation de l'excitation permet de moduler la visibilité de structures au sein d'un système complexe selon leur forme. Par ailleurs, nous avons caractérisé les propriétés optiques de différents liquides biologiques, qui prédisent qu'un corps lipidique dans un environnement aqueux doit constituer une source efficace de signal intracellulaire. Nous avons démontré que de telles structures peuvent effectivement être suivies et quantifiées par microscopie THG dans de nombreux types de tissus biologiques non marqués, ouvrant la voie à des applications en physiopathologie. Finalement, nous avons appliqué la microscopie THG à la visualisation in vivo et sans marquage du développement embryonnaire précoce chez la drosophile. Sur ce modèle, nous avons étudié les mécanismes de phototoxicité liés à l'imagerie THG et démontré la possibilité de visualiser les embryons en 3D sans perturbation du développement et de quantifier les mouvements morphogénétiques à partir des séquences obtenues.

Les phospholipases A2 constituent une superfamille de protéines comprenant au moins onze phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) et douze phospholipases A2 intracellulaires. Ces protéines catalysent l'hydrolyse des phospholipides en position sn-2, libérant un acide gras et un lysophospholipide. Elles contrôlent ainsi la production d'une variété de médiateurs lipidiques qui sont importants pour de multiples fonctions cellulaires dans différents contextes physiologiques ou physiopathologiques (maladies inflammatoires et cancer). La sPLA2 de groupe X a été clonée au laboratoire en 1997 et possède des propriétés moléculaires uniques. Son ARN messager est présent dans différents tissus, mais semble peu régulé par des stimuli proinflammatoires. L'enzyme est unique dans sa capacité à libérer des médiateurs lipidiques à partir des phospholipides cellulaires ou des lipoprotéines et possède aussi des propriétés antimicrobiennes variées. Un élément clé de la régulation fonctionnelle de la sPLA2 de groupe X est vraisemblablement lié à la présence d'un propeptide dans sa partie N-terminale. Le lieu de la maturation protéolytique de la sPLA2 de groupe X (dans la cellule avant sécrétion ou à l'extérieur après sécrétion du proenzyme), les protéases impliquées et la régulation de cette maturation dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques sont inconnus. Le travail de cette thèse a permis de mieux comprendre comment peut s'effectuer la maturation de la sPLA2 de groupe X et quels sont ses rôles physiologiques et physiopathologiques. Concernant la maturation, nos études in vitro sur protéines purifiées et en cellules transfectées (HEK293) ont permis de montrer qu'une protéase de type furine contribue de façon majeure à l'activation de l'enzyme, vraisemblablement au cours de sa sécrétion. Nos travaux suggèrent aussi qu'une maturation est possible par d'autres protéases et dans le milieu extracellulaire comme par exemple dans les cellules LOVO. Nous avons aussi tenté de mettre en évidence cette maturation dans des tissus murins dans certaines conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous avons notamment trouvé que la sPLA2-X était la sPLA2 majeure présente dans l'acrosome des spermatozoïdes. Enfin nous avons observé un polymorphisme présent dans le propeptide de la sPLA2 humaine qui conduit à la formation d'une protéine inactive et rapidement dégradée. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons montré que la forme active de la sPLA2 de groupe X, mais pas son proenzyme était capable i) de stimuler la prolifération cellulaire dans un contexte de cancer colorectal, ii) d'exercer une action toxique contre le parasite de la malaria P.falciparum lors de l'infection de globules rouges humains, et iii) de contrôler la réaction acrosomique des spermatozoïdes de souris, avec un impact important sur le taux de fécondité dans des tests de fécondation in vitro.

Yarrowia lipolytica a la particularité de pousser sur de nombreux substrats hydrophobes et de les métaboliser via la β-oxydation ou de les stocker dans des corps lipidiques. Le premier contact entre la cellule et les substrats hydrophobes se déroule sur la surface cellulaire. A cette étape, la composition de la paroi cellulaire en protéines, en β-glucane et en chitine pourrait jouer un rôle important sur l'adhésion et la prise en charge des substrats hydrophobes. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié l'effet d'une source de carbone hydrophobe (par rapport au glucose) et de la composition du milieu de culture sur la structure pariétale et la production de mélanine chez Y. lipolytica. Les résultats de nos analyses biochimiques et moléculaires ont montré que l'oléate de méthyle (un composé utilisé comme modèle de source de carbone hydrophobe) a induit des modifications au niveau de la paroi cellulaire et que ces modifications ont conduit ou non à l'adhésion de gouttelettes lipidiques à la surface cellulaire ; à une modification du contenu des composés pariétaux ; à la résistance des cellules à des composés toxiques ayant pour cible la paroi cellulaire ; et à la modification des profils d'expression de 27 gènes analysés codant des protéines de paroi cellulaire. L'identité des gènes surexprimés suggère la participation de leurs protéines dans l'intégrité de la paroi cellulaire, dans l'adhésion des gouttelettes lipidiques et dans la réponse au stress par l'oléate de méthyle et/ou le manque d'azote. Nos résultats ont aussi montré que la présence d'oléate de méthyle, huile de ricin et ricinoléate de méthyle a induit la production de DHN-mélanine chez une souche génétiquement modifiée de Y. lipolytica (MTLY40-2p) dont la β-oxydation est affectée

L'intestin assure l'absorption des lipides alimentaires et doit faire face aux variations d'apport en lipides, entre les périodes inter-prandiales et post-prandiales. J'ai donc étudié dans les cellules Caco-2/TC7, la réponse des entérocytes à différents modes d'apports en lipides. Par une approche transcriptomique, j'ai montré que les lipides modulent l'expression de nombreux gènes entérocytaires. Les profils géniques obtenus diffèrent entre l'apport luminal ou sérique en lipides. La comparaison des apports apicaux de micelles inter- ou post-prandiales (MPP) a montré que les MPP modulent spécifiquement l'expression de 46 gènes majoritairement impliqués dans la transduction de signaux, le métabolisme lipidique, et l'architecture cellulaire. Ces résultats, s'ajoutant aux effets spécifiques des MPP obtenus dans l'équipe, suggéraient une détection entérocytaire des lipides alimentaires apportés par ces MPP. J'ai alors montré que les MPP se lient à une protéine dont le poids moléculaire correspond à celui du récepteur SR-BI, induisant sa clusterisation à la membrane apicale et son adressage vers les rafts. Seules les MPP induisent, le trafic de l'apoB, de la membrane apicale vers les compartiments sécrétoires et l'activation de kinases. Ces effets sont abolis quand SR-BI est bloqué par un de ses ligands ou invalidé par ARN interférence. Ces travaux montrent pour la première fois que les entérocytes sont capables de détecter spécifiquement les lipides alimentaires sous forme micellaire. Cette détection implique SR-BI et induit des voies de signalisation aboutissant à la mise en place de paramètres morphologiques et fonctionnels nécessaires au transfert des lipides alimentaires.

Au cours de ce travail, nous avons étudié la dynamique des phospholipides constitutifs des bicouches lipidiques supportées sur des substrats solides. A l'aide d'un dispositif de retour de fluorescence après photoblanchiment (FRAPP : Fluorescence Recovery After Patterned Photobleaching), nous avons mis en évidence différents comportements diffusifs suivant la nature du substrat (rugosité et chimie), le phospholipide et la méthode de préparation de la bicouche. La mesure du coefficient de diffusion en fonction de la température nous a permis d'établir un ensemble de données fiables et reproductibles sur la transition de phase gel-fluide de ces systèmes. Il est apparu que leur diffusion dépendait de la nature du substrat. En effet, sur le verre, où les deux feuillets ont la même dynamique, on observe une transition couplée. Au contraire, sur le mica, le feuillet proximal a une dynamique plus lente que le feuillet distal qui est quasiment libre de toute interaction avec le support. La méthode de préparation s'est également révélée être un paramètre crucial puisque nous avons obtenu une plus grande dispersion des mesures en préparant les bicouches par éclatement de vésicules par rapport à la technique de Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaeffer qui donnent des échantillons sans microdomaines. Nous avons également déterminé les énergies d'activation des différentes phases ainsi que les enthalpies de transition pour les deux phospholipides étudiés. Ce travail constitue une étape primordiale dans la compréhension des mécanismes diffusifs de systèmes plus complexes.

Le but de ce travail est l'analyse du rôle des assemblages moléculaires du fluide synovial dans le fonctionnement tribologique d'une articulation naturelle saine et prothésée. Pour cela un modèle ex vivo réaliste reproduisant les caractéristiques mécaniques et physicochimiques d'une articulation naturelle a été conçu et exploité. <br />Ce modèle reconstitue ex vivo les propriétés mécaniques et physico-chimiques des cartilages articulaires en utilisant un matériau polymérique de type hydrogel. <br />Le modèle reconstitue aussi ex vivo les assemblages moléculaires du fluide synovial (multicouches lipidiques et vésicules du gel synovial) en utilisant des techniques de physique nanostructurale comme le dépôt lipidique par éclatement de vésicules et par la co-adsorption des micelles, la fabrication des liposomes et la microscopie de force atomique. L'évolution de ces assemblages moléculaires est visualisée in situ, au cours d'essais de frottement, par microscopie optique en fluorescence obtenue avec des marqueurs moléculaires. <br />Les résultats expérimentaux corrélés avec un modèle numérique des multicouches lipidiques (dynamique moléculaire) permettent de localiser où et comment s'effectue le glissement dans les assemblages moléculaires de la synovie ce qui contribue à expliquer l'origine des valeurs de frottement mesurées. Par exemple, si le glissement se localise dans le gel synovial le coefficient de frottement est de 0.15, alors qu'il n'est que de 0.0015 lorsqu'il se localise dans les multicouches lipidiques. <br />Sur le plan appliqué, d'autres résultats montrent que l'hydrogel, simulant le cartilage, favorise la formation et le maintien des multicouches lipidiques, ce qui n'est pas le cas avec l'acier et le polyéthylène des implants. Cela permet d'expliquer les différences de comportement tribologique dans les deux cas. Enfin, la mise en évidence d'une interdépendance entre les propriétés mécaniques et les propriétés physicochimiques de l'hydrogel a été exploitée pour comprendre des phénomènes mécaniques (variation du module d'élasticité, usure....) liées à l'évolution des pathologies.

Lors de la dégustation d'un vin, les tannins sont responsables de deux propriétés gustatives, l'amertume et l'astringence, respectivement dues à des associations avec les protéines salivaires et les récepteurs au goût amer. Néanmoins, leurs intensités perçues en bouche vont dépendre de multiples facteurs, notamment la présence de molécules externes aux complexes tannin-protéine tel que les lipides, qu'ils soient situés au niveau des membranes buccales ou issus de l'alimentation. L'objectif de cette thèse a ainsi été d'examiner l'impact des lipides sur ces sensations organoleptiques. Pour ce faire, cette étude, réalisée principalement par RMN, s'est intéressée aux interactions tannin-lipide sur des modèles de membranes buccales et d'émulsions de gouttelettes lipidiques. Nous avons pu alors étudier l'interaction tannin-lipide en termes de localisation, d'affinité et de dynamique. Nos résultats montrent dans un premier temps une localisation du tannin à l'interface de tous les modèles utilisés. En outre, l'insertion de tannins au niveau des vésicules multilamellaires, modèle utilisé pour mimer les membranes buccales, entraîne une fluidification de ce système lipidique. Il a été montré que cet effet fluidifiant dépend de la structure du tannin, de la présence d'éthanol et de la teneur en cholestérol du système lipidique. Enfin, un protocole permettant d'obtenir les constantes d'associations tannin-lipide par RMN a été établi. Ces dernières se sont révélées du même ordre de grandeur que celles relatives aux interactions tannin-protéine salivaire. Ces résultats montrent que les lipides auraient une influence d'une part sur l'astringence via une compétition entre les interactions tannin-lipide et les interactions tannin-protéines salivaires et d'autre part sur l'amertume en perturbant la dynamique de la membrane, ce qui pourrait induire une perturbation des récepteurs gustatifs.